CN109010927A - 一种可缓释生物活性因子的脱细胞牛心包基质的制备方法 - Google Patents

一种可缓释生物活性因子的脱细胞牛心包基质的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种可缓释生物活性因子的脱细胞牛心包基质的制备方法，具有这样的特征，包括以下步骤：步骤一，将牛心包置于非离子型去污剂缓冲液中真空冷冻2～6h；步骤二，将冷冻后的牛心包水浴溶解；步骤三，重复步骤一与步骤二1～10次；步骤四，将冻融后的牛心包置于非离子型去污剂缓冲液中在30～50℃震荡28～96h；步骤五，用无菌去离子水对牛心包清洗12～48h；步骤六，用磷酸盐溶液对牛心包荡清洗48～96h得到牛心包的脱细胞基质；步骤七，将脱细胞基质浸没在生物活性因子琼脂糖材料中20min～2h得到可缓释生物活性因子的脱细胞牛心包基质。

Description

一种可缓释生物活性因子的脱细胞牛心包基质的制备方法
技术领域
本发明涉及组织工程领域，具体涉及一种可缓释生物活性因子的脱细胞牛心包基质的制备方法。
背景技术
组织工程是将活细胞接种在组织基质上，制造出一种与受者组织相容性好，无免疫原性、不需抗凝、耐久性强的生物材料。其中，天然基质材料是组织工程研究的重要内容之一。理想的天然基质材料应具备以下优点：(1)良好的组织相容性，无生物毒性；(2)具有三维立体结构，材料需呈多孔海绵状，有利于细胞粘附浸润，以及营养物质的深入和代谢产物的排泄；(3)富含生物活性因子，为宿主细胞生长提供良好的微环境；(4)具有良好的机械性能，能抵抗体内血液等流体冲刷。
目前，组织工程基质材料主要分为人工高分子生物合成材料和天然基质材料两类。人工高分子生物合成材料组织相容性差、体内组织重塑不良，故限制了其广泛应用。而天然基质材料，例如牛心包因其来源广泛、具有良好的张力强度、易于塑形和缝合等优点，而广泛用于生物型人工心脏瓣膜、人工血管的制备以及各种组织器官缺损的修补材料。在当前的应用过程中，常用戊二醛对牛心包中的细胞和基质进行交联固定，以达到降低免疫原性、减轻异物反应、稳定胶原基质、增强抗酶解能力以及达到对材料进行消毒、保存的目的。尽管这种处理的牛心包在临床上已经获得很大成功，但戊二醛并不能完全封闭异种抗原，残留抗原所引起的免疫排斥反应以及戊二醛所致的钙化是导致构建组织器官失功、影响其临床使用寿命的主要原因之一。另外戊二醛具有生物毒性，导致宿主细胞不易生长，体内重塑性差。
因此，研发无免疫原性、组织相容性和力学性能优良，在结构上呈多孔海绵状、富含生物活性分子的牛心包基质材料对解决当前牛心包临床应用瓶颈至关重要。脱细胞是组织工程研究中降低移植组织免疫原性、保留移植物三维组织结构和生物力学性能的重要方法。其中，去污剂是最常用的脱细胞试剂，其可分为离子型和非离子型去污剂两种。虽然离子型去污剂能取得良好的脱细胞效果，但是残存毒性、易去除可溶性的生物活性因子、基质材料结构致密等导致细胞很难内生性生长，在宿主体内重塑效果不佳，这成为限制其处理临床组织标本的瓶颈。
发明内容
本发明是为了解决上述问题而进行的，目的在于提供一种可缓释生物活性因子的脱细胞牛心包基质的制备方法。
本发明提供了一种可缓释生物活性因子的脱细胞牛心包基质的制备方法，具有这样的特征，包括以下步骤：步骤一，在真空条件下，将牛心包置于非离子型去污剂缓冲液中冷冻2～6h；步骤二，冷冻结束后，将冷冻后的牛心包水浴溶解；步骤三，重复步骤一与步骤二1～10次，将牛心包进行多次冻融；步骤四，将多次冻融后的牛心包放置于非离子型去污剂缓冲液中，并在30～50℃摇床中处理震荡28～96h；步骤五，用无菌去离子水对震荡后的牛心包震荡清洗12～48h；步骤六，用磷酸盐溶液对无菌去离子水清洗后的牛心包荡清洗48～96h后，得到牛心包的脱细胞基质；步骤七，将脱细胞基质浸没在生物活性因子琼脂糖材料中20min～2h，得到可缓释生物活性因子的脱细胞牛心包基质，其中，非离子型去污剂缓冲液包括Tris缓冲液、非离子型去污剂以及脱氧胆酸钠，Tris缓冲液的浓度范围为8～12mmol/L，PH值为7.4～7.8，非离子型去污剂在Tris缓冲液的体积分数范围为0.8％～1.5％W/V，脱氧胆酸钠在Tris缓冲液的体积分数范围为0～0.8％W/V。
在本发明提供的可缓释生物活性因子的脱细胞牛心包基质的制备方法中，还可以具有这样的特征：其中，在步骤七中，生物活性因子琼脂糖材料中的生物活性因子为具有生物活性的生长因子。
在本发明提供的可缓释生物活性因子的脱细胞牛心包基质的制备方法中，还可以具有这样的特征：其中，在步骤七中，生物活性因子琼脂糖材料中的生物活性因子的浓度范围为2.0～12.0μg/ml。
在本发明提供的可缓释生物活性因子的脱细胞牛心包基质的制备方法中，还可以具有这样的特征：其中，去污剂为聚乙二醇辛基苯基醚。
在本发明提供的可缓释生物活性因子的脱细胞牛心包基质的制备方法中，还可以具有这样的特征：其中，在步骤二中，水浴的温度为30～50℃。
在本发明提供的可缓释生物活性因子的脱细胞牛心包基质的制备方法中，还可以具有这样的特征：其中，Tris缓冲液的浓度为10mmol/L，PH值为7.6。
在本发明提供的可缓释生物活性因子的脱细胞牛心包基质的制备方法中，还可以具有这样的特征：其中，在步骤一中，牛心包的冷冻时间为4～5h。
在本发明提供的可缓释生物活性因子的脱细胞牛心包基质的制备方法中，还可以具有这样的特征：其中，在步骤五中，去离子水的震荡清洗时间为24～36h。
在本发明提供的可缓释生物活性因子的脱细胞牛心包基质的制备方法中，还可以具有这样的特征：其中，在步骤六中，磷酸盐溶液的震荡清洗时间为72h。
发明的作用与效果
根据本发明所涉及的可缓释生物活性因子的脱细胞牛心包基质的制备方法，因为该制备方法中以牛心包为研究对象，采用非离子型去污剂作为缓冲液进行真空冷冻，然后水浴溶解，将牛心包经过多次冻融之后放置在非离子型去污剂缓冲液中震荡，最后分别用去离子水以及磷酸盐溶液对震荡后的牛心包进行震荡清洗得到牛心包的脱细胞基质，并在此基础上，以无生物毒性的琼脂糖为媒介制备可缓释生物活性因子的脱细胞牛心包基质，所以，本发明的制备方法得到的脱细胞牛心包基质具有微孔样结构、力学性能优良，可缓释生物活性因子，且无毒性，促进宿主干细胞粘附、血管新生，抑制纤维母细胞分化，可用于生物型人工心脏瓣膜、人工血管的制备以及各种组织器官缺损的修补材料，且体内重塑性好。
另外，由于本制备方法是以牛心包为研究对象，因此，本制备方法的成本低廉，节省了数亿元的宝贵的医疗资源，为其临床应用及脱细胞基质的优化研发提供了实验依据和指针。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，以下结合实施例对本发明可缓释生物活性因子的脱细胞牛心包基质的制备方法作具体阐述。
可缓释生物活性因子的脱细胞牛心包基质的制备方法主要包括以下步骤：
步骤一，在真空条件下，将牛心包置于非离子型去污剂缓冲液中冷冻2～6h，非离子型去污剂缓冲液包括：Tris缓冲液、非离子型去污剂以及脱氧胆酸钠。非离子型去污剂为聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)。Tris缓冲液的浓度范围为8～12mmol/L，PH值为7.4～7.8，Triton X-100在Tris缓冲液的体积分数范围为0.8％～1.5％W/V，脱氧胆酸钠在Tris缓冲液的体积分数范围为0～0.8％W/V。在本实施例中，Tris缓冲液、Triton X-100以及脱氧胆酸钠的配比为：Tris缓冲液的浓度为10mmol/L、PH为7.6，每100mL的Tris缓冲液中加入0.8～1.5mLTritonX-100和0.1～0.5g的脱氧胆酸钠。牛心包在非离子型去污剂缓冲液中的冷冻时间为4～5h。
步骤二，冷冻结束后，将冷冻后的牛心包放置在温度为30～50℃的水浴中溶解。
步骤三，重复步骤一与步骤二1～10次，将牛心包进行多次冻融。
步骤四，将多次冻融后的牛心包从非离子型去污剂缓冲液中取出，然后放置于新的非离子型去污剂缓冲液中，并在30～50℃摇床中处理震荡28～96h。
步骤五，用无菌去离子水对震荡后的牛心包震荡清洗12～48h。在本实施例中，无菌去离子水对牛心包的震荡清洗时间为24～36h，优选震荡时间为24h。
步骤六，用磷酸盐溶液对无菌去离子水清洗后的牛心包震荡清洗48～96h后，得到牛心包的脱细胞基质。在本实施例中，磷酸盐溶液对牛心包的震荡清洗时间为72h。
步骤七，将牛心包的脱细胞基质浸没在生物活性因子琼脂糖材料中20min～2h，得到可缓释生物活性因子的脱细胞牛心包基质。生物活性因子琼脂糖材料为含有生物活性因子的琼脂糖材料，其中，生物活性因子为具有生物活性的生长因子。在本实施例中，该生长因子为人重组碱性成纤维细胞生长因子(Human recombinant basic fibroblast growthfactor,HrbFGF)。生物活性因子的浓度范围为2.0～12.0μg/ml。
本实施例所得的可缓释生物活性因子的脱细胞牛心包基质的结构和性能特征分两步骤验证。
在验证步骤一中，以非离子型去污剂缓冲液处理方法得到的脱细胞牛心包基质为实验组，以离子型去污剂缓冲液(含1％(W/V)十二烷基硫酸钠、0.5％(W/V)脱氧胆酸钠的Tris缓冲液)处理方法得到的脱细胞牛心包基质为对照组，检测两组脱细胞牛心包基质的结构和生物力学特征，其得到结果如下：
(一)本实施例所涉及的方法能有效去除牛心包细胞核材料，形成多孔海绵状结构
病理H&E染色表明，实验组和对照组方法均能去除细胞。
DNA定量检测结果为：实验组的DNA含量为608.3±67.5ng/mg湿重组织；对照组的DNA含量为754.7±73.5ng/mg湿重组织。DNA定量检测表明，与离子型去污剂缓冲液处理方法相比，本实施例所涉及的方法能更有效去除牛心包组织中的核材料(P<0.05)。
扫描电镜表明，本实施例所涉及的方法处理的组织形成连续的微孔样结构，而对照方法处理组织也能形成微孔样结构，但是孔壁断裂。
(二)本实施例所涉及的方法能保持牛心包的生物力学性能和三维结构
弹力胶原染色表明，本实施例所涉及的方法处理的牛心包细胞外基质结构完整，而对照组所采用方法破坏猪主动脉细胞外基质，部分区域胶原弹力断裂。
生物力学检测结果如表1所示，该检测结果表明，与正常牛心包相比，实验组牛心包的最大载荷、最大应力及弹性模量与正常牛心包无明显区别(P>0.05)。但是对照组却显著降低牛心包最大载荷、最大应力及弹性模量(P<0.05)。
表1
正常 实验组 对照组
弹性模量(MPa) 14.9±2.3 16.7±4.7 1.6±0.2
最大应力(MPa) 15.6±1.7 18.6±4.8 3.3±0.8
最大载荷(N) 88.2±10.9 97.0±28.1 37.9±9.8
在验证步骤二中，将非离子型去污剂缓冲液处理方法得到的脱细胞牛心包基质包被生物活性因子，并作为实验组；未包被生物活性因子的脱细胞牛心包基质作为对照组；检测两组脱细胞牛心包基质在动物体内的性能特征，其得到结果如下：
(一)在动物体内，本实施例所涉及的方法处理的能缓释生物活性因子的脱细胞牛心包基质能促进间充质干细胞的粘附生长。在第1天，实验组中的CD29阳性、CD45阴性的间充质干细胞的数量为78.7±23.7个/高倍镜视野，而对照组中间充质干细胞的数量则为46.3±25.5个/高倍镜视野。两组相比具有明显的统计学意义(P<0.05)。
(二)在动物体内，本实施例所涉及的方法处理的能缓释生物活性因子的脱细胞牛心包基质能抑制肌纤维母细胞分化。在第28天，实验组中肌纤维母细胞的数量为8.0±5.8个/高倍镜视野，而对照组中肌纤维母细胞的数量则为39.5±18.0个/高倍镜视野。两组相比具有明显的统计学意义。
(三)在动物体内，本实施例所涉及的方法处理的能缓释生物活性因子的脱细胞牛心包基质能促进血管新生。在第28天，实验组中微血管数量为34.7±14.3个/高倍镜视野，而对照组中微血管数量则为16.7±10.6个/高倍镜视野。两组相比具有明显的统计学意义。
实施例的作用与效果
根据本发明所涉及的可缓释生物活性因子的脱细胞牛心包基质的制备方法，因为该制备方法中以牛心包为研究对象，采用非离子型去污剂作为缓冲液进行真空冷冻，然后水浴溶解，将牛心包经过多次冻融之后放置在非离子型去污剂缓冲液中震荡，最后分别用去离子水以及磷酸盐溶液对震荡后的牛心包进行震荡清洗得到牛心包的脱细胞基质，并在此基础上，以无生物毒性的琼脂糖为媒介制备可缓释生物活性因子的脱细胞牛心包基质，所以，本发明的制备方法得到的脱细胞牛心包基质具有微孔样结构、力学性能优良，可缓释生物活性因子，且无毒性，促进宿主干细胞粘附、血管新生，抑制纤维母细胞分化，可用于生物型人工心脏瓣膜、人工血管的制备以及各种组织器官缺损的修补材料。
另外，由于本制备方法是以牛心包为研究对象，因此，本制备方法的成本低廉，节省了数亿元的宝贵的医疗资源，为其临床应用及脱细胞基质的优化研发提供了实验依据和指针。
此外，在上述实施例中，因为采用的非离子型去污剂缓冲液中包括Tris缓冲液、非离子型的Triton X-100以及脱氧胆酸钠，所以，本发明的制备方法生物毒性低，能够有效保留牛心包的三维结构及生物力学性能。
另外，本实施例中的制备方法能够促进牛心包形成多孔海绵状结构，该多孔海绵状结构能够促进非离子型去污剂侵入组织内部去除细胞，进而能够有效地去除牛心包的细胞及核材料，降低免疫原性、促进宿主细胞内生性生长。
不仅如此，通过上述实施例得到的牛心包的脱细胞基质释放的生物活性因子能够促进间充质干细胞粘附、血管新生，并抑制纤维母细胞分化、减少后期组织纤维化的风险。
上述实施方式为本发明的优选案例，并不用来限制本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种可缓释生物活性因子的脱细胞牛心包基质的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一，在真空条件下，将牛心包置于非离子型去污剂缓冲液中冷冻2～6h；
步骤二，冷冻结束后，将冷冻后的所述牛心包水浴溶解；
步骤三，重复步骤一与步骤二1～10次，将所述牛心包进行多次冻融；
步骤四，将多次冻融后的所述牛心包放置于非离子型去污剂缓冲液中，并在30～50℃摇床中处理震荡28～96h；
步骤五，用无菌去离子水对震荡后的所述牛心包震荡清洗12～48h；
步骤六，用磷酸盐溶液对无菌去离子水清洗后的所述牛心包荡清洗48～96h后，得到牛心包的脱细胞基质；
步骤七，将所述脱细胞基质浸没在生物活性因子琼脂糖材料中20min～2h，得到可缓释生物活性因子的脱细胞牛心包基质，
其中，所述非离子型去污剂缓冲液包括：Tris缓冲液、非离子型去污剂以及脱氧胆酸钠，
所述Tris缓冲液的浓度范围为8～12mmol/L，PH值为7.4～7.8，
所述非离子型去污剂在所述Tris缓冲液的体积分数范围为0.8％～1.5％W/V，
所述脱氧胆酸钠在所述Tris缓冲液的体积分数范围为0～0.8％W/V。
2.根据权利要求1所述的可缓释生物活性因子的脱细胞牛心包基质的制备方法，其特征在于：
其中，在步骤七中，所述生物活性因子琼脂糖材料中的生物活性因子为具有生物活性的生长因子。
3.根据权利要求1所述的可缓释生物活性因子的脱细胞牛心包基质的制备方法，其特征在于：
其中，在步骤七中，所述生物活性因子琼脂糖材料中的生物活性因子的浓度范围为2.0～12.0μg/ml。
4.根据权利要求1所述的可缓释生物活性因子的脱细胞牛心包基质的制备方法，其特征在于：
其中，所述去污剂为聚乙二醇辛基苯基醚。
5.根据权利要求1所述的可缓释生物活性因子的脱细胞牛心包基质的制备方法，其特征在于：
其中，在步骤二中，所述水浴的温度为30～50℃。
6.根据权利要求1所述的可缓释生物活性因子的脱细胞牛心包基质的制备方法，其特征在于：
其中，所述Tris缓冲液的浓度为10mmol/L，PH值为7.6。
7.根据权利要求1所述的可缓释生物活性因子的脱细胞牛心包基质的制备方法，其特征在于：
其中，在步骤一中，所述牛心包的冷冻时间为4～5h。
8.根据权利要求1所述的可缓释生物活性因子的脱细胞牛心包基质的制备方法，其特征在于：
其中，在步骤五中，所述去离子水的震荡清洗时间为24～36h。
9.根据权利要求1所述的可缓释生物活性因子的脱细胞牛心包基质的制备方法，其特征在于：
其中，在步骤六中，所述磷酸盐溶液的震荡清洗时间为72h。
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