JP2003530912A - 靭帯置換構造物並びにその製造方法および使用 - Google Patents
靭帯置換構造物並びにその製造方法および使用Info
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Abstract
Description
F31 GM18905-02およびAR46117並びにNSF 大統領助成金 BES9553162/BES981782)
、従って、米国政府は本発明のある種の権利を有し得る。
ための繊維技術の使用に関する。特に、ヒト前十字靭帯(ACL)の生存可能な置
換構造物を提供する。本置換構造物は、宿主ACL細胞を播種した、分解性である
、ポリマー性繊維ベース三次元編組骨格(three-dimensional braided scaffold
)を含む。組織工学に基づく設計を伴なった本置換構造物の生体適合性は、損傷
したACLの治療および修復を促進することが期待できる。
変性、または先天的奇形によってもたらされる損傷組織を自家移植で置き換える
(Langer, R. and Vacanti, J.P. Science. 1993 260:920)。復元外科は、これら
のタイプの障害のある組織を生存可能な機能性代替物と置換することに基づいて
いる。骨格復元における骨の移植は、米国で毎年行なわれる863,200以上の移植
例によって、整形外科の執刀医の通常業務になってきた。軟骨置換については、
毎年行なわれる1,000,000以上の種々のタイプの例があり、靭帯修復については
、毎年行なわれるおよそ90,000の例がある(Langer, R. and Vacanti, J.P. Scie
nce. 1993 260:920)。
Amer. J. Sports Med. 1990 18:1)(患者から採取した組織)および同種移植(G
adzag et al. J. Amer. Acad Ortho. Surg. 1995 3:1; Shinoet al. J. Bone an
d Joint Surg. 1988 7011:556; Jackson et al. Arthroscopy 1994 10:442)(死
亡者から採取した組織)が、筋骨格の問題点を処置するために、最も一般的な代
替物の供給源である。前十字靭帯傷害の修復において、膝蓋腱の断片を頻繁に用
いている(Jackson et al. Amer. J. Sports Med. 1990 18:1)。軟骨および骨の
修復のために、自家移植の移植術が最適な最新の処置である。
ために、重大な制限は、採取部位の残余組織が移植片の除去により損傷を受け、
採取に利用可能な組織の量が制限されているというドナー部位の病的状態(dono
r site morbidity)である。同種移植の使用によって、これらの問題を緩和しよ
うとしている。しかしながら、このタイプの移植は、しばしば、組織に対する免
疫応答によって、宿主体によって拒絶される。同種移植はまた、疾患を伝染し得
る。徹底したスクリーニング手法によって、ほとんどの疾患保持組織が排除され
るが、この方法は100%効果的なものではない。 従来の復元移植材料による制限の結果、執刀医は合成代替物に注目してきた。
エチレンテレフタレート)、Gore Texプロテーゼ(prosthesis)(ポリテトラフ
ルオロエチレン)、DacronスリーブにDacronテープを捲きつけて作るStryker-Da
cron靭帯プロテーゼおよびポリプロピレンから作るGore-Tex靭帯増強デバイス(L
AD)を含む。これらの移植片は、良好な短期間の結果を示すが、長期間の研究で
は臨床の困難さに直面している。これらの合成ACL移植片の制限は、置換材料の
伸長、オリジナルの構造に比べて弱まる機械的強度および摩耗による置換材料の
断片化を含む。
度を示し、そして靭帯組織の形成を促進する。 多くの研究者が、コラーゲン繊維、生分解性ポリマーおよびそれらの複合材料
を含む潜在的なACL構造物を開示している。例えば、ACL由来のフィブロブラスト
を播種したACL復元のためのコラーゲン骨格および皮膚が記載されている(Dunn
et al. The Tissue Engineering Approach to Ligament Reconstruction. Mater
ial Research Society Symposium Proceedings 331, 13-18, 1994, Boston, Mat
erials Research Society; Bellincampi et al. J. Orthop. Res. 1998 16:414-
420)。WO 95/2550もまた、コラーゲン糸の配置を含む靭帯修復のプロテーゼデ
バイスを開示している。
剤の不存在、および生体工学組織を固定する骨プラグの使用において他の靭帯モ
デルとは異なるが、これもまた記載されている(Goulet et al. Tendons and Li
gaments. In R.P. Lanza, R. Langer, and W.L. Chick (eds), Principles of T
issue Engineering, pp. 639-645, R.G. Landes Company and Academic Press,
Inc. 1997)。 米国特許第4,792,336号明細書によって、グリコール酸エステル結合または乳
酸エステル結合を含む吸収性成分を含むデバイスが開示されている。このデバイ
スは、靭帯または腱の修復において平編組(flat braid)として用いることがで
きる吸収性成分を含む複数の繊維を含む。 本発明は、宿主ACL細胞および分解性ポリマー性繊維ベース三次元編組骨格か
ら構成される、靭帯修復および復元において用いるための移植材料に関する。
物を提供することである。好ましい態様において、本置換構造物は、前十字宿主
細胞(anterior cruciate host cells)が播種されており、その増殖は骨格によ
って支持されている。 本発明の他の目的は、組織培養において前十字宿主細胞を採取すること、増殖
すること、継代すること(passaging)および分解性ポリマー性繊維ベース三次
元編組骨格に培養細胞を播種することを含む、靭帯修復および復元に用いるため
の、分解性マトリックス中の生存細胞から構成される移植材料を製造する方法を
提供することである。 本発明の他の目的は、前十字宿主細胞を播種した分解性ポリマー性繊維ベース
三次元編組骨格を損傷領域に移植することを含む、ヒトにおいて損傷した前十字
靭帯を修復するための方法を提供することである。
oresorbable)の骨格を用いるという原則に基づいた組織修復へのアプローチに
関する。特に、本発明は、分解性骨格および、特に、ポリマー性繊維ベース三次
元編組骨格に関する。 本発明の繊維ベース編組骨格を組織置換の応用のための微繊維不織布マトリッ
クスと比較した。
ために用いられた。この技術の基礎は、反対に荷電したポリマー流体と収集スク
リーンの間の電界の発生である。ポリマー液をキャピラリーチップとともにガラ
スシリンジに添加した。銅のスクリーンに合わせた他の接続とともに液体中に電
極を置く。出力を増大すると、ポリマー液は荷電し、スクリーンに付着する。一
度、電圧が臨界値に達すると、荷電は滴液の表面張力を乗り越え、微繊維の噴出
が生産される。荷電繊維が射出されると、溶媒がすばやく減圧乾燥され、そして
繊維は無作為に収集スクリーンの表面に累積する。この結果、ミクロンスケール
の繊維の不織布メッシュが生じる。繊維の直径およびメッシュの厚さは、溶液濃
度、電圧、スクリーンとチップの間の距離、および電界紡糸の所要時間を含む多
数の種々のパラメータによって制御し得る。
カラム法(track and column method)を用いた4段法(4-step process)とし
て知られる織物編組法から形成される。4段編組装置は、糸巻きと糸送り(yarn
carriers)を設置したスロット付トラックからなる。トラック内の糸巻きおよ
び送りの動きは、3-D構造の垂直カラムを創出するために用いられる。編んだ格
子における交互性の送りのロウ(rows)とカラムは、3-D編組を創出するために
シフトされる。3-D編組の形状および繊維構造を決定する幾何学的なパラメータ
には、編組角配分(braiding angle distribution)、糸体積分率、送り数およ
び編組糸幅が含まれる。この高度に多目的なシステムによって、種々の構造およ
び機械特性を伴なった多様な3-D編組構造の形成を可能にする。
組を、細胞培養実験用に加工した。 これら実験において、2つの繊維に基づくマトリックスの階層的構造に対する
細胞の応答を比較した。特に、これらマトリックスの細胞骨格を生かす能力をイ
ンビトロ環境の中で骨芽細胞およびフィブロブラストを用いて評価した。
基礎的なマトリックス構造および組織を示した。微繊維マトリックスのSEM分析
は、高い多孔性、繊維の無作為配置による繊維構造を示した。PLAGA [50:50]繊
維は直径約2〜7μmの範囲であった。3-D編組マトリックスの画像は、3-D編組
方法によって高度に組織化された繊維構造を示した。繊維/糸の数の相違は、こ
れら2つの構造においてはっきりと明白であった。30繊維/糸を有する30糸
から加工されたブレード#1は、60繊維/糸を伴なう60糸から加工されたブ
レード#2よりも、構造全体を通してより多くの個別の編組を有していた。これ
らの構造は、繊維の充填密度によるものであるとすることができる。半分の糸あ
たり繊維数は、30糸のブレード#1は、60糸マトリックスよりもより小さい
編組単位セルを、より詰まった構造に充填することができる。これらの構造のSE
M評価は、全てのマトリックスが細胞の骨格としての機能に必要な構造的特徴を
備えていることを示した。
構造に依存することが明らかとなった。フィブロブラストと骨芽細胞の両方は、
微繊維不織布マトリックス上で同じ形態を有していた。微繊維マトリックス上で
の培養1日後、細胞は紡錘体の形状になり、表面に広がりを見せた。わずかな細
胞突起が、細胞本体からマトリックスの表面に伸びているのが見られた。しかし
ながら、SEMによっては、時点にかかわらず、いずれのサンプルにおいても微繊
維構造を示さなかった。1cm2マトリックスに、50,000細胞だけを播いたので
、細胞は微繊維構造を覆い隠す表面に完全に広がったと思われる。1日目で観察
される突起状の形態は、初期付着を示唆するものであり、細胞単層の形成ではな
い。
をも評価するために行なった。この研究によって、細胞培養培地中のマトリック
スが急速に劣化することが明らかになった。DMEMへの暴露によって、微繊維の膨
潤および凝集を引き起こすと考えられる。膨潤は、いくつかのサンプルにおいて
、その気孔率のほとんど全てが失われるほどに有意であった。したがって、この
劣化によって、細胞培養研究の経過の間、多孔性微繊維マトリックスを非孔性の
ポリマーの塊に変化した。
ロブラストの間で異なった。2週間の実験の経過後は、両方の細胞型は、細胞付
着、伸展および増殖で記載される事象の特徴的な並びに従う。しかしながら、こ
れらの事象が起きる率が、骨芽細胞とフィブロブラストで異なった。さらに、細
胞付着は、フィブロブラストより骨芽細胞の方がよりはっきりとあらわれた。例
えば、3-Dブレード#1上での細胞培養1日目で、骨芽細胞は、表面上に有意な
伸展および細胞層の形成を示した。これに対し、1日目のフィブロブラストはま
だ初期付着の特徴的な突起状形態を保持していた。加えて、フィブロブラストは
繊維の長さに沿って組織化された。細胞は、2つの隣接した繊維によって創出さ
れたグローブ(grove)に沿ってともにグループ化した。わずかな細胞質の伸長
が並んだ細胞間に見られた。
層構造が、細胞形態および組織化に重要な役割を担う。細胞は、不織布微繊維を
含む急速に劣化するマトリックスの変化する構造に対し動的に応答した。細胞は
、このような構造で組織化されず、特異的な細胞型の形態は類似した。これに対
し、3-D編組のゆっくりと劣化する繊維構造において、フィブロブラストは繊維
の長さに沿って組織化し、骨芽細胞はフィブロブラストよりもはっきりと異なっ
た形態を示した。
対し、いくつかの利点を有する。重要なことに、マトリックスに対する高いレベ
ルの構造的組織化を伝える能力は、マトリックス構造の正確な制御を可能にする
。3-Dに編まれたマトリックスおよび不織布マトリックスは、設計され、生産さ
れる3-D繊維構造の範囲の典型である。編まれたマトリックスは、3-D構造中に、
高度に組織化されたPLAGA糸織物からなる。不織布マトリックスは、無作為に方
向付けられた微繊維の結果であるが、構造は高度に均一であった。したがって、
4段3-D編組法および電界紡糸方法の両方が、種々の組織工学の応用に対する高
いレベルの汎用性を示す有用な形成方法である。種々の異なるマトリックスを製
造する能力およびマトリックス形成の正確な制御を維持することは、組織工学的
な骨格の設計に極めて重要である。
動の安定器として作用する前十字靭帯(ACL)などの大きな靭帯を含む。ACLは、
ACL傷害と診断される毎年250,000以上の患者で最も一般的に置換される膝の靭帯
である。このタイプの傷害は、しばしばスポーツおよび体操の間に起こり、たび
たび永続的および患者を無力にし得る障害をもたらす。
度を示し、靭帯組織の形成を促進する場合、ヒトの膝におけるACL靭帯などの靭
帯の置換構造物として特に有用であるだろうと考えられる。骨格の繊維ベースの
設計は、自然の靭帯と張り合い、そして編組構造は、機械的強度をもたらすとと
もに、細胞の付着および内部伸長のための気孔率を必要とした。PLAGA繊維を本
明細書に記載の実験において編組骨格に用いる一方で、限定されないが、ポリ乳
酸、ポリグリコール酸およびそれらのコポリマーなどを含むポリ(ヒドロキシ)
エステルをベースにした任意の分解性ポリマー繊維を用いることができる。
め、3タイプのポリマー繊維の束の劣化の特徴およびこれらポリマーの長期の機
械特性についての劣化の効果を試験した。試験した3つのポリマーは、10マル
チ繊維の束に織りまぜたL-ポリ-ラクチド(PLA、70デニール)、ポリ-グリコ
リド(PGA、60デニール)およびこれらの82:18のコポリマー(PLAGA、7
0デニール)の多繊維であった。全てのポリマーの質量保持率(mass retention
)および機械特性は、リン酸緩衝液(PBS)および細胞培養培地(αMEM)の両方
での浸漬時間が増加するにしたがって低減した。しかしながら、PGAの束は、強
度、質量および糸の完全性の最も急速な損失を示し、そしてこのポリマーは、2
週間後に大部分が分解し、小さな繊維に離散した。PLAの束およびPLAGAの束は、
その機械強度、質量保持率および分子量の減少に反映したように、よりゆっくり
と分解した。4週間後、PLAはPLAGAよりも高い最大引張荷重を維持した。ポリマ
ー質量保持率が機械強度および分子量の変化に独立していることが見出された。
おり、これは靭帯の治癒が起こるには速すぎるかもしれない。ポリマーが分解し
た場合、PBSのpHは、酸性分解産物が放出されるにつれて低くなった。pHの初期
低下がαMEMで測定された一方で、溶液は後に管理値に戻った。これはおそらく
、タンパク質吸着およびαMEMの高い緩衝能力によるもので、インビボでのポリ
マーの分解をモデル化するより現実的な溶液が提供されている。
験に基づいて、PLA(PLAGA 82:18またはPGAに比較して)は、本発明の編まれた
組織工学的3-D ACL置換構造物に使用するのに特別な利点を有する。その促進さ
れる分解および機械特性の損失によって、PGA単独は、ACL置換のためには適切で
はないだろう。
る。ウサギACLに対する同様の応力−ひずみ関係は繊維ベースの吸収性の骨格の3
-D編組を用いた階層設計で設計することができると考えられる。したがって、ウ
サギ靭帯をモデル化する構造が創出され得る。この合成靭帯は、全ゲージ長1c
mを有すべきである。機械試験は、好ましくは、各特定の試験についてサンプル
数6で行われる。
れ、これは材料がひずみ速度依存か否かを決定するのに役立つ。食品医薬品局の
示唆するように18のサンプル規模で試験するのが好ましい(Guidance Document
for the Preparation of Investigational Device Exemptions and Premarket
Approval Applications for Intra-Articular Prosthetic Knee Ligament Devic
es, 1987)。
着のために指定された2つの端面および置換ACLとして利用される中間領域を備
えた3つの領域から構成される。この態様において、中間領域は、サイズ、編組
角、気孔率および機械強度において、2つの末端領域と異なる。置換構造物の長
さおよび幅は、必要に応じてカスタマイズすることができる。
胞は、最初に採取され、組織培養で増殖および継代される。次いで、生存細胞お
よび分解性マトリックスから構成される移植材料を産生するため、培養細胞を3-
D編組骨格に播種する。次いで、この移植材料は、損傷したACLの治癒および修復
を促進するために靭帯損傷位置で患者に移植することができる。編組構造の付加
的な利点は、従来の繊維の束から用意された構造物と比べて、移植の容易さが増
したことを含む。
タを試験した。体内で見出される多くの豊富な細胞外接着タンパク質の1つであ
るフィブロネクチン(FN)は、靭帯形成の間、上方調節されると考えられている
。その結果、これらの実験の間、初期細胞接着を増大するため構造物をFNで予め
被覆した。種々の特性を備えた3つの型の分解性ポリマー上でのACL細胞の付着
および増殖を試験した。
6.9%を有し、PGAは気孔率63.3±7.3%を有し、そしてPLAGA構造物は
気孔率62.9±3.6%を有する。平均的な孔の直径は、PLAGA構造物とPLA構
造物の間では同じ(235〜250μm)であったが、PGAについては最も小さ
かった(177μm)
エントのときに、特異的な増殖方向に多核の培養物を形成した。細胞の増殖およ
び形態はポリマー組成と気孔率に依存した。細胞の広範囲のシートが、3つ全て
の型のポリマー上で観察されたが、形態および細胞の広がりは、PLAGA骨格からP
LA骨格まで異なっていた。細胞の広がりは、PLAGAではより少ないことがわかり
、一方で、PGAおよびPLAの両方の表面はより滑らかで、細胞の束がより少なかっ
た。定量的な細胞増殖(n=4)はまた、PGAと比較して、PLAGAおよびPLAでよ
り多くの細胞数が示された。構造物をフィブロネクチンで予め被覆することによ
って、増殖における増大をもたらした。これは、被覆しない構築物、および細胞
またはフィブロネクチンのない対照と比較した場合に、溶液pHのより急速な低下
を反映している。フィブロネクチンが、構築物へ付着する初期の細胞数を増大し
、その結果、長期培養での細胞増殖および代謝を増大すると思われる。したがっ
て、ACL細胞応答は、ポリマー組成および気孔率に依存した。さらに、構造物を
フィブロネクチンで予め被覆することは、これら骨格への細胞付着および増殖を
増大した。 以下、本発明をさらに示すために、これらに限定されない例を提供する。
技術を用いた。この方法において、PLAGA(50:50)を、1:4(重量:容積)溶液を
作るために、塩化メチレンに溶解した。電界紡糸方法において、20kVの電位を
、ポリマー溶液および電界を創出するための収集スクリーンに印加した。次いで
ポリマー溶液を収集スクリーンに30分間スプレーした。これによって均一な不
織布微繊維マトリックスがスクリーンに付着した。マトリックスを除去し、1c
m2断片に切った。
W. and Ko., F.K. (Elsevier, Amsterdam, 1989)においてKo, F.K.によって記載
された3-D編組方法を用いて加工した。この方法において、PLAGA繊維(5:95 PLA
GA)を糸あたり30および60繊維の繊維密度の糸を製造するために織りまぜた
。次いで、糸は6×12の送り配列を備えた特別に作られた編組織機に配置した
。送り(交互のロウとカラム)の一続きの動作によって、2つの矩形の3-D編組
(30糸編組(ブレード#1)および60糸編組(ブレード#2))の形成をも
たらす。
トリックスを評価した。全てのマトリックスは、細胞培養に先立ち、一面あたり
24時間、UV滅菌した。新生児ラットの頭蓋冠殻単離した初代培養の骨芽細胞を
、Jarcho, M. Clin. Ortho. 1981 157:259に記載のように、12%ウシ胎仔血清
(FBS)添加Ham's F-12培地(GIBCO)でコンフルエントまで増殖させた。マウスフ
ィブロブラスト細胞(ATCC(バージニア州アーリントン)から購入したBALB/C C
7)を10%FBS添加DMEMでコンフルエントまで増殖した。細胞をUV滅菌したマト
リックスに、5×105細胞/マトリックスの密度で播種した。細胞をマトリッ
クス上で1日、3日、7日、10日および14日の間培養し、DMEM(10%FBS
)で維持した。異なる時点で、細胞をグルタルアルデヒドに固定し、一連のエタ
ノール希釈を介して脱水した。走査電子顕微鏡(SEM)用サンプルは金で被覆し
たスパッタ(Denton Desk-1 Sputter Coater)であった。マトリックスおよび細
胞の構造は上昇電圧20kVでSEM(Amray 3000)によって視覚化した。
ル)およびこれらの82:18コポリマー(PLAGA、70デニール)の多繊維を
劣化研究に用いるための10個の多繊維の束に織りまぜた。束は、6cmの長さ
に切り、そして70%アルコールと続くUV照射によって滅菌した。ポリマーの束
を、10mlのリン酸溶液(PBS、pH=7.3)および10mlの細胞培養培地
(αMEM、pH=7.3;10%ウシ胎仔血清、L-グルタミンおよび1%抗生物質
添加)に浸した。サンプルは浸され、3週間までウォーターバスで37℃に維持
した。両方の溶液に対する浸漬割合は次の通りである:PLAは0.6mg/ml
、PLAGAは0.8mg/mlおよび0.7mg/ml。溶液は毎週替え、1、2
、3、4週でpH(n=8)を測定し、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)
で溶液中のモノマー量を定量した。
測定した。劣化に関連する形態変化を走査電子顕微鏡を用いて試験した。質量保
存率の測定のために、束を洗浄し、24時間凍結乾燥した。乾燥重量を記録し(
n=4)、そして同一サンプルを分子量(MW)測定に用いた。PLAおよびPLAGA(
82:18)に対する分子量(n=3)をポリスチレン標品を用い、テトラヒドロフ
ラン中のゲル透過クロマトグラフィーによって測定した。張力下の糸の機械特性
を、染色率毎秒2%で、500N負荷セル(ゲージ長=3cm)を用いて、イン
ストロンマシン(Instron machine (Model 4442, Instron Inc., MA))で試験し
た。
PLA、70デニール)、ポリ-グリコリド(PGA、60デニール)およびポリ-ラク
チド-コ-グリコリド82:18(PLAGA、70デニール)の繊維を10繊維/糸
の束に織りまぜ、次いでこれらの糸を3-D環状編組機(3-D circular braiding m
achine)を用いて編んだ。24糸の環状3-D編組を形成し、これらの実験につい
て1.5cmで切断した。ダクロン構造物を同様に形成し、対照として用いた。
omimetics)を用いて測定した。走査電子顕微鏡(SEM)を孔の配分を確認するた
めおよび孔のジオメトリを試験するために用いた。サンプルは培養に先立ちUV滅
菌した。構造物をそれぞれ再構成したヒトフィブロネクチン(10μg/ml)
で30分間覆った。
したACLを0.1%コラゲナーゼを用いて消化し、4回の消化から集めた細胞だ
けを研究に選んだ。細胞は、37℃、5%CO2で、αMEM+10%ウシ胎仔血
清、L-グルタミンおよび1%抗生物質で培養した。ACL細胞を80,000細胞/骨格
の密度で骨格に播種し、28日目まで増殖させた。組織培養プラスチックおよび
ダクロンを対照群に利用した。培地は、2日ごとに交換し、各時点でpHを測定し
た。細胞増殖を細胞−力価96アッセイ(cell-titer 96 assay)を用いて測定
した。骨格上の細胞形態および増殖をSEMを用いて画像化した。
Claims (3)
- 【請求項1】 前十字宿主細胞を播種した、分解性ポリマー繊維ベース三次
元編組骨格を含む置換構造物。 - 【請求項2】 (a)組織培養において、前十字宿主細胞を採取すること、
増殖することおよび継代すること、および (b)分解性ポリマー繊維ベース三次元組骨格に培養細胞を播種すること を含む、靭帯修復および復元において用いるための分解性マトリックス中の生存
細胞から構成される移植材料を製造する方法。 - 【請求項3】 前十字宿主細胞を播種した、分解性ポリマー繊維ベース三次
元編組骨格を損傷領域に移植することを含む、ヒトにおいて損傷した前十字靭帯
を修復するための方法。
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