-
Gebiet der Erfindung
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Fasertechnologien,
um nützliche
Matrizen in der Gewebetechnik zu gestalten. Insbesondere wird ein
brauchbares Ersatzkonstrukt für
ein humanes vorderes Kreuzband (ACL) bereitgestellt. Dieses Ersatzkonstrukt
besteht aus einem abbaubaren, porösen, auf Polymer-Fasern basierenden
dreidimensionalen umsponnenen Gerüst, das unter Verwendung einer
dreidimensionalen Spinntechnik gebildet wird, wobei die dreidimensional
Spinntechnik ein Vierschrittverfahren umfaßt, für das ein Spur- und Säulenverfahren
verwendet wird. Für
die biologische Verträglichkeit
dieses Ersatzkonstrukts, das mit der auf Gewebetechnik-basierenden
Gestaltung verbunden ist, wird angenommen, das sie die Heilung und Reparatur
von beschädigtem
ACL fördert.
-
Hintergrund der Erfindung
-
Bei
der orthopädischen
Rekonstruktion ersetzen Chirurgen häufig beschädigtes Gewebe, das von einem
Trauma, einer pathologischen Degeneration oder einer kongenitalen
Fehlbildung mit autogenen Transplantaten herrührt (Langer, R. und Vacanti, J.
P. Science 1993, 260: 929).
-
Rekonstruktive
Chirurgie basiert auf dem Prinzip des Ersatzes dieser Arten an gestörtem Gewebe
mit brauchbaren funktionsfähigen
Alternativen. Die Transplantation von Knochen bei der skeletalen Rekonstruktion
wurde zu einer üblichen
Maßnahme der
orthopädischen
Chirurgie mit über
863200 Transplantationsverfahren, die jedes Jahr in den USA durchgeführt werden.
Bei Knorpelersatz werden über 1.000.000
Verfahren der verschiedenen Arten jedes Jahr durchgeführt und
bei Ligamentreparaturen werden ungefähr 90.000 Verfahren pro Jahr
durchgeführt
(Langer, R. und Vacanti, J. P. Science 1993, 260: 920). Derzeitige
Autotransplantate (Friedman et al. Clin. Ortho. 1985, 196: 9; Jackson
et al. Amer. J. Sports Med. 1990, 18: 1) (Gewebe wurde dem Patienten
entnommen) und Allotransplantate (Gaszag et al. J. Amer. Acad. Ortho.
Surg. 1995, 3: 1; Shinoet et al. J. Bone and Joint Surg. 1988, 7011:
556; Jackson et al. Arthroscopy 1994 10: 442) (Gewebe wurde einem
Kadaver entnommen) sind die häufigstens üblichen
Ersatzquellen für
die Behandlung von muskoskeletalen Problemen. Bei der Reparatur
von vorderen Kreuzbandbeschädigungen
wurde häufig
ein Segment der Patellasehne verwendet (Jackson et al. Amer. J.
Sports Med. 1990, 18: 1). Für
Knorpel- und Knochenreparatur wurde die autogene Transplantation
zur häufigsten
Behandlung der Wahl.
-
Dennoch
sind verschiedene Probleme mit diesen Behandlungen verbunden. Zum
Beispiel sind bei autogenem Gewebe die entscheidenden Beschränkungen
die Morbidität
der Spenderseite, bei der das verbleibende Gewebe an der Entnahmestelle durch
die Entfernung des Transplantats beschädigt wird und die beschränkte Menge
an Gewebe, das für die
Entnahme verfügbar
ist. Die Verwendung von Allotransplantaten macht den Versuch, diese
Probleme zu erleichtern. Dennoch wird dieser Typ an Transplantat
häufig
vom Wirtskörper
infolge der Immunantwort gegenüber
dem Gewebe abgestoßen.
Allotransplantate sind auch zur Übertragung
von Krankheiten in der Lage. Obwohl ein gründliches Screeningverfahren
die meisten Krankheiten, die das Gewebe aufweist, eliminiert, ist
dieses Verfahren nicht zu 100% wirksam.
-
Als
ein Ergebnis der Beschränkungen
mit herkömmlichen
wiederherstellenden Transplantationsmaterialien haben die Chirurgen
nach synthetischen Alternativen gesucht.
-
Synthetische
ACL-Transplantate oder Transplantatträgermaterialien schließen Kohlenstofffasern, Leeds-Keio-Ligamente
(Polyethylenterephthalat), die Gore-Tex-Prothese (Polytetrafluorethylen), die
Stryker-Dacron-Ligament-Prothese, die aus Dacronbändern hergestellt
wird, die von einer Dacronhülse
umwickelt sind und die Gore-Tex Ligament-Vergrößerungs-Vorrichtung (LAD),
die aus Polypropylen hergestellt wird, ein. Diese Transplantate
weisen gute Kurzzeitergebnisse auf, stoßen aber in klinischen Langzeitstudien
auf Schwierigkeiten. Einschränkungen
dieser synthetischen Transplantate schließen die Dehnung des Ersatzmaterials,
schwache mechanische Festigkeit verglichen mit der Originalstruktur und
-fragmentation des Ersatzmaterials während der Beanspruchung ein.
-
Das
ideale ACL-Ersatzmaterial ist biologisch abbaubar, pörös, biologisch
verträglich,
weist eine ausreichende mechanische Festigkeit auf und fördert die
Bildung von Ligamentgewebe.
-
Viele
Forscher haben potentielle ACL-Konstrukte offenbart, die Kollagenfasern,
biologisch abbaubare Polymere und deren Verbundstoffe einschließen. Zum
Beispiel wurde ein Kollagengerüst
für die
ACL-Rekonstruktion, das mit Fibroblasten aus ACL und Haut beimpft
wurde, beschrieben (Dunn et al. The Tissue Engineering Approach
to Ligament Rekonstruction. Material Research Society Symposium
Proceedings 331, 13–18,
1994, Boston, Materials Research Society; Bellincampi et al. J.
Orthop. Res. 1998, 16: 414–420).
Die
WO 95/2550 offenbart
ebenfalls eine prosthetische Vorrichtung für die Ligamentreparatur, die
ein Arrangement an Kollagenfasern umfaßt.
-
Ein
biologisch-gestaltetes Ligamentmodell, das sich von den anderen
Ligamentmodellen durch die Zugabe von ACL-Fibroblasten zu der Struktur,
in Abwesenheit eines quernetzenden Mittels und der Verwendung von
Knochendübeln,
um das biologisch-gestaltete Gewebe zu verankern, unterscheidet,
wurde auch beschrieben (Goulet et al. Tendons and Ligaments. In
R. P. Lanza, R. Langer and W. L. Chick (eds.), Principles of Tissue
Engineering, pp. 639–645,
R. G. Landes Company and Academic Press Inc. 1997).
-
Das
US-Patent Nr. 5 376 118 beschreibt
ein Trägermaterial,
das aus einem semiabsorbierbaren Verbundgarn hergestellt wird, das
ein nicht-absorptionsfähiges,
elastisches Kerngarn und ein absorptionsfähiges, relativ unelastisches
Hüllgarn
umfaßt.
-
Das
US-Patent Nr. 4 792 336 offenbart
eine Vorrichtung mit einer absorptionsfähigen Komponente, die eine
Glykol- oder Milchsäureesterbindung
umfaßt.
Die Vorrichtung umfaßt
eine Vielzahl an Fasern, die die absorptionsfähige Komponente umfassen, die als
eine ebenes Geflecht bei der Reparatur des Ligaments oder Sehne
verwendet werden kann.
-
Die
WO 97/4547 offenbart ein
resorbierendes Biomaterial zur Implantation beim Menschen und anderen
Wesen umfassend amorphes oder kristallines kondensiertes Calciumphosphat
der allgemeinen Formel: [Ca(PO
3)
2]
n, wobei n gleich
3 oder größer ist und
das molare Verhältnis
von Ca:P zwischen 0,4 und 0,6 liegt.
-
Die
WO 95/10810 beschreibt
eine implantationsfähige
Prothese umfassend ein biologisch verträgliches, synthetisches im wesentlichen
bioabsorptionsfähiges
Matrixmaterial, das mit Fibroblastenzellen beimpft wurde.
-
Zusammenfassung der Erfindung
-
Gemäß einem
Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung
eines Ersatzkonstrukts für
Ligamente bereitgestellt, wobei das Ersatzkonstrukt aus einem abbaubaren,
porösen,
auf Polymer-Fasern basierenden, dreidimensionalen umsponnenen Gerüst, das
unter Verwendung einer dreidimensionalen textilen Spinntechnik gebildet
wird, besteht, gekennzeichnet dadurch, daß die dreidimensionale Spinntechnik
eine Vierschrittverfahren umfaßt,
für das
ein Spur- und Säulenverfahren verwendet
wird.
-
Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform wird
das Ersatzkonstrukt mit Zellen beimpft, deren Einwachsen durch das
Gerüst
unterstützt
wird. Vorzugsweise sind die Zellen Wirtszellen (host cells) aus dem
vorderen Kreuzband.
-
Vorzugsweise
ist das Ersatzkonstrukt zur Implantation bei einem Menschen konfiguriert,
um ein beschädigtes
Ligament zu reparieren.
-
Gemäß einem
weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur
Herstellung eines Transplantationsmaterials bereitgestellt, das aus
lebenden Zellen in einer abbaubaren Matrix besteht, umfassend:
- (a) Ernten, Wachsen und Passagieren von Zellen in
Gewebekultur; und
- (b) Aussäen
der kultivierten Zellen auf einem abbaubaren, auf Polymer-Fasern basierenden,
dreidimensionalen gesponnenen Gerüst, wie oben beschrieben.
-
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
-
Es
sollte erwähnt
werden, das der Schutzumfang der in den Ansprüchen definierte ist.
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft einen Ansatz zur Gewebereparatur,
der auf den Prinzipien der Verwendung von bioresorbierbaren Gerüsten basiert, die
als Matrize für
die Geweberegeneration dienen. Insbesondere betritt die vorliegende
Erfindung abbaubare Gerüste
und insbesondere polymere, faserbasierende dreidimensionale (3-D)
umsponnene Gerüste.
-
Faserbasierende
umsponnene Gerüste
der vorliegenden Erfindung werden mit Mikrofaser-Vliesstoff-Matrizen
für Gewebeersatzanwendungen
verglichen.
-
Eine
Elektrospinntechnik wurde verwendet, um die Mikrofase-Vliesstoff-Matrizen
herzustellen. Die Grundlage dieser Technik ist die Erzeugung eine elektrischen
Feldes zwischen einer entgegengesetzt geladenen Polymerflüssigkeit
und einem Sammelsieb. Eine Polymerlösung wird in eine Glasspritze
mit einer Kapillarspitze gegeben.
-
Eine
Elektrode wird in der Lösung
plaziert, die eine Verbindung mit einem Kupfersieb hergestellt.
Wenn die Antriebskraft erhöht
wird, wird die Polymerlösung
elektrisch geladen und wird von dem Sieb angezogen. Wenn die Spannung
einen kritischen Wert erreicht, überwindet
die Ladung die Oberflächenspannung
der Tropfen und ein Strom an Mikrofasern ist hergestellt. Wenn sich
die geladenen Fasern ausdehnen, verdampft das Lösungsmittel schnell und die
Fasern akkumulieren zufällig
auf der Oberfläche
des Sammelsiebs. Dieses Ergebnis für zu einem Vliesstoffnetz aus
mikroschuppigen Fasern. Der Faserdurchmesser und die Netzdicke können durch
eine Vielzahl von verschiedenen Parametern einschließlich der
Lösungsviskosität, der Spannung,
dem Abstand zwischen Sieb und Spitze und der Dauer des Elektrospinnvorgangs
kontrolliert werden.
-
Die
3-D-gesponnenen Gerüste
der vorliegenden Erfindung werden durch eine Textilspinntechnik,
die als ein Vierschrittverfahren bekannt ist, hergestellt, bei der
ein Spur- und Spinnverfahren verwendet wird, um die Fasermatrix
herzustellen. Die Vierschrittspinnausrüstung besteht aus genuteten Spuren,
wo Garnspulen und Garnträger
lokalisiert sind. Die Bewegung der Garnspulen und Träger innerhalb
der Spuren wird verwendet, um vertikale Spalten in der 3-D-Struktur
zu erzeugen. Alternierende Reihen und Spalten der Träger in dem
Spinngitter werden verschoben, um das 3-D-Geflecht zu erzeugen.
Die geometrischen Parameter, die die Gestalt und Faserarchitektur
des 3-D-Geflechts bestimmen, schließen Spinnwinkelverteilung,
Garnvolumenanteile, Anzahl der Träger und Spinngarnbreite ein.
Dieses höchst
vielfältige
System ermöglicht
die Bildung einer Vielzahl von 3-D-gesponnenen Strukturen mit unterschiedlichem
Aufbau und mechanischen Eigenschaften.
-
Basierend
auf diesen Fasertechnologien wurde ein Mikrofaser-Vliesstoff-Netz
und zwei rechtwinkelige 3-D-Geflechte für Zellkulturexperimente hergestellt.
-
In
diesen Experimenten wurde die Antwort von Zellen gegenüber hierarchischen
Strukturen der auf zwei Fasern-basierenden Matrizen verglichen. Insbesondere
wurde die Fähigkeit
dieser Matrizen bestimmt, um als zelluläres Gerüst zu dienen, wozu Osteoblasten
und Fibroblasten in einer in vitro Umgebung verwendet wurden.
-
Zuerst
wurde Elektronenmikroskopie der drei Matrixstrukturen durchgeführt. Schwache
Vergrößerungsbilder
zeigten die Basismatrixstrukturen und -organisation. Die SEM-Analyse
der Mikrofasermatrix zeigte eine hoch poröse, fibröse Struktur, die sich aus der
zufälligen
Anordnung der Fasern ergibt. PLAGA [50:50]-Fasern dehnen sich mit
einem Durchmesser von ungefähr
2 bis 7 μm
aus. Abbildungen der 3-D-gesponnenen Matrizen zeigten eine hoch
organisierte fibröse
Struktur, die sich aus dem 3-D-Spinnverfahren ergibt. Die Unterschiede
in der Anzahl der Fasern/Fäden
sind klar aus diesen beiden Strukturen ersichtlich. Geflecht #1,
das aus einem 30-Garn mit 30 Fasern/Fäden hergestellt wurde, hatte
ein individuelleres Geflecht über
die Struktur als das Geflecht #2-Matrix, die aus 60-Garn mit 60 Fasern/Fäden hergestellt
wurde. Diese Strukturen können
der Packungsdichte der Fasern zugeordnet werden. Mit halb so vielen
Fasern pro Garn war das 30-Garn des Geflechts #1 in der Lage, eine
dichter gepackte Struktur mit einer Spinneinheitszelle, die kleiner
als die der 60-Garnmatrix ist, zu schaffen. Die SEM-Abschätzung dieser
Strukturen deutete darauf hin, daß alle Matrizen, die die strukturellen
Eigenschaften entwickelt hatten, diese benötigten, um als zelluläres Gerüst zu funktionieren.
-
Dennoch
machen die Ergebnisse der in vitro Untersuchungen deutlich, daß die zelluläre Antwort von
der Matrixstruktur abhängig
ist. Sowohl Fibroblasten als auch Oestoblasten hatten die gleiche Morphologie
auf der Mikrofaser-Vliesstoff-Matrix. Nach einem Tag in Kultur auf
der Mikrofasermatrix sahen die Zellen spindelförmig aus und zeigten sich auf
der Oberfläche
verteilt. Schwache cytoplasmatische Projektionen wurden beobachtet,
die sich vom Zellkörper
zu der Oberfläche
der Matrix ausdehnen. Dennoch machte die SEM in keiner der Proben
eine Mikrofaserstruktur ungeachtet des Zeitpunkts deutlich. Weil
nur 50000 Zellen auf einer 1 cm2 Matrix
plattiert wurden, wird angenommen, daß die Zellen vollständig über der
Oberfläche
verteilt waren, die die Mikrofaserstruktur undurchsichtig machen.
Die spindelförmige
Morphologie, die nach einem Tag beobachtet wurde, ist ein Hinweis
auf die anfängliche
Anheftung und nicht die Bildung einer zellulären Monoschicht.
-
Es
wurde auch eine Abbaustudie durchgeführt, um beliebige Änderungen
der Matrixstruktur infolge des Abbaus in dem Gewebezellmedium zu
bestimmen. Diese Studie macht deutlich, daß die Matrix schnell in dem
Zellkulturmedium abgebaut wird. Es wird angenommen, daß die Einwirkung
von DMEM das Aufquellen und die Aggregation der Mikrofasern bewirkt.
Das Aufquellen war in einigen Proben so signifikant, daß die Struktur
fast vollständig
ihre Porosität
verloren hatte. Daher ändert
dieser Abbau die Matrix während
der Dauer der Zellkulturuntersuchung von einer porösen Mikrofasermatrix
zu einer nicht-porösen
Masse an Polymer.
-
Im
Gegensatz zu der Mikrofasermatrix unterscheidet sich die Zellmorphologie
des 3-D-Geflechts zwischen Osteoblasten und Fibroblasten. Über die Dauer
des 2-wöchigen Experiments
folgten beide Zelltypen der charakteristischen Sequenz von Abläufen, die
Zellanheftung, Verteilung und Proliferation beschreiben. Dennoch
unterscheidet sich die Rate mit der diese Abläufe für Osteoblasten und Fibroblasten
vorkommen. Des weiteren scheint die zelluläre Anheftung mit Osteoblasten
stärker
betont zu sein als mit Fibroblasten. Zum Beispiel zeigten nach einem Tag
Zellkultur auf 3-D-Geflecht #1 die Osteoblasten eine signifikante
Verbreitung über
die Oberfläche
und die Bildung eine zellulären
Schicht. Zum Vergleich behielten an Tag 1 die Fibroblasten noch
eine spindelförmige
Morphologiecharakteristik des anfänglichen Anheftens. Zusätzlich hatten
sich die Fibroblasten entlang der Länge der Fasern organisiert.
Die Zellen schienen, als hätten
sie sich zusammen entlang der Rinne gruppiert, die durch zwei benachbarte Fasern
erzeugt wurde.
-
Daher
spielen, wie durch die zelluläre
Antwort demonstriert wird, die in diesen Experimenten beobachtet
wurde, hierarchische Strukturen in der zellulären Morphologie und Organisation
eine wichtige Rolle. Zellen antworten dynamisch auf die Änderungen
der Struktur der schnell abbaubaren Matrix, die Vliestoffmikrofasern
umfaßt.
Die Zellen organisierten sich nicht auf solch einer Struktur und
die Morphologie der spezifischen Zellarten war ähnlich. Demgegenüber organisierten
sich in langsam abbaubaren Faserstrukturen des 3-D-Geflechts die Fibroblasten
entlang der Länge
der Fasern und die Oestoblasten zeigten eine merklich unterschiedliche
Morphologie als die Fibroblasten.
-
Demgemäß weist
die Verwendung der Fasertechnologie bei der Gewebegestaltung etliche Vorteile
gegenüber
einer Zahl von nicht-fibrösen 3-D-Strukturen
auf. Wichtig ist die Fähigkeit
in hohem Maß eine
strukturelle Organisation der Matrix zu verleihen, um die genaue
Kontrolle der Matrixstruktur zu ermöglichen. Die 3-D-gesponnenen und ungewebte Matrizen
sind im Bereich der 3-D-Faserarchitektur beispielhaft, die erzeugt
und produziert werden können.
Die gesponnene Matrix besteht aus hoch organisierten PLAGA-Fäden, die
in 3-D-Struktur verwoben sind. Obwohl die ungewebte Matrix das Ergebnis von
zufällig
orientierten Mikrofasern ist, ist die Struktur höchst einheitlich. Daher ist
sowohl die Vierschritt-3-D-Spinn-Technik
als auch des Elektrospinnverfahren nützliche Herstellungsverfahren,
die höchste
Niveaus an Einsatzflexibilität
für verschiedene
Gewebegestaltungsanwendungen zeigen. Die Fähigkeit zur Herstellung einer
Vielzahl von unterschiedlichen Matrizen und die Erhaltung der genauen Kontrolle über die
Matrizenherstellung sind extrem wichtige Faktoren bei der Erzeugung
von gewebegestalteten Gerüsten.
-
Zum
Beispiel enthält
das menschliche Knie große
Ligamente, wie das vordere Kreuzband (ACL), das das Femur mit der
Tibia verbindet und an der motorischen Kontrolle beteiligt ist,
wobei es als Stabilisator der Bewegungsverbindung wirkt. ACL ist
das häufigste
Ersatzligament des Knies, bei über
250000 Patienten wird eine ACL-Verletzung jedes Jahr diagnostiziert.
Dieser Typ an Verletzung kommt oft während des Sports und körperlicher Übungen vor
und führt häufig zu
Behinderungen, die permanent und behindernd für den Patienten sind.
-
Es
wird angenommen, daß die
3-D-gesponnenen Gerüste
insbesondere nützlich
als Ersatzkonstrukte für
Ligamente, wie das ACL-Ligament im menschlichen Knie sind, da diese
Gerüste
abbaubar, porös,
biologisch verträglich,
eine ausreichende Festigkeit aufweisen und die Bildung von Ligamentgewebe
fördern.
Die faserbasierte Gestaltung des Geflechts ahmt das natürliche Ligament
nach und die gesponnene Struktur bietet mechanische Festigkeit sowie
die benötigte
Porosität
für das
Anheften und Einwachsen der Zelle. Während PLAGA-Fasern für die gesponnenen
Gerüste,
die hier in den Experimenten beschrieben werden, verwendet werden,
können abbaubare
Polymerfasern, die auf Poly(hydroxy)estern basieren, einschließlich aber
nicht beschränkt auf
Polylactic, Polyglykol und deren Copolymere, verwendet werden.
-
Um
die Auswahl an Polymerfasern, die für das Spinnen der 3-D-Konstrukte
für den
ACL-Ersatz verwendet werden können,
zu unterstützen,
wurden die Abbaueigenschaften der drei Arten an Polymerfaserbündeln und
der Effekt des Abbaus der langfristigen mechanischen Eigenschaften
dieser Polymere untersucht. Die drei untersuchten Polymere waren Multifilamentfasern
von L-Polylactid (PLA, 70 Denier), Polyglykolid (PGA, 60 Denier)
und deren 82:18 Copolymer (PLAGA, 70 Denier), die zu 10 Mulitfaserbündeln zusammengeschnürt waren.
Die Massenretention und die mechanischen Eigenschaften aller Polymere
nahmen mit ansteigender Eintauchzeit sowohl in Phosphat-gepuffertem
Salz (PBS) und dem Zellkulturmedium (αNEM) ab. Dennoch zeigten die PGA-Bündel den
schnellster Verlust an Festigkeit, Masse und Fadenintegrität und dieses
Polymer war nach 2 Wochen stark abgebaut und zu kleinen Fasern zerbrochen.
PLA- und PLAGA- Bündel wurden langsamer
abgebaut, was sich in der Abnahme ihrer mechanischen Festigkeit,
Massenretention und Molekulargewicht wiedergespiegelte. Nach 4 Wochen erhielt
PGA eine höhere
maximale Zugbelastung als PLAGA aufrecht. Es wurde gefunden, daß die Polymermassenretention
abhängig
ist von Änderungen der
mechanischen Festigkeit und des Molekulargewichts.
-
Das
Molekulargewicht von PLAGA nahm auf die Hälfte seines Ursprungswertes
nach 2 Wochen Eintauchen in αNEM
ab, was zu schnell ist, damit die Ligamentheilung stattfindet. Wenn
die Polymere abgebaut werden, nimmt der pH-Wert von PBS ab, weil saure Abbauprodukte
freigesetzt werden. Während eine
anfängliche
Abnahme des pH-Wertes in αNEM gemessen
wurde, kehrt die Lösung
später
zu Kontrollwerten zurück.
Dies ist wahrscheinlich auf die Proteinabsorption und das höhere Pufferpotential von αNEM zurückzuführen, was
eine realistischere Lösung
wiedergibt, in der der Polymerabbau in vivo modelliert wird.
-
Daher
hat, basierend auf den Untersuchungen der Änderungen des Molekulargewichts,
der mechanischen Festigkeit und der Massenretention, wenn das Polymer
abgebaut wird, PLA (im Vergleich mit PLAGA 82:18 oder PGA) besondere
Vorteile bei der Verwendung als gesponnene gewebegestaltende 3-D-ACL-Ersatzkonstrukte
der vorliegenden Erfindung. Infolge seines beschleunigten Abbaus
und Verlusts an mechanischen Eigenschaften ist PGA allein nicht
für den
ACL-Ersatz geeignet.
-
Mechanische
Tests können
verwendet werden, um das Spannungs-Dehnungs-Verhältnis
des fibrösen
3-D-Konstrukts zu charakterisieren. Es wird angenommen, daß ähnliche
Spannungs-Dehnungs-Verhältnisse
gegenüber
Kaninchen-ACL mit einem hierarchischen Design unter Verwendung von 3-D-Geflechten
einer Faser basierend auf einem absorbierbaren Gerüst gestaltet
werden kann. Demgemäß kann eine
Struktur erzeugt werden, die ein Kaninchenligament modelliert. Dieses
synthetische Ligament sollte eine Gesamtzuglänge von 1 cm haben. Mechanische
Tests werden vorzugsweise mit einer Probenanzahl von 6 für jeden
einzelnen Test durchgeführt.
-
Zugtests
werden vorzugsweise bei Dehnungsraten von 0,01%/s, 2,2%/s und 50%/s
durchgeführt,
weil dies hilft, zu bestimmen, ob das Material abhängig von
der Dehnungsrate ist. Es ist bevorzugt, daß eine Probengröße von 18
getestet wird, wie von der Food and Drug Administration vorgeschlagen wird
(Guidance Document for the Preparation of Investigational Device
Exemptions and Premarket Approval Applications for Intra-Articular
Prosthetic Knee Ligament Devices, 1987).
-
Das
gesponnene Konstrukt kann aus drei Regionen zusammengesetzt sein,
mit zwei Endabschnitten, die für
die Befestigung des Konstrukt an die Femur und Tibia gestaltet sind
und der mittleren Region, die als Ersatz-ACL dient. In diesem Beispiel
unterscheidet sich die mittlere Region von den beiden Endregionen
in der Größe, dem
Spinnwinkel, der Porosität
und der mechanischen Festigkeit. Die Länge und Breite des Ersatzkonstrukts
kann, wie benötigt,
maßgeschneidert
werden.
-
Zur
ACL-Reparatur und -rekonstruktion werden die 3-D-umsponnenen Gerüste mit
ACL-Wirtszellen beimpft. Die ACL-Wirtszellen werden zuerst geerntet,
wachsen gelassen und in Gewebekulturen passagiert. Mit diesen kultivierten
Zellen wird dann das 3-D-umsponnenen Gerüst beimpft, um Transplantationsmaterial
zu erzeugen, das aus lebenden Zellen und abbaubarer Matrix zusammengesetzt
ist. Dieses Transplatationsmaterial kann dann durch einen chirurgischen
Eingriff bei einen Patienten an der Stelle der Ligamentverletzung
implantiert werden, um die Heilung und Reparatur der beschädigten ACL zu
fördern.
Zusätzliche
Vorteile der gesponnenen Struktur schließen ihre leichte Handhabung
bei der Implantation ein, verglichen mit dem den aus dem Stand der
Technik bekannten Konstrukten, die aus Faserbündeln hergestellt werden.
-
Es
wurden die Gestaltungsparameter, wie Polymerzusammensetzung und
die Antwort von primären
ACL-Zellen gegenüber
dem 3-D-umsponnenen Konstrukten bestimmt. Für Fibronektin (FN), eines der
am meisten vorhandenen extrazellulären Adhäsionproteine, die im Körper gefunden
werden, wird angenommen, daß es
während
der Ligamentbildung hoch dosiert ist. Demgemäß werden bei diesen Experimenten
die Konstrukte mit FN vorbeschichtet, um die anfängliche Zelladhäsion zu
verstärken.
Das Anheften und das Wachstum von ACL-Zellen auf drei Arten der
abbaubaren Polymere mit verschiedenen Porositäten wurde bestimmt.
-
Die
Porosität
des Gerüsts
lag im Bereich von 54% bis 63%, mit PLA-Konstrukt mit einer Porosität von 53,5 ± 6,9%,
mit PGA mit einer Porosität
von 63,3% ± 7,3%
und PLAGA-Konstrukten mit einer durchschnittlichen Porosität von 62,9% ± 3,6%.
Der durchschnittliche Porendurchmesser war zwischen PLAGA- und PLA-Konstrukten
(235–250 μm) ähnlich,
aber für
PGA am kleinsten (177 μm).
-
Primäre ACL-Ligament-ähnliche
Zellen zeigten eine semi-eiförmige,
fibroblasten-ähnliche
Morphologie und wenn sie konfluent waren, bildeten sie mehrfach
haufenförmige
Kulturen mit besonderen Wachtumsorientierungen. Zellwachstum und
Morphologie waren abhängig
von der Polymerzusammensetzung und Porosität. Extensive Zellschichten wurden
bei allen drei Polymertypen beobachtet, aber die Morphologie und
Zellausdehnung waren bei PLAGA- bis PLA-Gerüsten unterschiedlich. Die Zellausdehnung
war bei PLAGA geringer, während
die Oberfläche
sowohl von PGA als auch PLA glatter war und weniger zelluläre Bündel hatte.
Quantitatives zelluläres
Wachstum (n = 4) wurde auch bei höheren Zellzahlen bei PLAGA
und PLA erreicht, wenn sie mit PGA verglichen wurden. Die Vorbeschichtung
des Konstrukts mit Fibronektin führte
zu einem Anstieg bei der Proliferation, was sich in der schnellen
Abnahme des Lösungs-pH-Wertes
wiederspiegelte, wenn sie mit nicht beschichteten Konstrukten und Kontrollzellen
oder Fibronektin verglichen wurden. Es ist möglich, daß Fibronektin die anfängliche
Zellzahl ansteigen läßt, die
sich an das Konstrukt anheften und demgemäß das Zellwachstum und den
Metabolismus in Langzeitkulturen ansteigen läßt. Deshalb ist die ACL-zelluläre Antwort
von der Polymerzusammensetzung und der Porosität abhängig. Des weiteren läßt die Vorbeschichtung
der Konstrukte mit Fibronektin das Zellanheften und das Wachstum
auf diesen Gerüsten
ansteigen.
-
Die
folgenden nicht beschränkenden
Beispiel werden bereitgestellt, um die vorliegende Erfindung weiter
zu veranschaulichen.
-
Beispiele
-
Beispiel 1: Mikrofaser Matrizen
-
Es
wurde eine Elektrospinntechnik verwendet, um biologisch abbaubare
Vliesstoff-Fasergerüste mit
einer ungefähren
Dicke von 0,5 mm herzustellen. Bei diesem Verfahren wurde PLAGA
(50:50) in Methylenchlorid gelöst,
um eine 1:4 Gewicht:Volumen-Lösung
zu erzeugen. Bei dem Elektrospinnverfahren wurde ein elektrisches
Potential von 20 kV an die Polymerlösung und ein Sammelsieb angelegt,
um eine elektrisches Feld zu erzeugen. Die Polymerlösung wurde
dann auf das Sammelsieb für
30 Minuten gesprüht.
Dies führte
zu einer einheitlichen Vliesstoff-Mikrofasermatrix, die an dem Sieb
befestigt war. Die Matrix wurde entfernt und in 1 cm2 große Stücke geschnitten.
-
Beispiel 2: 3-dimensionales Fasergeflecht
-
Dreidimensionale
fibröse
Matrizen wurden unter Verwendung eine 3-D-Spinnverfahrens hergestellt, wie von
Ko, F. R in Textile Structural Composites, eds. Chou, T. W. and
Ko, F. K. (Elsevier, Amsterdam, 1989) beschrieben. Bei diesem Verfahren
werden PLAGA-Fasern (5:95 PLAGA) gebündelt, um Garne mit einer Faserdichte
von 30 und 60 Fasern pro Faden herzustellen. Die Fäden werden
dann in einem gewöhnlich
gebauten Spinnwebstuhl mit einem 6 an 12 Trägerarrangement plaziert. Sequentielle
Bewegung der Träger
[alternierende Reihen und Spalten] führte zu der Bildung von zwei
rechteckigen 3-D-Geflechten: einem 30-Faden-Geflecht [Geflecht #1]
und einem 60-Faden-Geflecht [Geflecht #2].
-
Beispiel 3: In vitro Zellkultur
-
Die
Matrizen wurden in einer 2-wöchigen Zellkulturuntersuchung
abgeschätzt,
wobei Fibroblasten und primäre
Osteoblasten in Kultur verwendet wurden. Alle Matrizen wurden mit
UV für
24 Stunden pro Seite vor der Zellkultur sterilisiert. Primäre Osteoblasten
in Kultur, die aus neugeborenen Rattencalvaria isoliert wurden,
wurden bis zur Konfluenz in Ham's
F-12-Medium (Gibco), ergänzt
mit 12% fötalem
Rinderserum (PBS) (Sigma) wachsen gelassen, wie von Jarcho, M. Clin.
Ortho. 1981, 157; 259, beschrieben. Mausfibroblastzellen (BALG/C
C7 bezogen von ATTC: Arlington Virgina) wurden bis zur Konfluenz
in DMEM, ergänzt
mit 10% FBS wachsen gelassen. UV sterilisierte Matrizen wurden mit
Zellen mit eine Dichte von 5 × 105 Zellen/Matrix beimpft. Zellen wurden auf
den Matrizen für
1, 3, 7, 10 und 14 Tage kultiviert und minit DMEM (10% FBS) gehalten. Zu
den verschiedenen Zeitpunkten wurden Zellen mit Glutaraldehyd fixiert
und mit einer Reihe von Ethanolverdünnungen dehydriert. Proben
zur Rasterelektronenmikroskopie (SEM) wurden mit Gold sputterbeschichtet
(Denton Desk-1 Sputter Coater). Matrix und zelluläre Struktur
wurden mit SEM (Array 300) bei einer Beschleunigungsspannung von
20 kV sichtbar gemacht.
-
Beispiel 4: Abbaueigenschaften von verschiedenen Polymeren
-
Multifilamentfasern
von L-Polylactid (PLA, 70 Denier), Polyglykolid (PGA, 60 Denier)
und deren 82:18 Copolymer (PLAGA, 70 Denier) wurden in 10 Multifaserbündel gebündelt, um
für Abbaustudien verwendet
zu werden. Die Bündel
wurden auf eine Länge
von 6 cm geschnitten und mit 70% Alkohol und anschließender UV-Bestrahlung
sterilisiert. Die Polymerbündel
wurden in 10 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS, pH = 7,3) und in
10 ml Kulturmedium (αMEM,
pH = 7,3) ergänzt
mit 10% fötalem
Rinderserum, L-Glutamin und 1% Antibiotika getaucht. Die Proben
wurden geschüttelt
und bei 37°C
im Wasserbad für
bis zu 3 Wochen gehalten. Die Eintauchverhältnisse für beide Lösungen waren, wie folgt, PLA
bei 0,6 mg/ml, PLAGA bei 0,8 mg/ml und PGA bei 0,7 mg/ml. Die Lösungen wurden
wöchentlich ausgetauscht
und nach 1, 2, 3 und 4 Wochen wurden der pH-Wert (n = 8) gemessen
und die Menge an Monomer in der Lösung wurden durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie
(HPLC) gemessen.
-
Nach
2 und 4 Wochen nach dem Eintauchen wurden das Molekulargewicht,
die Massenretention und die mechanischen Eigenschaften der Bündel (n =
5) bestimmt. Abbaubezogene morphologische Änderungen wurden mit Rasterelektronenmikroskopie bestimmt.
Für die
Massenretentionsmessungen wurden die Bündel gespült und für 24 Stunden lyophilisiert.
Das Trockengewicht wurde aufgenommen (n = 4) und die gleiche Probe
wurde für
die Bestimmung des Molekulargewichts verwendet. Molekulargewichte
(n = 3) für
PLA und PLAGA (82:18) wurden mit Gelpermeationschromatographie in
Tetrahydrofuran mit Polystyrolstandards gemessen. Die mechanischen Eigenschaften
des Garn unter Spannung wurden mit einer Instron-Vorrichtung (Modell
4442, Instron Inc., MA) mit einer 500 N Belastungszelle (Zuglänge = 3 cm)
mit einer Dehnungsrate von 2% pro Sekunde gestestet.
-
Beispiel 5: Wirkung des Polymerkonstrukts
auf die Morphologie und das Wachstum von vorderen Kreuzbandzellen
-
Fibröse Gerüste wurden
unter Verwendung des in Beispiel 2 beschriebenen 3-D-Spinnverfahrens hergestellt.
Fasern von L-Polylactid (PLA, 70 Denier), Polyglykolid (PGA, 60
Denier) und deren 82:18 Copolymer (PLAGA, 70 Denier) wurden in 10 Multifaserbündel gebündelt und
diese Garne wurde dann unter Verwendung einer 3-D-zirkulären Spinnmaschine
gesponnen. Zirkuläre
3-D-Geflechte mit 24 Fäden
wurden gebildet und auf eine Länge
von 1,5 cm für
diese Experimente geschnitten. Dacron-Konstrukte wurden ähnlich hergestellt
und als Kontrollen verwendet.
-
Die
Porosität,
der Porendurchmesser und die Gesamtporenfläche dieser Konstrukte wurden unter
Verwendung des Autopore III Porosimeter (Micromimetrics) bestimmt.
Rasterelektronenmikroskopie (SEM) wurden verwendet, um die Porenverteilung
zu bestätigen
und die Porengeometrie zu untersuchen. Die Proben wurden vor der
Kultivierung UV-sterilisiert. Die Konstrukte wurden jeweils mit
rekonstituiertem humanen Fibronektin (10 μg/ml) für 30 Minuten beschichtet.
-
Primäre ACL-Zellen
wurden aus 1 kg weißen Neuseeland-Kaninchen
isoliert. Die herausgeschnittenen ACL wurden mit einer 0,1%igen
Kollagenaselösung
verdaut und nur Zellen, die aus der vierten Verdauung gesammelt
wurden, wurden für
die Untersuchung ausgewählt.
Zellen wurden in αMEM
+ 10% fötalem
Rinderserum, L- Glutamin
und 1% Antibiotika bei 37°C
und 5% CO2 kultiviert. Das Gerüst wird
mit ACL-Zellen mit einer Dichte von 80000 Zellen/Gerüst beimpft
und bis zu 28 Tage wachsen gelassen. Gewebekulturplastik und Dacron
dienten als Kontrollgruppen. Das Medium wurden alle zwei Tage ausgetauscht
und zu jedem Zeitpunkt wurde der pH-Wert gemessen. Das Zellwachstum
wurde unter Verwendung des Zelltiter-96-Assays bestimmt. Die Zellmorphologie
und -wachstum auf dem Gerüst
wurden mit SEM-Anwendung sichtbar gemacht.