CN100462105C - 一种重组合神经替代物的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种重组合神经替代物的制备方法，本发明是以异种动物去细胞神经为支架，注入复合有神经营养因子的控制释放微球，构成重组合神经替代物，并建立有利于神经再生的微环境，促进神经再生。本发明具有制备周期短、成本低、材料来源广泛、方法简便、易于操作的优点；使所获得的重组合神经替代物具有良好的三维空间结构，低免疫排斥反应，重建神经再生的微环境，可以达到保护神经元，引导轴突再生的效果，在医用生物材料技术领域用于修复周围神经缺损，具有广阔的应用前景。

Description

一种重组合神经替代物的制备方法

技术领域

本发明属于组织工程技术领域，具体涉及一种用于修复周围神经缺损的重组合神经替代物的制备方法。

背景技术

周围神经缺损后的再生和功能恢复一直是神经科学领域的热门问题。由于周围神经结构和功能上的特殊性，大多数情况下无法直接对拉吻合，因此必须寻找一种神经替代物来修复缺损。自体神经移植是目前治疗周围神经缺损的“金标准”，然而由于自体神经来源严重不足，并会造成供区的感觉障碍，这使得其在临床使用中受到了限制。因此人们研究的重点已着眼于使用人工神经替代物来引导周围神经再生。

异体或异种神经具有轴突生长所需的正常细胞外基质支架，故被认为是修复神经缺损的理想材料，其优越性表现在：①去细胞神经具有完全仿真的三维结构，由空的神经基底膜管和管之间的胶原纤维构成，这种结构为神经纤维再生提供了比较理想的三维空间。②去细胞神经与机体有良好的相容性，故被认为是修复神经缺损的理想材料。但由于其明显的免疫原性，会产生免疫排斥导致移植失败。研究发现周围神经的结构组成中，异体或异种神经的抗原性主要存在于雪旺细胞及其形成的髓鞘(Ansselin AD，Pollard JD.Immunopathological factors in peripheral nerve allograftrejection：quantificationof lymphocyte invasion and major histocompatibility complex expression.J Neurol Sci.1990Apr；96(1)：75-88.)，而胶原蛋白抗原性则非常弱，这使得去细胞的异体或异种神经的临床应用成为可能。

去细胞神经保留了很多细胞外基质，神经基底膜中有丰富的层粘连蛋白，这对种子细胞的粘附、迁移和再生轴突的生长有积极作用；另一方面，神经处理后髓鞘等主要抗原成分被清除，异种去细胞神经移植将不会引起明显的排斥反应，大大扩充了组织工程化神经支架的来源。由此可见，去细胞神经具有良好的空间结构和相容性，作为构建组织工程化神经的支架，比目前常用的可降解高分子支架更具优越性。

周围神经再生的成功还有赖于一个适宜的微环境，神经再生微环境通常包括神经损伤后两断端及其间隙中所含的促进神经纤维生长的细胞成分、细胞外基质成分和神经营养物质等。由Lundborg(Lundborg G，Hansson HA.Nerve regeneration through preformed pseudosynovial tubes.A preliminary report of a newexperimental model for studying the regeneration and reorganization capacity of peripheralnerve tissue.J Hand Surg.1980 Jan；5(1)：35-8.)最早提出的周围神经再生室模型具有封闭特点，可防止再生微环境成分的外溢，由此收集而来的神经再生液即成为研究周围神经再生微环境的公认的良好工具。神经再生液的主要成份是血浆、神经内液、轴浆和细胞分泌合成的神经营养因子，对神经再生起营养诱导作用，生物活性从术后3天开始表达，术后2周明显增强，术后3周达到高峰。因此提取再生液中的有效成分添加到神经支架中，可以重建神经再生微环境，利于神经的再生。

中国专利申请(200410027222.9)公开了一种组织工程化周围神经移植物，该发明所述的组织工程化周围神经移植物，包括用于连接神经两断端的支架和具有促进神经再生功能的种子细胞，种子细胞附着于支架上，形成具有仿神经三维结构和生物活性的复合体。所述的支架为去细胞异体神经，其种子细胞是由成体干细胞经体外诱导而成的类许旺细胞。其主要缺点是：①未阐明成体干细胞经体外如何诱导成为类许旺细胞，是否在体内发挥许旺细胞的功能，临床疗效未说明；②未阐明添加的生长因子的作用方式，支架中的生长因子在没有保护的情况下会很快失活，而一般神经的再生周期都比较长，这种情况下生长因子的作用难以发挥；③支架材料使用同种异体神经(取自尸体)，其来源受到限制；④说明书中无具体操作方法，一般技术人员难以重复。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明目的在于提供一种重组合神经替代物的制备方法，具有制备周期短、成本低、材料来源广泛、方法简便、易于操作的优点；使所获得的重组合神经替代物具有良好的三维空间结构、低免疫排斥反应、重建神经再生的微环境，可以达到保护神经元、引导轴突再生的效果。

本发明提出的重组合神经替代物的制备方法，包括去细胞神经支架的制备、神经营养因子控释微球的制备和重组合神经替代物的制备，具体操作步骤如下：

1)去细胞神经支架的制备

取健康哺乳动物的周围神经，去除表面的组织后用无菌生理盐水冲洗，用高渗盐溶液浸泡，再用无菌蒸馏水和磷酸盐缓冲液依次反复浸洗(磷酸盐缓冲液内含有蛋白酶抑制物效果更好)，然后用含有过氧乙酸、乙二胺四乙酸和曲拉通X200的磷酸盐缓冲液浸泡以去除神经内所有的细胞成分，再用戊二醛溶液浸泡10～30分钟以促进基质交联和降低抗原性，以磷酸盐缓冲液清洗后经辐射照射得到去细胞神经支架，4℃保存备用。

2)神经营养因子控制释放微球的制备

利用可降解材料(包括甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐、聚乳酸、聚羟基乙酸、明胶等)制备纳米微球(Fa-ming Chen，et al.Preparation and biologicalcharacteristics of recombinant human bone morphogenetic protein-2-loadeddextran-co-gelatin hydrogenl microspheres，in vitro and in vivo.Pharmacology.2005；75：133-144.)；另构建神经再生室(Lundborg G，Hansson HA.Nerve regenerationthrough preformed pseudosynovial rtubes.A preliminary report of a new experimental modelfor studying the regeneration and reorganization capacity of peripheral nerve tissue.J HandSurg[Am].1980 Jan；5(1)：35-8.)从中提取神经营养因子，将其与纳米微球混合，使神经营养因子吸附到纳米微球内部，冻干后即形成复合有神经营养因子的控制释放微球。

3)重组合神经替代物的制备

将I型胶原凝胶溶液冰浴下调节pH至7.2-7.4，加入复合有神经营养因子的纳米微球，混匀后将其注入去细胞神经支架中，待形成凝胶后，冷冻干燥即形成重组合神经替代物。

本发明所制备的重组合神经替代物具有良好的三维结构，这种结构能为细胞的附着提供理想的三维空间；同时还具有良好的生物相容性，由于去除了易引起免疫排斥反应的雪旺细胞、髓鞘等成分，几乎不引起免疫排斥反应。本发明采用高渗、复合处理液溶解的方法联合使用，可以脱掉神经内的细胞成分，保留细胞外基质(ECM)构成的基底膜管的形态结构，从而降低其抗原性。本发明的重组合神经替代物还可以防止局部神经营养因子的流失；利于附近循环系统的细小微血管长入再生神经。

本发明中的神经营养因子由控制释放微球来释放。在神经导管中加入营养因子的主要作用是：重建神经再生的微环境、维持神经元的存活、引导神经轴突的再生。通常直接使用营养因子会由于体内的环境而失活，达不到期望的生物效应，而且持续作用时间短。因此本发明使用复合有神经营养因子的纳米控制释放微球，可使释放持续较长时间，保持神经营养因子的浓度，使其持续发挥作用。控制释放微球采用生物可降解材料复合神经营养因子，使神经营养因子随着材料的降解而逐渐释放，进入机体发挥其生物作用，因此神经营养因子的生物作用能够维持相当长的时间，从而实现对神经营养因子的控制释放。本发明所述的神经营养因子与纳米微球混合的重量比为0.1～2.0％；所述的神经营养因子控制释放微球的直径在10nm～10μm之间，降解时间为30天～150天，是根据神经缺损的长度进行调整：缺损越长，降解时间越长，要求微球直径越大。

本发明与现有技术相比其优点在于：采用异种动物的去细胞神经，大大扩展了支架材料的来源，解决了去细胞神经的来源问题，并避免了伦理学的难题；对神经营养因子实现控制释放，利于神经营养因子长时间的发挥作用，可以起到保护神经元、促进神经轴突再生的作用，能够修复较长距离的神经缺损；并具有制备周期短、成本低、材料来源广泛、方法简便、易于操作的优点；所得重组合神经替代物具有良好的三维空间结构、低免疫排斥反应、重建神经再生的微环境，能达到保护神经元、引导轴突再生的效果。动物实验表明，本发明制备的重组合神经替代物可有效的修复大鼠10mm、犬30mm的坐骨神经缺损。为临床治疗提供了可行方案。

附图及其说明

附图1为本发明制备的重组合神经替代物照片；其中A为大体照片；B为电子扫描显微照片。附图2为本发明制备的神经营养因子控制释放微球的电子扫描显微照片。附图3为用本发明制备的重组合神经替代物修复SD大鼠坐骨神经缺损的效果照片；其中A为术中使用重组合神经替代物修复10mm坐骨神经缺损的照片；B为术后16周的照片，缺损的神经外观已经恢复。附图4为用本发明制备的重组合神经替代物修复犬坐骨神经缺损的效果照片；其中A为术中使用重组合神经替代物修复30mm坐骨神经缺损的照片；B为术后6个月的照片，缺损的神经外观已经恢复。

具体实施方式

以下结合具体实施例将本发明作进一步说明。

1)去细胞神经支架的制备

取健康猪、牛、狗等哺乳动物的周围神经，手术显微镜下去除表面组织后，用无菌生理盐水冲洗，再用1M的NaCL溶液常温下浸泡12小时，再用无菌蒸馏水和0.01M的磷酸盐缓冲液依次反复浸洗，缓冲液内含0.035mM的苯甲基磺酰氟化物(蛋白酶抑制物)，然后用内含有0.15％过氧乙酸、0.01％EDTA(乙二胺四乙酸)和1％曲拉通X200的磷酸盐缓冲液(m/v)，在4±2℃条件下浸泡3天，最好加以振荡，以充分去除神经内所有细胞成分；再用0.01M磷酸盐缓冲液反复浸洗后，用0.5％浓度的戊二醛溶液浸泡30分钟，清洗后经⁶⁰Co照射后，4℃保存备用。

2)复合神经营养因子的提取

将York猪麻醉后暴露坐骨神经，于梨状肌下缘5mm截断，缝接入50mm硅胶管中，其中近端伸入管中5mm，远端进入5mm，形成神经再生室，关闭创面。分别在7天、14天、21天后使用注射器吸取硅胶管内液体，-4℃下10000g离心取上清，-80℃下储存备用。使用凝胶层析柱(Sephacryl S-200)连接到蛋白层析系统(AKTA prime)，用0.01M磷酸盐缓冲液平衡凝胶柱，取5ml神经再生液样品(上清液)上柱，用0.01M磷酸盐缓冲液洗脱，流速5ml/min，按峰自动收集，得到2个蛋白峰，收集第二个蛋白洗脱液，真空冷冻干燥，即得到神经再生微环境内的复合神经营养因子。

3)神经营养因子控制释放微球的制备

将10g右旋糖苷和2g 4-二甲基氨基吡啶溶解在90ml的二甲基亚砜中，加入1.46g的甲基丙烯酸缩水甘油酯，搅拌24小时；再加入等体积乙醇搅拌、抽滤，将得到的沉淀物于4℃下溶于20ml的蒸馏水中，透析、冻干，得到甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖苷(dex-GMA)，再将其溶于磷酸盐缓冲液后备用；另外以二甲苯为水相，加入乳化剂(吐温80)，其浓度为0.1～5％(v/v)，搅拌并通入氮气，滴加入1.2g的dex-GMA，再加入100～200mg四甲基乙二胺，以200～600r/min的速率搅拌，即可形成微球。微球也可参照文献(载rhBMP2凝胶微球控释系统的设计与合成实验.陈发明等.实用口腔医学杂志.200521(2)：175)所载方法制备。冻干后，称取100mg微球溶胀于10ml蒸馏水中，再加入1mg复合神经营养因子，0℃下放置2天、经冻干后，即形成复合有神经营养因子的控制释放微球。

4)重组合神经替代物的构建方法

I型胶原凝胶溶液在冰浴下加入1/10体积的胎牛血清、10mg/ml浓度的DMEM培养基，调节pH值至7.3，然后添加所制备的神经营养因子纳米微球，使其终浓度达到100mg/ml，混匀后将其注入去细胞神经支架，注入量约20μl/10mm的去细胞神经支架，待其形成凝胶后，无菌条件下4℃保存备用。

5)用重组合神经替代物修复SD大鼠坐骨神经缺损

使用重组合神经替代物桥接SD大鼠10mm坐骨神经缺损，16周后通过免疫组化、电生理、透射电镜、辣根过氧化物酶逆行示踪等方法检测神经再生及坐骨神经功能恢复情况。(见附图3)发现神经纤维排列整齐、数目多，神经纤维粗大、髓鞘厚，束间结缔组织少，再生髓鞘内板层致密，髓鞘明显增厚，轴浆内富含神经微丝和微管，电生理可以检测到坐骨神经混合动作电位，坐骨神经功能指数显示坐骨神经功能已经大部分恢复。

6)用重组合神经替代物修复犬坐骨神经缺损

使用重组合神经替代物桥接犬30mm坐骨神经缺损，6个月后通过免疫组化、电生理、透射电镜、辣根过氧化物酶逆行示踪等方法检测神经再生及坐骨神经功能恢复情况。(见附图4)发现神经纤维排列整齐、数目多，神经纤维粗大，髓鞘厚，束间结缔组织少，再生髓鞘内板层致密，髓鞘明显增厚，轴浆内富含神经微丝和微管，电生理可以检测到坐骨神经混合动作电位，坐骨神经功能指数显示坐骨神经功能已经大部分恢复。

Claims (2)

1.一种重组合神经替代物的制备方法，其特征在于，是按以下操作步骤制备：

1)去细胞神经支架的制备将哺乳动物的周围神经去除表面组织后，用无菌生理盐水冲洗，再用高渗盐溶液浸泡后，用无菌蒸馏水和磷酸盐缓冲液依次反复浸洗，然后用含有0.15％重量体积比的过氧乙酸、0.01％重量体积比的乙二胺四乙酸和1％重量体积比的曲拉通X200的磷酸盐缓冲液浸泡去除神经内细胞成分，再用0.5％浓度的戊二醛溶液浸泡10～30分钟，以磷酸盐缓冲液清洗后经辐射照射得到去细胞神经支架，4℃保存备用；

2)神经营养因子控制释放微球的制备利用可降解材料制备纳米微球，其直径在10nm～10μm之间；另构建神经再生室，从中提取神经营养因子，将其与纳米微球混合，混合的重量比为0.1～2.0％，使神经营养因子吸附到纳米微球内部，冻干后即形成复合有神经营养因子的控制释放微球；

3)重组合神经替代物的制备将I型胶原凝胶溶液在冰浴下调节pH值至7.2-7.4，加入复合有神经营养因子纳米微球，终浓度为100mg/ml，混匀后将其注入去细胞神经支架中，形成凝胶后，冷冻干燥后即形成重组合神经替代物。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在高渗盐溶液浸泡后，用于浸洗的磷酸盐缓冲液内含有蛋白酶抑制物。

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