CN105311675A - 膀胱脱细胞基质材料的表面修饰方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种膀胱脱细胞基质材料的表面修饰方法及应用。利用该方法对膀胱脱细胞基质材料进行表面修饰，血管内皮生长因子与膀胱脱细胞基质的结合能力得到了加强，与单纯将血管内皮生长因子吸附在膀胱脱细胞基质材料相比，血管内皮生长因子在膀胱脱细胞基质材料上的释放速度得到了明显降低，血管内皮生长因子在膀胱脱细胞基质材料上的体外缓释能力得到了显著提高，血管内皮生长因子在膀胱脱细胞基质材料上的有效浓度得到了显著提高。其中，第7天血管内皮生长因子在膀胱脱细胞基质材料上的有效浓度提高了300％。同时，利用该方法对膀胱脱细胞基质材料进行表面修饰，能够更有效的促进膀胱脱细胞基质材料内部的血管化形成。
Description
技术领域
本发明涉及天然生物材料领域，特别涉及一种膀胱脱细胞基质材料的表面修饰方法及其应用。
背景技术
膀胱脱细胞基质(BAM)是采用物理或化学方法去除机体原型组织中的实质细胞制备得到的，保留了膀胱细胞外基质的天然骨架，具有良好的生物相容性。膀胱脱细胞基质除含有胶原蛋白、糖蛋白和蛋白多糖之外，还含有各种生物因子和细胞因子，对于调节细胞在材料上的黏附、生长和增殖具有重要作用，是目前膀胱重建研究中最为常用的修复材料。
然而，研究表明，在较大面积的膀胱修复中，单纯利用膀胱脱细胞基质材料往往会出现中心区域的缺血缺氧坏死和移植区域皱缩等情况。移植区的血管再生是膀胱重建修复的关键环节，血管内皮生长因子(VEGF)是最有效的促血管生长因子。利用VEGF活化膀胱脱细胞基质材料是目前膀胱重建研究的焦点，常用方法是将其简单吸附在膀胱脱细胞基质材料上。然而，这种方式存在着很大不足，原因是移植到体内后，由于体液的浸润和和冲刷，致使VEGF很难在膀胱脱细胞基质材料上保持其有效浓度。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种膀胱脱细胞基质材料的表面修饰方法。利用该方法对膀胱脱细胞基质材料进行表面修饰，血管内皮生长因子与膀胱脱细胞基质的结合能力得到了加强，能够更有效的促进膀胱脱细胞基质材料内部的血管化形成。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种膀胱脱细胞基质材料的表面修饰方法，其特征在于，具体步骤为：
A.膀胱脱细胞基质的制备：无菌条件下取哺乳动物整个或部分膀胱组织，加入浓度为5-15kIU/mL的抑肽酶溶液，于4℃条件下搅拌45-50h，抑肽酶溶液的体积为膀胱组织体积的10-15倍；接着将膀胱组织置于质量分数为0.9-1.1％的聚乙二醇辛基苯基醚溶液中于4℃条件下搅拌45-55h，聚乙二醇辛基苯基醚溶液的体积为膀胱组织体积的12-18倍；然后将膀胱组织置于DNA水解酶的浓度为48-53U/mL、RNA酶A的浓度为0.8-1.3U/mL的溶液中在4℃条件下搅拌21-25h，该溶液的体积为膀胱组织体积的15-25倍；用1×PBS缓冲液清洗三次，每次5min，在4℃条件下冷藏，再在真空条件下冷冻干燥并通过11-14kGyCo60辐照杀菌，然后置于-20℃条件下存放直至下一步使用；
B.血管内皮生长因子/膀胱脱细胞基质的制备：将浓度为2-3mg/mL的2-亚氨氢氯化硫醇溶液与步骤A制得的膀胱脱细胞基质在室温下孵育2h，所述2-亚氨氢氯化硫醇溶液的体积为步骤A制得的膀胱脱细胞基质的体积的15-25倍；用pH＝8.0并含4mmol/L的乙二胺四乙酸的PBS缓冲液清洗3次，每次5min；将浓度为0.08-0.12mg/mL的血管内皮生长因子溶液25mL与浓度为0.4-0.6mg/mL的4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐溶液40mL在室温下反应1h，反应后的溶液过脱盐柱；将过脱盐柱处理过的血管内皮生长因子-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐复合物加入经2-亚氨氢氯化硫醇处理过的膀胱脱细胞基质材料上，室温下孵育1h，用1×PBS缓冲液清洗三次，每次5min；在4℃条件下冷藏，再在真空条件下冷冻干燥。
膀胱脱细胞基质(BAM)是采用物理或化学方法去除机体原型组织中的实质细胞制备得到的，保留了膀胱细胞外基质的天然骨架，具有良好的生物相容性。膀胱脱细胞基质除含有胶原蛋白、糖蛋白和蛋白多糖之外，还含有各种生物因子和细胞因子，对于调节细胞在材料上的黏附、生长和增殖具有重要作用，是目前膀胱重建研究中最为常用的修复材料。
进一步，步骤A中所述抑肽酶溶液的浓度为10kIU/mL，体积为膀胱组织体积的12倍，在该溶液中的搅拌时间为48h。所述抑肽酶别名抑胰肽酶、屈来密多、胰蛋白酶抑制剂，是一种非特异性血清蛋白酶抑制剂，具有保护血小板、抑制纤溶蛋白的作用。抑肽酶是细胞培养系统中的保护剂，在中性和酸性环境下稳定，耐高温、耐蛋白水解酶降解。它对一些丝氨酸蛋白酶(如胰蛋白酶)有抑制能力。
进一步，步骤A中所述聚乙二醇辛基苯基醚溶液的质量分数为1％，体积为膀胱组织体积的16倍，在该溶液中的搅拌时间为48h。所述聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)是一种非离子型表面活性剂(或去污剂),分子量为646.86。它能溶解脂质，以增加抗体对细胞膜的通透性。在生命科学领域，该产品常用于帮助分解蛋白酶。
进一步，步骤A中所述含有DNA水解酶和RNA酶A的溶液中DNA水解酶和RNA酶A的浓度分别为50U/mL和1U/mL，该溶液的体积为膀胱组织体积的18倍，在该溶液中的搅拌时间为24h。所述DNA水解酶用于切断磷酸二酯键的酶，这些酶使糖-磷酸酯主链上的磷酸二酯键水解。所述RNA酶A是一类催化RNA降解的核酸酶。
进一步，步骤A中所述Co60辐照杀菌的强度为12kGy。所述辐照杀菌耗能低，与传统的方法相比，可节省能源几倍到十几倍；射线穿透力强，可杀灭各种包装、散装、固体、液体表面及内部的各种微生物和害虫；辐照加工属于冷加工，不会引起内部温度的明显增加，同时它又是物理加工，不需要添加任何化学药剂，没有农药残留，也不发生放射性，不污染环境。
进一步，步骤A和步骤B中所述真空条件下冷冻干燥的温度为-10～-30℃，压力为10～12Pa。所述真空条件下冷冻干燥是将湿物料或溶液在较低的温度(－10℃～－50℃)下冻结成固态，然后在真空(1.3～13Pa)下使其中的水分不经液态直接升华成气态，最终使物料脱水的干燥技术。
进一步，步骤B所述2-亚氨氢氯化硫醇溶液的浓度为2.5mg/mL，体积为步骤A制得的膀胱脱细胞基质的体积的20倍。所述2-亚氨氢氯化硫醇英文名称为Traut’s试剂。在本发明中，是利用Traut’s试剂和交联剂4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(Sulfo-SMCC)将血管内皮生长因子锚定在膀胱脱细胞基质上，从而加强VEGF与BAM的结合能力。
进一步，步骤B所述血管内皮生长因子溶液的浓度为0.1mg/mL，4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐溶液的浓度为0.5mg/mL。
所述血管内皮生长因子(VEGF)是血管内皮细胞特异性的肝素结合生长因子，可在体内诱导血管新生。VEGF能直接作用于血管内皮细胞促进血管内皮细胞增殖，增加血管通透性。所述4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐英文名称为Sulfo-SMCC，是水溶性、双异官能团交联试剂，将胺以及巯基反应性地合并入扩展间隔片。本发明采用化学交联剂Sulfo-SMCC和Traut’s试剂将VEGF锚定在BAM上，能够加强VEGF与BAM的结合能力，降低VEGF在BAM上的扩散速度，促进BAM材料内部的血管化形成。
本发明的目的还在于保护所述膀胱脱细胞基质材料的表面修饰方法在SD大鼠膀胱脱细胞基质材料的表面修饰中的应用。
本发明的有益技术效果是：
利用本发明所述方法对膀胱脱细胞基质材料进行表面修饰，血管内皮生长因子与膀胱脱细胞基质的结合能力得到了加强，与单纯将血管内皮生长因子吸附在膀胱脱细胞基质材料相比，血管内皮生长因子在膀胱脱细胞基质材料上的释放速度得到了明显降低，血管内皮生长因子在膀胱脱细胞基质材料上的体外缓释能力得到了显著提高，血管内皮生长因子在膀胱脱细胞基质材料上的有效浓度得到了显著提高。其中，第7天血管内皮生长因子在膀胱脱细胞基质材料上的有效浓度提高了300％。同时，利用该方法对膀胱脱细胞基质材料进行表面修饰，能够更有效的促进膀胱脱细胞基质材料内部的血管化形成。
附图说明
图1A为实施例3得到的膀胱组织；
图1B为实施例3得到的膀胱组织的苏木精-伊红染色结果显示图；
图1C为膀胱组织脱细胞基质；
图1D为膀胱脱细胞基质的苏木精-伊红染色结果图；
图2为实施例4中VEGF分别通过单纯吸附(单纯吸附组)和交联至BAM材料(交联组)后，0-7天的释放量的检测结果图；
图3为实施例5免疫组化对材料术后30天血管生成能力的检测(×200倍)；
图3A为PBS组的免疫组化染色；
图3B为VEGF单纯吸附组的免疫组化染色；
图3C为VEGF交联组的免疫组化染色。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明的实施例进行详细的描述。
实施例1
一种膀胱脱细胞基质材料的表面修饰方法，具体步骤为：
A.膀胱脱细胞基质的制备：无菌条件下取雄性SD大鼠整个膀胱组织，加入浓度为5kIU/mL的抑肽酶溶液，于4℃条件下搅拌50h，抑肽酶溶液的体积为膀胱组织体积的10倍；接着将膀胱组织置于质量分数为1.1％的聚乙二醇辛基苯基醚溶液中于4℃条件下搅拌45h，聚乙二醇辛基苯基醚溶液的体积为膀胱组织体积的12倍；然后将膀胱组织置于DNA水解酶的浓度为48U/mL、RNA酶A的浓度为1.3U/mL的溶液中在4℃条件下搅拌21h，该溶液的体积为膀胱组织体积的15倍；用1×PBS缓冲液清洗三次，每次5min，在4℃条件下冷藏，再在-20℃、10Pa条件下真空冷冻干燥并通过11kGyCo60辐照杀菌，然后置于-20℃条件下存放直至下一步使用；
B.血管内皮生长因子/膀胱脱细胞基质的制备：将浓度为3mg/mL的2-亚氨氢氯化硫醇溶液与步骤A制得的膀胱脱细胞基质在室温下孵育2h，2-亚氨氢氯化硫醇溶液的体积为步骤A制得的膀胱脱细胞基质的体积的15倍；pH＝8.0并含4mmol/L的乙二胺四乙酸的PBS缓冲液清洗3次，每次5min；将浓度为0.08mg/mL的血管内皮生长因子溶液25mL与浓度为0.6mg/mL的4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐溶液40mL在室温下反应1h，反应后过脱盐柱；将过脱盐柱处理过的血管内皮生长因子-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐复合物加入经2-亚氨氢氯化硫醇处理过的膀胱脱细胞基质材料上，室温下孵育1h，用1×PBS缓冲液清洗三次，每次5min；在4℃条件下冷藏，再在再在-20℃、10Pa条件下真空冷冻干燥。
实施例2
一种膀胱脱细胞基质材料的表面修饰方法，具体步骤为：
A.膀胱脱细胞基质的制备：无菌条件下取雄性SD大鼠整个膀胱组织，加入浓度为15kIU/mL的抑肽酶溶液，于4℃条件下搅拌45h，抑肽酶溶液的体积为膀胱组织体积的15倍；接着将膀胱组织置于质量分数为0.9％的聚乙二醇辛基苯基醚溶液中于4℃条件下搅拌55h，聚乙二醇辛基苯基醚溶液的体积为膀胱组织体积的18倍；然后将膀胱组织置于DNA水解酶的浓度为53U/mL、RNA酶A的浓度为0.8U/mL的溶液中在4℃条件下搅拌25h，该溶液的体积为膀胱组织体积的25倍；用1×PBS缓冲液清洗三次，每次5min，在4℃条件下冷藏，再在-10℃、12Pa条件下真空冷冻干燥并通过14kGyCo60辐照杀菌，然后置于-20℃条件下存放直至下一步使用；
B.血管内皮生长因子/膀胱脱细胞基质的制备：将浓度为2mg/mL的2-亚氨氢氯化硫醇溶液与步骤A制得的膀胱脱细胞基质在室温下孵育2h，2-亚氨氢氯化硫醇溶液的体积为步骤A制得的膀胱脱细胞基质的体积的25倍；pH＝8.0并含4mmol/L的乙二胺四乙酸的PBS缓冲液清洗3次，每次5min；将浓度为0.12mg/mL的血管内皮生长因子溶液25mL与浓度为0.4mg/mL的4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐溶液40mL在室温下反应1h，反应后过脱盐柱；将过脱盐柱处理过的血管内皮生长因子-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐复合物加入经2-亚氨氢氯化硫醇处理过的膀胱脱细胞基质材料上，室温下孵育1h，用1×PBS缓冲液清洗三次，每次5min；在4℃条件下冷藏，再在-10℃、12Pa条件下真空冷冻干燥。
实施例3
一种膀胱脱细胞基质材料的表面修饰方法，具体步骤为：
A.膀胱脱细胞基质的制备：无菌条件下取雄性SD大鼠整个膀胱组织，加入浓度为10kIU/mL的抑肽酶溶液，于4℃条件下搅拌48h，抑肽酶溶液的体积为膀胱组织体积的12倍；接着将膀胱组织置于质量分数为1％的聚乙二醇辛基苯基醚溶液中于4℃条件下搅拌48h，聚乙二醇辛基苯基醚溶液的体积为膀胱组织体积的16倍；然后将膀胱组织置于DNA水解酶的浓度为50U/mL、RNA酶A的浓度为1U/mL的溶液中在4℃条件下搅拌24h，该溶液的体积为膀胱组织体积的18倍；用1×PBS缓冲液清洗三次，每次5min，在4℃条件下冷藏，再在-15℃、11Pa条件下真空冷冻干燥并通过12kGyCo60辐照杀菌，然后置于-20℃条件下存放直至下一步使用；
B.血管内皮生长因子/膀胱脱细胞基质的制备：将浓度为2.5mg/mL的2-亚氨氢氯化硫醇溶液与步骤A制得的膀胱脱细胞基质在室温下孵育2h，所述2-亚氨氢氯化硫醇溶液的体积为步骤A制得的膀胱脱细胞基质的体积的20倍；pH＝8.0并含4mmol/L的乙二胺四乙酸的PBS缓冲液清洗3次，每次5min；将浓度为0.1mg/mL的血管内皮生长因子溶液25mL与浓度为0.5mg/mL的4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐溶液40mL在室温下反应1h，反应后过脱盐柱；将过脱盐柱处理过的血管内皮生长因子-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐复合物加入经2-亚氨氢氯化硫醇处理过的膀胱脱细胞基质材料上，室温下孵育1h，用1×PBS缓冲液清洗三次，每次5min；在4℃条件下冷藏，再在-15℃、11Pa条件下真空冷冻干燥。
图1A为实施例3得到的膀胱组织，图1B为实施例3得到的膀胱组织的苏木精-伊红染色结果显示图，图1C为膀胱组织脱细胞基质；图1D为膀胱脱细胞基质的苏木精-伊红染色结果图。
从图1D可以看出，实施例3制备的膀胱脱细胞基质无细胞核残留，呈网状、多孔结构，适合细胞长入。
实施例4
VEGF/BAM的生长因子结合与缓释能力分析
为验证本发明制备的VEGF/BAM的生长因子结合与缓释能力，将实施例3制备的VEGF/BAM(交联组)材料与单纯吸附VEGF的BAM材料(单纯吸附组)均以圆柱状形式加入48孔板，该圆柱的底面半径为0.5cm，高为2mm。每孔加入500μL1×PBS缓冲液，然后置于37℃摇床孵育，摇床的转速为80rpm，每隔12h更换一次PBS缓冲液，用酶联免疫吸附测定法检测1-7天残留在BAM材料上的VEGF的量。其中单纯吸附组用0.1mg/mL的VEGF与BAM进行吸附，该组BAM采用实施例3步骤A所述方法制备。
图2为实施例4中VEGF分别通过单纯吸附(单纯吸附组)和交联至BAM材料(交联组)后，0-7天的释放量的检测结果图。
从图2可以看出，前7天每个时间点交联组的VEGF释放速度要显著低于单纯吸附组，即交联组VEGF的释放速度明显低于单纯吸附组，交联组VEGF在BAM材料上的有效浓度明显高于单纯吸附组。其中，第7天交联组VEGF在BAM材料上的有效浓度比VEGF单纯吸附组高了300％。由此证明，本发明所述方法使得VEGF在BAM材料上的释放速度明显降低，VEGF在BAM材料上具有更好的体外缓释能力。
实施例5
VEGF/BAM促血管形成能力检测
选用6只200-220g雄性SD大鼠，用质量分数为1％的戊巴比妥向大鼠腹腔内注射麻醉(按体重40mg/kg),常规备皮、消毒、铺巾。在大鼠背部对称部位分别取左上、右上、左下、右下部，剪开全层皮肤，钝性分离组织，于皮下撑开三个口袋状的空间，分别填入实施例3制备的VEGF/BAM(交联组)、实施例4制备的VEGF(单纯吸附组)、PBS组(空白对照)，三者均以圆柱状形式填入，该圆柱的底面半径为0.5cm，高为2mm。1个月后取材，利用血管性假血友病因子抗体(anti-VWF)，采用免疫组织化学的方法检测血管形成能力。
图3为实施例5免疫组化对材料术后30天血管生成能力的检测(×200倍)。图3A为PBS组的免疫组化染色；图3B为VEGF单纯吸附组的免疫组化染色；图3C为VEGF交联组的免疫组化染色。
从图3可以看出，VEGF单纯吸附组和VEGF交联组均能够促进BAM材料内部的血管再生。与VEGF单纯吸附组相比，VEGF交联组更能有效促进血管再生。由此证明，本发明所述方法能够更有效的促进血管再生。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，本领域的普通技术人员应当理解，可以对技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (9)
1.一种膀胱脱细胞基质材料的表面修饰方法，其特征在于，具体步骤为：
A.膀胱脱细胞基质的制备：无菌条件下取哺乳动物整个或部分膀胱组织，加入浓度为5-15kIU/mL的抑肽酶溶液，于4℃条件下搅拌45-50h，抑肽酶溶液的体积为膀胱组织体积的10-15倍；接着将膀胱组织置于质量分数为0.9-1.1％的聚乙二醇辛基苯基醚溶液中于4℃条件下搅拌45-55h，聚乙二醇辛基苯基醚溶液的体积为膀胱组织体积的12-18倍；然后将膀胱组织置于DNA水解酶的浓度为48-53U/mL、RNA酶A的浓度为0.8-1.3U/mL的溶液中在4℃条件下搅拌21-25h，该溶液的体积为膀胱组织体积的15-25倍；用1×PBS缓冲液清洗三次，每次5min，在4℃条件下冷藏，再在真空条件下冷冻干燥并通过11-14kGyCo60辐照杀菌，然后置于-20℃条件下存放直至下一步使用；
B.血管内皮生长因子/膀胱脱细胞基质的制备：将浓度为2-3mg/mL的2-亚氨氢氯化硫醇溶液与步骤A制得的膀胱脱细胞基质在室温下孵育2h，所述2-亚氨氢氯化硫醇溶液的体积为步骤A制得的膀胱脱细胞基质的体积的15-25倍；用pH＝8.0并含4mmol/L的乙二胺四乙酸的PBS缓冲液清洗3次，每次5min；将浓度为0.08-0.12mg/mL的血管内皮生长因子溶液25mL与浓度为0.4-0.6mg/mL的4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐溶液40mL在室温下反应1h，反应后的溶液过脱盐柱；将过脱盐柱处理过的血管内皮生长因子-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐复合物加入经2-亚氨氢氯化硫醇处理过的膀胱脱细胞基质材料上，室温下孵育1h，用1×PBS缓冲液清洗三次，每次5min；在4℃条件下冷藏，再在真空条件下冷冻干燥。
2.根据权利要求1所述膀胱脱细胞基质材料的表面修饰方法，其特征在于：步骤A中所述抑肽酶溶液的浓度为10kIU/mL，体积为膀胱组织体积的12倍，在该溶液中的搅拌时间为48h。
3.根据权利要求1所述膀胱脱细胞基质材料的表面修饰方法，其特征在于：步骤A中所述聚乙二醇辛基苯基醚溶液的质量分数为1％，体积为膀胱组织体积的16倍，在该溶液中的搅拌时间为48h。
4.根据权利要求1所述膀胱脱细胞基质材料的表面修饰方法，其特征在于：步骤A中所述含有DNA水解酶和RNA酶A的溶液中DNA水解酶和RNA酶A的浓度分别为50U/mL和1U/mL，该溶液的体积为膀胱组织体积的18倍，在该溶液中的搅拌时间为24h。
5.根据权利要求1所述膀胱脱细胞基质材料的表面修饰方法，其特征在于：步骤A中所述Co60辐照杀菌的强度为12kGy。
6.根据权利要求1所述膀胱脱细胞基质材料的表面修饰方法，其特征在于：步骤A和步骤B中所述真空条件下冷冻干燥的温度为-10～-30℃，压力为10～12Pa。
7.根据权利要求1所述膀胱脱细胞基质材料的表面修饰方法，其特征在于：步骤B所述2-亚氨氢氯化硫醇溶液的浓度为2.5mg/mL，体积为步骤A制得的膀胱脱细胞基质的体积的20倍。
8.根据权利要求1所述膀胱脱细胞基质材料的表面修饰方法，其特征在于：步骤B所述血管内皮生长因子溶液的浓度为0.1mg/mL，4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐溶液的浓度为0.5mg/mL。
9.权利要求1-8任一项所述膀胱脱细胞基质材料的表面修饰方法在SD大鼠膀胱脱细胞基质材料的表面修饰中的应用。
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