CN106606804A - 一种制备复合结构的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物学，再生医学，生物打印(例如3D生物打印)，组织工程学等技术领域。特别地，本发明提供了一种制备包含至少两种细胞的复合结构的方法，以及通过该方法获得的复合结构。特别优选地，本发明的复合结构是包含骨和软骨的复合结构，或者包含内皮细胞和平滑肌细胞的复合结构。因此，本发明提供了一种制备包含骨细胞和软骨细胞的复合结构的方法，和一种制备包含内皮细胞和平滑肌细胞的复合结构的方法，以及通过所述方法获得的复合结构。此外，本发明还涉及所获得的复合结构的各种应用。

Description

一种制备复合结构的方法
技术领域
本发明涉及生物学，再生医学，生物打印(例如3D生物打印)，组织工程学等技术领域。特别地，本发明提供了一种制备包含至少两种细胞的复合结构的方法，以及通过该方法获得的复合结构。特别优选地，本发明的复合结构是包含骨和软骨的复合结构，或者包含内皮细胞和平滑肌细胞的复合结构。因此，本发明提供了一种制备包含骨细胞和软骨细胞的复合结构的方法，和一种制备包含内皮细胞和平滑肌细胞的复合结构的方法，以及通过所述方法获得的复合结构。此外，本发明还涉及所获得的复合结构的各种应用。
背景技术
关节软骨的活力状态是关节维持其结构和功能的关键。关节软骨的缺失，将引起关节炎并极大限制关节的功能。关节软骨由于缺乏血管，且软骨细胞不能自主迁移、成熟软骨细胞不能增殖等，因此即便受到轻微损伤也难以自行愈合。
临床上软骨缺损常伴有软骨下骨的缺损。近年来，研究人员试图使用人工软骨对人体受损软骨进行修复或替换，但是通过长期研究发现，单纯的人工软骨在植入体内后，由于软骨-骨界面难以快速融合，使得植入的人工软骨与周围骨组织无法完全整合，甚至出现移位、脱出的情况，导致修复失败。已有研究表明，骨-骨的结合比软骨-骨的结合更加快速和牢固，因此在修复软骨缺损时，应同时考虑软骨下骨的修复，即构建同时带有软骨组织和骨组织的人工植入物。
间充质干细胞(MSC)是组织工程构建骨组织或软骨组织常用的种子细胞，研究人员通过在培养基中添加0.1μM地塞米松、0.05mM抗坏血酸(AA)、以及10mM甘油磷酸，将MSCs诱导分化为成骨细胞；通过添加10ng/ml TGF-β3、100nM地塞米松、50μg/ml的2-磷酸抗坏血酸、100μg/ml丙酮酸钠、40μg/ml脯氨酸以及胰岛素-转铁蛋白-硒溶液(ITS+,Collaborative Biomedical,Bedford,MA,USA)，将MSCs诱导分化为成软骨细胞。在支架复合细胞的技术方法上，常见的选择包括：1、使用支架复合种子细胞构建骨组织，同时将形成软骨组织的种子细胞直接种植在骨组织支架上方形成软骨组织；2、分别用支架附和种子细胞的方法形成骨组织和软骨组织，再将两种组织进行整合成为复合型植入物；3、在单一种类或复合型支架表面同时种植形成骨组织和软骨组织的种子细胞，通过体外培养形成骨、软骨复合型植入物；4、在含有不同诱导分化因子的双层支架材料中植入同种祖源细胞后置于特制的单腔或双腔生物反应器中复合培养。
虽然相关技术已经经历了多年的发展，但是仍存在显著不足：1、MSCs诱导分化的培养过程非常繁琐，将MSCs诱导分化为不同种类细胞时，需要不同的培养体系。2、需要先对MSCs进行扩增培养，进而诱导分化，再将分化后的细胞与支架材料相复合，最终再通过体内、外培养形成完整的人工植入物。整个培养过程耗费时间长，极大的增加了污染的风险。3、使用将种子细胞种植于支架材料表面的方法构建人工植入物，难以对生长在材料表面的细胞进行精确排布，从而导致形成的人工植入物结构混乱，功能不足。
发明概述
为了解决上述技术问题，本申请发明人开发了一种构建复合人工组织植入物(特别是包含骨和软骨的复合人工组织植入物，或者包含内皮细胞和平滑肌细胞的复合结构)的新型技术方法。该方法无需将种子细胞种植至材料支架的操作过程，而是直接使用包含细胞的微囊(例如包含MSC细胞的微囊)来构建人工植入物。同时，该方法在操作细胞(例如MSC细胞)之前无需预先对细胞进行体外大量增殖；相反地，该方法在将包含细胞的微囊构建成人工植入物后，其所包含的细胞直接在微囊内大量增殖并最终形成完整植入物。此外，该方法无需多种培养体系；相反地，该方法能够在同一个培养体系下同时培养多种微囊，并使得微囊中的细胞增殖和/或分化为所需的各种目的细胞(例如，该方法能够在同一个培养体系下同时诱导MSCs分别分化为成骨细胞和成软骨细胞，或者同时诱导MSCs分别分化为内皮细胞和平滑肌细胞)。最后，通过对包含细胞的微囊的精确排布，该方法能够实现多种目的细胞(例如成骨细胞和成软骨细胞，例如内皮细胞和平滑肌细胞)的精确排布，并最终形成结构功能完整的人工植入物(例如，包含骨细胞和软骨细胞的复合结构，或者包含内皮细胞和平滑肌细胞的复合结构)。
因此，在一个方面，本发明提供了一种制备包含m种细胞的复合结构的方法，其中，m为≥2的整数，所述方法包括：
(1)提供m种包含细胞的微囊，其中，每种微囊各自对应于复合结构中的一种细胞，即，每种微囊各自包含复合结构中的一种细胞，和/或能够分化为复合结构中的该种细胞的干细胞；
(2)提供所述复合结构的细胞分布信息；
(3)基于所述复合结构的细胞分布信息，对所述m种微囊进行排布，以制备构建体；
(4)培养步骤(3)获得的构建体，产生所述复合结构。
在本发明的某些优选实施方案中，所述复合结构是包含骨细胞和软骨细胞的复合结构。在某些优选的实施方案中，所述方法包括：
(1)提供两种包含细胞的微囊，其中，第一微囊包含MSC细胞，以及诱导MSC向成骨细胞或骨细胞分化的诱导因子；并且，第二微囊包含MSC细胞，以及诱导MSC向成软骨细胞或软骨细胞分化的诱导因子；
(2)提供包含骨细胞和软骨细胞的复合结构的细胞分布信息；
(3)基于所述复合结构的细胞分布信息，对所述第一微囊和第二微囊进行排布，以制备构建体；
(4)培养步骤(3)获得的构建体，产生所述复合结构。
在某些优选的实施方案中，所述微囊(例如第一微囊和/或第二微囊)包含细胞(例如MSC细胞)，和包裹所述细胞的核层，其中所述核层由生物可降解材料制成。在某些优选的实施方案中，所述微囊还包含封装所述核层的壳层，其中所述壳层由生物可降解材料制成。
在本发明的某些优选实施方案中，所述复合结构是包含内皮细胞和平滑肌细胞的复合结构。在某些优选的实施方案中，所述方法包括：
(1)提供两种包含细胞的微囊，其中，第一微囊包含MSC细胞和内皮细胞；并且，第二微囊包含MSC细胞和平滑肌细胞；
(2)提供包含内皮细胞和平滑肌细胞的复合结构的细胞分布信息；
(3)基于所述复合结构的细胞分布信息，对所述第一微囊和第二微囊进行排布，以制备构建体；
(4)培养步骤(3)获得的构建体，产生所述复合结构；
优选地，所述微囊(例如第一微囊和/或第二微囊)包含细胞(例如MSC细胞，以及内皮细胞或平滑肌细胞)，包裹细胞的核层，和，任选地，封装所述核层的壳层；优选地，所述核层和任选的壳层各自独立地由生物可降解材料制成。在另一个方面，还提供了通过本发明方法制备的复合结构。在某些优选的实施方案中，所述复合结构是包含骨细胞和软骨细胞的复合结构。在某些优选的实施方案中，所述复合结构是包含内皮细胞和平滑肌细胞的复合结构。
在另一个方面，还提供了本发明的复合结构的各种应用，例如用于研究领域或医药领域的应用。例如，本发明的复合结构可用于研究干细胞分化，用于药物发现，用于药物筛选，用于体内或体外测定，用于植入宿主体内，用于组织工程或用于组织再生。
在另一个方面，本发明提供了一种试剂盒，其包含通过本发明方法制备的复合结构(例如包含骨细胞和软骨细胞的复合结构，例如包含内皮细胞和平滑肌细胞的复合结构)。
下面将结合附图和发明详述来对本发明的实施方案进行详细阐释。但是，本领域技术人员将理解，下列附图和发明详述仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和发明详述的详细公开内容，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
附图说明
图1示意性描述了本发明的一种微囊的结构，其包括：细胞，其能够进行生长、增殖、分化或迁移；包裹所述细胞的核层，其由生物可降解材料制成，并且为细胞的生命活动提供微环境，例如营养物质；和，任选地，封装所述核层的壳层，其位于最外侧，由生物可降解材料制成，并且为内部的核层和细胞提供力学保护。此外，所述壳层是通透性的，具有用于微囊内外物质交换的通道。在优选的实施方案中，细胞可均匀分散于核层中，或者可以聚集在一起，位于核层内部。
图2A-C示意性描述了使用本发明微囊构建的三维构建体的结构实例。
图2A-B描述的三维构建体包括两层结构，即，成骨层(其包含第一微囊)和成软骨层(其包含第二微囊)。其中，成骨层由第一微囊构建；成软骨层由第二微囊构建。成骨层和成软骨层各自可以由一层或多层细胞构成，根据所使用的微囊中含有的细胞的具体数量而定。微囊之间的间隙填充有生物粘合剂。在优选的实施方案中，生物粘合剂中可进一步包含维持、促进、改善、调控微囊内的细胞的生命活动的试剂。在优选的实施方案中，本发明的三维构建体是使用本发明的第一和第二微囊，通过3D生物打印方法而构建的。然而，不受于理论限制，本发明的三维构建体也可以使用本发明的第一和第二微囊，通过任何其他已知的方法(例如手工放置的方法)来构建。
图2C描述的三维构建体包括三层结构，即，内皮细胞层，平滑肌细胞层和成纤维细胞层。其中，内皮细胞层由包含内皮细胞的微囊构建；平滑肌细胞层由包含平滑肌细胞的微囊构建；成纤维细胞层由包含成纤维细胞的微囊构建。内皮细胞层，平滑肌细胞层和成纤维细胞层各自可以由一层或多层细胞构成，根据所使用的微囊中含有的细胞的具体数量而定。微囊之间的间隙填充有生物粘合剂。在优选的实施方案中，生物粘合剂中可进一步包含维持、促进、改善、调控微囊内的细胞的生命活动的试剂。例如，当微囊中的细胞为内皮细胞时，生物粘合剂中可进一步包含促进内皮细胞生长和分化的细胞因子。在优选的实施方案中，本发明的三维构建体是使用本发明的微囊，通过3D生物打印方法而构建的。然而，不受于理论限制，本发明的三维构建体也可以使用本发明的微囊，通过任何其他已知的方法(例如手工放置的方法)来构建。
图3A-3C显示了使用造粒仪在不同仪器参数下制备的微囊的相差显微照片，其中，图3A中的微囊的直径为约120μm(标尺为100μm)；图3B中的微囊的直径为约200μm(标尺为100μm)；图3C中的微囊的直径为约450μm(标尺为200μm)。图3A-3C的微囊中所使用的细胞为人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，壳层的主要成分是海藻酸钙，核层的主要成分是海藻酸钠+I型胶原。这些结果表明，可通过控制造粒仪的仪器参数(例如，同心喷嘴的内喷嘴和外喷嘴的直径)来控制微囊的尺寸。本发明的微囊的尺寸是可控的，可根据需要进行选择。
图4显示了通过实施例1方法制备的微囊A的显微照片，其中，高亮部分代表微囊的壳层，且该壳层的厚度为约2μm(标尺为50μm)。图4的微囊中所使用的细胞为人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，壳层的主要成分是海藻酸钙，核层的主要成分是海藻酸钠+I型胶原。结果表明，可通过控制造粒仪的同心喷嘴的内喷嘴和外喷嘴的直径，壳层材料的泵出速度等参数来控制壳层的厚度。本发明的微囊的壳层厚度是可控的，可根据需要进行选择。
图5A-5C显示了通过实施例1方法制备的微囊的显微照片，其中，图5A中的微囊包裹的细胞数为约50个(标尺为100μm)；图5B中的微囊包裹的细胞数为约8个(标尺为100μm)；图5C中的微囊包裹的细胞数为约2个(标尺为100μm)。图5A-5C的微囊中所使用的细胞为人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，壳层的主要成分是海藻酸钙，核层的主要成分是海藻酸钠+I型胶原。这些结果表明，可通过控制细胞悬液的细胞浓度来控制微囊包裹的细胞数。本发明微囊包含的细胞的数量是可控的，可根据需要进行选择。
图6A-6D显示了使用造粒仪制备的微囊B1-B4的显微照片，其中，图6A中的微囊为微囊B1，其直径为约600μm(标尺为500μm)；图6B中的微囊为微囊B2，其直径为约500μm(标尺为500μm)；图6C中的微囊为微囊B3，其直径为约500μm(标尺为500μm)；图6D中的微囊为微囊B4，其直径为约500μm(标尺为500μm)。这些结果表明，可使用各种合适的生物可降解材料来制备本发明的微囊。
图6E显示了用包裹有tracker CM-Dil(红色荧光)标记的细胞的核层材料和带有FITC(绿色荧光)的壳层材料制备的微囊B2的共聚焦显微图像，其中，绿色荧光代表壳层，红色荧光代表核层所包裹的细胞。
图7A显示了使用本发明的微囊制备的生物墨汁的显微照片。其中，微囊包含人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，并且其壳层的主要成分是海藻酸钙，核层的主要成分是海藻酸钠+I型胶原，且包含甲基紫染料；生物粘合剂的主要成分是海藻酸钠+明胶。如图7A所示，紫色染色仅存在于微囊内部，而不存在于生物墨汁的载体(生物粘合剂)中。这表明微囊的壳层能够在生物墨汁中保持微囊的完整性。
图7B显示了用本发明的生物墨汁打印得到的单细胞层的显微照片。其中，微囊包含人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，并且其壳层的主要成分是海藻酸钙，核层的主要成分是海藻酸钠+I型胶原，且包含甲基紫染料；生物粘合剂的主要成分是海藻酸钠+明胶。如图7B所示，紫色染色仅存在于微囊内部，而不存在于生物墨汁的载体(生物粘合剂)中。这表明微囊的壳层能够在生物打印过程中保持微囊的完整性。
图8显示了所使用的生物粘合剂(海藻酸钠+明胶)的粘度分析。结果显示，在25℃-40℃下，所使用的生物粘合剂的粘度为30-160Pas；并且，随着温度升高，生物粘合剂的粘度有所下降。
图9A-9D显示了使用共聚焦显微镜观察通过实施例1方法制备的微囊中细胞活力的分析结果，其中，所述微囊用钙黄绿素(绿色荧光)和碘化丙啶(红色荧光)进行了双重染色；所使用的细胞为人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，壳层的主要成分是海藻酸钙，核层的主要成分是海藻酸钠+I型胶原。
图9A显示了在微囊制备之后立即进行的微囊中细胞活力的分析结果。在图9A中，每个标记的白色圆圈代表一个微囊，并且，高亮点为红色荧光(代表死细胞)，低亮点为绿色荧光(代表活细胞)。图9A的结果显示，在用实施例1的方法制备微囊后，微囊中98％以上的细胞存活。
图9B显示了将制备的微囊在4℃下贮存3小时后，微囊中细胞活力的分析结果。在图9B中，每个标记的白色圆圈代表一个微囊，并且，高亮点为红色荧光(代表死细胞)，低亮点为绿色荧光(代表活细胞)。图9B的结果显示，所制备的微囊在4℃下保存3小时后，微囊中的细胞仍然保持高活力(存活率为90％)。
图9C显示了在将微囊制备成生物墨汁并进行生物打印后，立即进行的微囊中细胞活力的分析结果。在图9C中，高亮点为红色荧光(代表死细胞)，低亮点为绿色荧光(代表活细胞)。图9C的结果显示，将微囊制备成生物墨汁并立即进行生物打印后，微囊中的细胞仍然保持高活力(存活率为97％)。
图9D显示了所制备的微囊在37℃下，在H-DMEM培养基中培养5天后，微囊中细胞活力的分析结果。在图9D中，高亮点为红色荧光(代表死细胞)，低亮点为绿色荧光(代表活细胞)。图9D的结果显示，所制备的微囊在37℃下培养5天后，微囊中的细胞仍然保持高活力(存活率为95％)。
图10A-10B显示了使用共聚焦显微镜观察通过实施例1方法制备的微囊中细胞的粘附和伸展的分析结果，其中，所述微囊用钙黄绿素(绿色荧光)和碘化丙啶(红色荧光)进行了双重染色；所使用的细胞为HepG2细胞，壳层的主要成分是海藻酸钙，核层的主要成分是海藻酸钠+I型胶原。
图10A显示了在培养微囊第1天，使用共聚焦显微镜观察到的照片(放大倍数：40倍)，其中细胞呈圆形，未粘附伸展。图10B显示了培养所述微囊5天后，使用共聚焦显微镜观察到的照片(放大倍数：200倍)，其中细胞粘附伸展。图10A-10B的结果表明，在培养5天后，微囊内的细胞伸展并建立细胞间连接。
图11显示了使用共聚焦显微镜观察微囊中的细胞增殖的分析结果(放大倍数：200倍)，其中，所述微囊用DAPI(蓝色荧光)和EdU(红色荧光)进行了双重染色；所使用的细胞为HepG2细胞，壳层的主要成分是海藻酸钙，核层的主要成分是海藻酸钠+I型胶原。图11的结果表明，在培养5天后，微囊内的细胞处于增殖状态。
图12A-12B显示了通过传统方法制备的细胞微球在培养过程中的细胞增殖情况(标尺为500μm)。结果显示，与培养之前(图12A)相比，培养7天后(图12B)的细胞微球中的细胞增殖不明显，细胞呈圆形，散在分布。图12C-12D显示了使用实施例1方法制备的微囊在培养过程中的细胞增殖情况(标尺为500μm)。结果显示，与培养之前(图12C)相比，培养7天后(图12D)的微囊中的细胞增殖明显，细胞在微囊中伸展、粘附，并相互连接在一起。图12E显示了使用实施例1方法制备的微囊在培养7天后的显微照片(标尺为100μm)。结果显示，微囊中的HepG2细胞之间相互连接，形成有机的整体。图12A-12E的结果表明，与传统方法制备的细胞微球相比，本发明的微囊能够更好地促进细胞的增殖，促进细胞之间建立连接。
图13显示了使用共聚焦显微镜观察培养7天后的微囊的结果(图中标尺为100μm)，其中，所使用的微囊包含用绿色荧光标记的HepG2细胞和用红色荧光标记的HUVEC细胞，并且图中的黄色区域是由红色荧光和绿色荧光叠加所致，这表明HepG2细胞和HUVEC细胞之间建立了连接。结果显示，微囊内部的HepG2细胞之间、HUVEC细胞之间以及HepG2细胞与HUVEC细胞之间均建立了细胞间连接。
图14A显示了使用共聚焦显微镜观察培养7天后的微囊的结果(图中标尺为100μm)，其中，所使用的微囊包含分别用cell trackerGreen CMFDA(绿色荧光)标记的HepG2细胞和HUVEC细胞。结果显示，两个微囊的细胞之间建立了细胞连接，如方框中的桥状结构所显示的。
图14B显示了使用共聚焦显微镜观察培养7天后的微囊的结果(图中标尺为500μm)，其中，使用了两种微囊：一种微囊包含用celltracker Green CMFDA(绿色荧光)标记的HepG2细胞，且另一种微囊包含用tracker CM-Dil(红色荧光)标记的HUVEC细胞；并且，图中的黄色区域是由红色荧光和绿色荧光叠加所致。结果显示，表达红色荧光的微囊与表达绿色荧光的微囊之间建立了细胞连接，如图中的黄色区域所显示的。
图14C显示了使用共聚焦显微镜观察培养7天后的微囊的结果(图中标尺为500μm)，其中，所使用的微囊包含用cell tracker GreenCMFDA(绿色荧光)标记的HepG2细胞和HUVEC细胞；并且，图中的各个白色圆环分别表示一个微囊。结果显示，不同微囊的细胞之间建立了细胞连接，并形成有机的整体。
图15显示了包含MSC细胞的微囊的显微照片，其中，图15A显示了包含MSC细胞的单个微囊(标尺为100μm)；图15B显示了培养7天后的包含MSC细胞的微囊(标尺为500μm)；图15C显示了培养9天后的包含MSC细胞的微囊(标尺为500μm)。结果显示，培养7天后，多个包含MSC细胞的微囊相互融合(如图15B中的白色箭头所指示的)；并且，培养9天后，包含MSC细胞的微囊完全融合，形成有机整体(如图15C所显示的)。
图16A显示了通过实施例10的方法制备的第一微囊在37℃，5％CO2下培养1天后的显微照片。结果显示，细胞正常生长，但未出现分化。
图16B显示了通过实施例10的方法制备的第一微囊在37℃，5％CO2下培养10天后经茜素红染色的显微照片，其中，粗箭头所指处为一个完整的微囊，细箭头所指处为钙结节。结果显示，微囊内出现大量钙结节，如细箭头所指示的。这表明，第一微囊中的MSC细胞向成骨细胞分化。
图17显示了使用本发明的微囊制备含有内皮细胞和平滑肌细胞的复合结构的过程，包括将实施例15制备的第一微囊规则排列在组织前体的外层，将实施例15制备的第二微囊规则排列在组织前体的内部，形成组织前体。
图18显示了使用本发明的微囊制备的含有内皮细胞和平滑肌细胞的复合结构的染色结果。结果显示：(1)经过培养后，第一微囊内的MSC干细胞分化为内皮细胞，且，第二微囊内的MSC干细胞分化为平滑肌细胞；(2)第一微囊和第二微囊内的细胞按照设计好的结构规则排列：含有内皮细胞的组织位于组织块的外层，含有平滑肌细胞的组织位于组织块的内部；并且，(3)两种微囊融合成有机的整体(即，复合结构)。这些实验结果表明，所制备的微囊可以用于制备含有内皮细胞和平滑肌细胞的复合结构。
图19示意性地描述了使用本发明的微囊/生物墨汁来生物打印血管的流程图。
发明详述
术语定义
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。然而，为了更好地理解本发明，下面提供本说明书中的相关术语的定义和解释。当本说明书中给出的定义与本领域技术人员所通常理解的含义相冲突时，以本说明书中的定义为准。
如本说明书和所附权利要求书中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数的指示物，除非上下文另有明确规定。此外，本文中任何提及的“或”意在包括“和/或”，除非另有说明。
如本文中所使用的，术语“微囊”用于指本发明人构建的一种基本结构单元，其可用于多个领域，例如生物打印(如3D生物打印)、组织工程、再生医学等领域。特别地，本发明的微囊具有特定的结构和组成，即，其包括：细胞，和包裹所述细胞的核层，其中所述核层由生物可降解材料制成。在某些优选的实施方案中，所述微囊还任选地包括，封装所述核层的壳层，其中所述壳层由生物可降解材料制成。本发明的微囊的一种示意性结构可参见图1。在本发明中，微囊不局限于特定的形状或大小，例如，其可以是球形的，或者任何期望的形状。
如本文中使用的，术语“生物打印”是指：利用生物材料(包括但不限于，生物分子例如蛋白质，脂质，核酸和代谢产物；细胞例如细胞溶液、含细胞的凝胶、细胞悬浮液、细胞浓缩物、多细胞聚集体和多细胞体；亚细胞结构例如细胞器和细胞膜；与生物分子相关的分子例如合成的生物分子或生物分子的类似物)的打印。如本文中使用的，术语“打印”是指，按照预定的模式沉积材料的过程。在本发明中，生物打印优选地通过与自动的或半自动的、计算机辅助的三维原型装置(例如生物打印机)相匹配的方法来实现。然而，在本发明中，“打印”(例如生物打印)可通过各种方法来进行，包括但不限于，使用打印机(例如3D打印机或生物打印机)进行打印；使用自动化或非自动化机械过程(而非打印机)进行打印；通过手工放置或手工沉积(例如使用移液器)进行打印。
如本文中使用的，术语“组织”是指由形态相同或类似、机能相同的细胞群构成的细胞集合体，并且通常还包含非细胞形态的物质(称为细胞间质，例如基质、纤维等)。组织可包括一种或多种细胞。如本文中使用的，术语“器官”是指由不同的细胞和组织构成的、用于实现某一或某些特定功能的结构。器官可包括一种或多种组织。“人工组织”是指，不是通过天然组织生成或发育过程在生物体内形成的组织。人工组织可以是人为制造的组织，例如通过生物打印方法获得的组织。在本发明中，术语“人工组织”和“组织构建体”可互换使用。如本文中使用的，术语“组织前体”是指细胞集合体，其在培养、诱导或操作步骤后，能够形成组织。在本发明中，组织前体可以是人为制造的组织前体(即，人工组织前体)。
特别地，在本发明中，组织的实例包括但不限于：结缔组织(例如，疏松结缔组织、致密结缔组织、弹性组织、网状结缔组织和脂肪组织)、肌肉组织(例如，骨骼肌、平滑肌和心肌)、泌尿生殖组织、胃肠组织、肺组织、骨组织、软骨组织、神经组织和上皮组织(例如，单层上皮和复层上皮)、内胚层来源的组织、中胚层来源的组织和外胚层来源的组织。特别优选地，在本发明中，组织是骨组织，软骨组织，和/或关节组织。
如本文中使用的，术语“构建体”是指，使用本发明的微囊构建的物体，其可以具有二维或三维的结构，并且可以是组织前体，组织或器官。特别优选地，在本发明中，构建体是包含骨和软骨的复合结构，或用于形成包含骨和软骨的复合结构。
如本文中使用的，术语“组织工程”具有本领域技术人员通常理解的含义。特别地，组织工程是跨学科的领域，其应用并结合了工程学和生命科学的原理，并且通常是指，使用生物替代品(例如本发明的微囊)来恢复、保持或改善组织功能。经典组织工程学的基本原理是：从机体获取少量的活体组织，用特殊的酶或其他方法将细胞(又称种子细胞)从组织中分离出来在体外进行培养扩增，然后将扩增的细胞与具有良好生物相容性、可降解性和可吸收的生物材料(支架)按一定的比例混合，使细胞黏附在生物材料(支架)上形成细胞-材料复合物；将该复合物植入机体的组织或器官病损部位，随着生物材料在体内逐渐被降解和吸收，植入的细胞在体内不断增殖并分泌细胞外基质，最终形成相应的组织或器官，从而达到修复创伤和重建功能的目的。本发明的微囊具有下述显著的优点：微囊所包裹的细胞(例如MSC细胞)的数目是可控的；并且微囊本身的尺寸也是可控的；并且，微囊的核层和任选的壳层各自由生物可降解材料制成；从而特别适合用于组织工程。
如本文中使用的，“生物相容性材料”是指这样的材料，其(以及其降解产物)对于细胞是无毒性的，并且在植入宿主(例如人体)后与宿主相容，不会造成显著的或者严重的副作用，例如，不会对宿主(例如人体组织)造成毒害作用，不会引起宿主的免疫排斥反应、过敏反应或炎症反应等等。
如本文中使用的，“生物可降解材料”是指这样的材料，其能够被细胞或生物体降解和吸收，并且其降解产物是生物相容性的。此类材料可以是天然来源的(例如来源于动植物)，也可以是人工合成的。
如本文中使用的，“经过改性的可降解聚合物”是指，通过化学和/或物理方法，改变原始聚合物具有的化学性质和/或物理性质而得到的可降解聚合物。例如，可通过化学反应改变原始聚合物的主链或侧链上的原子或原子团的种类和/或结合方式，从而获得经过改性的可降解聚合物。例如，对海藻酸钠进行氧化反应，以得到改性的海藻酸钠(即，氧化的海藻酸钠)。
如本文中所使用的，术语“力学保护”是指，壳层具有一定的硬度和弹性模量，从而能够减少或避免其封装的细胞遭受外界的机械损伤/力学损伤(例如，3D生物打印过程中可能产生的剪切力，挤压力等引起的损伤)。
如本文中使用的，“生物粘合剂”是指，起粘合作用的、与细胞和生物体相容的、可降解的材料。其具体实例可包括，但不限于胶原、纤维蛋白、壳聚糖、海藻酸盐、淀粉、透明质酸、层粘连蛋白、弹性蛋白、明胶、聚氨基酸(例如聚赖氨酸)、琼脂糖、葡聚糖、甲基纤维素、聚乙烯醇、聚丙烯酸及其衍生物(例如聚甲基丙烯酸，丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物)，或其任何组合。
如本文中使用的，“凝聚”指将细胞、细胞聚集体、多细胞聚集体、多细胞体和/或它们的层结合起来的细胞-细胞粘附。该术语可以与“融合”互换使用。
如本文中使用的，“层状”是指多层的、生物打印的组织，其中两个或多个平面层组合起来以增加该组织在z平面(即，垂直平面)的总厚度。在一些实施方案中，每个平面层在结构和/或组成上可以是基本类似的。在其它实施方案中，每个平面层在结构和/或组成上可以是基本上独特的，即彼此不同。此外，在每个平面层的x-y平面(即：水平平面)内，多个微囊(或者其中的细胞)和/或空隙空间相对于彼此空间布置成设定的图案。
如本文中使用的，“一层或多层”是指，由至少一个平面层/组织层组成，其中每个平面层/组织层是一个或多个细胞层的厚度。由于本发明的微囊可以包含一个细胞，也可以包含多个细胞(例如100个或1000个)。因此，在一些实施方案中，平面层/组织层为一个细胞层的厚度。在其它实施方案中，平面层/组织层为多个细胞层的厚度。此外，在3D生物打印过程中，可以一次沉积一个层，也可以同时沉积多个层。任选地，每个平面层/组织层包含多种细胞类型。此外，在每个平面层/组织层中的多种细胞类型任选地在x-y平面(即：水平平面)上以空间限定的结构相对于彼此排列。此外，在某些情况下，在z-平面(即：垂直平面)上的组织层增加导致细胞在组织层内相对于彼此的受控空间定位，使得空间限定的结构在z-平面上继续。
如本文中使用的，“试剂”是指化学试剂，生化试剂或药物，包括但不限于，小分子化合物，激素，肽(例如寡肽或蛋白质)，核酸(寡核苷酸，DNA，RNA或化学修饰的核酸)等，其对细胞活性，功能和/或行为具有作用或影响。试剂可以是天然来源的，重组产生的，或化学合成的。“刺激”是指，化学因素(例如试剂，酸，碱，氧浓度等)或物理因素(例如温度，辐照，机械力等)，其对细胞活性，功能和/或行为具有作用或影响。
如本文中使用的，“受试者”是指动物，例如脊椎动物。优选地，受试者为哺乳动物，例如人，牛科动物，马科动物，猫科动物，犬科动物，啮齿类动物或灵长类动物。特别优选地，受试者为人。在本文中，该术语可以与“患者”、“受体”和“供体”互换使用。
在本文中，除非上下文明确指出，否则术语“微囊”是指m种微囊中的任意一种或多种，例如第一微囊和/或第二微囊。
因此，在一个方面，本发明提供了一种制备包含m种细胞的复合结构的方法，其中，m为≥2的整数，所述方法包括：
(1)提供m种包含细胞的微囊，其中，每种微囊各自对应于复合结构中的一种细胞，即，每种微囊各自包含复合结构中的一种细胞，和/或能够分化为复合结构中的该种细胞的干细胞；
(2)提供所述复合结构的细胞分布信息；
(3)基于所述复合结构的细胞分布信息，对所述m种微囊进行排布，以制备构建体；
(4)培养步骤(3)获得的构建体，产生所述复合结构。
在某些优选的实施方案中，所述复合结构的m种细胞是由同一种干细胞分化而来的。在这种情况下，步骤(1)所述的m种微囊可包含相同的干细胞，并且每种微囊各自包含诱导所述干细胞分化为复合结构中的一种细胞的诱导因子。
例如，在某些优选的实施方案中，所述复合结构是包含骨细胞和软骨细胞的复合结构。骨细胞和软骨细胞可以由相同的干细胞(例如MSC细胞)分化而来。例如，可使用诱导MSC向成骨细胞或骨细胞分化的诱导因子来诱导微囊中的MSC细胞分化为骨细胞；并且，可使用诱导MSC向成软骨细胞或软骨细胞分化的诱导因子来诱导微囊中的MSC细胞分化为软骨细胞。因此，在这种情况下，本发明的方法可包括：
(1)提供两种包含细胞的微囊，其中，第一微囊包含MSC细胞，以及诱导MSC向成骨细胞或骨细胞分化的诱导因子；并且，第二微囊包含MSC细胞，以及诱导MSC向成软骨细胞或软骨细胞分化的诱导因子；
(2)提供包含骨细胞和软骨细胞的复合结构的细胞分布信息；
(3)基于所述复合结构的细胞分布信息，对所述第一微囊和第二微囊进行排布，以制备构建体；
(4)培养步骤(3)获得的构建体，产生所述复合结构。
在某些优选的实施方案中，所述微囊(例如第一微囊和/或第二微囊)包含细胞(例如MSC细胞)，和包裹所述细胞的核层，其中所述核层由生物可降解材料制成。在某些优选的实施方案中，所述微囊(例如第一微囊和/或第二微囊)任选地还包含封装所述核层的壳层，其中所述壳层由生物可降解材料制成。
在某些优选的实施方案中，所述微囊(例如第一微囊和/或第二微囊)包含干细胞(例如MSC细胞)。在此情况下，在某些优选的实施方案中，所述微囊的核层和任选的壳层还可包含诱导所述干细胞分化为复合结构中的一种细胞的诱导因子(例如，诱导MSC向成骨细胞或骨细胞分化的诱导因子，或诱导MSC向成软骨细胞或软骨分化的诱导因子)。在某些优选的实施方案中，所述m种微囊包含相同的干细胞，但各自包含不同的诱导所述干细胞分化的诱导因子。
在某些优选的实施方案中，所述第一微囊包括：MSC细胞，包裹所述MSC细胞的核层，和，任选地，封装所述核层的壳层，其中所述核层和任选的壳层各自独立地由生物可降解材料制成，并且所述核层包含诱导MSC向成骨细胞或骨细胞分化的诱导因子。
在某些优选的实施方案中，所述第二微囊包括：MSC细胞，包裹所述MSC细胞的核层，和，任选地，封装所述核层的壳层，其中所述核层和任选的壳层各自独立地由生物可降解材料制成，并且所述核层包含诱导MSC向成软骨细胞或软骨分化的诱导因子。
在某些优选的实施方案中，所述复合结构的m种细胞是由同一种干细胞分化而来的，步骤(1)所述的m种微囊既包含相同的干细胞，还各自包含复合结构中的一种细胞。
例如，在某些优选的实施方案中，所述复合结构是包含内皮细胞和平滑肌细胞的复合结构。内皮细胞和平滑肌骨细胞可以由相同的干细胞(例如MSC细胞)分化而来。因此，在这种情况下，本发明的方法可包括：
(1)提供两种包含细胞的微囊，其中，第一微囊包含MSC细胞和内皮细胞；并且，第二微囊包含MSC细胞和平滑肌细胞；
(2)提供包含内皮细胞和平滑肌细胞的复合结构的细胞分布信息；
(3)基于所述复合结构的细胞分布信息，对所述第一微囊和第二微囊进行排布，以制备构建体；
(4)培养步骤(3)获得的构建体，产生所述复合结构；
在某些优选的实施方案中，所述第一微囊包括：MSC细胞和内皮细胞，包裹所述MSC细胞和内皮细胞的核层，和，任选地，封装所述核层的壳层；优选地，所述核层和任选的壳层各自独立地由生物可降解材料制成；
在某些优选的实施方案中，所述第二微囊包括：MSC细胞和平滑肌细胞，包裹所述MSC细胞和平滑肌细胞的核层，和，任选地，封装所述核层的壳层，其中所述核层和任选的壳层各自独立地由生物可降解材料制成；
在本发明的某些优选实施方案中，所述核层和任选的壳层中的生物可降解材料能够减少或避免微囊内的细胞在操作(例如生物打印)过程中遭受机械损伤，并且能够提供物质(例如营养物质，细胞外基质，细胞因子，药物活性成分等)的可控释放，以促进细胞活性和功能(增殖、分化、迁移、分泌或新陈代谢)。在某些实施方案中，所述方法用于制备包含骨细胞和软骨细胞的复合结构，所述方法包括提供两种包含细胞的微囊，其中，第一微囊和第二微囊均包含MSC细胞，并且第一微囊包含诱导因子，其能够促进MSC细胞分化为成骨细胞，并最终形成骨细胞和骨结构；第二微囊包含诱导因子，其能够促进MSC细胞分化为成软骨细胞，并最终形成软骨细胞核软骨结构。
在某些优选的实施方案中，所述核层提供了适合细胞粘附和伸展的空间结构和微环境，从而细胞在该结构内能够正常进行增殖、分化、迁移、分泌或新陈代谢。所述微环境指细胞所生长的环境，其包含的要素包括物理因素，比如空间结构、力学强度、温度、湿度、渗透压等；化学因素，比如酸碱度、离子浓度等；生物因素，包括细胞、细胞因子等。这些要素共同构成细胞生命活动的环境，并对在这个环境中生长的细胞的增殖、分化、迁移、分泌和新陈代谢进行动态调控。在某些实施方案中，所述核层能够为细胞的生命活动提供微环境，例如空间结构、营养物质等。优选地，所述核层各自独立地由生物可降解材料制成，并且所述生物可降解材料是生物相容性的。
在本发明中，使用生物可降解材料来制备微囊的核层是特别优选的。特别地，对于微囊的某些用途(例如，生物打印，制备构建体，组织工程等)而言，无法降解的材料的使用是不利的。这是因为，一方面，这些无法降解的材料将被保留在所获得的构建体或人工组织中，从而限制构建体或人工组织的应用；另一方面，这些无法降解的材料将阻碍不同微囊的细胞之间建立细胞连接，不利于构建有机的整体(例如，人工组织)。因此，生物可降解材料在核层中的使用对于利用微囊来制备构建体、人工组织、器官是特别有利的和优选的。
在本发明的实施方案中，用于制备核层的生物可降解材料可以是天然存在的(例如来源于动植物的天然存在的生物可降解材料，例如胶原蛋白，纤维蛋白，壳聚糖，海藻酸盐，淀粉，透明质酸，层粘连蛋白，琼脂糖，明胶，葡聚糖，以及其任意组合)，人工合成的，重组产生的，经过改性的，或者其任何组合。
在某些优选的实施方案中，用于制备核层的所述生物可降解材料是天然存在的可降解聚合物。优选地，所述可降解聚合物选自胶原蛋白，纤维蛋白，壳聚糖，海藻酸盐，淀粉，透明质酸，层粘连蛋白，琼脂糖，明胶，葡聚糖，以及其任意组合。
在某些优选的实施方案中，用于制备核层的所述生物可降解材料是经过改性的可降解聚合物，例如经过改性的海藻酸盐，例如氧化海藻酸盐(例如氧化海藻酸钠)。
在某些优选的实施方案中，用于制备核层的所述生物可降解材料是合成的可降解聚合物。此类可降解聚合物包括但不限于，聚磷腈，聚丙烯酸及其衍生物(例如聚甲基丙烯酸，丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物)，聚乳酸(PLA)，聚羟基乙酸(PGA)，聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)，聚原酸酯(POE)，聚己内酯(PCL)，聚羟基丁酸酯(PHB)，聚氨基酸(polyamino acid)(例如聚赖氨酸)，可降解性聚氨酯，以及其任何组合。
在某些优选的实施方案中，用于制备核层的所述生物可降解材料包含天然存在的可降解聚合物和合成的可降解聚合物。
在某些优选的实施方案中，用于制备核层的所述生物可降解材料能够被酶(例如细胞分泌的酶)所降解。不同的生物可降解材料的降解速率差异很大，其范围可以为一个月到数年。然而在本发明中，特别优选地，用于制备核层的生物可降解材料在不超过2个月的时间内降解，例如在不超过1个月的时间内降解，例如在不超过30天、不超过25天、不超过20天、不超过15天、不超过10天、不超过5天、不超过4天、不超过3天、不超过2天、或不超过1天的时间内降解。例如，用于制备核层的生物可降解材料可以在1-2天，2-3天，3-4天，4-5天，5-10天，10-15天，15-20天，20-25天，25-30天，或30-60天的时间内降解。降解速率与生物可降解材料的分子组成、分子量大小和分子排列(例如，直链或支链)密切相关。一般情况下，分子量越高、分子排列越紧密，降解时间越长。因此，核层的降解速率可通过对核层的组分和/或含量的配置来控制。例如，为了获得更快的降解速率，可使用低含量(例如低于0.5％、1％、2％、3％、4％、或5％)的生物可降解材料、低分子量(例如低于500Da、1kDa、2kDa、3kDa、5kDa、或10kDa)的生物可降解材料，和/或具有疏松分子排布的生物可降解材料。为了获得更慢的降解速率，可使用高含量(例如高于0.5％、1％、2％、3％、4％、或5％)的生物可降解材料、高分子量(例如高于500Da、1kDa、2kDa、3kDa、5kDa、或10kDa)的生物可降解材料，和/或具有紧密分子排布的生物可降解材料。另外，还可通过改变微囊的结构(如：多层包裹、表面多孔、孔隙率大小、比表面积等)来调节生物可降解材料的降解速率。此外，生物可降解材料的降解速率还可以通过改变合成该材料的聚合方式和共聚物比例来进行调节；或者，可通过对该材料的交联来进行调节。
各种生物可降解材料是本领域技术人员已知的，并且其降解性能已被进行了广泛研究(参见例如，Alexander D.Augst,Hyun Joon Kong,David J.Mooney,Alginate Hydrogels as Biomaterials,Macromol.Biosci.2006,6,623-633)。本领域技术人员可根据实际需要，选择合适的生物可降解材料来制备核层。
在某些优选的实施方案中，所述核层的降解能够提供维持或促进所述细胞的生命活动的微环境，例如营养物质。在某些优选的实施方案中，核层的降解产物为小分子化合物，例如有机酸、单糖(例如葡萄糖)、寡糖、氨基酸、脂质等。此类降解产物可参与到细胞的新陈代谢活动中，用于合成细胞外基质或转化为活动所需的能量。
在某些优选的实施方案中，用于制备核层的生物可降解材料及其降解产物对于细胞是无毒的，和/或对于宿主是非免疫原性的。
在某些优选的实施方案中，用于制备核层的生物可降解材料选自胶原蛋白(例如I型，II型，III型胶原蛋白)、纤维蛋白、壳聚糖、海藻酸盐(例如海藻酸钠)、氧化的海藻酸盐(例如氧化的海藻酸钠)、淀粉、透明质酸，层粘连蛋白，弹性蛋白，明胶、葡聚糖、聚氨基酸(例如聚赖氨酸)、琼脂糖，可降解性聚氨酯，或其任何组合。
在某些优选的实施方案中，用于制备核层的生物可降解材料含有细胞外基质或其类似物(例如胶原蛋白)。细胞外基质或其类似物(例如胶原蛋白)的使用能够为微囊内的细胞的生命活动(特别是细胞的生长、粘附、伸展，以及细胞间连接的建立)提供类似于体内的有利的微环境，从而是优选的。例如，I型胶原的空间结构与细胞外基质的空间结构类似，能够为细胞生存和增殖提供类似于细胞外基质骨架结构的微环境，为细胞生物学功能的实现提供支持。因此，在某些优选的实施方案中，用于制备核层的生物可降解材料为I型胶原或者含有I型胶原。
在某些优选的实施方案中，所述核层包含I型胶原蛋白和/或海藻酸盐，例如包含I型胶原蛋白和海藻酸钠。在某些优选的实施方案中，I型胶原蛋白和海藻酸钠在核层中的重量比为约1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、3:25、1:9、1:10、1:20、1:30、或1:50。在某些优选的实施方案中，I型胶原蛋白和海藻酸钠在核层中的重量比为1:1-1:2、1:2-1:4、1:4-1:6、1:6-1:8、1:8-1:9、1:9-1:10、1:10-1:20、1:20-1:30、1:30-1:50、1:1-1:5、1:5-1:10、1:7-1:10、或1:8-1:9。在某些优选的实施方案中，I型胶原蛋白在核层中的重量百分比为约0.01％、0.05％、0.1％、0.125％、0.15％、0.175％、0.2％、0.25％、0.3％、0.4％、0.5％、1％、2％、3％、4％、或5％。在某些优选的实施方案中，I型胶原蛋白在核层中的重量百分比为0.01％-0.05％、0.05％-0.1％、0.1％-0.125％、0.125％-0.15％、0.15％-0.175％、0.175％-0.2％、0.2％-0.25％、0.25％-0.3％、0.3％-0.4％、0.4％-0.5％、0.5％-1％、1％-2％、2％-3％、3％-4％、4％-5％、0.01％-0.1％、0.1％-0.2％、0.125％-0.175％、0.2％-0.5％、0.1％-0.5％、0.1％-1％、或0.05％-5％。在某些优选的实施方案中，海藻酸钠在核层中的重量百分比为约0.1％、0.5％、1％、1.25％、1.5％、2％、3％、4％、5％、7.5％、或10％。在某些优选的实施方案中，海藻酸钠在核层中的重量百分比为0.1％-0.5％、0.5％-1％、1％-1.25％、1.25％-1.5％、1.5％-2％、2％-3％、3％-4％、4％-5％、5％-7.5％、7.5％-10％、0.1％-1％、1％-1.5％、1％-2％、0.5-2.5％、1％-3％、5-10％、或0.5-5％。
在某些优选的实施方案中，所述核层包含海藻酸钠。在某些优选的实施方案中，所述核层包含I型胶原蛋白。在某些优选的实施方案中，所述核层包含淀粉。在某些优选的实施方案中，所述核层包含可降解性聚氨酯。在某些优选的实施方案中，所述核层包含层粘连蛋白。
在某些优选的实施方案中，所述核层包含海藻酸盐(例如海藻酸钠或海藻酸钙)和氧化海藻酸盐(例如氧化海藻酸钠)。在某些优选的实施方案中，海藻酸盐(例如海藻酸钠或海藻酸钙)和氧化海藻酸盐(例如氧化海藻酸钠)在核层中的重量比为约10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、或1:10。在某些优选的实施方案中，海藻酸盐(例如海藻酸钠或海藻酸钙)和氧化海藻酸盐(例如氧化海藻酸钠)在核层中的重量比为10:1-9:1、9:1-8:1、8:1-7:1、7:1-6:1、6:1-5:1、5:1-4:1、4:1-3:1、3:1-2:1、2:1-1:1、1:1-1:2、1:2-1:3、1:3-1:4、1:4-1:5、1:5-1:6、1:6-1:7、1:7-1:8、1:8-1:9、1:9-1:10、10:1-5:1、5:1-1:1、1:1-1:5、1:5-1:10、2:1-1:2、4:1-1:4、或10:1-1:10。
在某些优选的实施方案中，所述核层为凝胶状。
在某些实施方案中，所述方法用于制备包含骨细胞和软骨细胞的复合结构，所述方法包括提供两种包含细胞的微囊，其中，第一微囊包含MSC细胞，以及诱导MSC向成骨细胞或骨细胞分化的诱导因子；并且，第二微囊包含MSC细胞，以及诱导MSC向成软骨细胞或软骨细胞分化的诱导因子。
在某些优选的实施方案中，所述诱导MSC向成骨细胞或骨分化的诱导因子包含地塞米松、抗坏血酸和甘油磷酸。在某些优选的实施方案中，所述核层能够以受控的方式释放诱导MSC向成骨细胞或骨分化的诱导因子。
在某些优选的实施方案中，所述诱导MSC向成软骨细胞或软骨分化的诱导因子包含TGF-β3、地塞米松、2-磷酸抗坏血酸、丙酮酸钠、脯氨酸和胰岛素-转铁蛋白-硒溶液。在某些优选的实施方案中，所述核层能够以受控的方式释放诱导MSC向成软骨细胞或软骨分化的诱导因子。
此外，在某些优选的实施方案中，本发明的第一微囊的任选的壳层也包含诱导MSC向成骨细胞或骨分化的诱导因子。在某些优选的实施方案中，所述诱导MSC向成骨细胞或骨分化的诱导因子包含地塞米松、抗坏血酸和甘油磷酸。在某些优选的实施方案中，所述任选的壳层能够以受控的方式释放诱导MSC向成骨细胞或骨分化的诱导因子。
在某些优选的实施方案中，本发明的第二微囊的任选的壳层也包含诱导MSC向成软骨细胞或软骨分化的诱导因子。在某些优选的实施方案中，所述诱导MSC向成软骨细胞或软骨分化的诱导因子包含TGF-β3、地塞米松、2-磷酸抗坏血酸、丙酮酸钠、脯氨酸和胰岛素-转铁蛋白-硒溶液。在某些优选的实施方案中，所述任选的壳层能够以受控的方式释放诱导MSC向成软骨细胞或软骨分化的诱导因子。
微囊的壳层为包裹的细胞提供了力学保护。在某些优选的实施方案中，所述微囊或微囊的壳层具有一定的力学强度，从而能够实现立体堆积。在本发明中，特别优选地，微囊及其壳层具有适当的力学保护性能(例如，具有合适的硬度和/或弹性模量)。一方面，微囊内的细胞在操作过程中(例如，在3D打印过程中)易于因外界压力或剪切力的伤害而受损或死亡。因此，如果微囊及其壳层的硬度和/或弹性模量太低，那么将导致微囊内的细胞存活率在人工操作后显著下降，进而导致微囊的应用受到限制，或者需要使用大量的细胞。另一方面，如果微囊及其壳层的硬度和/或弹性模量太高，那么将导致微囊内的细胞的伸展、迁移受到限制，并且阻碍不同微囊的细胞之间建立细胞连接，不利于构建有机的整体(例如，人工组织)。因此，适当的力学保护性能不仅使得能够对本发明的微囊进行各种操作(例如进行3D生物打印，进行微囊的精确排布等)，而且有利于微囊内的细胞伸展、迁移、建立细胞连接，并形成有机的构建体(例如人工组织)，因此，是特别优选的。
在某些优选的实施方案中，所述任选的壳层为包裹的细胞提供了力学保护。在某些优选的实施方案中，所述微囊或微囊的壳层各自独立地具有一定的力学强度，从而能够实现立体堆积。在某些优选的实施方案中，所述微囊或微囊的壳层各自独立地具有约0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.15、0.2、0.3、或0.4GPa的硬度。在某些优选的实施方案中，所述微囊或微囊的壳层各自独立地具有0.01-0.02、0.02-0.03、0.03-0.04、0.04-0.05、0.05-0.06、0.06-0.07、0.07-0.08、0.08-0.09、0.09-0.1、0.1-0.15、0.15-0.2、0.2-0.3、0.3-0.4、0.01-0.4、0.01-0.05、0.05-0.1、0.1-0.2、0.2-0.4、0.05-0.15、或0.06-0.1GPa的硬度。在某些优选的实施方案中，所述微囊或微囊的壳层各自独立地具有约0.083GPa的硬度。在某些优选的实施方案中，所述微囊或微囊的壳层各自独立地具有约0.01、0.05、0.1、0.5、0.8、1、1.2、1.4、1.6、1.8、2、2.4、2.8、3.2、4、10、20、30、40、50、80、或100MPa的弹性模量。在某些优选的实施方案中，所述微囊或微囊的壳层各自独立地具有0.01-0.05、0.05-0.1、0.1-0.5、0.5-0.8、0.8-1、1-1.2、1.2-1.4、1.4-1.6、1.6-1.8、1.8-2、2-2.4、2.4-2.8、2.8-3.2、3.2-4、4-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-80、80-100、0.5-4、0.5-1、1-1.5、1.5-2、2-3、0.8-1.6、1.4-2.4、0.8-3.2、0.01-100、1-100、10-100、或0.5-50MPa的弹性模量。在某些优选的实施方案中，所述微囊或微囊的壳层各自独立地具有约1.683MPa的弹性模量。壳层的力学保护作用(例如，硬度和弹性模量)可通过对壳层的组分和/或含量的配置来控制。
在某些优选的实施方案中，所述任选的壳层也能够为细胞的生命活动提供微环境，例如营养物质。优选地，所述壳层各自独立地由生物可降解材料制成，并且所述生物可降解材料是生物相容性的。
在本发明中，使用生物可降解材料来制备微囊的壳层是特别优选的。特别地，对于微囊的某些用途(例如，生物打印，制备构建体，组织工程等)而言，无法降解的材料的使用是不利的。这是因为，一方面，这些无法降解的材料将被保留在所获得的构建体或人工组织中，从而限制构建体或人工组织的应用；另一方面，这些无法降解的材料将阻碍不同微囊的细胞之间建立细胞连接，不利于构建有机的整体(例如，人工组织)。因此，生物可降解材料在壳层中的使用对于利用微囊来制备构建体、人工组织、器官是特别有利的和优选的。
在本发明的实施方案中，用于制备壳层的生物可降解材料可以是天然存在的(例如来源于动植物的天然存在的生物可降解材料，例如胶原蛋白，纤维蛋白，壳聚糖，海藻酸盐，淀粉，透明质酸，层粘连蛋白，琼脂糖，明胶，葡聚糖，以及其任意组合)，人工合成的，重组产生的，经过改性的，或者其任何组合。
在某些优选的实施方案中，用于制备壳层的所述生物可降解材料是天然存在的可降解聚合物。优选地，所述可降解聚合物选自胶原蛋白，纤维蛋白，壳聚糖，海藻酸盐，淀粉，透明质酸，层粘连蛋白，琼脂糖，明胶，葡聚糖，以及其任意组合。
在某些优选的实施方案中，用于制备壳层的所述生物可降解材料是经过改性的可降解聚合物，例如经过改性的海藻酸盐，例如氧化海藻酸盐(例如氧化海藻酸钠)。
在某些优选的实施方案中，用于制备壳层的所述生物可降解材料是合成的可降解聚合物。此类可降解聚合物包括但不限于，聚磷腈，聚丙烯酸及其衍生物(例如聚甲基丙烯酸，丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物)，聚乳酸(PLA)，聚羟基乙酸(PGA)，聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)，聚原酸酯(POE)，聚己内酯(PCL)，聚羟基丁酸酯(PHB)，聚氨基酸(polyamino acid)(例如聚赖氨酸)，可降解性聚氨酯，以及其任何组合。
在某些优选的实施方案中，用于制备壳层的所述生物可降解材料包含天然存在的可降解聚合物和合成的可降解聚合物。
在某些优选的实施方案中，用于制备核层和任选的壳层的生物可降解材料是相同的或不同的。在某些优选的实施方案中，核层和任选的壳层分别以不同的重量比包含相同的生物可降解材料。
在某些优选的实施方案中，用于制备壳层的所述生物可降解材料能够被酶(例如细胞分泌的酶)所降解。不同的生物可降解材料的降解速率差异很大，其范围可以为一个月到数年。在某些优选的实施方案中，然而在本发明中，特别优选地，用于制备壳层的生物可降解材料在不超过1个月的时间内降解，例如在不超过30天、不超过25天、不超过20天、不超过15天、不超过10天、不超过5天、不超过4天、不超过3天、不超过2天、或不超过1天的时间内降解。例如，用于制备壳层的生物可降解材料可以在1-2天，2-3天，3-4天，4-5天，5-10天，10-15天，15-20天，20-25天，或25-30天的时间内降解。特别优选地，用于制备壳层的生物可降解材料在不超过10天的时间内降解。降解速率与生物可降解材料的分子组成、分子量大小和分子排列(例如，直链或支链)密切相关。一般情况下，分子量越高、分子排列越紧密，降解时间越长。因此，壳层的降解速率可通过对核层的组分和/或含量的配置来控制。例如，为了获得更快的降解速率，可使用低含量(例如低于0.5％、1％、2％、3％、4％、或5％)的生物可降解材料、低分子量(例如低于500Da、1kDa、2kDa、3kDa、5kDa、或10kDa)的生物可降解材料，和/或具有疏松分子排布的生物可降解材料。为了获得更慢的降解速率，可使用高含量(例如高于0.5％、1％、2％、3％、4％、或5％)的生物可降解材料、高分子量(例如高于500Da、1kDa、2kDa、3kDa、5kDa、或10kDa)的生物可降解材料，和/或具有紧密分子排布的生物可降解材料。另外，还可通过改变微囊的结构(如：多层包裹、表面多孔、孔隙率大小、比表面积等)来调节生物可降解材料的降解速率。此外，生物可降解材料的降解速率还可以通过改变合成该材料的聚合方式和共聚物比例来进行调节；或者，可通过对该材料的交联来进行调节。此外，用于制备壳层的生物可降解材料的降解速率还可受细胞生命活动的影响。
在本发明中，特别优选的是，微囊内的细胞能够生长、伸展、增殖、迁移，并与其他微囊内的细胞建立细胞连接，形成有机的构建体(例如人工组织)。因此，在某些优选的实施方案中，所述微囊的壳层在相对短的时间(例如不超过30天的时间内，例如不超过10天的时间内)降解，以促进不同微囊之间的细胞连接的建立，避免因壳层的存在而阻碍或影响不同微囊之间的细胞建立相互的细胞连接。在某些优选的实施方案中，所述微囊的壳层在不超过30天、不超过25天、不超过20天、不超过15天、不超过10天、不超过5天、不超过4天、不超过3天、不超过2天、或不超过1天的时间内降解。例如，所述微囊的壳层可以在1-2天，2-3天，3-4天，4-5天，5-10天，10-15天，15-20天，20-25天，或25-30天的时间内降解。
各种生物可降解材料是本领域技术人员已知的，并且其降解性能已被进行了广泛研究(参见例如，Alexander D.Augst,Hyun Joon Kong,David J.Mooney,Alginate Hydrogels as Biomaterials,Macromol.Biosci.2006,6,623-633)。本领域技术人员可根据实际需要，选择合适的生物可降解材料来制备壳层。
在某些优选的实施方案中，所述任选的壳层的降解能够提供维持或促进所述细胞的生命活动的微环境，例如营养物质。在某些优选的实施方案中，壳层的降解产物为小分子化合物，例如有机酸、单糖(例如葡萄糖)、寡糖、氨基酸、脂质等。此类降解产物可参与到细胞的新陈代谢活动中，用于合成细胞外基质或转化为活动所需的能量。
在某些优选的实施方案中，用于制备壳层的生物可降解材料及其降解产物对于细胞是无毒的，和/或对于宿主是非免疫原性的。
在某些优选的实施方案中，用于制备壳层的生物可降解材料含有细胞外基质或其类似物(例如弹性蛋白)。细胞外基质或其类似物(例如弹性蛋白)的使用能够为微囊内的细胞的生命活动(特别是细胞的生长、粘附、伸展，以及细胞间连接的建立)提供类似于体内的有利的微环境，从而是优选的。
在某些优选的实施方案中，用于制备壳层的生物可降解材料选自胶原蛋白(例如I型，II型，III型胶原蛋白)、纤维蛋白、壳聚糖、海藻酸盐(例如海藻酸钠或海藻酸钙)、氧化海藻酸盐(例如氧化海藻酸钠)、淀粉、透明质酸，层粘连蛋白，弹性蛋白，明胶、葡聚糖、聚氨基酸(例如聚赖氨酸)、琼脂糖，或其任何组合。
在某些优选的实施方案中，所述壳层包含海藻酸盐(例如海藻酸钠或海藻酸钙)，例如包含海藻酸钙和明胶，任选地还包含弹性蛋白。
在某些优选的实施方案中，所述壳层包含海藻酸盐(例如海藻酸钠或海藻酸钙)和明胶。在某些优选的实施方案中，海藻酸盐(例如海藻酸钠或海藻酸钙)和明胶在壳层中的重量比为约10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、或1:10。在某些优选的实施方案中，海藻酸盐(例如海藻酸钠或海藻酸钙)和明胶在壳层中的重量比为10:1-9:1、9:1-8:1、8:1-7:1、7:1-6:1、6:1-5:1、5:1-4:1、4:1-3:1、3:1-2:1、2:1-1:1、1:1-1:2、1:2-1:3、1:3-1:4、1:4-1:5、1:5-1:6、1:6-1:7、1:7-1:8、1:8-1:9、1:9-1:10、10:1-5:1、5:1-1:1、1:1-1:5、1:5-1:10、2:1-1:2、4:1-1:4、或10:1-1:10。在某些优选的实施方案中，所述壳层还包含弹性蛋白。在某些优选的实施方案中，海藻酸盐(例如海藻酸钠或海藻酸钙)和弹性蛋白在壳层中的重量比为约1000:1、500:1、400:1、300:1、250:1、200:1、100:1、50:1或10:1。在某些优选的实施方案中，海藻酸盐(例如海藻酸钠或海藻酸钙)和弹性蛋白在壳层中的重量比为10:1-50:1、50:1-100:1、100:1-200:1、200:1-250:1、250:1-300:1、300:1-400:1、400:1-500:1、500:1-1000:1、10:1-100:1、100:1-200:1、200:1-300:1、300:1-400:1、400:1-1000:1、或100:1-500:1。在某些优选的实施方案中，明胶和弹性蛋白在壳层中的重量比为约1000:1、500:1、400:1、300:1、250:1、200:1、100:1、50:1或10:1。在某些优选的实施方案中，明胶和弹性蛋白在壳层中的重量比为10:1-50:1、50:1-100:1、100:1-200:1、200:1-250:1、250:1-300:1、300:1-400:1、400:1-500:1、500:1-1000:1、10:1-100:1、100:1-200:1、200:1-300:1、300:1-400:1、400:1-1000:1、或100:1-500:1。在某些优选的实施方案中，海藻酸盐(例如海藻酸钠或海藻酸钙)、明胶和弹性蛋白在壳层中的重量比为约250:250:1。在某些优选的实施方案中，海藻酸盐(例如海藻酸钠或海藻酸钙)在壳层中的重量百分比为约0.1％、0.5％、1％、1.25％、1.5％、2％、3％、4％、5％、7.5％、或10％。在某些优选的实施方案中，海藻酸盐(例如海藻酸钠或海藻酸钙)在壳层中的重量百分比为0.1％-0.5％、0.5％-1％、1％-1.25％、1.25％-1.5％、1.5％-2％、2％-3％、3％-4％、4％-5％、5％-7.5％、7.5％-10％、0.1％-1％、1％-1.5％、1％-2％、0.5-2.5％、1％-3％、5-10％、或0.5％-5％。在某些优选的实施方案中，明胶在壳层中的重量百分比为约0.1％、0.5％、1％、1.25％、1.5％、2％、3％、4％、5％、7.5％、或10％。在某些优选的实施方案中，明胶在壳层中的重量百分比为0.1％-0.5％、0.5％-1％、1％-1.25％、1.25％-1.5％、1.5％-2％、2％-3％、3％-4％、4％-5％、5％-7.5％、7.5％-10％、0.1％-1％、1％-1.5％、1％-2％、0.5-2.5％、1％-3％、5-10％、或0.5％-5％。在某些优选的实施方案中，弹性蛋白在壳层中的重量百分比为约0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.1％、0.15％、0.2％、或0.5％。在某些优选的实施方案中，弹性蛋白在壳层中的重量百分比为0.01％-0.02％、0.02％-0.03％、0.03％-0.04％、0.04％-0.05％、0.05％-0.06％、0.06％-0.07％、0.07％-0.08％、0.08％-0.1％、0.1％-0.15％、0.15％-0.2％、0.2％、0.2％-0.5％、0.01％-0.03％、0.03％-0.05％、0.05％-0.08％、0.08％-0.15％、0.01％-0.05％、0.05％-0.1％、0.03％-0.07％、0.04％-0.06％、0.01％-0.1％、0.1％-0.5％、或0.01％-0.5％。
在某些优选的实施方案中，所述壳层包含海藻酸盐(例如海藻酸钠或海藻酸钙)，例如包含海藻酸钙和明胶，任选地还包含弹性蛋白。在某些优选的实施方案中，所述壳层包含氧化海藻酸盐(例如氧化海藻酸钠)。在某些优选的实施方案中，所述壳层包含海藻酸盐(例如海藻酸钠或海藻酸钙)和琼脂糖。
在某些优选的实施方案中，可使用氧化的海藻酸盐(例如氧化的海藻酸钠和氧化的海藻酸钙)来制备微囊的壳层/外壳，并且可通过控制海藻酸盐的氧化度来调节其降解速度，从而使壳层/外壳的降解速度与包裹在其中的细胞生长速度相匹配。
因此，在某些优选的实施方案中，本发明微囊的至少一个壳层包含氧化的海藻酸盐(例如氧化的海藻酸钠和/或氧化的海藻酸钙)，从而使得能够对微囊(或其壳层)的降解速度进行控制(例如，通过控制海藻酸盐的氧化度)。在某些优选的实施方案中，本发明微囊的至少一个壳层(例如所有壳层)包含氧化的海藻酸盐(例如氧化的海藻酸钠和/或氧化的海藻酸钙)。在某些优选的实施方案中，本发明微囊的位于最外侧的壳层包含氧化的海藻酸盐(例如氧化的海藻酸钠和/或氧化的海藻酸钙)。在某些优选的实施方案中，在本发明的微囊中，仅位于最外侧的壳层包含氧化的海藻酸盐(例如氧化的海藻酸钠和/或氧化的海藻酸钙)。
在某些优选的实施方案中，所述氧化的海藻酸盐包含氧化的海藻酸钠和/或氧化的海藻酸钙。在某些优选的实施方案中，所述氧化的海藻酸盐包含氧化的海藻酸钠。在某些优选的实施方案中，所述氧化的海藻酸盐包含氧化的海藻酸钙。在某些优选的实施方案中，所述氧化的海藻酸盐包含氧化的海藻酸钠和氧化的海藻酸钙。
在某些优选的实施方案中，所述氧化的海藻酸盐的分子量为4kDa-1500kDa。在某些优选的实施方案中，所述氧化的海藻酸盐的分子量为4-10kDa、10-20kDa、20-30kDa、30-40kDa、40-50kDa、50-60kDa、60-70kDa、70-80kDa、80-90kDa、90-100kDa、100-200kDa、200-300kDa、300-400kDa、400-500kDa、500-600kDa、700-800kDa、800-900kDa、900-1000kDa、1100-1200kDa、1200-1300kDa、1300-1400kDa、或1400-1500kDa。在某些优选的实施方案中，所述氧化的海藻酸盐的分子量为32k-250k Da。在某些优选的实施方案中，所述氧化的海藻酸盐是可溶于水的。
在某些优选的实施方案中，所述氧化的海藻酸盐的G/M值为0.2-5。在某些优选的实施方案中，所述氧化的海藻酸盐的G/M值为0.2-0.3、0.3-0.4、0.4-0.5、0.5-0.6、0.6-0.7、0.7-0.8、0.8-0.9、0.9-1.0、1.0-1.5、1.5-2.0、2.0-2.5、2.5-3.0、3.0-3.5、3.5-4.0、4.0-4.5、或4.5-5.0。在某些优选的实施方案中，所述氧化的海藻酸盐的G/M值为0.2-2.5。
在某些优选的实施方案中，所述氧化的海藻酸盐的氧化度为1-40％。在某些优选的实施方案中，所述氧化的海藻酸盐的氧化度为1-2％、2-3％、3-4％、4-5％、5-6％、6-7％、7-8％、8-9％、9-10％、11-12％、12-13％、13-14％、14-15％、15-16％、16-17％、17-18％、18-19％、19-20％、20-25％、25-30％、30-35％、或35-40％。在某些优选的实施方案中，所述氧化的海藻酸盐的氧化度为2.5-4.4％、4.4-8.8％、8.8-17.6％或17.6-22％。
在某些优选的实施方案中，用于制备壳层的氧化的海藻酸盐的粘度为100-3000mPa·s。在某些优选的实施方案中，用于制备壳层的氧化的海藻酸盐的粘度为100-200、200-300、300-400、400-500、500-600、600-700、700-800、800-900、900-1000、1000-1100、1100-1200、1200-1300、1300-1400、1400-1500、1500-1600、1600-1700、1700-1800、1800-1900、1900-2000、2000-2100、2100-2200、2200-2300、2300-2400、2400-2500、2500-2600、2600-2700、2700-2800、2800-2900、或2900-3000mPa·s。在某些优选的实施方案中，用于制备壳层的氧化的海藻酸盐的粘度为200-2000mPa·s。
在某些优选的实施方案中，所述氧化的海藻酸盐是通过将从藻类(例如褐藻，例如海带和马尾藻)中提取到的海藻酸盐氧化而获得的。
在某些优选的实施方案中，本发明微囊的至少一个壳层包含1-25％(wt)的氧化的海藻酸盐。在某些优选的实施方案中，本发明微囊的至少一个壳层包含1-2％、2-3％、3-4％、4-5％、5-6％、6-7％、7-8％、8-9％、9-10％、10-15％、15-20％、20-25％(wt)的氧化的海藻酸盐。在某些优选的实施方案中，本发明微囊的至少一个壳层包含至少5％(wt)的氧化的海藻酸盐。
在某些优选的实施方案中，本发明微囊的至少一个壳层包含氧化的海藻酸盐(例如，上文所定义的氧化的海藻酸盐)，以及海藻酸盐(例如海藻酸钠和/或海藻酸钙)。
在某些优选的实施方案中，包含于所述至少一个壳层中的海藻酸盐的分子量为4kDa-1500kDa。在某些优选的实施方案中，包含于所述至少一个壳层中的海藻酸盐的分子量为4-10kDa、10-20kDa、20-30kDa、30-40kDa、40-50kDa、50-60kDa、60-70kDa、70-80kDa、80-90kDa、90-100kDa、100-200kDa、200-300kDa、300-400kDa、400-500kDa、500-600kDa、700-800kDa、800-900kDa、900-1000kDa、1100-1200kDa、1200-1300kDa、1300-1400kDa、或1400-1500kDa。在某些优选的实施方案中，包含于所述至少一个壳层中的海藻酸盐的分子量为32k-250k Da。
在某些优选的实施方案中，包含于所述至少一个壳层中的海藻酸盐的G/M值为0.2-5。在某些优选的实施方案中，包含于所述至少一个壳层中的海藻酸盐的G/M值为0.2-0.3、0.3-0.4、0.4-0.5、0.5-0.6、0.6-0.7、0.7-0.8、0.8-0.9、0.9-1.0、1.0-1.5、1.5-2.0、2.0-2.5、2.5-3.0、3.0-3.5、3.5-4.0、4.0-4.5、或4.5-5.0。在某些优选的实施方案中，包含于所述至少一个壳层中的海藻酸盐的G/M值为0.2-2.5。
在某些优选的实施方案中，用于制备所述至少一个壳层的海藻酸盐的粘度为100-3000mPa·s。在某些优选的实施方案中，用于制备所述至少一个壳层的海藻酸盐的粘度为100-200、200-300、300-400、400-500、500-600、600-700、700-800、800-900、900-1000、1000-1100、1100-1200、1200-1300、1300-1400、1400-1500、1500-1600、1600-1700、1700-1800、1800-1900、1900-2000、2000-2100、2100-2200、2200-2300、2300-2400、2400-2500、2500-2600、2600-2700、2700-2800、2800-2900、或2900-3000mPa·s。在某些优选的实施方案中，用于制备所述至少一个壳层的海藻酸盐的粘度为200-2000mPa·s。
在某些优选的实施方案中，在所述至少一个壳层中，海藻酸盐与氧化的海藻酸盐的质量比为1:9至9:1。在某些优选的实施方案中，在所述至少一个壳层中，海藻酸盐与氧化的海藻酸盐的质量比为1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2、9:1。
在某些优选的实施方案中，所述壳层包含海藻酸盐(例如海藻酸钠或海藻酸钙)和氧化海藻酸盐(例如氧化海藻酸钠)。在某些优选的实施方案中，海藻酸盐(例如海藻酸钠或海藻酸钙)和氧化海藻酸盐(例如氧化海藻酸钠)在壳层中的重量比为约10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、或1:10。在某些优选的实施方案中，海藻酸盐(例如海藻酸钠或海藻酸钙)和氧化海藻酸盐(例如氧化海藻酸钠)在壳层中的重量比为10:1-9:1、9:1-8:1、8:1-7:1、7:1-6:1、6:1-5:1、5:1-4:1、4:1-3:1、3:1-2:1、2:1-1:1、1:1-1:2、1:2-1:3、1:3-1:4、1:4-1:5、1:5-1:6、1:6-1:7、1:7-1:8、1:8-1:9、1:9-1:10、10:1-5:1、5:1-1:1、1:1-1:5、1:5-1:10、2:1-1:2、4:1-1:4、或10:1-1:10。
在某些优选的实施方案中，所述至少一个壳层在不超过28天的时间内完全降解。在某些优选的实施方案中，所述至少一个壳层在不超过21天、不超过14天、不超过12天、不超过10天、不超过9天、不超过8天、不超过7天、不超过6天、不超过5天、不超过4天、不超过3天、或不超过2天的时间内完全降解。在某些优选的实施方案中，所述至少一个壳层在2-5天，2-6天，2-8天，2-10天，2-12天，或2-14天内完全降解。
在某些优选的实施方案中，所述至少一个壳层的粘度为100-3000mPa·s。在某些优选的实施方案中，所述至少一个壳层的粘度为100-200、200-300、300-400、400-500、500-600、600-700、700-800、800-900、900-1000、1000-1100、1100-1200、1200-1300、1300-1400、1400-1500、1500-1600、1600-1700、1700-1800、1800-1900、1900-2000、2000-2100、2100-2200、2200-2300、2300-2400、2400-2500、2500-2600、2600-2700、2700-2800、2800-2900、或2900-3000mPa·s。在某些优选的实施方案中，所述至少一个壳层的粘度为200-2000mPa·s。
在某些优选的实施方案中，微囊的壳层各自任选地经过处理(例如使用壳层固定液进行处理，例如，以改善壳层的力学性能)。在某些优选的实施方案中，第一微囊和第二微囊的壳层均经过处理(例如使用壳层固定液进行处理，例如，以改善壳层的力学性能)。
在某些优选的实施方案中，用于制备核层和壳层的生物可降解材料可以是相同的或不同的。然而，特别优选地，根据其预期的目的，核层和壳层具有不同的组成。不拘于理论限制，通常认为，壳层提供了主要的力学保护作用，而核层则提供了细胞生命活动所需的主要的营养成分和微环境。因此，在某些优选的实施方案中，与壳层相比，核层具有更多的营养物质。在某些优选的实施方案中，与核层相比，壳层具有较低的降解速率，但具有更高的硬度和/或弹性模量。在某些优选的实施方案中，壳层中不包含细胞。
因此，在某些优选的实施方案中，核层和壳层由不同的生物可降解材料制成。例如，在某些优选的实施方案中，用于制备核层的生物可降解材料为，海藻酸钠和任选的I型胶原；并且，用于制备壳层的生物可降解材料为，海藻酸钙和任选的弹性蛋白。在某些优选的实施方案中，用于制备核层的生物可降解材料为淀粉；并且，用于制备壳层的生物可降解材料为海藻酸钙。在某些优选的实施方案中，用于制备核层的生物可降解材料为I型胶原；并且，用于制备壳层的生物可降解材料为聚赖氨酸。在某些优选的实施方案中，用于制备核层的生物可降解材料为I型胶原；并且，用于制备壳层的生物可降解材料为海藻酸钙。在某些优选的实施方案中，用于制备核层的生物可降解材料为聚氨酯；并且，用于制备壳层的生物可降解材料为海藻酸钙。在某些优选的实施方案中，用于制备核层的生物可降解材料为海藻酸钠；并且，用于制备壳层的生物可降解材料为聚赖氨酸。
在某些优选的实施方案中，核层和壳层分别以不同的重量比包含相同的生物可降解材料。换言之，核层和壳层可以由相同的生物可降解材料制成，但以不同的重量比包含生物可降解材料。例如，在某些优选的实施方案中，核层和壳层均由海藻酸钠制成；但核层包含不超过2％(例如1.5％)的海藻酸钠，而壳层包含超过4％(例如5％)的海藻酸钠。不超过2％(例如1.5％)的海藻酸钠能够为细胞在核层中的生长、增殖、分化或迁移提供优良的条件(通常，细胞难以在超过2％的海藻酸钠的条件下生长和存活)；而超过4％(例如5％)的海藻酸钠则能够为壳层提供足够的硬度和弹性。
在某些优选的实施方案中，所述核层和壳层包含选自下述的组合：
核层 壳层
组合1 I型胶原 海藻酸钠
组合2 I型胶原 氧化海藻酸钠
组合3 I型胶原 海藻酸钠+氧化海藻酸钠(二者浓度比为9:1)
组合4 I型胶原 海藻酸钠+氧化海藻酸钠(二者浓度比为7:3)
组合5 层粘连蛋白 海藻酸钠+琼脂糖(二者浓度比为8:2)
组合6 淀粉 氧化海藻酸钠
组合7 淀粉 海藻酸钠+氧化海藻酸钠(二者浓度比为7:3)
组合8 可降解聚氨酯 氧化海藻酸钠
组合9 可降解聚氨酯 海藻酸钠+氧化海藻酸钠(二者浓度比为9:1)
组合10 可降解性聚氨酯 海藻酸钠+明胶(二者浓度比为85:15)
在某些优选的实施方案中，所述任选的壳层各自独立地是通透性的。例如，所述壳层对于水，氧气，和营养物质(糖类例如葡萄糖，脂肪，蛋白质，氨基酸，短肽，矿物质，维生素、细胞因子、核苷酸等)是通透性的。
一般认为，半通透的(即，选择通透的)壳层的使用可能是有利的，因为其能够使得水，氧气，葡萄糖，矿物质，和氨基酸等营养物质透过壳层，进入核层，并提供给细胞，并且能够阻止对细胞有害的物质(例如来自宿主免疫系统的抗体蛋白)进入核层。然而，在本发明的微囊中，通透性壳层的使用是优选的和有利的。特别地，通透性的壳层使得各种营养物质(包括大分子和小分子营养物质，例如葡萄糖，脂肪，蛋白质，氨基酸，短肽，矿物质，维生素、细胞因子、核苷酸等)能够更加容易、顺畅地进行交换，避免局部区域的细胞无法获得充足的营养物质。例如，当使用本发明的微囊构建大尺寸的人工组织时，通透性的壳层将能够促进各种营养物质的交换，促进人工组织内部/核心区域的微囊内的细胞获得充足的营养物质。此外，通透性的壳层有利于不同微囊之间的细胞进行信号传递和建立细胞连接。特别地，细胞在生长过程中会分泌多种物质(包括细胞外基质的某些组分和多种信号分子)，与邻近的、甚至远端的细胞进行信号传递和/或物质交流，并由此对细胞自身的生命活动以及邻近的、甚至远端的细胞的生命活动产生影响或进行调控。因此，如果使用选择通透性的壳层的话，那么细胞之间的信号传递和/或物质交流将有可能受到影响/阻碍，例如细胞分泌的某些大分子信号物质(例如细胞因子蛋白)可能无法透过壳层，从而可能阻碍不同微囊之间的细胞信号的传递和细胞连接的建立，不利于构建有机的整体(例如，人工组织)。因此，通透性壳层的使用对于本发明的微囊而言是优选的。在本发明中，表述“通透性壳层”意指，各种小分子和大分子物质(例如蛋白质)能够自由通过壳层。例如，在某些优选的实施方案中，所述壳层对于分子量在5000kDa以下的分子是通透的。例如，在某些实施方案中，所述壳层对于分子量在200kDa以下或分子量在200kDa-300kDa、300kDa-400kDa、400kDa-500kDa、500kDa-800kDa、800kDa-1000kDa、1000kDa-1500kDa、1500kDa-2000kDa、2000kDa-3000kDa、3000kDa-4000kDa或4000kDa-5000kDa范围内的分子是通透的。在某些实施方案中，所述壳层对于免疫球蛋白(例如IgG、IgM、IgA、IgD、IgE)是通透的。
在某些优选的实施方案中，所述任选的壳层各自独立地具有用于微囊内外物质交换的通道或孔。在某些优选的实施方案中，营养物质(糖类例如葡萄糖，脂肪，蛋白质，氨基酸，短肽，矿物质，维生素、细胞因子、核苷酸等)通过所述通道或孔扩散进入所述微囊内。在某些优选的实施方案中，所述通道的直径为至少10、20、50、100、150、200、250、300、350、400、或500nm。在某些优选的实施方案中，所述通道的直径为例如1nm-5μm；10nm-2μm；100nm-1μm；200-800nm等。在某些优选的实施方案中，所述孔的直径为至少100、200、400、600、800、1000、1500、2000、4000、或5000nm。
本发明的m种微囊的任选的壳层的厚度可以各自独立地根据实际需要进行选择，而不受特别限制。例如，本发明微囊的壳层的厚度各自独立地可以为1-20μm，例如5-15μm，例如8-12μm。在某些优选的实施方案中，本发明的微囊的壳层的厚度各自独立地可以为约0.1、0.5、1、2、5、10、15、20、25、30、或50μm。在某些优选的实施方案中，本发明的微囊的壳层的厚度各自独立地可以为0.1-0.5、0.5-1、1-2、2-5、5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-50、50-100、100-200、200-300、300-400、400-500、0.1-1、1-5、1-10、5-10、10-20、10-30、5-20、或1-20μm。
在某些优选的实施方案中，本发明的微囊的壳层不包含细胞。
在某些优选的实施方案中，所述核层和/或任选的壳层各自独立地还包含额外的试剂，例如，营养物质、细胞外基质、细胞因子和/或药物活性成分。优选地，所述额外的试剂能够调控(例如促进)细胞(例如MSC细胞)的增殖、分化、迁移、分泌和/或新陈代谢。在某些优选的实施方案中，所述核层包含至少一种(例如1、2、3、4、5或更多种)能够调控(例如促进)细胞(例如MSC细胞)的增殖、分化、迁移、分泌和/或新陈代谢的额外的试剂。在某些优选的实施方案中，所述核层能够以受控的方式释放所述额外的试剂。
在某些优选的实施方案中，所述营养物质包括但不限于，核苷酸，氨基酸，多肽，碳水化合物(例如单糖，寡糖，多糖)，脂质，维生素等。
在某些优选的实施方案中，细胞外基质选自多糖，例如糖胺聚糖、蛋白聚糖；结构蛋白，例如胶原和弹性蛋白；粘着蛋白，例如纤粘连蛋白和层粘连蛋白。
在某些优选的实施方案中，所述细胞因子可以是用于调控细胞(例如MSC细胞)的增殖、分化、迁移、分泌和/或新陈代谢的细胞因子，包括但不限于：
-与细胞(例如MSC细胞)生长相关的细胞因子，例如胰岛素、类胰岛素生长因子(如IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ)、转化生长因子(如TGFα和TGFβ)、血管内皮生长因子、表皮生长因子、成纤细胞生长因子、血小板来源生长因子、骨肉瘤来源生长因子、生长激素释放抑制因子、神经生长因子、白细胞介素(如IL-1、IL-11、IL-3)、红细胞生长素、集落刺激因子、皮质醇、甲状腺素，或其任何组合；
-与细胞(例如MSC细胞)分化相关的细胞因子，例如Oct3/4，Sox2，Klf4，c-Myc，GATA4，TSP1，β-甘油磷酸钠，地塞米松，维生素C，胰岛素，IBMX，吲哚美锌，血小板衍生生长因子BB(PDGF-BB)，5-氮杂胞苷，或其任何组合；
-与细胞(例如MSC细胞)迁移相关的细胞因子，例如环磷酸腺苷，三磷酸磷脂酰肌醇，基质细胞衍生因子-1，N-钙粘蛋白，核因子κB，骨连接素，血栓素A2，Ras，或其任何组合；和/或
-与细胞(例如MSC细胞)新陈代谢相关的细胞因子，例如胰岛素生长因子1、TRIP-Br2、DKK-1、sRANKL、OPG、TRACP-5b、ALP、SIRT1(2-7)、PGC-1α、PGC-1β、OPG、IL-3、IL-4、IL-6、TGF-β、PGE2、G-CSF、TNF-α，或其任何组合。
在某些优选的实施方案中，所述药物活性成分为能够调控(例如促进)细胞(例如MSC细胞)的增殖、分化、迁移、分泌和/或新陈代谢的试剂。在某些优选的实施方案中，所述药物活性成分选自rhIL-2、rhIL-11、rhEPO、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、G-CSF、GM-CSF、rHuEPO、sTNF-R1、和rhTNF-α。
在某些优选的实施方案中，所述微囊包括：MSC细胞，包裹所述MSC细胞的核层，和，封装所述核层的壳层；优选地，所述核层和壳层各自独立地由生物可降解材料制成，并且所述核层提供诱导MSC向成骨细胞或骨分化的微环境(例如，所述核层包含诱导MSC向成骨细胞或骨分化的诱导因子)。在某些优选实施方案中，此类微囊的壳层也提供诱导MSC向成骨细胞或骨分化的微环境(例如，所述壳层包含诱导MSC向成骨细胞或骨分化的诱导因子)。在某些优选实施方案中，所述诱导MSC向成骨细胞或骨分化的诱导因子包含地塞米松、抗坏血酸和甘油磷酸。
在某些优选的实施方案中，所述微囊包括：MSC细胞，包裹所述MSC细胞的核层，和，封装所述核层的壳层；优选地，所述核层和壳层各自独立地由生物可降解材料制成，并且所述核层提供诱导MSC向成软骨细胞或软骨分化的微环境(例如，所述核层包含诱导MSC向成软骨细胞或软骨分化的诱导因子)。在某些优选实施方案中，此类微囊的壳层也提供诱导MSC向成软骨细胞或软骨分化的微环境(例如，所述壳层包含诱导MSC向成软骨细胞或软骨分化的诱导因子)。在某些优选实施方案中，所述诱导MSC向成软骨细胞或软骨分化的诱导因子包含TGF-β3、地塞米松、2-磷酸抗坏血酸、丙酮酸钠、脯氨酸和胰岛素-转铁蛋白-硒溶液。
本发明m种微囊所包含的细胞的数量可以各自独立地根据实际需要进行选择，而不受特别限制。例如，本发明微囊各自独立地可以包含1-106个细胞，例如10-900、20-800、30-700、40-600、50-500、60-400、70-300、80-200、10-100个、10-103个、10-104个、10-105个、10-106个细胞。在某些优选的实施方案中，本发明微囊各自独立地包含至少1、2、4、6、8、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、104、2x104、3x104、4x104、5x104、6x104、7x104、8x104、9x104、105、2x105、3x105、4x105、5x105、6x105、7x105、8x105、9x105、或106个细胞。在某些优选的实施方案中，本发明微囊各自独立地可以包含1-2、2-4、4-6、6-8、8-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100、100-150、150-200、200-300、300-400、400-500、500-1000、1000-2000、2000-3000、3000-4000、4000-5000、5000-104、104-2x104、2x104-3x104、3x104-4x104、4x104-5x104、5x104-105、105-2x105、2x105-3x105、3x105-4x105、4x105-5x105、5x105-106、1-10、2-10、2-5、5-10、10-20、20-30、30-50、2-25、25-50、2-50、50-100、100-200、50-250、250-500、500-2000、2-100、2-500、或2-2000个细胞。
不受理论限制，本发明的微囊可以包含任何种类和类型的细胞。在某些优选的实施方案中，本发明的微囊可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、或更多种类型的细胞。例如，所述细胞可以为细菌、酵母、植物细胞或动物细胞，例如哺乳动物细胞，优选人细胞。优选地，所述细胞为粘附细胞，例如分化的粘附细胞或未分化的粘附细胞。优选地，所述细胞为多能干细胞。在某些优选的实施方案中，所述粘附细胞来源于选自下述的组织：结缔组织(例如，疏松结缔组织、致密结缔组织、弹性组织、网状结缔组织和脂肪组织)、肌肉组织(例如，骨骼肌、平滑肌和心肌)、泌尿生殖组织、胃肠组织、肺组织、骨组织、神经组织和上皮组织(例如，单层上皮和复层上皮)、内胚层来源的组织、中胚层来源的组织和外胚层来源的组织。
在某些优选的实施方案中，所述粘附细胞选自肌肉细胞(例如，骨骼肌细胞、心肌细胞、平滑肌细胞和成肌细胞)、结缔组织细胞(例如，骨细胞、软骨细胞、成纤维细胞以及分化为成骨细胞、软骨细胞或淋巴组织的细胞)、骨髓细胞、内皮细胞、皮肤细胞、上皮细胞、乳腺细胞、血管细胞、血细胞、淋巴细胞、神经细胞、许旺细胞、胃肠细胞、肝细胞、胰细胞、肺细胞、气管细胞、角膜细胞、泌尿生殖细胞、肾细胞、脂肪细胞、实质细胞、周细胞、间皮细胞、基质细胞、未分化的细胞(如干细胞和祖细胞)、内胚层来源的细胞、中胚层来源的细胞、外胚层来源的细胞、癌来源的细胞，细胞系、诱导的多能干细胞(iPS)、或其任何组合。
在某些优选的实施方案中，所述核层包裹的细胞获自动物，例如哺乳动物，例如人、猿、大猩猩、牛、猪、犬、绵羊和山羊。在某些实施方案中，所述细胞为动物细胞，优选人细胞或大鼠细胞。
在某些优选的实施方案中，所述核层包裹的细胞包括未分化的细胞，例如干细胞、祖细胞或其组合。在某些优选的实施方案中，所述干细胞为多能干细胞，例如诱导的多能干细胞。在某些优选的实施方案中，所述干细胞包括间充质干细胞。在某些优选的实施方案中，所述间充质干细胞是骨髓、脂肪、脐带、脐带血、和/或胎盘来源的间充质干细胞。在某些优选的实施方案中，所述间充质干细胞是骨髓来源的间充质干细胞。在某些优选的实施方案中，所述间充质干细胞获自动物，例如哺乳动物，例如人、猿、大猩猩、牛、猪、犬、绵羊和山羊。
在某些优选的实施方案中，除了如上描述的未分化的细胞之外，所述核层包裹的细胞还包括额外细胞。在某些优选的实施方案中，所述额外细胞来源于选自下述的组织：结缔组织(例如，疏松结缔组织、致密结缔组织、弹性组织、网状结缔组织和脂肪组织)、肌肉组织(例如，骨骼肌、平滑肌和心肌)、泌尿生殖组织、胃肠组织、肺组织、骨组织、神经组织和上皮组织(例如，单层上皮和复层上皮)、内胚层来源的组织、中胚层来源的组织和外胚层来源的组织。在某些优选的实施方案中，所述额外细胞选自肌肉细胞(例如，骨骼肌细胞、心肌细胞、平滑肌细胞和成肌细胞)、结缔组织细胞(例如，骨细胞、软骨细胞、成纤维细胞以及分化为成骨细胞、软骨细胞或淋巴组织的细胞)、骨髓细胞、皮肤细胞、上皮细胞、乳腺细胞、血管细胞、血细胞、淋巴细胞、神经细胞、许旺细胞、胃肠细胞、肝细胞、胰细胞、肺细胞、气管细胞、角膜细胞、泌尿生殖细胞、肾细胞、脂肪细胞、实质细胞、周细胞、间皮细胞、基质细胞、内胚层来源的细胞、中胚层来源的细胞、外胚层来源的细胞、癌来源的细胞、细胞系、或其任何组合。在某些优选的实施方案中，所述额外细胞为内皮细胞。在某些优选的实施方案中，所述额外细胞为平滑肌细胞。
在某些优选的实施方案中，所述微囊包含未分化的细胞和额外细胞。在某些优选的实施方案中，所述未分化的细胞和额外细胞包裹于同一核层或不同核层。例如，所述未分化的细胞位于第一核层且所述额外的细胞位于第二核层，或者相反。
在某些优选的实施方案中，所述微囊包含未分化的细胞和额外细胞。在某些优选的实施方案中，所述未分化的细胞占细胞总数量的1％-100％，例如，2％-90％、3％-80％、4％-70％、5％-60％、5.5％-50％、6％-40％、6.5％-30％、7％-20％、7.5％-19％、8％-18％、8.5％-17％、9％-16％、9.1％-15％、9.2％-14％、9.3％-13％、9.4％-12％、9.5％-11.5％、9.6％-11％、9.7％-10.9％、9.8％-10.8％、9.9％-10.7％、9.9％-10.6％、9.9％-10.5％、9.9％-10.4％、9.9％-10.3％、9.9％-10.2％、9.9％-10.1％、或10.0％。在某些优选的实施方案中，所述额外细胞占细胞总数量的0％-99％，例如，1％-90％、5％-80％、10％-70％、15％-65％、20％-60％、25％-55％、30％-50％、35％-45％、36％-44％、37％-43％、38％-42％、39％-41％、39.1％、39.2％、39.3％、39.4％、39.5％、39.6％、39.7％、39.8％、39.9％、40.0％、40.1％、40.2％、40.3％、40.4％、40.5％、40.6％、40.7％、40.8％或40.9％。在某些优选的实施方案中，所述额外细胞与未分化的细胞的比例为约1:20-约1:1,例如约1:19、约1:18、约1:17、约1:16、约1:15、约1:14、约1:13、约1:12、约1:11、约1:10、约1:9、约1:8、约1:7、约1:6、约1:5、约1:4、约1:3、约1:2、或约1:1.5。在某些优选的实施方案中，所述额外细胞与未分化的细胞的比例为约1:15、约1:14、约1:13、约1:12、约1:11.5、约1:11、约1:10.5、约1:10、约1:9.5、约1:9、约1:8.5、约1:8、约1:7、约1:6、约1:5、约1:4、约1:3。在某些优选的实施方案中，所述额外细胞与未分化的细胞的比例为约1:10或约1:3。
在某些优选的实施方案中，所述核层包裹的细胞包括内皮细胞和未分化的细胞，且所述未分化的细胞为间充质干细胞，所述内皮细胞和间充质干细胞的比例为约1:10。
在某些优选的实施方案中，所述核层包裹的细胞包括平滑肌细胞和未分化的细胞，且所述未分化的细胞为间充质干细胞，所述平滑肌细胞和间充质干细胞的比例为约1:3。
本发明的m种微囊的尺寸可以各自独立地根据实际需要进行选择，而不受特别限制。球形微囊的尺寸通常可以通过其直径来进行明确定义。在严格定义的情况下，术语“直径”不能用于描述非球形的结构。然而，在本发明中，也使用术语“直径”来描述非球形的微囊的尺寸。在此情况下，术语“直径”表示，与非球形的微囊具有相同体积的球形微囊的直径。换言之，在本发明中，使用球形微囊的直径来描述具有相同体积的非球形的微囊的尺寸。因此，在某些优选的实施方案中，本发明微囊的尺寸(即，本文所定义的直径)各自独立地可以为20-2000μm，例如30-1900μm，40-1800μm，50-1700μm，60-1600μm，70-1500μm，80-1400μm，90-1300μm，100-1200μm，200-1000μm，300-800μm，400-600μm，100-500μm。在某些优选的实施方案中，本发明微囊的尺寸(即，本文所定义的直径)各自独立地可以为20-30、30-50、50-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-600、600-700、700-800、800-900、900-1000、1000-1500、1500-2000、20-50、20-100、100-200、200-400、500-600、600-800、800-1000、或1000-2000μm。在某些优选的实施方案中，本发明微囊的尺寸(即，本文所定义的直径)各自独立地为至少20、30、50、100、120、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、1500、或2000μm。
本发明的m种微囊的形状可以各自独立地根据实际需要进行选择，而不受特别限制。例如，本发明微囊各自独立地可以是球形，或者任何期望的形状(例如立方体，矩形棱柱，六棱柱，圆柱，或不规则的形状)。例如，一些形状(例如球形，立方体，矩形棱柱，六棱柱)可用于实现微囊在构建体中的紧密堆积。
在某些优选的实施方案中，本发明的微囊各自独立地为固体或半固体。在某些优选的实施方案中，本发明的微囊为凝胶态。例如，本发明的微囊的核层和/或壳层可以为凝胶态。在某些优选的实施方案中，本发明的微囊包含水凝胶。在某些优选的实施方案中，所述水凝胶包含海藻酸盐，琼脂糖，明胶，壳聚糖，或其它水溶性或亲水性聚合物。
在某些优选的实施方案中，本发明的微囊以混合物的形式存在。在此类实施方案中，微囊可以与混合物中的另一微囊接触或融合。在某些优选的实施方案中，本发明的微囊是分离的微囊。例如，在某些实施方案中，微囊不与其他的微囊直接接触。在某些优选的实施方案中，本发明的分离的微囊提供于容器中。
本发明的微囊可使用各种方法来制备。例如，在某些优选的实施方案中，可使用用于制造微球体的方法来制备本发明的微囊，例如使用造粒仪来进行制备。在某些优选的实施方案中，本发明的微囊是在无菌条件下制备的。某些优选的实施方案中，本发明的微囊是在GMP工作间中制备的。在某些优选的实施方案中，本发明的微囊在即将使用前被制备。在某些优选的实施方案中，本发明的微囊在制备后贮存于4℃，例如贮存3小时、6小时、12小时、1天、2天、或3天。
在某些优选的实施方案中，本发明的微囊能够减少细胞在生物打印过程中受到的机械损伤。例如，在某些优选的实施方案中，在使用相同生物打印机和相同打印条件的情况下，与将细胞直接用于生物打印相比，本发明的微囊能够减少细胞受到的机械损伤至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、70％、80％、或90％。在某些优选的实施方案中，本发明的微囊能够在生物打印过程中保留微囊内的细胞的生物活性(例如，增殖、分化、迁移、分泌和/或新陈代谢)。在某些优选的实施方案中，微囊内至少80％、85％、87.5％、90％、92.5％、95％、或98％的细胞在生物打印后存活至少24小时。在某些优选的实施方案中，微囊内至少90％的细胞在生物打印后存活至少3小时、6小时、12小时、1天、2天、4天、或7天。在某些优选的实施方案中，微囊内至少80％、85％、87.5％、90％、92.5％、95％、或98％的细胞在生物打印24小时后能够增殖和/或分化。在某些优选的实施方案中，微囊内至少80％、85％、87.5％、90％、92.5％、95％、或98％的细胞在生物打印24小时后具有正常的新陈代谢。在某些优选的实施方案中，微囊内至少80％、85％、87.5％、90％、92.5％、95％、或98％的细胞在生物打印24小时后能够迁移。在某些优选的实施方案中，微囊内至少80％、85％、87.5％、90％、92.5％、95％、或98％的细胞在生物打印24小时后能够分泌。
本发明的一种微囊的示意性结构示于图1中。如图1所示，本发明的一种示例性微囊包括：细胞(例如MSC细胞)，其能够进行生长、增殖、分化或迁移；包裹所述细胞的核层，其由生物可降解材料制成，并且为细胞的生命活动提供微环境；和，任选地，封装所述核层的壳层，其位于最外侧，由生物可降解材料制成，并且为内部的核层和细胞提供力学保护。在优选的实施方案中，细胞可均匀分散于核层中，或者可以聚集在一起，位于核层内部。
在某些优选的实施方案中，本发明的m种微囊(例如第一微囊和第二微囊)各自包含在不同的容器中。在某些优选的实施方案中，本发明的m种微囊(例如第一微囊和第二微囊)提供于单个容器中。合适的容器包括但不限于，皿(例如组织培养皿或细胞培养皿)，瓶，管(例如试管，离心管，微量离心管等)，多孔板的孔等。在某些优选的实施方案中，本发明的m种微囊(例如第一微囊和第二微囊)用于平行测定或高通量测定中。
在某些优选的实施方案中，本发明的m种微囊(例如第一微囊和第二微囊)各自独立地以组合物的形式存在，其中所述组合物任选地还包含载体(所述载体优选包含生物粘合剂)。在某些优选的实施方案中，本发明的m种微囊(例如第一微囊和第二微囊)共同存在于相同的组合物中，其中所述组合物任选地还包含载体(所述载体优选包含生物粘合剂)。在某些优选的实施方案中，所述载体包含生物粘合剂，或者由生物粘合剂组成。
在某些优选的实施方案中，所述载体(例如生物粘合剂)及其降解产物对于细胞是无毒的，和/或对于宿主是非免疫原性的。在某些优选的实施方案中，所述载体(例如生物粘合剂)包含生物可降解材料。在某些优选的实施方案中，所述载体(例如生物粘合剂)中的生物可降解材料是生物相容性的。
在某些优选的实施方案中，所述载体(例如生物粘合剂)中的生物可降解材料的降解能够提供维持或促进微囊内的细胞的生命活动的微环境，例如营养物质。在某些优选的实施方案中，降解产物为小分子化合物，例如有机酸、单糖(例如葡萄糖)、寡糖、氨基酸、脂质等。此类降解产物可参与到细胞的新陈代谢活动中(例如用于合成细胞外基质)，用于合成细胞外基质或转化为活动所需的能量。
在某些优选的实施方案中，所述载体(例如生物粘合剂)中的生物可降解材料是天然存在的(例如来源于动植物的天然存在的生物可降解材料，例如胶原蛋白，纤维蛋白，壳聚糖，海藻酸盐，淀粉，透明质酸，层粘连蛋白，琼脂糖，明胶，葡聚糖，以及其任意组合)，人工合成的，重组产生的，经过改性的，或者其任何组合。
在某些优选的实施方案中，所述载体(例如生物粘合剂)中的生物可降解材料是天然存在的可降解聚合物。优选地，所述可降解聚合物选自胶原蛋白，纤维蛋白，壳聚糖，海藻酸盐，淀粉，透明质酸，层粘连蛋白，明胶，葡聚糖，弹性蛋白，以及其任意组合。
在某些优选的实施方案中，所述载体(例如生物粘合剂)中的生物可降解材料是经过改性的可降解聚合物，例如经过改性的海藻酸盐，例如氧化海藻酸盐(例如氧化海藻酸钠)。
在某些优选的实施方案中，所述载体(例如生物粘合剂)中的生物可降解材料是合成的可降解聚合物。此类可降解聚合物包括但不限于，聚磷腈，聚丙烯酸及其衍生物(例如聚甲基丙烯酸，丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物)，聚乳酸(PLA)，聚羟基乙酸(PGA)，聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)，聚原酸酯(POE)，聚己内酯(PCL)，聚羟基丁酸酯(PHB)，聚氨基酸(polyamino acid)(例如聚赖氨酸)，可降解性聚氨酯，以及其任何组合。
在某些优选的实施方案中，所述载体(例如生物粘合剂)中的生物可降解材料选自胶原、纤维蛋白、壳聚糖、海藻酸盐(例如海藻酸钠或海藻酸钙)、氧化海藻酸盐(例如氧化海藻酸钠)、淀粉、透明质酸、层粘连蛋白、弹性蛋白、明胶、聚氨基酸(例如聚赖氨酸)、琼脂糖、葡聚糖、甲基纤维素、聚乙烯醇、聚丙烯酸及其衍生物(例如聚丙烯酸或其酯、聚甲基丙烯酸或其酯)、聚丙烯酰胺、聚N-取代丙烯酰胺或其任何组合。在某些优选的实施方案中，所述载体(例如生物粘合剂)包含海藻酸钠和/或氧化的海藻酸钠。
在某些优选的实施方案中，所述载体(例如生物粘合剂)包含海藻酸盐(例如海藻酸钠或海藻酸钙)和氧化海藻酸盐(例如氧化海藻酸钠)。在某些优选的实施方案中，海藻酸盐(例如海藻酸钠或海藻酸钙)和氧化海藻酸盐(例如氧化海藻酸钠)在载体中的重量比为约10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、或1:10。在某些优选的实施方案中，海藻酸盐(例如海藻酸钠或海藻酸钙)和氧化海藻酸盐(例如氧化海藻酸钠)在载体中的重量比为10:1-9:1、9:1-8:1、8:1-7:1、7:1-6:1、6:1-5:1、5:1-4:1、4:1-3:1、3:1-2:1、2:1-1:1、1:1-1:2、1:2-1:3、1:3-1:4、1:4-1:5、1:5-1:6、1:6-1:7、1:7-1:8、1:8-1:9、1:9-1:10、10:1-5:1、5:1-1:1、1:1-1:5、1:5-1:10、2:1-1:2、4:1-1:4、或10:1-1:10。
在某些优选的实施方案中，与微囊的核层或任选的壳层相比，所述载体(例如生物粘合剂)以不同的浓度包含相同的生物可降解材料，或者以不同的重量比包含相同的生物可降解材料的组合。在某些优选的实施方案中，与微囊的核层或任选的壳层相比，所述载体(例如生物粘合剂)包含不同的生物可降解材料。
在某些优选的实施方案中，所述载体还包含水，无机盐，pH缓冲剂，稳定剂，防腐剂，或其任何组合。
在某些优选的实施方案中，所述载体(例如生物粘合剂)促进微囊在构建体(例如三维构建体，组织前体，或组织)上的安置，和/或将微囊固定在构建体(例如三维构建体，组织前体，或组织)上。
在某些优选的实施方案中，载体(例如生物粘合剂)为液体或半液体(例如凝胶)。在某些优选的实施方案中，所述载体(例如生物粘合剂)的粘度为1-1000Pas，例如30-160Pas。在某些优选的实施方案中，所述载体(例如生物粘合剂)的粘度为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、25、30、50、80、100、200、300、400、500、800、或1000Pas。在某些优选的实施方案中，所述载体(例如生物粘合剂)的粘度为1-2、2-3、3-4、4-5、5-6、6-7、7-8、8-9、9-10、10-12、12-14、14-16、16-18、18-20、20-25、25-30、30-50、50-80、80-100、100-200、200-300、300-400、400-500、500-800、或800-1000、1-3、3-8、8-16、3-10、10-20、20-50、50-160Pas、或30-160Pas。
在某些优选的实施方案中，本发明的m种微囊(例如第一微囊和第二微囊)各自独立地以至少约10％、20％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、或99％(按重量计，w/w)的浓度存在于组合物中。在某些优选的实施方案中，本发明的m种微囊(例如第一微囊和第二微囊)各自独立地以10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-55％、55％-60％、60％-65％、65％-70％、70％-75％、75％-80％、80％-85％、85％-90％、90％-95％、95％-100％、50％-60％、60％-70％、70％-80％、80％-90％、90％-100％、50％-75％、75％-100％、或50％-100％(按重量计，w/w)的浓度存在于组合物中。
在某些优选的实施方案中，本发明的m种微囊(例如第一微囊和第二微囊)共同地以至少约10％、20％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、或99％(按重量计，w/w)的浓度存在于组合物中。在某些优选的实施方案中，本发明的m种微囊(例如第一微囊和第二微囊)共同地以10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-55％、55％-60％、60％-65％、65％-70％、70％-75％、75％-80％、80％-85％、85％-90％、90％-95％、95％-100％、50％-60％、60％-70％、70％-80％、80％-90％、90％-100％、50％-75％、75％-100％、或50％-100％(按重量计，w/w)的浓度存在于组合物中。
在某些优选的实施方案中，除了微囊(例如第一微囊和/或第二微囊)中包含的液体之外，所述组合物基本上不含液体，例如具有少于约1％、2.5％、5％、7.5％、或10％的液体。
在某些优选的实施方案中，第一微囊和/或第二微囊以组合物的形式存在。在某些优选的实施方案中，所述组合物中的第一微囊和/或第二微囊的平均尺寸(即，本文所定义的直径)为约20、30、50、100、120、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、1500、或2000μm。在某些优选的实施方案中，所述组合物中的第一微囊和/或第二微囊的平均尺寸为20-30、30-50、50-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-600、600-700、700-800、800-900、900-1000、1000-1500、1500-2000、20-50、20-100、100-200、200-400、500-600、600-800、800-1000、1000-2000、20-100、100-500、500-1000、300-800、30-50、30-200、30-500、30-1000、30-2000、或20-2000μm。在某些优选的实施方案中，所述组合物中的第一微囊和/或第二微囊的尺寸的变异程度小于微囊的平均尺寸的1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、或35％。在某些优选的实施方案中，所述组合物中的第一微囊和/或第二微囊所包含的细胞的平均数目为至少1、2、4、6、8、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、104、2x104、3x104、4x104、5x104、6x104、7x104、8x104、9x104、105、2x105、3x105、4x105、5x105、6x105、7x105、8x105、9x105、或106个细胞。在某些优选的实施方案中，所述组合物中的微囊所包含的细胞的平均数目为1-2、2-4、4-6、6-8、8-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100、100-150、150-200、200-300、300-400、400-500、500-1000、1000-2000、2000-3000、3000-4000、4000-5000、5000-104、104-2x104、2x104-3x104、3x104-4x104、4x104-5x104、5x104-105、105-2x105、2x105-3x105、3x105-4x105、4x105-5x105、5x105-106、1-10、2-10、2-5、5-10、10-20、20-30、30-50、2-25、25-50、2-50、50-100、100-200、50-250、250-500、500-2000、2-100、2-500、或2-2000个细胞。在某些优选的实施方案中，在本发明的组合物中，相同类型的微囊之间细胞数目的变异程度小于相同类型的微囊的平均细胞数目的1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、或35％。
在某些优选的实施方案中，通过将第一微囊和/或第二微囊与上文论述的载体(例如生物粘合剂)混合而制备所述组合物。在某些优选的实施方案中，所述组合物是在无菌条件下制备的。在某些优选的实施方案中，所述组合物是在GMP工作间中制备的。在某些优选的实施方案中，所述组合物在即将使用前被制备。在某些优选的实施方案中，所述组合物在制备后贮存于4℃，例如贮存3小时、6小时、12小时、1天、2天、或3天。在某些优选的实施方案中，所述组合物用于生物打印构建体(例如三维构建体)。在某些优选的实施方案中，所述组合物与其他生物相容性材料或组合物一起用于生物打印。
如上文所描述的，本发明微囊的壳层是通透性的。因此，在某些优选的实施方案中，载体(例如生物粘合剂)可包含额外的试剂，例如，营养物质、细胞外基质、细胞因子和/或药物活性成分。优选地，所述额外的试剂能够调控(例如促进)细胞的增殖、分化、迁移、分泌和/或新陈代谢。在某些优选的实施方案中，所述载体(例如生物粘合剂)包含至少一种(例如1、2、3、4、5或更多种)能够调控(例如促进)细胞的增殖、分化、迁移、分泌和/或新陈代谢的额外的试剂。在某些优选的实施方案中，所述载体(例如生物粘合剂)能够以受控的方式释放所述额外的试剂。
在某些优选的实施方案中，所述载体(例如生物粘合剂)可包括，维持或促进细胞的生命活动的营养物质(包括但不限于，核苷酸，氨基酸，多肽，碳水化合物(例如单糖，寡糖，多糖)，脂质，维生素，细胞培养基等等)。在某些优选的实施方案中，所述载体(例如生物粘合剂)可包括，改善或调控细胞的生命活动的物质，例如细胞因子，细胞外基质，抗凋亡剂，抗氧化剂，药物活性成分，或其任何组合。
在某些优选的实施方案中，细胞外基质选自多糖，例如糖胺聚糖、蛋白聚糖；结构蛋白，例如胶原和弹性蛋白；粘着蛋白，例如纤粘连蛋白和层粘连蛋白。
在某些优选的实施方案中，所述细胞因子可以是用于调控细胞的增殖、分化、迁移、分泌和/或新陈代谢的细胞因子，包括但不限于：
-与细胞生长相关的细胞因子，例如胰岛素、类胰岛素生长因子(如IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ)、转化生长因子(如TGFα和TGFβ)、血管内皮生长因子、表皮生长因子、成纤细胞生长因子、血小板来源生长因子、骨肉瘤来源生长因子、生长激素释放抑制因子、神经生长因子、白细胞介素(如IL-1、IL-11、IL-3)、红细胞生长素、集落刺激因子、皮质醇、甲状腺素，或其任何组合；
-与细胞分化相关的细胞因子，例如Oct3/4，Sox2，Klf4，c-Myc，GATA4，TSP1，β-甘油磷酸钠，地塞米松，维生素C，胰岛素，IBMX，吲哚美锌，血小板衍生生长因子BB(PDGF-BB)，5-氮杂胞苷，或其任何组合；
-与细胞迁移相关的细胞因子，例如环磷酸腺苷，三磷酸磷脂酰肌醇，基质细胞衍生因子-1、N-钙粘蛋白，核因子κB，骨连接素，血栓素A2，Ras，或其任何组合；和/或
-与细胞新陈代谢相关的细胞因子，例如胰岛素生长因子1、TRIP-Br2、DKK-1、sRANKL、OPG、TRACP-5b、ALP、SIRT1(2-7)、PGC-1α、PGC-1β、OPG、IL-3、IL-4、IL-6、TGF-β、PGE2、G-CSF、TNF-α，或其任何组合。
在某些优选的实施方案中，所述药物活性成分为能够调控(例如促进)细胞的增殖、分化、迁移、分泌和/或新陈代谢的试剂。在某些优选的实施方案中，所述药物活性成分选自rhIL-2、rhIL-11、rhEPO、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、G-CSF、GM-CSF、rHuEPO、sTNF-R1、和rhTNF-α。
在某些优选的实施方案中，本发明的组合物包含，上文所描述的含有MSC细胞和诱导MSC向成骨细胞或骨分化的诱导因子的微囊。优选地，在此类组合物中，所述载体(例如生物粘合剂)也包含诱导MSC向成骨细胞或骨分化的诱导因子。
在某些优选的实施方案中，本发明的组合物包含，上文所描述的含有MSC细胞和诱导MSC向成软骨细胞或软骨分化的诱导因子的微囊。优选地，在此类组合物中，所述载体(例如生物粘合剂)也包含诱导MSC向成软骨细胞或软骨分化的诱导因子。
在某些优选的实施方案中，所述组合物为液体，半固体(例如凝胶)或固体组合物，例如溶液，悬浮液，凝胶，或浓缩物。在某些优选的实施方案中，所述载体(例如生物粘合剂)和/或组合物的粘度为1-1000Pas，例如30-160Pas，例如40-120Pas，50-150Pas，80-100Pas。在某些优选的实施方案中，所述组合物是可挤出的组合物。由此，所述组合物能够被用于生物打印，以产生特定的平面和/或层状几何形状；并且优选地，所产生的平面和/或层状几何形状能够进一步堆叠，从而形成具有特定形状和结构的构建体(例如三维构建体)。因此，所述组合物可用于形成构建体(例如三维构建体)。
在某些优选的实施方案中，步骤(2)所述的细胞分布信息选自，复合结构的各个细胞层的位置或类型，各个层的细胞的类型，各个层中不同细胞的比率，各个层中的细胞分布模式，或其任何组合。
在某些优选的实施方案中，在步骤(3)中，通过生物打印(例如3D生物打印)对所述m种微囊进行排布，以制备构建体。在某些优选的实施方案中，所述构建体是三维构建体。在某些优选的实施方案中，所述构建体是活的构建体。
在某些优选的实施方案中，所述构建体包含多个微囊。在某些优选的实施方案中，所述微囊以预定的模式(即，复合结构的细胞分布模式)排布。在某些优选的实施方案中，所述复合结构是包含骨细胞和软骨细胞的复合结构，或者包含是包含内皮细胞和平滑肌细胞的复合结构，因此，所述预定的模式可基于天然组织或器官的结构和细胞分布模式(例如包含骨和软骨的天然结构或者包含包含内皮细胞和平滑肌细胞的天然结构)。在某些优选的实施方案中，所述构建体(例如三维构建体)的尺寸为至少30μm、50μm、100μm、200μm、500μm、1mm、2mm、5mm、1cm、2cm、5cm、10cm、20cm、或50cm。
在某些优选的实施方案中，所述构建体的至少一个部分是生物打印的。生物打印一般通过使用快速原型技术的方法来进行。快速原型技术是基于通过三维递送装置(例如生物打印机)将细胞/微囊和任选的限制材料向生物相容性表面(例如由水凝胶和/或多孔膜组成的生物相容性表面)上进行三维、自动化、计算机辅助的沉积。如本文中使用的，在用于指代组织和/或器官时，术语“工程化的”是指：根据计算机脚本，通过计算机辅助的装置(例如生物打印机)，将细胞、细胞溶液、细胞悬浮液、包含细胞的凝胶或浆料、细胞浓缩物、多细胞聚集体、微囊和它们的层放置以形成三维结构。在进一步的实施方案中，计算机脚本例如是一个或多个计算机程序、计算机应用或计算机模块。在更进一步的实施方案，通过细胞、多细胞体或微囊的打印后融合来形成三维组织结构。
尽管有许多方法可以用来将细胞、多细胞聚集体、微囊和/或它们的层布置在生物相容性表面上以产生三维结构(例如手动放置)，但通过自动化的、计算机辅助的机器(例如生物打印机)来放置是有利的。采用生物打印机来递送细胞、多细胞体、微囊是有利的，其优点包括：快速、精确和可再现地放置细胞、多细胞体、微囊以产生构建体，该构建体表现出具有各种组成的细胞、多细胞聚集体、微囊和/或它们的层的计划的或预先确定的取向或图案。
在一些实施方案中，生物打印方法是连续的和/或基本连续的。连续生物打印方法的非限制性实例是：经由连接到生物墨汁储存器的分配末端(例如，注射器、毛细管等)从生物打印机分配生物墨汁(例如与生物粘合剂或挤出化合物组合的微囊)。在进一步的非限制性实施方案中，连续生物打印方法是按功能单元的重复图案分配生物墨汁。在各个实施方案中，重复功能单元具有任何适宜的几何形状，包括例如：圆形、正方形、矩形、三角形、多边形和不规则的几何形状，从而产生具有通过独特生物墨汁和/或间隙空间的空间图案化而获得的平面几何形状的一个或多个组织层。在进一步的实施方案中，生物打印的功能单元的一个重复图案包括一个层，相邻地生物打印(例如堆叠)多个层以形成具有层状几何形状的工程化组织或器官。在各个实施方案中，相邻地生物打印(例如堆叠)了2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个层，以形成工程化组织或器官。在进一步的实施方案中，具有层状几何形状的组织的一个或多个层也具有平面几何形状。
除了喷墨生物打印技术之外，还可使用低温沉降成型技术或紫外光固化成型技术，对所述m种微囊进行排布，以制备构建体。关于喷墨生物打印技术、低温沉降成型技术和紫外光固化成型技术的详细描述，可参见例如，25th Anniversary Article:Engineering Hydrogelsfor Biofabrication，其通过引用以其全文并入本文。
在某些优选的实施方案中，所述构建体具有一层或多层结构。进一步优选的，每一个层结构各自由一层或多层微囊构建。不同的结构层所使用的微囊可以是相同或者不同的。例如，所述构建体可具有类似于关节的、包含骨和软骨的复合结构的细胞分布模式。
在某些优选的实施方案中，所述构建体由微囊内的细胞凝聚而形成。特别地，在本发明的实施方案中，微囊的核层和任选的壳层，以及载体(例如生物粘合剂)各自由生物可降解材料制成。因此，在生物打印后，可对构建体进行培养，由此，在微囊内部/外部各种活性物质的刺激下，微囊内的细胞开始进行生长、增殖、分化、分泌和/或迁移；微囊的核层和壳层以及载体(例如生物粘合剂)开始不断降解；细胞之间逐步凝聚/融合，建立连接(包括微囊内部的细胞连接，微囊之间的细胞连接)；并且，细胞分泌的细胞外基质也相互融合形成一体；由此，打印后精确排布的所有细胞融合形成有机排列的、一体化的复合结构(例如包含骨细胞和软骨细胞的复合结构，或者包含包含内皮细胞和平滑肌细胞的复合结构)。
在某些优选的实施方案中，所述构建体的尺寸可以为微米至厘米级别，例如1μm-1cm，例如，10μm-5mm，50μm-1mm，100μm-800μm，300μm-600μm。在某些优选的实施方案中，所述构建体的尺寸可以为至少30μm、50μm、100μm、200μm、500μm、1mm、2mm、5mm、1cm、2cm、5cm、10cm、20cm、或50cm。
在某些优选的实施方案中，所述构建体的各种微囊可在相同的培养体系中进行进一步的培养。在某些优选的实施方案中，在培养过程中，构建体的微囊中的细胞生长，增殖，分化、分泌和/或迁移；并且微囊的核层和/或壳层的生物可降解材料被至少部分降解。在某些优选的实施方案中，微囊内的细胞在培养后增殖至少2、5、10、20、50、100、200、500、1000、2000、5000、10000、20000、50000、或100000倍。在某些优选的实施方案中，微囊的核层和/或壳层的生物可降解材料被降解至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或90％。在某些优选的实施方案中，在培养后，构建体中的不同微囊之间的细胞彼此连接，并且微囊的核层和/或壳层的生物可降解材料被至少部分降解。在某些优选的实施方案中，不同微囊之间，至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或90％的细胞彼此连接。在某些优选的实施方案中，载体(例如生物粘合剂)中的生物可降解材料被降解至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或90％。在某些优选的实施方案中，核层和/或壳层和/或载体中的生物可降解材料的降解产物为细胞提供了营养物质或细胞外基质材料。在某些优选的实施方案中，所述构建体被培养至少0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、25、或30天，例如1-3、3-5、5-7、7-10、10-14、14-21、21-28、1-7、7-14、1-14、或14-28天，以产生复合结构，例如包含骨细胞和软骨细胞的复合结构，或者包含包含内皮细胞和平滑肌细胞的复合结构。在某些优选的实施方案中，所述构建体在3D培养箱中进行培养。在某些优选的实施方案中，所述构建体在生物反应器中进行培养。在某些优选的实施方案中，在培养过程中对构建体施加物理刺激(例如压力，剪切力，光照，加热等)。在某些优选的实施方案中，在培养过程中对构建体施加化学刺激(例如激素，细胞因子，化学试剂等)。
使用本发明微囊构建的三维构建体的一个实例的示意性结构示于图2中。如图2所示，该三维构建体包括两层结构，即，成骨层(其包含第一微囊)和成软骨层(其包含第二微囊)。其中，成骨层由第一微囊构建；成软骨层由第二微囊构建。成骨层和成软骨层各自可以由一层或多层细胞构成，根据所使用的微囊中含有的细胞的具体数量而定。微囊之间的间隙填充有生物粘合剂。在优选的实施方案中，生物粘合剂中可进一步包含维持、促进、改善、调控微囊内的细胞的生命活动的试剂。
使用本发明微囊构建的三维构建体的一个实例的示意性结构示于图3中。如图3所示，该三维构建体包括两部分结构，即，包含内皮细胞的部分(其包含第一微囊)和包含平滑肌细胞的部分(其包含第二微囊)。其中，包含内皮细胞的部分由第一微囊构建；包含平滑肌细胞的部分由第二微囊构建。包含内皮细胞的部分和包含平滑肌细胞的部分各自可以由一层或多层细胞构成，根据所使用的微囊中含有的细胞的具体数量而定。
在某些优选的实施方案中，本发明的三维构建体是使用本发明的微囊，通过3D生物打印方法而构建的。然而，不受于理论限制，本发明的三维构建体也可以使用本发明的微囊，通过任何其他已知的方法(例如手工放置的方法)来构建。
在某些优选的实施方案中，在步骤(3)中，通过生物打印(例如3D生物打印)对所述m种微囊进行排布，以制备构建体。在某些优选的实施方案中，本发明方法中的生物打印步骤是连续的和/或基本连续的。在某些优选的实施方案中，本发明方法包括，连续地生物打印多个层，以获得具有预定模式的、包含多个层的三维构建体，其中每个层根据预定的模式用上文定义的微囊或组合物进行生物打印。在某些优选的实施方案中，本发明方法包括，连续地生物打印多个区段，以获得具有预定模式的、包含多个区段的三维构建体，其中每个区段根据预定的模式用上文定义的微囊或组合物进行生物打印。在某些优选的实施方案中，组合物中的载体包含生物粘合剂，其将层、区段和/或构建体中的微囊粘结在一起。在某些优选的实施方案中，组合物中的载体包含生物粘合剂，其将微囊固定在层、区段和/或构建体中。在某些优选的实施方案中，所述预定的模式通过支架来限定。在某些优选的实施方案中，本发明的微囊或组合物被打印至支架上。优选地，所述支架具有预定的模式。在某些优选的实施方案中，所述支架为包含生物可降解材料的人工结构，其能够支持组合物中的微囊形成人工组织或组织前体。在某些优选的实施方案中，本发明的制备构建体的方法不使用支架。
本发明方法中，制备构建体的步骤与本领域已知的其他生物打印方法是相容的。例如，制备构建体的步骤可使用Cyfuse、Organovo和EnvisionTEC开发的生物打印机来进行。目前已开发了三种主要的生物打印机，即，喷墨型生物打印机，挤出型生物打印机和激光辅助型生物打印机(参见Murph SV and Atala A.(2014)NatureBiotechnology,32(8):773-785)。备选地，制备构建体的步骤可使用自动化或非自动化机械过程(而非打印机)的生物打印方法来进行，或者使用手工放置或手工沉积法(例如使用移液器)的生物打印方法来进行。在某些优选的实施方案中，通过喷墨方式来进行生物打印。在某些优选的实施方案中，通过挤出的方式来进行生物打印。在某些优选的实施方案中，通过手工放置或手工沉积来进行生物打印。
在某些优选的实施方案中，在步骤(3)中，使用本发明的微囊或组合物在体内进行生物打印，以在体内产生构建体。在某些优选的实施方案中，在受试者(例如人受试者)上直接进行生物打印。在某些优选的实施方案中，在受试者的组织(例如皮肤组织)的损伤位点直接进行生物打印。在某些优选的实施方案中，所述组织因创伤，感染，疾病，或老龄化而遭致损伤。在某些优选的实施方案中，根据组织或组织损伤位点的细胞分布信息，在受试者的组织(例如皮肤组织)的损伤位点直接进行生物打印。在某些优选的实施方案中，所述细胞分布信息选自，组织或组织损伤位点的各个细胞层的位置或类型，各个层的细胞的类型，各个层中不同细胞的比率，各个层中的细胞分布模式，或其任何组合。在某些优选的实施方案中，在进行生物打印之前，获得组织或组织损伤位点的细胞分布信息。在某些优选的实施方案中，所述方法还包括，获得组织或组织损伤位点的细胞分布信息，然后根据所述细胞分布信息进行生物打印。在某些优选的实施方案中，用于在受试者上进行生物打印的微囊或组合物中的细胞来源于所述受试者。在某些优选的实施方案中，用于在受试者上进行生物打印的微囊或组合物中的细胞来源于与所述受试者具有相似或相同特征(例如，物种，年龄，性别，遗传信息等)的其他受试者。在某些优选的实施方案中，用于在受试者上进行生物打印的组合物中的细胞来源于同种异体。在某些优选的实施方案中，用于在受试者上进行生物打印的微囊或组合物中的细胞来源于细胞系。在某些优选的实施方案中，使用本发明的微囊或组合物在体外进行生物打印。
本发明方法中制备构建体的步骤不会对组合物中或微囊内的细胞造成机械损伤。在某些优选的实施方案中，组合物中或微囊内至少80％、85％、87.5％、90％、92.5％、95％、或98％的细胞在生物打印后存活。在某些优选的实施方案中，组合物中或微囊内至少90％的细胞在生物打印后存活至少3小时、6小时、12小时、1天、2天、4天、或7天。在某些优选的实施方案中，组合物中或微囊内至少80％、85％、87.5％、90％、92.5％、95％、或98％的细胞在生物打印后能够增殖和/或分化。在某些优选的实施方案中，组合物中或微囊内至少80％、85％、87.5％、90％、92.5％、95％、或98％的细胞在生物打印后具有正常的新陈代谢。在某些优选的实施方案中，组合物中或微囊内至少80％、85％、87.5％、90％、92.5％、95％、或98％的细胞在生物打印后能够迁移。在某些优选的实施方案中，组合物中或微囊内至少80％、85％、87.5％、90％、92.5％、95％、或98％的细胞在生物打印后能够分泌。
在某些优选的实施方案中，在步骤(4)中，在允许微囊内的细胞增殖、分化、迁移、分泌和/或新陈代谢的条件下，培养所获得的构建体。培养条件取决于所使用的细胞类型，所使用的微囊的类型，构建体的结构和形状等等。本领域技术人员能够选择合适的培养条件，例如培养基，pH，温度，CO2水平和持续时间。一般的组织和细胞培养条件可参见例如，Doyle,Alan,and J.Bryan Griffiths,eds.Cell andtissue culture:laboratory procedures in biotechnology.NewYork:Wiley,1998。在某些优选的实施方案中，在步骤(4)中，在相同的培养体系中培养经过排布的m种微囊(即，构建体)。在某些优选的实施方案中，培养所获得的构建体至少0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、25、或30天，例如以获得所述复合结构(例如人工组织或其前体)。在某些优选的实施方案中，培养所获得的构建体1-3、3-5、5-7、7-10、10-14、14-21、21-28、1-7、7-14、1-14、或14-28天，例如以获得所述复合结构(例如人工组织或其前体)。在某些优选的实施方案中，在3D培养箱中培养所获得的构建体。在某些优选的实施方案中，在生物反应器中培养所获得的构建体。在某些优选的实施方案中，在37℃，5％CO2的条件下培养所获得的构建体。在某些优选的实施方案中，在培养过程中对构建体施加物理刺激(例如压力，剪切力，光照，加热等)。在某些优选的实施方案中，在培养过程中对构建体施加化学刺激(例如激素，细胞因子，化学试剂等)。在某些优选的实施方案中，微囊的核层和/或壳层和/或载体中的生物可降解材料在培养过程中至少一部分被降解。优选地，此类生物可降解材料的降解产物为微囊中的细胞提供了营养物质和/或细胞外基质。在某些优选的实施方案中，细胞在培养过程中的分泌物整合入构建体的细胞外基质中。在某些优选的实施方案中，微囊内的细胞在培养过程中彼此连接。在某些优选的实施方案中，微囊之间的细胞在培养过程中彼此连接。在某些优选的实施方案中，所述构建体在培养后具有高细胞密度(例如至少100、200、500、1000、2000、5000、10000、20000、50000、或100000细胞/mm3)。在某些优选的实施方案中，微囊内的细胞在培养后增殖至少2、5、10、20、50、100、200、500、1000、2000、5000、10000、20000、50000、或100000倍。
本发明方法所制备的复合结构可具有任何预定的模式，例如任何预定的形状。例如，所述复合结构可以是片状结构(例如长方形，正方形，圆形，椭圆形，六角形或不规则形状的片状结构)，或中空管状结构，或中空三维结构(例如中空立方体，中空球体，中空的矩形棱柱体，中空圆柱体，或中空的不规则形状的三维结构)，或实心三维结构(例如实心立方体，实心球体，实心矩形棱柱体，实心圆柱体，或实心不规则形状的三维结构)，或其任何组合。在某些优选的实施方案中，所述复合结构的形状模拟天然组织或器官(例如骨组织，软骨组织，和关节组织)的形状。在某些优选的实施方案中，所述复合结构的尺寸为至少30μm、50μm、100μm、200μm、500μm、1mm、2mm、5mm、1cm、2cm、5cm、10cm、20cm、或50cm。
与现有技术方法不同，在刚刚完成生物打印步骤之时，构建体中的不同微囊之间的细胞彼此不互相连接。对构建体进行进一步培养将导致细胞首先在微囊壳层内生长、增殖、分化、分泌和/或迁移；随后在培养过程中，随着微囊内生物可降解材料(例如核层和壳层中的生物可降解材料)的降解，细胞可突破微囊的壳层。由此，可在基于微囊的构建体中实现精确的细胞排布，这进而使得能够产生更加复杂的复合结构(例如组织或器官)。
在另一个方面，本发明提供了通过上述方法制备的复合结构。在某些优选的实施方案中，所述复合结构是组织前体，组织或器官。在某些优选的实施方案中，所述复合结构是包含骨细胞和软骨细胞的复合结构。在某些优选的实施方案中，所述复合结构是包含内皮细胞和平滑肌细胞的复合结构。
在某些优选的实施方案中，所述复合结构是骨组织、软骨组织、关节组织、或包含骨和软骨的复合结构。对于此类复合结构而言，其可包含，上文所描述的含有MSC细胞和诱导MSC向成骨细胞或骨分化的诱导因子的微囊，和/或，上文所描述的含有MSC细胞和诱导MSC向成软骨细胞或软骨分化的诱导因子的微囊。此类复合结构可通过使用上文所描述的含有MSC细胞和诱导MSC向成骨细胞或骨分化的诱导因子的微囊，和/或，上文所描述的含有MSC细胞和诱导MSC向成软骨细胞或软骨分化的诱导因子的微囊而制备。
在某些优选的实施方案中，所述复合结构是包含内皮细胞和平滑肌细胞的复合结构。对于此类复合结构而言，其可包含，上文所描述的含有MSC细胞和内皮细胞的微囊，和/或，上文所描述的含有MSC细胞和平滑肌细胞的微囊。此类复合结构可通过使用上文所描述的含有MSC细胞和和内皮细胞的微囊，和/或，上文所描述的含有MSC细胞和平滑肌细胞的微囊而制备。
在另一个方面，本发明提供了通过上述方法获得的构建体或复合结构(例如包含骨细胞和软骨细胞的复合结构，或包含内皮细胞和平滑肌细胞的复合结构)的用途。本发明的构建体或复合结构可用于各种应用，例如用于研究领域或医药领域的应用。例如，本发明的构建体或复合结构可用于研究干细胞分化，用于药物发现，用于药物筛选，用于体内或体外测定，用于植入宿主体内，用于组织工程或用于组织再生。本发明的构建体或复合结构还可用于制备试剂盒，所述试剂盒用于各种应用，例如用于研究领域或医药领域的应用。例如，本发明的构建体或复合结构可用于研究干细胞分化，用于药物发现，用于药物筛选，用于体内或体外测定，用于植入宿主体内，用于组织工程或用于组织再生。
在某些优选的实施方案中，本发明的构建体或复合结构可用于组织工程。在某些优选的实施方案中，构建体或复合结构中的微囊为微囊内的细胞提供了独特的微环境，从而允许研究培养条件(例如三维培养条件)的作用/影响，例如研究培养条件(例如三维培养条件)对细胞增殖、分化、新陈代谢、迁移、分泌、组织发育或器官生成(例如骨组织，软骨组织，和关节组织的发育)的影响。在某些优选的实施方案中，本发明的构建体或复合结构可用于研究干细胞分化(例如MSC细胞分化)。
在某些优选的实施方案中，本发明的构建体或复合结构可用于体外测定。在某些优选的实施方案中，所述体外测定是用于检测或测量物质(例如化学试剂，生化试剂，药物等)在生物学样品(例如细胞聚集体，组织，器官，生物体等)中的存在或活性的方法。在某些优选的实施方案中，所述体外测定是定性的。在某些优选的实施方案中，所述体外测定是定量的。示例性的体外测定包括但不限于，基于图像的测定，分泌的蛋白质的测定，标志物的表达和蛋白质的产生。在某些优选的实施方案中，体外测定用于检测或测量下述中的一个或多个：分子结合(包括放射性配体结合)，分子摄取，活性(例如，酶活性和受体活性等)，基因表达，蛋白质表达，受体激动作用，受体拮抗作用，细胞信号传导，细胞凋亡，化学敏感性，转染，细胞迁移，趋化性，细胞活力，细胞增殖，安全性，有效性，新陈代谢，毒性和滥用倾向。在某些优选的实施方案中，体外测定是免疫测定，例如竞争性免疫测定和非竞争性免疫测定。在某些优选的实施方案中，体外测定是酶联免疫吸附测定。在某些优选的实施方案中，本发明的构建体或复合结构提供了体外测定中测量或检测的分子，细胞，细胞群或组织。在某些优选的实施方案中，体外测定用于基础研究，以发现、开发或研究任何分子，细胞，或其结构或作用机制。体外测定的示例性应用包括但不限于，开发三维培养系统，研究信号传导通路，干细胞诱导和分化，细胞间相互作用等等。
在某些优选的实施方案中，本发明的构建体或复合结构可用于药物筛选或药物发现。在某些优选的实施方案中，本发明的构建体或复合结构用于制备细胞的阵列，微阵列或芯片，多细胞聚集体或组织，从而用于药物筛选或药物发现。在某些优选的实施方案中，本发明的构建体或复合结构存在于多孔容器的孔中。优选地，所述容器与自动化药物筛选方法和/或装置兼容。在某些优选的实施方案中，本发明的构建体或复合结构用于药物筛选或药物发现，以研究或开发可用于治疗疾病的药物。优选地，所述疾病包括但不限于，感染性疾病，血液疾病，肿瘤疾病，儿科疾病，心血管疾病，中枢神经系统疾病，神经内科疾病，消化内科疾病，肝病科疾病，泌尿科疾病，不孕不育，眼科疾病，肾内科疾病，骨科疾病，疼痛，呼吸病，皮肤疾病，免疫疾病，精神疾病。例如，所述疾病可以为骨科疾病。
在某些优选的实施方案中，本发明的构建体或复合结构用于体内测定。在某些优选的实施方案中，本发明的构建体或复合结构用作受试者(例如动物模型)中的异种移植物。在某些优选的实施方案中，本发明的构建体或复合结构用作移植物，用于植入受试者体内。
在某些优选的实施方案中，本发明的构建体或复合结构用于分析细胞在体内响应刺激或试剂而产生的变化(例如形态变化或功能变化)。在此类实施方案中，将构建体或复合结构的微囊中的细胞暴露于所述刺激或试剂，和，评估微囊中的细胞的功能变化。在某些优选的实施方案中，所述微囊位于受试者体内。
在某些优选的实施方案中，本发明的构建体或复合结构用于研究干细胞分化(特别是MSC细胞分化)。在某些优选的实施方案中，本发明的构建体或复合结构用于评估因子(例如，化学试剂，例如化合物；物理刺激，例如辐射或加热)对组织或组织中的细胞的作用。在某些优选的实施方案中，本发明的构建体或复合结构用于三维组织培养。在某些优选的实施方案中，本发明的构建体或复合结构用于修复受试者中损伤组织(例如，骨组织，软骨组织，关节组织，或包含内皮细胞和平滑肌细胞的组织)。
在某些优选的实施方案中，本发明的微囊用于直接在受试者中进行生物打印。在某些优选的实施方案中，根据组织的细胞分布信息来进行生物打印。在某些优选的实施方案中，所述微囊被打印至受试者中的支架上。在某些优选的实施方案中，在生物打印过程中不使用支架。在某些优选的实施方案中，所述受试者是动物模型。
在某些优选的实施方案中，本发明的构建体或复合结构用于研究体内微环境的影响，因为构建体或复合结构的微囊中的细胞能够在受试者体内增殖，分化，迁移，新陈代谢，分泌或发育。在某些优选的实施方案中，本发明的构建体或复合结构用于研究化合物(例如药物)在体内对微囊中的细胞的作用。
在某些优选的实施方案中，本发明的构建体或复合结构用于组织再生。在某些优选的实施方案中，本发明的构建体或复合结构用于体内组织或器官移植。在某些优选的实施方案中，本发明的构建体或复合结构用于保护、修复或替换受试者(例如人)体内的受损的，患病的或衰竭的组织或器官(例如，骨组织，软骨组织，关节组织，或包含内皮细胞和平滑肌细胞的组织)。在某些优选的实施方案中，本发明的构建体或复合结构用于生产细胞(例如干细胞，祖细胞，前体细胞，免疫细胞等等)，以用于细胞疗法。在某些优选的实施方案中，本发明的构建体或复合结构用于生产生物活性分子(例如激素，生长因子，细胞因子，配体等等)。优选地，所述生物活性分子可用于诱导接受本发明的构建体或复合结构或其产物(例如细胞或生物活性分子)的受试者(例如人)的组织再生。
在另一个方面，本发明提供了评估因子(例如，化学试剂，例如化合物；物理刺激，例如辐射或加热)对组织或组织中的细胞的作用的方法，其包括，将本发明的构建体或复合结构暴露于所述因子，和，评估所述构建体或复合结构中的细胞响应所述因子的变化(例如形态变化或功能变化)，从而确定所述因子对组织或组织中的细胞的作用。在某些优选的实施方案中，所述化合物是药物。在某些优选的实施方案中，所述方法用于测定所述药物的功效。在某些优选的实施方案中，所述方法用于筛选药物。在某些优选的实施方案中，所述构建体或复合结构的微囊中的细胞来源于需要所述药物的受试者。
在另一个方面，本发明提供了修复受试者中损伤组织的方法，其包括，将通过本发明方法获得的构建体或复合结构植入受试者的损伤组织，或者通过上述方法在受试者中组织的损伤位点直接生物打印出构建体或复合结构。在某些优选的实施方案中，在置于组织损伤位点的支架上进行生物打印。在某些优选的实施方案中，在生物打印过程中不使用支架。在某些优选的实施方案中，所述方法包括，获得组织或组织损伤位点的细胞分布信息，然后根据所述细胞分布信息进行生物打印。在某些优选的实施方案中，用于在受试者上进行生物打印的微囊或组合物中的细胞来源于所述受试者。在某些优选的实施方案中，用于在受试者上进行生物打印的微囊或组合物中的细胞来源于与所述受试者具有相似或相同特征(例如，物种，年龄，性别，遗传信息等)的其他受试者。在某些优选的实施方案中，用于在受试者上进行生物打印的微囊或组合物中的细胞来源于同种异体。在某些优选的实施方案中，用于在受试者上进行生物打印的微囊或组合物中的细胞来源于细胞系。
在另一个方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含通过上述方法获得的构建体或复合结构。在某些优选的实施方案中，所述药物组合物用于组织再生。在某些优选的实施方案中，所述药物组合物还包含药学可接受的载体，赋形剂，稳定剂或能够为所述药物组合物的施用(例如施用给人受试者)提供有利性质的其他试剂。合适的药物载体包括例如，无菌水，盐水，葡萄糖，蓖麻油和环氧乙烷的缩合产物，液体酸，低级醇，油(例如玉米油，花生油，芝麻油；其任选还包含乳化剂如脂肪酸的单-或二-甘油酯，或磷脂例如卵磷脂)，乙二醇，聚亚烷基二醇，藻酸钠，等等。所述载体任选地还可包含佐剂，防腐剂，稳定剂，润湿剂，乳化剂，渗透增强剂等。在某些优选的实施方案中，所述药物组合物是无菌的。此外，所述药物组合的粘度可通过选择合适的溶剂或赋形剂来控制和维持。
在某些优选的实施方案中，赋形剂和稀释剂可包括但不限于，乳糖，葡萄糖，蔗糖，山梨醇，甘露糖醇，淀粉，阿拉伯树胶，磷酸钙，海藻酸盐，黄蓍胶，明胶，硅酸钙，微晶纤维素，纤维素，水，盐水溶液，糖浆，甲基纤维素，羟基苯甲酸甲酯和丙酯，滑石，硬脂酸镁和矿物油。在某些优选的实施方案中，所述药物组合物经配制具有4.5-9.0，5.0-8.0，6.5-7.5，或6.5-7.0的pH。在某些优选的实施方案中，所述药物组合物是与血液等渗的。
在某些优选的实施方案中，所述药物组合物用于治疗需要保护、修复或置换组织(例如骨组织，软骨组织，关节组织，或包含内皮细胞和平滑肌细胞的组织)的受试者，例如人受试者。在某些优选的实施方案中，本发明提供了保护组织(例如骨组织，软骨组织，关节组织，或包含内皮细胞和平滑肌细胞的组织)的方法，其包括，给有此需要的受试者施用有效量的本发明的药物组合物。在某些优选的实施方案中，本发明提供了修护受损组织(例如骨组织，软骨组织，关节组织，或包含内皮细胞和平滑肌细胞的组织)的方法，其包括，给有此需要的受试者施用有效量的本发明的药物组合物。在某些优选的实施方案中，本发明提供了置换组织(例如受损组织，缺陷组织；例如骨组织，软骨组织，关节组织，或包含内皮细胞和平滑肌细胞的组织)的方法，其包括，给有此需要的受试者施用有效量的本发明的药物组合物。在某些优选的实施方案中，所述受试者是人。在某些优选的实施方案中，所述药物组合物用于组织再生。在某些优选的实施方案中，所述药物组合物用于细胞疗法。在某些优选的实施方案中，本发明提供了细胞疗法，其包括，给有此需要的受试者施用有效量的本发明的药物组合物。在某些优选的实施方案中，有效量的药物组合物足以改善组织(例如骨组织，软骨组织，关节组织，或包含内皮细胞和平滑肌细胞的组织)的条件(例如完整性，健康，外观等)至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或90％。药物组合物的有效量可根据实际情况来确定。
本发明的药物组合物可以通过任何合适的方式来施用。在某些优选的实施方案中，通过手术植入来使用所述药物组合物。在某些优选的实施方案中，所述药物组合物被施用一次。在某些优选的实施方案中，所述药物组合物被施用多次。在某些优选的实施方案中，所述药物组合物以选自下述的频率施用：每天三次，每天两次，每天一次，每两天一次，每3天一次，每周一次，每两周一次，每三周一次，每月一次，每两个月一次，每3个月一次，每六个月一次或每年一次。
在另一个方面，本发明提供了通过上述方法获得的构建体或复合结构用于制备上述药物组合物的用途。在某些优选的实施方案中，所述药物组合物用于组织再生，或体内组织或器官移植。在某些优选的实施方案中，所述组织是骨组织，软骨组织，和/或关节组织。在某些优选的实施方案中，所述组织是包含内皮细胞和平滑肌细胞的组织。
在另一个方面，本发明提供了一种试剂盒，其包含通过上述方法获得的构建体或复合结构(例如包含骨和软骨的复合结构，和/或包含内皮细胞和平滑肌细胞的复合结构)。
在某些优选的实施方案中，所述试剂盒包含本发明的构建体。在某些优选的实施方案中，本发明的构建体是使用上述方法制备的(例如通过生物打印)。在某些优选的实施方案中，所述试剂盒还包含，培养基，缓冲剂，和/或用于培养构建体所需的其他试剂。在某些优选的实施方案中，所述试剂盒还包含使用说明书，其描述了培养所述构建体的方法。在某些优选的实施方案中，所述试剂盒用于再生医学，例如体内移植或细胞疗法。在某些优选的实施方案中，所述试剂盒用于体外测定或药物筛选。在某些优选的实施方案中，所述试剂盒还包含，体外测定、药物筛选或再生医学(例如体内移植或细胞疗法)所需的其他试剂，和/或使用说明书。在某些优选的实施方案中，所述试剂盒还包含支架，或者用于制备支架的材料。
在某些优选的实施方案中，所述试剂盒可用于分析细胞响应刺激或试剂而产生的功能变化，用于药物筛选或药物发现，用于治疗有此需要的受试者，用于研究干细胞分化，用于评估因子(例如，化学试剂，例如化合物；物理刺激，例如辐射或加热)对组织或组织中的细胞的作用，用于三维组织培养，用于修复受试者中损伤组织。在某些优选的实施方案中，所述组织是骨组织，软骨组织，和/或关节组织，和/或包含内皮细胞和平滑肌细胞的复合结构。
本发明的试剂盒可置于任何合适的包装中。此类包装包括但不限于，瓶，罐，和软包装(如聚酯薄膜或塑料袋)。
在另一个方面，本发明提供了本发明的构建体或复合结构(例如包含骨和软骨的复合结构)用于制备试剂盒的用途，所述试剂盒可用于上文所论述的各种应用。例如，所述试剂盒可用于分析细胞响应刺激或试剂而产生的功能变化，用于药物筛选或药物发现，用于治疗有此需要的受试者，用于研究干细胞分化，用于评估因子(例如，化学试剂，例如化合物；物理刺激，例如辐射或加热)对组织或组织中的细胞的作用，用于三维组织培养，用于修复受试者中损伤组织。在某些优选的实施方案中，所述组织是骨组织，软骨组织，和/或关节组织，和/或包含内皮细胞和平滑肌细胞的复合结构。
发明的有益效果
与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下有益效果：
(1)本发明的方法无需将种子细胞种植至材料支架的操作过程，而是直接使用包含细胞的微囊(例如包含MSC细胞的微囊)来构建人工植入物。
(2)本发明的方法在操作细胞(例如MSC细胞、内皮细胞和/或平滑肌细胞)之前无需预先对细胞进行体外大量增殖；相反地，本发明的方法在将包含细胞的微囊构建成人工植入物后，其所包含的细胞直接在微囊内大量增殖并最终形成完整植入物。
(3)本发明的方法无需多种培养体系；相反地，本发明的方法能够在同一个培养体系下同时培养多种微囊，并使得微囊中的细胞增殖和/或分化为所需的各种目的细胞(例如，该方法能够在同一个培养体系下同时诱导MSCs分别分化为成骨细胞和成软骨细胞，或者在同一个培养体系下同时诱导MSCs分别分化为内皮细胞和成平滑肌细胞)。
(4)通过对包含细胞的微囊的精确排布，本发明的方法能够实现多种目的细胞(例如成骨细胞和成软骨细胞，或内皮细胞细胞和成平滑肌细胞)的精确排布，并最终形成结构功能完整的人工植入物(例如，包含骨细胞和软骨细胞的复合结构或包含内皮细胞和平滑肌细胞的复合结构)。
具体实施方式
现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。
实施例中未指明其来源的试剂、试剂盒或仪器均为市场上商购可得的常规产品。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。
实施例1.微囊的制备
本实施例提供了制备微囊的示例性方法。微囊的制备方法应当在无菌条件下进行。此外，如果意欲将微囊应用于人体的话，那么其制备方法的生物安全等级应当达到GMP车间级别。
本方法所使用的仪器为造粒仪(BUCHI，Encapsulator，B-395Pro)，其配备的同心喷嘴的直径如下：内层喷嘴，200μm；外层喷嘴，300μm。
本方法所使用的材料如下：
(1)用于制备核层的材料
I型胶原：4mg/ml，使用无菌1M NaOH进行中和；
海藻酸钠：使用去离子水溶解稀释；
血管内皮生长因子VEGF；
将I型胶原与2％(w/v)(即，2g/100ml，下同)海藻酸钠溶液以1:1的比例(按重量计)混合，用于制备核层。
(2)用于制备壳层的材料
4％海藻酸钠；
弹性蛋白；
壳层固定液，即，0.1mol/L CaCl2溶液。
(3)所使用的细胞：人脐静脉内皮细胞(HUVEC)(购买自ATCC)。
制备微囊的操作步骤如下(以下实验步骤均在冰上操作)：
将120μl NaOH溶液与750μl I型胶原混合，然后向其中加入130μl血管内皮细胞悬液(细胞浓度为1x105个/ml，悬浮于PBS中)，从而获得1ml细胞包裹液。然后，将细胞包裹液与1ml 2％海藻酸钠(包含终浓度为20ng/ml的VEGF)混合，使细胞均匀分散，从而获得包裹细胞的核层材料。
向2ml 4％海藻酸钠溶液中加入100ng弹性蛋白(elastin，其终浓度为50ng/ml)，充分混匀，该混合物用作壳层材料，用于制备微囊的壳层。此外，取300ml 0.1mol/L CaCl2溶液置于烧杯中，用于壳层材料的固定。
将如上制备的核层材料和壳层材料分别置于2支5ml注射器中。按照制造商的说明书，设置造粒仪的压力、离散力、泵的速度等参数，然后使用所述核层材料和壳层材料进行造粒和包被。造粒仪的内喷嘴的直径设置为200μm，外喷嘴的直径设置为300μm。将获得的微囊微粒收集于装有300ml 0.1mol/L CaCl2溶液的烧杯中，固定5min，制备获得微囊。所制备的微囊可以在4℃下保存，或可直接用于3D生物打印。
实施例2.微囊的表征
本实施例具体分析了通过实施例1方法制备的微囊的性能，包括微囊的尺寸，壳层的厚度和力学保护作用，所包含的细胞的数量等。
使用显微镜来观察通过实施例1方法制备的微囊，结果示于图3A-3C中。图3A-3C显示了使用造粒仪在不同仪器参数(同心喷嘴的内喷嘴和外喷嘴的直径)下制备的微囊的显微照片，其中，图3A中的微囊的直径为约120μm(标尺为100μm)；图3B中的微囊的直径为约200μm(标尺为100μm)；图3C中的微囊的直径为约450μm(标尺为200μm)。这些结果表明，可通过控制造粒仪的仪器参数(例如，同心喷嘴的内喷嘴和外喷嘴的直径)来控制微囊的尺寸。本发明的微囊的尺寸是可控的，可根据需要进行选择。
还使用显微镜进一步观察了通过实施例1方法制备的微囊的壳层厚度，结果示于图4中。图4显示了通过实施例1方法制备的微囊的显微照片，其中，高亮部分代表微囊的壳层，且该壳层的厚度为约2μm(标尺为50μm)。结果表明，可通过控制造粒仪的同心喷嘴的内喷嘴和外喷嘴的直径，壳层材料的泵出速度等参数来控制壳层的厚度。本发明的微囊的壳层厚度是可控的，可根据需要进行选择。
还使用显微镜进一步观察了通过实施例1方法制备的微囊所包含的细胞的数量。结果示于图5A-5C中。图5A-5C显示了通过实施例1方法制备的微囊的显微照片，其中，图5A中的微囊包裹的细胞数为约50个(标尺为100μm)；图5B中的微囊包裹的细胞数为约8个(标尺为100μm)；图5C中的微囊包裹的细胞数为约2个(标尺为100μm)。这些结果表明，可通过控制细胞悬液的细胞浓度来控制微囊包裹的细胞数。本发明微囊包含的细胞的数量是可控的，可根据需要进行选择。
另外，还根据制造商的说明书，使用美国Hysitron(海思创)TI-950型纳米压痕仪，检测了通过实施例1方法制备的微囊(尺寸为约400μm)的力学性能。检测结果显示，该批次的微囊的硬度平均大约为0.083GPa，弹性模量平均大约为1.683MPa。
这些结果表明，本发明微囊具有优良的力学保护性能，可有效避免微囊内的细胞遭受外界的力学损伤/机械损伤。此外，还已发现，可通过控制微囊的壳层厚度和壳层材料等参数来控制微囊的力学保护性(数据未显示)。本发明微囊的力学保护性能是可控的，可根据需要进行选择。
实施例3.其他类型的微囊的制备
还使用与实施例1类似的方法，利用造粒仪，以下述原料制备了其他类型的微囊(即，微囊B1-B4)。
图6A-6D显示了使用造粒仪制备的微囊B1-B4的显微照片，其中，图6A中的微囊为微囊B1，其直径为约600μm(标尺为500μm)；图6B中的微囊为微囊B2，其直径为约500μm(标尺为500μm)；图6C中的微囊为微囊B3，其直径为约500μm(标尺为500μm)；图6D中的微囊为微囊B4，其直径为约500μm(标尺为500μm)。这些结果表明，可使用各种合适的生物可降解材料来制备本发明的微囊。
另外，为了更清楚地观察所制备的微囊的结构，还使用trackerCM-Dil(红色荧光)对用于制备微囊B2的核层材料所包裹的细胞进行标记；并且，使用带有FITC(绿色荧光)的聚赖氨酸作为制备微囊B2的壳层材料。随后，使用共聚焦显微镜来观察用含有tracker CM-Dil标记的细胞的核层材料和带有FITC的壳层材料所制备的微囊B2。结果示于图6E中。图6E显示了用经标记的核层材料和壳层材料制备的微囊B2的共聚焦显微图像，其中，绿色荧光代表壳层，红色荧光代表核层所包裹的细胞。
实施例4.壳层含有氧化海藻酸盐的微囊的制备
本实施例提供了壳层含有氧化海藻酸盐的微囊的示例性制备方法。微囊的制备方法应当在无菌条件下进行。此外，如果意欲将微囊应用于人体的话，那么其制备方法的生物安全等级应当达到GMP车间级别。
本方法所使用的仪器为造粒仪(BUCHI，Encapsulator，B-395Pro)，其配备的同心喷嘴的直径如下：内层喷嘴，200μm；外层喷嘴，300μm。
本方法所使用的材料如下：
(1)用于制备核层的材料
I型胶原：4mg/ml，使用无菌1M NaOH进行中和；
(2)用于制备壳层的材料
指定浓度的氧化海藻酸钠溶液，或含有指定浓度的氧化海藻酸钠和其他壳层材料的混合溶液；
壳层固定液，即，0.1mol/L CaCl2溶液。
(3)所使用的细胞：人脐静脉内皮细胞(HUVEC)(购买自ATCC)、肝癌细胞(HepG2，购买自ATCC)、人成纤维细胞(购买自ATCC)、大鼠间充质干细胞(MSC，原代)。
制备微囊的操作步骤如下(以下实验步骤均在冰上操作)：
(1)将120μl NaOH溶液与750μl I型胶原混合，然后向其中加入130μl细胞悬液(细胞浓度为1x105个/ml，悬浮于PBS中)，从而获得1ml细胞包裹液，用作核层材料。
(2)配制50ml 5wt％氧化海藻酸钠溶液用作壳层材料。
(3)配制300ml 0.1M CaCl2溶液置于烧杯中，用于壳层材料的固定。
(4)将如上制备的核层材料置于2ml注射器中，并且将50ml壳层材料置于造粒仪的包裹液瓶中，随后，用所述核层材料和壳层材料进行造粒和包被。
(5)将步骤(4)的产物收集于装有300ml 0.1mol/L CaCl2溶液的烧杯中，固定5min，制备获得微囊。所制备的微囊可以在4℃下保存，或可直接用于3D生物打印。
实施例5.壳层含有氧化海藻酸盐的微囊的表征
本实施例具体分析了通过实施例4方法制备的微囊的性能，包括微囊的尺寸，壳层的厚度和力学保护作用，所包含的细胞的数量等。
使用显微镜来观察通过实施例4方法制备的微囊。在制备过程中，使用了不同的造粒仪的仪器参数(例如，同心喷嘴的内喷嘴和外喷嘴的直径)，制备了不同尺寸的微囊。结果显示，可通过控制造粒仪的仪器参数(例如，同心喷嘴的内喷嘴和外喷嘴的直径)来控制微囊的尺寸。本发明的微囊的尺寸是可控的，可根据需要进行选择。
还使用显微镜进一步观察了通过实施例4方法制备的微囊的壳层厚度。结果表明，可通过控制造粒仪的同心喷嘴的内喷嘴和外喷嘴的直径，壳层材料的泵出速度等参数来控制壳层的厚度。本发明的微囊的壳层厚度是可控的，可根据需要进行选择。
还使用显微镜进一步观察了通过实施例4方法制备的微囊所包含的细胞的数量。结果表明，可通过控制细胞悬液的细胞浓度来控制微囊包裹的细胞数。本发明微囊包含的细胞的数量是可控的，可根据需要进行选择。
另外，还根据制造商的说明书，使用美国Hysitron(海思创)TI-950型纳米压痕仪，检测了通过实施例4方法制备的微囊的力学性能。结果显示，本发明微囊具有优良的力学保护性能，可有效避免微囊内的细胞遭受外界的力学损伤/机械损伤。此外，还已发现，可通过控制微囊的壳层厚度和壳层材料等参数来控制微囊的力学保护性(数据未显示)。本发明微囊的力学保护性能是可控的，可根据需要进行选择。
实施例6.微囊壳层的降解速度的调控
在本实施例中，对微囊的壳层降解速度进行了研究。本实施例所使用的微囊基本上按照实施例4描述的方法来制备，其中根据实验设置，对所使用的造粒仪的仪器参数(例如，同心喷嘴的内喷嘴和外喷嘴的直径)、细胞(类型和数量)，核层材料，和壳层材料进行了调整。并且，在本实施例中，通过下述方法来检测所制备的微囊的壳层降解速度：将微囊在37℃培养箱中进行培养，并在指定的时间点检测微囊的质量，测定微囊的失重率。另外，还可绘制失重率-时间曲线，作为微囊壳层的降解曲线。
首先，我们检测了所使用的细胞的类型和数量，以及氧化海藻酸钠的氧化度对微囊壳层的降解速度的影响。
按照实施例4描述的方法来制备微囊，其中，所使用的细胞为HUVEC、HepG2和MSC；所使用的细胞密度为4×106/mL，6×106/mL，或12×106/mL；所使用的核层材料为包裹细胞的I型胶原；所使用的壳层材料为5wt％氧化海藻酸钠，并且氧化海藻酸钠的氧化度为2.5％、4.4％、8.8％、17.6％或22％。随后，按照上文描述的方法，测定所制备的微囊的壳层降解速度。测定结果示于表1中。
表1.
上述结果表明，用于制备微囊的细胞的类型和数量以及氧化海藻酸钠的氧化度均能够影响微囊壳层的降解速度。具体而言，(1)细胞的生长和增殖速度越快，则微囊壳层的降解速度也越快。例如，HUVEC/HepG2细胞的生长和增殖速度快于MSC，因此，在同等条件下，包含HUVEC/HepG2的微囊的壳层降解速度快于包含MSC的微囊，如微囊4和9所显示的。(2)细胞的数量越多，则微囊壳层的降解速度越快，例如，如微囊5和7所显示的。(3)氧化海藻酸钠的氧化度越高，则微囊壳层的降解速度越快，例如，如微囊4-6，或微囊9和11所显示的。
其次，我们检测了微囊壳层中氧化海藻酸钠的浓度对微囊壳层的降解速度的影响。
按照实施例4描述的方法来制备微囊，其中，所使用的核层材料为包裹细胞的I型胶原；所使用的壳层材料为指定浓度(5％、6％、7％、8％、9％、或10％)的氧化海藻酸钠，并且氧化海藻酸钠的氧化度为8.8％。随后，按照上文描述的方法，测定所制备的微囊的壳层降解速度。实验结果见表2。
表2
实验结果表明，微囊壳层中氧化海藻酸钠的浓度能够影响微囊壳层的降解速度。特别地，氧化海藻酸钠的浓度越高，则微囊壳层的降解速度越慢。
另外，我们还研究了微囊壳层中其他生物可降解材料(例如，海藻酸钠)的存在对微囊壳层的降解速度的影响。特别地，我们使用不同比例的海藻酸钠和氧化海藻酸钠来制备微囊的壳层，并研究了海藻酸钠和氧化海藻酸钠的比例对微囊壳层的降解速度的影响。
按照实施例4描述的方法来制备微囊，其中，所使用的核层材料为包裹细胞的I型胶原；所使用的壳层材料为指定比例的氧化海藻酸钠(OSA)和海藻酸钠(SA)，并且氧化海藻酸钠(OSA)和海藻酸钠(SA)的总浓度为5％。随后，按照上文描述的方法，测定所制备的微囊的壳层降解速度。实验结果见表3。
表3
结果表明，微囊壳层中氧化海藻酸钠含量的降低将导致微囊壳层的降解速度下降。特别地，氧化海藻酸钠在壳层中所占的比例越高，则微囊壳层的降解速度越快；反之，氧化海藻酸钠在壳层中所占的比例越低，则微囊壳层的降解速度越慢。
此外，我们还检测了所使用的细胞的类型对微囊壳层的降解速度的影响。
按照实施例4描述的方法来制备微囊，其中，所使用的细胞为MSC、HUVEC、HepG2或成纤维细胞；并且，在制备微囊过程中，使用相同的细胞密度(例如6×106/mL)，相同的核层材料(例如I型胶原)，相同的壳层材料(例如，5wt％氧化海藻酸钠，并且氧化海藻酸钠的氧化度为8.8％)，并且使用相同的造粒仪的仪器参数。随后，按照上文描述的方法，测定所制备的包含不同类型的细胞的微囊的壳层降解速度。
结果显示，用于制备微囊的细胞的类型能够影响微囊壳层的降解速度。具体而言，细胞的生长和增殖速度越快，则微囊壳层的降解速度也越快。例如，HUVEC/HepG2细胞的生长和增殖速度快于MSC，因此，在同等条件下，包含HUVEC/HepG2的微囊的壳层降解速度快于包含MSC的微囊。
另外，我们还检测了所使用的细胞的数量对微囊壳层的降解速度的影响。
按照实施例4描述的方法来制备微囊，其中，所使用的细胞密度为4×106/mL，6×106/mL，8×106/mL，12×106/mL，16×106/mL，或24×106/mL；并且，在制备微囊过程中，使用相同的细胞(例如HepG2细胞)，相同的核层材料(例如I型胶原)，相同的壳层材料(例如，5wt％氧化海藻酸钠，并且氧化海藻酸钠的氧化度为8.8％)，并且使用相同的造粒仪的仪器参数。随后，按照上文描述的方法，测定所制备的包含不同数量的细胞的微囊的壳层降解速度。
结果显示，用于制备微囊的细胞的数量能够影响微囊壳层的降解速度。具体而言，细胞的数量越多，则微囊壳层的降解速度越快。反之，细胞的数量越少，则微囊壳层的降解速度越慢。
此外，我们还检测了所制备的微囊的壳层厚度对微囊壳层的降解速度的影响。
按照实施例4描述的方法来制备微囊，其中，在制备微囊过程中，使用相同的细胞(例如HepG2细胞)，相同的细胞密度(例如6×106/mL)，相同的核层材料(例如I型胶原)，相同的壳层材料(例如，5wt％氧化海藻酸钠，并且氧化海藻酸钠的氧化度为8.8％)，但是通过调整造粒仪的仪器参数(例如，同心喷嘴的内喷嘴和外喷嘴的直径)，制备具有不同壳层厚度的微囊。随后，按照上文描述的方法，测定所制备的具有不同壳层厚度的微囊的壳层降解速度。
结果显示，微囊的壳层厚度能够影响微囊壳层完全降解所需的时间。具体而言，微囊的壳层越厚，则壳层完全降解所需的时间越长。
实施例7.生物墨汁的制备和表征
本实施例将根据实施例1中描述的方法制备的微囊与生物粘合剂均匀混合，制备成用于生物打印的生物墨汁。所使用的生物粘合剂为海藻酸钠+明胶。
在制备所述生物墨汁后，立即使用相差显微镜来进行观察。为了便于观察，在制备微囊时，在核层中添加了甲基紫染料。观察结果示于图7A中。
图7A显示了使用本发明的微囊制备的生物墨汁的显微照片。其中，微囊包含人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，并且其壳层的主要成分是海藻酸钙，核层的主要成分是海藻酸钠+I型胶原，且包含甲基紫染料；生物粘合剂的主要成分是海藻酸钠+明胶。另外，由于微囊和生物粘合剂的部分成分是一致的，因此，为了便于观察，在微囊中添加了甲基紫染料。从而，在图7A中，微囊显示为紫色。如图7A所示，紫色染色仅存在于微囊内部，而不存在于生物墨汁的载体(生物粘合剂)中。这表明微囊的壳层能够在生物墨汁中保持微囊的完整性。
进一步，将如上制备的生物墨汁打印为单细胞层(宽度约为250)μm，并使用显微镜来进行观察。观察结果示于图7B中。
图7B显示了用本发明的生物墨汁打印得到的单细胞层的显微照片。其中，微囊包含人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，并且其壳层的主要成分是海藻酸钙，核层的主要成分是海藻酸钠+I型胶原，且包含甲基紫染料；生物粘合剂的主要成分是海藻酸钠+明胶。在图7B中，微囊因甲基紫染料的存在，而显示为紫色。如图7B所示，紫色染色仅存在于微囊内部，而不存在于生物墨汁的载体(生物粘合剂)中。这表明微囊的壳层能够在生物打印过程中保持微囊的完整性。
为了进一步表征生物墨汁，使用粘度测定仪，测量生物粘合剂的粘度随温度(25℃-40℃)的变化情况。结果示于图8中。
图8显示了所使用的生物粘合剂(海藻酸钠+明胶)的粘度分析。结果显示，在25℃-40℃下，所使用的生物粘合剂的粘度为30-160Pas；并且，随着温度升高，生物粘合剂的粘度有所下降。另外，还已发现，生物粘合剂与微囊混合后(即，生物墨汁)的粘度未发生显著改变(数据未显示)。生物墨汁的粘度主要取决于载体(例如生物粘合剂)的粘度。
可通过控制生物粘合剂的组分的类型和含量来调整生物墨汁/生物粘合剂的粘度。通常，粘度在1-1000Pas范围内的生物墨汁可与生物打印机相容。因此，本发明的生物墨汁在4-40℃的温度下可用于本领域已知的生物打印系统。
实施例8.微囊/生物墨汁的细胞相关的性能分析
细胞的活力
在本实验中，通过染色法检测了微囊内的细胞活性。所使用的试剂如下：
钙黄绿素CaAM(公司：Invitrogen，货号：C3100MP)，其用于活细胞染色，能够对细胞浆进行标记，显示绿色荧光。使用方法：用10ulDMSO溶解50ug钙黄绿素，然后添加10ml PBS并混匀。所获得的溶液中钙黄绿素的终浓度为5mmol/l。
碘化丙啶核酸染料(公司：Invitrogen，货号：P1304MP)，其用于死细胞染色，能够对细胞核进行标记，显示红色荧光。使用方法：用双蒸水将碘化丙啶核酸染料稀释至1mg/ml，用作储存液；然后用PBS将储存液以1:3000的比例稀释至终浓度500nM，用作工作液。
染色方法如下：
将通过实施例1方法制备的微囊(包含HUVEC，100个细胞/微囊)置于1ml CaAM中，于37℃孵育1h；然后加入1ml碘化丙啶核酸染料，染色15min。之后，使用激光共聚焦显微镜观察微囊的染色结果。结果示于图9A-9D中。
图9A-9D显示了使用共聚焦显微镜观察通过实施例1方法制备的微囊中细胞活力的分析结果，其中，所述微囊用钙黄绿素(绿色荧光)和碘化丙啶(红色荧光)进行了双重染色；所使用的细胞为人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，壳层的主要成分是海藻酸钙，核层的主要成分是海藻酸钠+I型胶原。
图9A显示了在微囊制备之后立即进行的微囊中细胞活力的分析结果。在图9A中，每个标记的白色圆圈代表一个微囊，并且，高亮点为红色荧光(代表死细胞)，低亮点为绿色荧光(代表活细胞)。使用image pro plus软件，对红色、绿色进行颜色聚类统计，并计算红光斑和绿光斑的数量、面积、平均光密度、直径、累计光密度，由此确定红、绿像素点的个数，并计算细胞生存率。细胞生存率＝活细胞数量/(活细胞数+死细胞数)。图9A的结果显示，在用实施例1的方法制备微囊后，微囊中98％以上的细胞存活。
图9B显示了将制备的微囊在4℃下贮存3小时后，微囊中细胞活力的分析结果。在图9B中，每个标记的白色圆圈代表一个微囊，并且，高亮点为红色荧光(代表死细胞)，低亮点为绿色荧光(代表活细胞)。如图9A，使用image pro plus软件计算细胞生存率。图9B的结果显示，所制备的微囊在4℃下保存3小时后，微囊中的细胞仍然保持高活力(存活率为90％)。
图9C显示了在将微囊制备成生物墨汁并进行生物打印后，立即进行的微囊中细胞活力的分析结果。在图9C中，高亮点为红色荧光(代表死细胞)，低亮点为绿色荧光(代表活细胞)。如图9A，使用image proplus软件计算细胞生存率。图9C的结果显示，将微囊制备成生物墨汁并立即进行生物打印后，微囊中的细胞仍然保持高活力(存活率为97％)。
图9D显示了所制备的微囊在37℃下，在H-DMEM培养基中培养5天后，微囊中细胞活力的分析结果。在图9D中，高亮点为红色荧光(代表死细胞)，低亮点为绿色荧光(代表活细胞)。如图9A，使用image proplus软件计算细胞生存率。图9D的结果显示，所制备的微囊在37℃下培养5天后，微囊中的细胞仍然保持高活力(存活率为95％)。
细胞的粘附和伸展
将包含HepG2细胞的微囊在37℃，5％CO2，含10％FBS(胎牛血清)的H-DMEM培养基中培养5天，以允许细胞伸展，增殖，并建立微囊内的细胞之间的连接(即，粘附)。如上文所述的，使用钙黄绿素(绿色荧光)和碘化丙啶(红色荧光)对微囊进行双重染色，并使用激光共聚焦显微镜进行观察。观察结果示于图10A-10B中。
图10A-10B显示了使用共聚焦显微镜观察通过实施例1方法制备的微囊中细胞的粘附和伸展的分析结果，其中，所述微囊用钙黄绿素(绿色荧光)和碘化丙啶(红色荧光)进行了双重染色；所使用的细胞为HepG2细胞，壳层的主要成分是海藻酸钙，核层的主要成分是海藻酸钠+I型胶原。
图10A显示了在培养微囊第1天，使用共聚焦显微镜观察到的照片(放大倍数：40倍)，其中细胞呈圆形，未粘附伸展。图10B显示了培养所述微囊5天后，使用共聚焦显微镜观察到的照片(放大倍数：200倍)，其中细胞粘附伸展。图10A-10B的结果表明，在培养5天后，微囊内的细胞伸展并建立细胞间连接。
细胞的增殖
将包含HepG2细胞的微囊(100个细胞/微囊)在37℃，5％CO2，含10％FBS(胎牛血清)的H-DMEM培养基中培养5天，以允许细胞增殖。随后，使用DAPI(蓝色荧光)和EdU(红色荧光)对细胞进行双重染色，并使用激光共聚焦显微镜进行观察。观察结果示于图11中。
图11显示了使用共聚焦显微镜观察微囊中的细胞增殖的分析结果(放大倍数：200倍)，其中，所述微囊用DAPI(蓝色荧光)和EdU(红色荧光)进行了双重染色；所使用的细胞为HepG2细胞，壳层的主要成分是海藻酸钙，核层的主要成分是海藻酸钠+I型胶原。图11的结果表明，在培养5天后，微囊内的细胞处于增殖状态。
微囊与细胞微球的比较
在本实验中，将本发明微囊中的细胞增殖/连接情况与通过传统方法制备的细胞微球中的细胞增殖/连接情况进行了比较。
通过下述传统方法来制备细胞微球：使用造粒仪，用海藻酸钠直接包裹细胞，以形成细胞液滴；随后，将细胞液滴置于CaCl2溶液中，以使海藻酸钠在钙离子的作用下形成海藻酸钙，从而将细胞液滴交联固化成细胞微球。
另外，通过实施例1的方法来制备微囊，其中，所使用的细胞为HepG2细胞，壳层的主要成分是海藻酸钙，核层的主要成分是海藻酸钠+I型胶原。
将如上制备的细胞微球和微囊于37℃、5％CO2环境下培养7天。并且，在培养之前和培养7天后，用钙黄绿素(绿色荧光)对细胞微球和微囊进行染色。染色结果示于图12A-12E中。
图12A-12B显示了通过传统方法制备的细胞微球在培养过程中的细胞增殖情况(标尺为500μm)。结果显示，与培养之前(图12A)相比，培养7天后(图12B)的细胞微球中的细胞增殖不明显，细胞呈圆形，散在分布，细胞之间未建立连接。
图12C-12D显示了使用实施例1方法制备的微囊在培养过程中的细胞增殖情况(标尺为500μm)。结果显示，与培养之前(图12C)相比，培养7天后(图12D)的微囊中的细胞增殖明显，细胞在微囊中伸展、粘附，并相互连接在一起。
图12E显示了使用实施例1方法制备的微囊在培养7天后的显微照片(标尺为100μm)。结果显示，微囊中的HepG2细胞之间相互连接，形成有机的整体。
图12A-12E的结果表明，与传统方法制备的细胞微球相比，本发明的微囊能够更好地促进细胞的增殖，促进细胞之间建立连接。这对于后续的组织形成具有重要意义。
细胞间连接的建立-1
在本实验中，使用共聚焦显微镜观察微囊内部的细胞间连接的建立。
通过实施例1的方法来制备微囊，其中，所使用的细胞为HepG2，其用cell tracker Green CMFDA(绿色荧光)进行标记，以及人HUVEC细胞，其用tracker CM-Dil(红色荧光)进行标记；壳层的主要成分是海藻酸钙，核层的主要成分是海藻酸钠+I型胶原。将所制备的微囊于37℃、5％CO2环境下培养7天，随后用共聚焦显微镜进行观察。观察结果示于图13中。
图13显示了使用共聚焦显微镜观察培养7天后的微囊的结果(图中标尺为100μm)，其中，所使用的微囊同时包含用绿色荧光标记的HepG2细胞和用红色荧光标记的HUVEC细胞，并且图中的黄色区域是由红色荧光和绿色荧光叠加所致，这表明HepG2细胞和HUVEC细胞之间建立了连接。结果显示，微囊内部的HepG2细胞之间、HUVEC细胞之间以及HepG2细胞与HUVEC细胞之间均建立了细胞间连接。
细胞间连接的建立-2
本实验中，使用共聚焦显微镜观察微囊之间的细胞连接的建立情况。
通过实施例1方法来制备微囊，其中，壳层的主要成分是海藻酸钙，核层的主要成分是海藻酸钠+I型胶原。微囊于37℃、5％CO2环境下培养7天后，用共聚焦显微镜进行观察。结果如图14A-14C所示。
图14A显示了使用共聚焦显微镜观察培养7天后的微囊的结果(图中标尺为100μm)，其中，所使用的微囊包含分别用cell trackerGreen CMFDA(绿色荧光)标记的HepG2细胞和HUVEC细胞。结果显示，两个微囊的细胞之间建立了细胞连接，如方框中的桥状结构所显示的。
图14B显示了使用共聚焦显微镜观察培养7天后的微囊的结果(图中标尺为500μm)，其中，使用了两种微囊：一种微囊包含用celltracker Green CMFDA(绿色荧光)标记的HepG2细胞，且另一种微囊包含用tracker CM-Dil(红色荧光)标记的HUVEC细胞；并且，图中的黄色区域是由红色荧光和绿色荧光叠加所致。结果显示，表达红色荧光的微囊与表达绿色荧光的微囊之间建立了细胞连接，如图中的黄色区域所显示的。
图14C显示了使用共聚焦显微镜观察培养7天后的微囊的结果(图中标尺为500μm)，其中，所使用的微囊包含用cell tracker GreenCMFDA(绿色荧光)标记的HepG2细胞和HUVEC细胞；并且，图中的各个白色圆环分别表示一个微囊。结果显示，不同微囊的细胞之间建立了细胞连接，并形成有机的整体。
本实施例的结果显示，细胞在本发明的微囊内具有高活力(存活率为98％以上)，并且能够在微囊内正常生长，增殖，伸展和分化。此外，本实施例的结果还显示，微囊内部的细胞之间以及不同微囊的细胞之间能够建立细胞间连接。这表明，本发明的微囊以及其制备方法能够有效保持细胞的活力，并且能够促进细胞在微囊内增殖，促进细胞之间建立连接，从而可有利地用于下游的各种应用，例如生物打印。
实施例9.包含MSC细胞的微囊的制备及应用
使用与实施例1类似的方法，利用造粒仪，制备了包裹MSC细胞的微囊，其中，所使用的细胞为来自原代培养的大鼠的MSC细胞(其用cell tracker dil标记红色荧光)，核层材料为I型胶原，壳层材料为聚赖氨酸。
将包含MSC细胞的微囊在37℃，5％CO2的环境下进行培养，以允许细胞伸展，增殖，并建立细胞之间的连接。使用显微镜来观察培养之前、培养7天后以及培养9天后的包含MSC细胞的微囊，结果示于图15中。
图15显示了包含MSC细胞的微囊的显微照片，其中，图15A显示了培养第2天的包含MSC细胞的单个微囊(标尺为100μm)；图15B显示了培养7天后的包含MSC细胞的微囊(标尺为500μm)；图15C显示了培养9天后的包含MSC细胞的微囊(标尺为500μm)。结果显示，培养7天后，多个包含MSC细胞的微囊相互融合(如图15B中的白色箭头所指示的)；并且，培养9天后，包含MSC细胞的微囊完全融合，形成有机整体(如图15C所显示的)。
实施例10.包含MSC细胞和诱导因子的微囊的制备
本实施例提供了制备包含MSC细胞和诱导因子的第一微囊和第二微囊的示例性方法。微囊的制备方法应当在无菌条件下进行。此外，如果意欲将微囊应用于人体的话，那么其制备方法的生物安全等级应当达到GMP车间级别。
本方法所使用的仪器为造粒仪(BUCHI，Encapsulator，B-395Pro)，其配备的同心喷嘴的直径如下：内层喷嘴，200μm；外层喷嘴，300μm。
本方法所使用的材料如下：
(1)用于制备核层的材料
海藻酸钠：使用去离子水溶解稀释；
I型胶原：4mg/ml，使用无菌1M NaOH进行中和；
在I型胶原中添加下述因子：
(1)诱导MSC向成骨细胞或骨分化的诱导因子：0.1μM地塞米松、0.05mM抗坏血酸、以及10mM甘油磷酸；用于制备第一微囊。或者
(2)诱导MSC向成软骨细胞或软骨分化的诱导因子：10ng/mlTGF-β3、100nM地塞米松、50μg/ml的2-磷酸抗坏血酸、100μg/ml丙酮酸钠、40μg/ml脯氨酸以及胰岛素-转铁蛋白-硒溶液(ITS+,Collaborative Biomedical,Bedford,MA,USA)；用于制备第二微囊。
将I型胶原与2％(w/v)海藻酸钠以1:1的比例(按重量计)混合，用于制备核层。
(2)用于制备壳层的材料
4％海藻酸钠；
弹性蛋白；
壳层固定液，即，0.1mol/L CaCl2溶液。
(3)所使用的细胞：MSC细胞(购买自ATCC)。
制备微囊的操作步骤如下(以下实验步骤均在冰上操作)：
将120μl NaOH溶液与750μl I型胶原混合，然后向其中加入130μl MSC细胞悬液(细胞浓度为1x 105个/ml，悬浮于PBS中)，从而获得1ml细胞包裹液。然后，将细胞包裹液与1ml 2％海藻酸钠混合，使细胞均匀分散，从而获得包裹细胞的核层材料。
向2ml 4％海藻酸钠溶液中加入100ng弹性蛋白(elastin，其终浓度为50ng/ml)，充分混匀，该混合物用作壳层材料，用于制备微囊的壳层。此外，取300ml 0.1mol/L CaCl2溶液置于烧杯中，用于壳层材料的固定。
将如上制备的核层材料和壳层材料分别置于2支5ml注射器中。按照制造商的说明书，设置造粒仪的压力、离散力、泵的速度等参数，然后使用所述核层材料和壳层材料进行造粒和包被。造粒仪的内喷嘴的直径设置为200μm，外喷嘴的直径设置为300μm。将获得的微囊微粒收集于装有300ml 0.1mol/L CaCl2溶液的烧杯中，固定5min，制备获得第一微囊和第二微囊。所制备的微囊可以在4℃下保存，或可直接用于3D生物打印。
实施例11.包含MSC细胞和诱导因子的微囊的表征
本实施例具体分析了通过实施例10方法制备的微囊的性能，包括微囊的尺寸，壳层的厚度和力学保护作用，所包含的细胞的数量等。
使用显微镜来观察通过实施例10方法制备的第一微囊，结果示于图16A-16B中。图16A显示了通过实施例10方法制备的第一微囊在37℃，5％CO2下培养1天后的显微照片。结果显示，细胞正常生长，但未出现分化。图16B显示了通过实施例1方法制备的第一微囊在37℃，5％CO2下培养10天后经茜素红染色的显微照片，其中，粗箭头所指处为一个完整的微囊，细箭头所指处为钙结节。结果显示，微囊内出现大量钙结节，如细箭头所指示的。这表明，第一微囊中的MSC细胞向成骨细胞分化。
此外，还如实施例2中所描述的，使用不同的造粒仪的仪器参数(例如，同心喷嘴的内喷嘴和外喷嘴的直径)，制备了不同尺寸的微囊。结果显示，可通过控制造粒仪的仪器参数(例如，同心喷嘴的内喷嘴和外喷嘴的直径)来控制包含MSC细胞和诱导因子的微囊的尺寸。本发明的微囊的尺寸是可控的，可根据需要进行选择。
另外，还如实施例2中所描述的，使用显微镜进一步观察了通过实施例10方法制备的微囊的壳层厚度。结果表明，可通过控制造粒仪的同心喷嘴的内喷嘴和外喷嘴的直径，壳层材料的泵出速度等参数来控制壳层的厚度。本发明的包含MSC细胞和诱导因子的微囊的壳层厚度是可控的，可根据需要进行选择。
还如实施例2中所描述的，使用显微镜进一步观察了通过实施例10方法制备的微囊所包含的MSC细胞的数量。结果表明，可通过控制细胞悬液的细胞浓度来控制微囊包裹的细胞数。本发明微囊包含的MSC细胞的数量是可控的，可根据需要进行选择。
另外，还根据制造商的说明书，使用美国Hysitron(海思创)TI-950型纳米压痕仪，检测了通过实施例10方法制备的微囊的力学性能。结果显示，本发明的包含MSC细胞和诱导因子的微囊具有优良的力学保护性能，可有效避免微囊内的细胞遭受外界的力学损伤/机械损伤。此外，还已发现，可通过控制微囊的壳层厚度和壳层材料等参数来控制微囊的力学保护性(数据未显示)。本发明微囊的力学保护性能是可控的，可根据需要进行选择。
实施例12.用于生物打印的组合物的制备和表征
本实施例将根据实施例10中描述的方法制备的微囊与生物粘合剂均匀混合，制备成用于生物打印的组合物。所使用的生物粘合剂为海藻酸钠+明胶。
在制备所述组合物后，立即使用相差显微镜来进行观察。结果显示，微囊的壳层能够在组合物中保持微囊的完整性。
进一步，将如上制备的组合物打印为单细胞层(宽度约为250)μm，并使用显微镜来进行观察。结果显示，本发明的微囊的壳层能够在生物打印过程中保持微囊的完整性。
为了进一步表征用于生物打印的组合物，使用粘度测定仪，测量生物粘合剂的粘度随温度(25℃-40℃)的变化情况。结果显示，随着温度升高，生物粘合剂的粘度有所下降。另外，还已发现，生物粘合剂与微囊混合后的粘度未发生显著改变(数据未显示)。用于生物打印的组合物的粘度主要取决于载体(例如生物粘合剂)的粘度。
可通过控制生物粘合剂的组分的类型和含量来调整组合物/生物粘合剂的粘度。通常，粘度在1-1000Pas范围内的组合物可与生物打印机相容。因此，本发明的组合物在4-40℃的温度下可用于本领域已知的生物打印系统。
实施例13.包含MSC细胞和诱导因子的微囊/组合物的细胞相关的性能分析
细胞的活力
在本实验中，通过染色法检测了微囊内的细胞活性。所使用的试剂如下：
钙黄绿素CaAM(公司：Invitrogen，货号：C3100MP)，其用于活细胞染色，能够对细胞浆进行标记，显示绿色荧光。使用方法：用10ulDMSO溶解50ug钙黄绿素，然后添加10ml PBS并混匀。所获得的溶液中钙黄绿素的终浓度为5mmol/l。
碘化丙啶核酸染料(公司：Invitrogen，货号：P1304MP)，其用于死细胞染色，能够对细胞核进行标记，显示红色荧光。使用方法：用双蒸水将碘化丙啶核酸染料稀释至1mg/ml，用作储存液；然后用PBS将储存液以1:3000的比例稀释至终浓度500nM，用作工作液。
染色方法如下：
将通过实施例10方法制备的微囊(包含HUVEC，100个细胞/微囊)置于1ml CaAM中，于37℃孵育1h；然后加入1ml碘化丙啶核酸染料，染色15min。之后，使用激光共聚焦显微镜观察微囊的染色结果。结果显示，在用实施例10的方法制备微囊后，微囊中98％以上的细胞存活；并且，所制备的微囊在4℃下保存3小时后，微囊中的细胞仍然保持高活力(存活率为98％)。此外，结果还显示，将微囊制备成组合物并立即进行生物打印后，微囊中的细胞仍然保持高活力(存活率为97％)；并且，所制备的微囊在37℃下培养5天后，微囊中的细胞仍然保持高活力(存活率为95％)。
细胞的粘附和伸展
使用共聚焦显微镜观察通过实施例10方法制备的微囊中MSC细胞的粘附和伸展。结果显示，在培养5天后，微囊内的MSC细胞伸展并建立细胞间连接。
细胞的增殖
使用共聚焦显微镜观察微囊中的MSC细胞增殖结果表明，在培养5天后，微囊内的MSC细胞处于增殖状态。
本实施例的结果显示，MSC细胞在本发明的微囊内具有高活力(存活率为98％以上)，并且能够在微囊内正常生长，增殖，伸展和分化。这表明，本发明的包含MSC细胞和诱导因子的微囊以及其制备方法能够有效保持细胞的活力，从而可有利地用于下游的各种应用，例如生物打印。
实施例14.包含骨和软骨的三维构建体的生物打印
本实施例示例性地使用包含根据实施例10描述的方法制备的微囊的组合物，通过生物打印方法，构建了包含骨和软骨的复合结构。
简言之，该方法包含下述步骤：
(1)采集大鼠关节(例如膝关节)的生物学信息，并构建关节结构数字模型。
(2)使用实施例10中描述的方法，构建第一微囊和第二微囊。
(3)将生物粘合剂分别与前一步骤获得的2种微囊混合，制备获得2种组合物。所使用的生物粘合剂为海藻酸钠+明胶；生物粘合剂与微囊的用量比为1:4(按重量计)。
应当注意的是，步骤(1)可以在步骤(2)和(3)之前，与之同时，或之后进行。
(4)使用3D生物打印机，以旋转打印方式进行打印。打印过程中，以关节结构数字模型为模板，使用对应的组合物进行生物打印。微囊通过生物粘合剂而固化，形成关节前体。
(5)将关节前体置于三维培养箱中，在37℃，5％CO2的条件下使用常规细胞培养基(H-DMEM培养基+10％胎牛血清)对关节前体进行培养。培养过程中，可对关节前体施加物理刺激，例如剪切力。连续培养7-10天，使关节前体形成关节组织。
实施例15.包含内皮细胞或平滑肌细胞的微囊的制备方法
(1)制备含内皮细胞和MSC细胞的微囊
使用MSCs和内皮细胞以10:1的比例共混(细胞浓度：4x106/ml)，作为微囊的种子细胞，使用聚赖氨酸制备微囊的壳层，I型胶原制备微囊的核层，按照实施例1的过程制成第一微囊。
(2)制备含平滑肌细胞和MSC细胞的微囊
使用MSCs和平滑肌细胞以3:1的比例共混(细胞浓度：4.6x106/ml)，作为微囊的种子细胞，使用聚赖氨酸制备微囊的壳层，I型胶原制备微囊的核层，按照实施例1的过程制成第二微囊。
实施例16.包含内皮细胞和平滑肌细胞的复合结构的制备
如图17所示，将实施例15制备的第一微囊规则排列在组织前体的外层，将实施例15制备的第二微囊规则排列在组织前体的内部，形成组织前体。
将组织前体置于37℃、5％CO2、含10％胎牛血清的H-DMEM环境下培养7天，形成直径约3mm大小的组织块。随后，对获得的组织块进行HE染色和免疫组化染色；其中，针对CD31的免疫组化染色用于指示内皮细胞，且针对α-SMA的免疫组化染色用于指示平滑肌细胞。染色结果示于图18。图18的染色结果显示：(1)经过培养后，第一微囊内的MSC干细胞分化为内皮细胞，且，第二微囊内的MSC干细胞分化为平滑肌细胞；(2)第一微囊和第二微囊内的细胞按照设计好的结构规则排列：含有内皮细胞的组织位于组织块的外层，含有平滑肌细胞的组织位于组织块的内部；并且，(3)两种微囊融合成有机的整体(即，复合结构)。这些实验结果表明，所制备的微囊可以用于制备含有内皮细胞和平滑肌细胞的复合结构。
实施例17.三维构建体的生物打印
本实施例示例性地使用包含根据实施例1描述的方法制备的微囊的生物墨汁，通过生物打印方法，构建了三维构建体(例如血管)。
图19示意性地描述了使用本发明的微囊/生物墨汁来生物打印血管的流程图。具体而言，该方法包含下述步骤：
(1)用DIO(绿色)、Mitochacker(红色)和hoechst(蓝色)对血管的内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞进行染色，然后采集大鼠血管的生物学信息，并构建血管结构数字模型。根据该模型，血管分为三层结构，即，位于最内层的血管内皮细胞，位于中间层的血管平滑肌细胞，以及位于最外层的成纤维细胞。
(2)使用实施例1中描述的方法，构建包含血管内皮细胞的微囊、包含血管平滑肌细胞的微囊、以及包含成纤维细胞的微囊。其中，所使用的血管内皮细胞、血管平滑肌细胞和成纤维细胞分别为来源于大鼠的原代培养的细胞；所使用的核层材料和壳层材料如实施例1所述。另外，为了促进细胞增殖和分化，在包含血管内皮细胞的微囊核层中添加血管内皮生长因子(VEGF)；在包含血管平滑肌细胞的微囊核层中添加血小板源生长因子(PDGF)；在包含成纤维细胞的微囊核层中添加成纤维细胞生长因子(FGF)。
所制备的包含血管内皮细胞的微囊大小为约30μm，内含2-3个血管内皮细胞；包含血管平滑肌细胞的微囊大小为约200μm，内含50个左右的血管平滑肌细胞；包含成纤维细胞的微囊大小为约100μm，内含10个左右的成纤维细胞。
(3)将生物粘合剂分别与前一步骤获得的3种微囊混合，制备获得三种生物墨汁。所使用的生物粘合剂为海藻酸钠+明胶；生物粘合剂与微囊的用量比为1:4(按重量计)。
应当注意的是，步骤(1)可以在步骤(2)和(3)之前，与之同时，或之后进行。
(4)使用3D生物打印机，以旋转打印方式进行打印。打印过程中，以血管结构数字模型为模板，使用对应的生物墨汁进行生物打印，其中，如图2A-B所示，血管的最内层结构使用包含含有血管内皮细胞的微囊的生物墨汁进行打印，中间层结构使用包含含有血管平滑肌细胞的微囊的生物墨汁进行打印，最外层结构使用包含含有成纤维细胞的微囊的生物墨汁进行打印。微囊通过生物粘合剂而固化，形成血管前体。
(5)将血管前体置于三维培养箱中，在37℃，5％CO2的条件下使用常规细胞培养基(H-DMEM培养基+10％胎牛血清)对血管前体进行培养。培养过程中，可对血管前体施加物理刺激，例如剪切力。连续培养7-10天，使血管前体形成血管。
实施例18：微囊的各种应用
干细胞分化的研究
使用实施例10中描述的方法，构建第一微囊和/或第二微囊。任选地，向第一微囊和/或第二微囊中添加额外的试剂或试剂组合，以促进或抑制MSC细胞朝向成骨细胞，脂肪细胞，软骨细胞或肌细胞分化。在相同的培养系统，例如在相同的容器(例如培养皿或培养瓶)中培养所述微囊。观察各个分离的微囊中的细胞，分析细胞中的干细胞标志物的表达情况，并评估不同的微环境对MSC干细胞分化的影响。
组织再生
本实施例提供了示例性的组织再生方法，其用于修复关节中的损伤。
首先，使用医学成像方法来扫描关节中的损伤，以获得关节以及损伤部位的结构信息。
其次，基于医学成像数据，根据损伤部位的结构信息和关节组织的细胞分布信息，构建数字修复模型。进一步，基于数字修复模型，制备相应类型的微囊，包括本发明的第一微囊，本发明的第二微囊。随后，根据数字修复模型，将这些微囊用于直接在损伤部位上进行生物打印。
在某些情况下，微囊中的细胞来源于获自相同受试者的自体干细胞。在生物打印后，微囊中的细胞在损伤部位的不同层和微环境中增殖和分化，形成了相应的组织层和结构，从而修复了关节中的损伤。
实施例19：构建体的各种应用
使用构建体来体外研究组织发育
制备本发明的第一微囊和/或第二微囊。根据目的组织(例如骨组织，软骨组织，关节组织)的细胞分布模式，使用所制备的微囊进行生物打印，获得相应的构建体(即，组织前体)。在合适的条件下，体外培养所获得的组织前体，以使其发育为目的组织。将微囊中的细胞暴露于可能影响组织发育的候选试剂或试剂组合。然后，观察整个发育过程中，微囊中的细胞的变化以及组织发育过程的变化。
移植物免疫学的体内研究
制备包含来源于即将接受组织移植的受试者(实验动物)的MSC细胞的第一微囊和/或第二微囊。使用所制备的微囊进行生物打印，以获得组织前体或人工组织(例如骨组织，软骨组织，关节组织)。随后，将组织前体或人工组织植入受试者中，并观察受试者对组织前体或人工组织的免疫学应答，包括生物相容性和免疫排斥。
药物筛选
使用实施例10中描述的方法来制备关节组织。所使用的微囊中的细胞来源于即将接受药物的受试者。将所制备的关节组织暴露于各种药物(每一种药物设置多个不同的剂量)，然后评估各个剂量下，各种药物对关节组织的功效和影响。随后，根据评估结果，将具有最高功效和/或最低副作用的药物及其剂量施用给受试者，以治疗影响关节组织的疾病。
药物发现
制备本发明的第一微囊和/或第二微囊，并将其打印为与药物功能相关的人工组织(例如骨组织，软骨组织，关节组织)。根据制备过程中所使用的条件，例如微囊中的细胞的来源，微囊的核层中包含的试剂或刺激，或培养条件，此类人工组织可以为健康组织或患病组织。将所获得的人工组织暴露于一组化合物，并任选地，将各种化合物对患病的人工组织的作用与相同化合物对相应健康的人工组织的作用进行比较，从而确定各种化合物对与该组织相关的疾病的治疗效果。还基于化合物对健康的人工组织的影响来确定各种化合物的毒性和副作用。随后，将具有最佳治疗效果和/或最低毒性和副作用的化合物，或者在治疗效果与副作用之间取得最佳平衡的化合物确定为前导化合物，用于进一步的药物研发。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公开的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (17)

1.一种制备包含m种细胞的复合结构的方法，其中，m为≥2的整数，所述方法包括：
(1)提供m种包含细胞的微囊，其中，每种微囊各自对应于复合结构中的一种细胞，即，每种微囊各自包含复合结构中的一种细胞，和/或能够分化为复合结构中的该种细胞的干细胞；
(2)提供所述复合结构的细胞分布信息；
(3)基于所述复合结构的细胞分布信息，对所述m种微囊进行排布，以制备构建体；
(4)培养步骤(3)获得的构建体，产生所述复合结构；
优选地，所述复合结构的m种细胞是由同一种干细胞分化而来的，并且，步骤(1)所述的m种微囊都包含所述干细胞，并且每种微囊各自包含诱导所述干细胞分化为复合结构中的一种细胞的诱导因子；优选地，所述干细胞是MSC细胞；
优选地，所述微囊包含细胞，和包裹所述细胞的核层，其中所述核层由生物可降解材料制成；
优选地，所述微囊任选地还包含封装所述核层的壳层，其中所述壳层由生物可降解材料制成。
2.一种制备包含骨细胞和软骨细胞的复合结构的方法，所述方法包括：
(1)提供两种包含细胞的微囊，其中，第一微囊包含MSC细胞，以及诱导MSC向成骨细胞或骨细胞分化的诱导因子；并且，第二微囊包含MSC细胞，以及诱导MSC向成软骨细胞或软骨细胞分化的诱导因子；
(2)提供包含骨细胞和软骨细胞的复合结构的细胞分布信息；
(3)基于所述复合结构的细胞分布信息，对所述第一微囊和第二微囊进行排布，以制备构建体；
(4)培养步骤(3)获得的构建体，产生所述复合结构；
优选地，所述第一微囊包括：MSC细胞，包裹所述MSC细胞的核层，和，任选地，封装所述核层的壳层；优选地，所述核层和任选的壳层各自独立地由生物可降解材料制成，并且所述核层包含诱导MSC向成骨细胞或骨分化的诱导因子；
优选地，所述第一微囊的壳层包含诱导MSC向成骨细胞或骨分化的诱导因子；
优选地，所述诱导MSC向成骨细胞或骨分化的诱导因子包含地塞米松、抗坏血酸和甘油磷酸；
优选地，所述第一微囊的壳层不包含细胞；
优选地，所述第二微囊包括：MSC细胞，包裹所述MSC细胞的核层，和，任选地，封装所述核层的壳层，其中所述核层和任选的壳层各自独立地由生物可降解材料制成，并且所述核层包含诱导MSC向成软骨细胞或软骨分化的诱导因子；
优选地，所述第二微囊的壳层包含诱导MSC向成软骨细胞或软骨分化的诱导因子；
优选地，所述诱导MSC向成软骨细胞或软骨分化的诱导因子包含TGF-β3、地塞米松、2-磷酸抗坏血酸、丙酮酸钠、脯氨酸和胰岛素-转铁蛋白-硒溶液；
优选地，所述第二微囊的壳层不包含细胞。
3.一种制备包含内皮细胞和平滑肌细胞的复合结构的方法，所述方法包括：
(1)提供两种包含细胞的微囊，其中，第一微囊包含MSC细胞和内皮细胞；并且，第二微囊包含MSC细胞和平滑肌细胞；
(2)提供包含内皮细胞和平滑肌细胞的复合结构的细胞分布信息；
(3)基于所述复合结构的细胞分布信息，对所述第一微囊和第二微囊进行排布，以制备构建体；
(4)培养步骤(3)获得的构建体，产生所述复合结构；
优选地，所述第一微囊包括：MSC细胞和内皮细胞，包裹所述MSC细胞和内皮细胞的核层，和，任选地，封装所述核层的壳层；优选地，所述核层和任选的壳层各自独立地由生物可降解材料制成；
优选地，所述第一微囊中，内皮细胞与MSC细胞的比例为约1:20-约1:1,例如约1:19、约1:18、约1:17、约1:16、约1:15、约1:14、约1:13、约1:12、约1:11、约1:10、约1:9、约1:8、约1:7、约1:6、约1:5、约1:4、约1:3、约1:2、或约1:1.5；优选地，所述内皮细胞与MSC细胞的比例为约1:15、约1:14、约1:13、约1:12、约1:11.5、约1:11、约1:10.5、约1:10、约1:9.5、约1:9、约1:8.5、约1:8、约1:7、约1:6；更优选地，所述内皮细胞与MSC细胞的细胞的比例为约1:10；
优选地，所述第一微囊的壳层不包含细胞；
优选地，所述第二微囊包括：MSC细胞和平滑肌细胞，包裹所述MSC细胞和平滑肌细胞的核层，和，任选地，封装所述核层的壳层，其中所述核层和任选的壳层各自独立地由生物可降解材料制成；
优选地，所述第二微囊中，平滑肌细胞与MSC细胞的比例为约1:20-约1:1,例如约1:19、约1:18、约1:17、约1:16、约1:15、约1:14、约1:13、约1:12、约1:11、约1:10、约1:9、约1:8、约1:7、约1:6、约1:5、约1:4、约1:3、约1:2、或约1:1.5；优选地，所述平滑肌细胞与MSC细胞的比例为约1:15、约1:14、约1:13、约1:12、约1:11.5、约1:11、约1:10.5、约1:10、约1:9.5、约1:9、约1:8.5、约1:8、约1:7、约1:6、约1:5、约1:4、约1:3、约1:2；更优选地，所述平滑肌细胞与MSC细胞的细胞的比例为约1:3；
优选地，所述第二微囊的壳层不包含细胞。
4.权利要求1-3任一项的方法，其中，所述核层能够为细胞的生命活动提供微环境；
优选地，所述核层各自独立地由生物可降解材料制成，并且所述生物可降解材料是生物相容性的；
优选地，用于制备核层的生物可降解材料是天然存在的(例如来源于动植物的天然存在的生物可降解材料)，人工合成的，重组产生的，经过改性的，或者其任何组合；
优选地，用于制备核层的所述生物可降解材料包含天然存在的可降解聚合物，例如胶原蛋白、纤维蛋白、壳聚糖、海藻酸盐、淀粉、透明质酸、层粘连蛋白、琼脂糖、明胶、葡聚糖、以及其任意组合；经过改性的可降解聚合物，例如经过改性的海藻酸盐，例如氧化海藻酸盐(例如氧化海藻酸钠)；和/或合成的可降解聚合物，例如聚磷腈、聚丙烯酸及其衍生物(例如聚甲基丙烯酸、丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物)、聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)、聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)、聚原酸酯(POE)、聚己内酯(PCL)、聚羟基丁酸酯(PHB)、聚氨基酸(例如聚赖氨酸)、可降解性聚氨酯、以及其任何组合；
优选地，用于制备核层的所述生物可降解材料能够被酶(例如细胞分泌的酶)所降解；优选地，所述核层的降解能够提供维持或促进所述细胞的生命活动的营养物质；
优选地，所述生物可降解材料选自胶原蛋白(例如I型，II型，III型胶原蛋白)、纤维蛋白、壳聚糖、海藻酸盐(例如海藻酸钠)、氧化的海藻酸盐(例如氧化的海藻酸钠)、淀粉、透明质酸，层粘连蛋白，弹性蛋白，明胶、葡聚糖、聚氨基酸(例如聚赖氨酸)、琼脂糖、可降解性聚氨酯，或其任何组合；
优选地，所述核层包含I型胶原蛋白和/或海藻酸盐，例如包含I型胶原蛋白和海藻酸钠；或者，包含层粘连蛋白；或者，包含淀粉；或者，包含可降解性聚氨酯；或者，包含海藻酸盐(例如海藻酸钠或海藻酸钙)和氧化海藻酸盐(例如氧化海藻酸钠)；
优选地，所述核层为凝胶状。
5.权利要求1-4任一项的方法，其中，所述任选的壳层为包裹的细胞提供了力学保护；优选地，所述壳层各自独立地具有0.01-0.4GPa的硬度，例如0.01-0.02、0.02-0.03、0.03-0.04、0.04-0.05、0.05-0.06、0.06-0.07、0.07-0.08、0.08-0.09、0.09-0.1、0.1-0.15、0.15-0.2、0.2-0.3、0.3-0.4、0.01-0.4、0.01-0.05、0.05-0.1、0.1-0.2、0.2-0.4、0.05-0.15、或0.06-0.1GPa的硬度；和/或，具有0.01-100MPa的弹性模量，例如0.01-0.05、0.05-0.1、0.1-0.5、0.5-0.8、0.8-1、1-1.2、1.2-1.4、1.4-1.6、1.6-1.8、1.8-2、2-2.4、2.4-2.8、2.8-3.2、3.2-4、4-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-80、80-100、0.5-4、0.5-1、1-1.5、1.5-2、2-3、0.8-1.6、1.4-2.4、0.8-3.2、0.01-100、1-100、10-100、或0.5-50MPa的弹性模量；
优选地，所述壳层能够为细胞的生命活动提供微环境；
优选地，所述壳层各自独立地由生物可降解材料制成，并且所述生物可降解材料是生物相容性的；优选地，用于制备壳层的生物可降解材料是天然存在的(例如来源于动植物的天然存在的生物可降解材料)，人工合成的，重组产生的，经过改性的，或者其任何组合；
优选地，用于制备壳层的所述生物可降解材料包含天然存在的可降解聚合物，例如胶原蛋白、纤维蛋白、壳聚糖、海藻酸盐、淀粉、透明质酸、层粘连蛋白、琼脂糖、明胶、葡聚糖、以及其任意组合；经过改性的可降解聚合物，例如经过改性的海藻酸盐，例如氧化海藻酸盐(例如氧化海藻酸钠)；和/或，合成的可降解聚合物，例如聚磷腈、聚丙烯酸及其衍生物(例如聚甲基丙烯酸、丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物)、聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)、聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)、聚原酸酯(POE)、聚己内酯(PCL)、聚羟基丁酸酯(PHB)、聚氨基酸(例如聚赖氨酸)、可降解性聚氨酯、以及其任何组合；
优选地，用于制备壳层的所述生物可降解材料能够被酶(例如细胞分泌的酶)所降解；优选地，所述壳层的降解能够提供维持或促进所述细胞的生命活动的营养物质；
优选地，所述生物可降解材料选自胶原蛋白(例如I型，II型，III型胶原蛋白)、纤维蛋白、壳聚糖、海藻酸盐(例如海藻酸钠或海藻酸钙)、氧化海藻酸盐(例如氧化海藻酸钠)、淀粉、透明质酸，层粘连蛋白，弹性蛋白，明胶、葡聚糖、聚氨基酸(例如聚赖氨酸)、琼脂糖、或其任何组合；
优选地，所述壳层包含海藻酸盐(例如海藻酸钠或海藻酸钙)，例如包含海藻酸钙和明胶，任选地还包含弹性蛋白；
优选地，所述壳层包含海藻酸盐(例如海藻酸钠或海藻酸钙)，例如包含海藻酸钙和明胶，任选地还包含弹性蛋白；或者，包含氧化海藻酸盐(例如氧化海藻酸钠)；或者，包含海藻酸盐(例如海藻酸钠或海藻酸钙)和氧化海藻酸盐(例如氧化海藻酸钠)；或者，包含海藻酸盐(例如海藻酸钠或海藻酸钙)和琼脂糖；
优选地，所述壳层各自独立地是经过处理的(例如，使用壳层固定液进行了处理，例如以改善壳层的力学性能)。
优选地，所述壳层各自独立地为通透性的；例如，所述壳层对于水，氧气，和营养物质(糖类例如葡萄糖、脂肪、蛋白质、氨基酸、短肽、矿物质、维生素、细胞因子、核苷酸)是通透性的；
优选地，所述壳层各自独立地具有用于微囊内外物质交换的通道或孔；
优选地，通道的直径为至少10、20、50、100、150、200、250、300、350、400、或500nm；优选地，所述孔的直径为至少100、200、400、600、800、1000、1500、2000、4000、或5000nm；
优选地，所述壳层的厚度各自独立地为0.1-50μm，例如0.1-0.5、0.5-1、1-2、2-5、5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-50、50-100、100-200、200-300、300-400、400-500、0.1-1、1-5、1-10、5-10、10-20、10-30、5-20、或1-20μm。
6.权利要求1-5任一项的方法，其中，所述核层和/或壳层各自独立地还包含额外的试剂，例如，营养物质、细胞外基质、细胞因子和/或药物活性成分；
优选地，所述额外的试剂能够调控(例如促进)细胞的增殖、分化、迁移、分泌和/或新陈代谢；
优选地，所述营养物质包括但不限于，核苷酸，氨基酸，多肽，碳水化合物(例如单糖，寡糖，多糖)，脂质，维生素；
优选地，细胞外基质选自多糖，例如糖胺聚糖、蛋白聚糖；结构蛋白，例如胶原和弹性蛋白；粘着蛋白，例如纤粘连蛋白和层粘连蛋白；
优选地，所述细胞因子可以是用于调控细胞的增殖、分化、迁移、分泌和/或新陈代谢的细胞因子，包括但不限于：
-与细胞生长相关的细胞因子，例如胰岛素、类胰岛素生长因子(如IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ)、转化生长因子(如TGFα和TGFβ)、血管内皮生长因子、表皮生长因子、成纤细胞生长因子、血小板来源生长因子、骨肉瘤来源生长因子、生长激素释放抑制因子、神经生长因子、白细胞介素(如IL-1、IL-1、IL-3)、红细胞生长素、集落刺激因子、皮质醇、甲状腺素，或其任何组合；
-与细胞(例如MSC细胞)分化相关的细胞因子，例如Oct3/4，Sox2，Klf4，c-Myc，GATA4，TSP1，β-甘油磷酸钠，地塞米松，维生素C，胰岛素，IBMX，吲哚美锌，血小板衍生生长因子BB(PDGF-BB)，5-氮杂胞苷，或其任何组合；
-与细胞迁移相关的细胞因子，例如环磷酸腺苷，三磷酸磷脂酰肌醇，基质细胞衍生因子-1，N-钙粘蛋白，核因子κB，骨连接素，血栓素A2，Ras，或其任何组合；和/或
-与细胞新陈代谢相关的细胞因子，例如胰岛素生长因子1、TRIP-Br2、DKK-1、sRANKL、OPG、TRACP-5b、ALP、SIRT1(2-7)、PGC-1α、PGC-1β、OPG、IL-3、IL-4、IL-6、TGF-β、PGE2、G-CSF、TNF-α，或其任何组合；
优选地，所述药物活性成分为能够调控(例如促进)细胞的增殖、分化、迁移、分泌和/或新陈代谢的试剂；优选地，所述药物活性成分选自rhIL-2、rhIL-11、rhEPO、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、G-CSF、GM-CSF、rHuEPO、sTNF-R1、和rhTNF-α。
7.权利要求1-6任一项的方法，其中，所述微囊各自独立地包含一个或多个细胞，例如1-106个细胞，例如10-900、20-800、30-700、40-600、50-500、60-400、70-300、80-200、10-100个、10-103个、10-104个、10-105个、10-106个细胞；
优选地，所述微囊的尺寸各自独立地为20-2000μm，例如30-1900μm，40-1800μm，50-1700μm，60-1600μm，70-1500μm，80-1400μm，90-1300μm，100-1200μm，200-1000μm，300-800μm，400-600μm，100-500μm；
优选地，所述微囊各自独立地为球形，或者任何期望的形状(例如立方体，矩形棱柱，六棱柱，圆柱，或不规则的形状)；
优选地，所述微囊各自独立地为固体或半固体，例如凝胶态；
优选地，所述微囊以混合物的形式存在；
优选地，所述微囊是分离的微囊；
优选地，所述微囊提供于容器中。
8.权利要求1-7任一项的方法，其中，所述微囊(例如第一微囊和第二微囊)各自独立地以组合物的形式存在，其中所述组合物任选地还包含载体(所述载体优选包含生物粘合剂)；或者所述微囊(例如第一微囊和第二微囊)共同存在于相同的组合物中，其中所述组合物任选地还包含载体(所述载体优选包含生物粘合剂)；
优选地，所述载体(例如生物粘合剂)及其降解产物对于细胞是无毒的，和/或对于宿主是非免疫原性的；
优选地，所述载体(例如生物粘合剂)包含生物可降解材料；优选地，所述载体(例如生物粘合剂)中的生物可降解材料是生物相容性的；
优选地，所述载体(例如生物粘合剂)中的生物可降解材料的降解能够提供维持或促进微囊内的细胞的生命活动的营养物质；
优选地，所述载体(例如生物粘合剂)中的生物可降解材料是天然存在的(例如来源于动植物的天然存在的生物可降解材料)，人工合成的，重组产生的，经过改性的，或者其任何组合；
优选地，所述载体(例如生物粘合剂)中的生物可降解材料包含天然存在的可降解聚合物，例如胶原蛋白，纤维蛋白，壳聚糖，海藻酸盐，淀粉，透明质酸，层粘连蛋白，明胶，葡聚糖，弹性蛋白，以及其任意组合；经过改性的可降解聚合物，例如经过改性的海藻酸盐，例如氧化海藻酸盐(例如氧化海藻酸钠)；和/或，合成的可降解聚合物，例如聚磷腈，聚丙烯酸及其衍生物(例如聚甲基丙烯酸，丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物)，聚乳酸(PLA)，聚羟基乙酸(PGA)，聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)，聚原酸酯(POE)，聚己内酯(PCL)，聚羟基丁酸酯(PHB)，聚氨基酸(例如聚赖氨酸)，可降解性聚氨酯，以及其任何组合；
优选地，所述载体(例如生物粘合剂)中的生物可降解材料选自胶原、纤维蛋白、壳聚糖、海藻酸盐(例如海藻酸钠或海藻酸钙)、氧化海藻酸盐(例如氧化海藻酸钠)、淀粉、透明质酸、层粘连蛋白、弹性蛋白、明胶、聚氨基酸(例如聚赖氨酸)、琼脂糖、葡聚糖、甲基纤维素、聚乙烯醇、聚丙烯酸及其衍生物(例如聚丙烯酸或其酯、聚甲基丙烯酸或其酯)、聚丙烯酰胺、聚N-取代丙烯酰胺或其任何组合；
优选地，所述载体(例如生物粘合剂)包含海藻酸钠和/或氧化的海藻酸钠；或者，包含海藻酸盐(例如海藻酸钠或海藻酸钙)和氧化海藻酸盐(例如氧化海藻酸钠)；
优选地，所述载体还包含水，无机盐，pH缓冲剂，稳定剂，防腐剂，或其任何组合；
优选地，所述载体(例如生物粘合剂)为液体或半液体(例如凝胶)；
优选地，所述载体(例如生物粘合剂)的粘度为1-1000Pas，例如1-2、2-3、3-4、4-5、5-6、6-7、7-8、8-9、9-10、10-12、12-14、14-16、16-18、18-20、20-25、25-30、30-50、50-80、80-100、100-200、200-300、300-400、400-500、500-800、或800-1000、1-3、3-8、8-16、3-10、10-20、20-50、50-160Pas、或30-160Pas；
优选地，所述载体(例如生物粘合剂)包含额外的试剂，例如，营养物质、细胞外基质、细胞因子和/或药物活性成分；
优选地，所述额外的试剂能够调控(例如促进)细胞的增殖、分化、迁移、分泌和/或新陈代谢；
优选地，所述额外的试剂包括，维持或促进细胞的生命活动的营养物质(包括但不限于，核苷酸，氨基酸，多肽，碳水化合物(例如单糖，寡糖，多糖)，脂质，维生素，细胞培养基)；和/或，改善或调控细胞的生命活动的物质，例如细胞因子，细胞外基质，抗凋亡剂，抗氧化剂，药物活性成分，或其任何组合；
优选地，细胞外基质选自多糖，例如糖胺聚糖、蛋白聚糖；结构蛋白，例如胶原和弹性蛋白；粘着蛋白，例如纤粘连蛋白和层粘连蛋白；
优选地，所述细胞因子是用于调控细胞的增殖、分化、迁移、分泌和/或新陈代谢的细胞因子，包括但不限于：
-与细胞生长相关的细胞因子，例如胰岛素、类胰岛素生长因子(如IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ)、转化生长因子(如TGFα和TGFβ)、血管内皮生长因子、表皮生长因子、成纤细胞生长因子、血小板来源生长因子、骨肉瘤来源生长因子、生长激素释放抑制因子、神经生长因子、白细胞介素(如IL-1、IL-11、IL-3)、红细胞生长素、集落刺激因子、皮质醇、甲状腺素，或其任何组合；
-与细胞分化相关的细胞因子，例如Oct3/4，Sox2，Klf4，c-Myc，GATA4，TSP1，β-甘油磷酸钠，地塞米松，维生素C，胰岛素，IBMX，吲哚美锌，血小板衍生生长因子BB(PDGF-BB)，5-氮杂胞苷，或其任何组合；
-与细胞迁移相关的细胞因子，例如环磷酸腺苷，三磷酸磷脂酰肌醇，基质细胞衍生因子-1，N-钙粘蛋白，核因子κB，骨连接素，血栓素A2，Ras，或其任何组合；和/或
-与细胞新陈代谢相关的细胞因子，例如胰岛素生长因子1、TRIP-Br2、DKK-1、sRANKL、OPG、TRACP-5b、ALP、SIRT1(2-7)、PGC-1α、PGC-1β、OPG、IL-3、IL-4、IL-6、TGF-β、PGE2、G-CSF、TNF-α，或其任何组合；
优选地，所述药物活性成分为能够调控(例如促进)细胞的增殖、分化、迁移、分泌和/或新陈代谢的试剂；优选地，所述药物活性成分选自rhIL-2、rhIL-11、rhEPO、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、G-CSF、GM-CSF、rHuEPO、sTNF-R1、和rhTNF-α；
优选地，所述微囊(例如第一微囊和第二微囊)各自独立地以至少约10％、20％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、或99％(按重量计，w/w)的浓度存在于组合物中；或者，所述微囊(例如第一微囊和第二微囊)共同地以至少约10％、20％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、或99％(按重量计，w/w)的浓度存在于组合物中；
优选地，所述组合物为液体，半固体(例如凝胶)或固体组合物，例如溶液，悬浮液，凝胶，或浓缩物；
优选地，所述组合物是可挤出的组合物；
优选地，所述组合物用于生物打印，和/或用于形成构建体(例如三维构建体)。
9.权利要求1-8任一项的方法，其中，步骤(2)所述的细胞分布信息选自，复合结构的各个细胞层的位置或类型，各个层的细胞的类型，各个层中不同细胞的比率，各个层中的细胞分布模式，或其任何组合。
10.权利要求1-9任一项的方法，其中，在步骤(3)中，通过生物打印(例如3D生物打印)对所述m种微囊进行排布，以制备构建体；
优选地，所述构建体是三维构建体；
优选地，所述构建体是活的构建体；
优选地，所述构建体包含多个微囊；优选地，所述微囊以预定的模式(即，复合结构的细胞分布模式)排布；
优选地，所述构建体(例如三维构建体)的尺寸为至少30μm、50μm、100μm、200μm、500μm、1mm、2mm、5mm、1cm、2cm、5cm、10cm、20cm、或50cm；
优选地，所述构建体的至少一个部分是生物打印的；
优选地，所述构建体具有预先确定的结构；
优选地，所述构建体具有一层或多层结构；优选地，每一个层结构各自由一层或多层微囊构建；
优选地，所述构建体的微囊中的细胞能够生长，增殖，分化，分泌和/或迁移；
优选地，所述构建体具有片状结构(例如长方形，正方形，圆形，椭圆形，六角形或不规则形状的片状结构)，或中空管状结构，或中空三维结构(例如中空立方体，中空球体，中空的矩形棱柱体，中空圆柱体，或中空的不规则形状的三维结构)，或实心三维结构(例如实心立方体，实心球体，实心矩形棱柱体，实心圆柱体，或实心不规则形状的三维结构)，或其任何组合；优选地，所述构建体模拟天然组织或器官的形状；
优选地，所述构建体包括两部分，即成骨层和成软骨层；优选地，所述构建体包括两部分，即包含内皮细胞的部分和包含平滑肌细胞的部分；
优选地，所述生物打印步骤是连续的和/或基本连续的；
优选地，所述生物打印步骤包括，连续地生物打印多个层，以获得具有预定模式的、包含多个层的三维构建体，其中每个层根据预定的模式用所述微囊进行生物打印；
优选地，所述生物打印步骤包括，连续地生物打印多个区段，以获得具有预定模式的、包含多个区段的三维构建体，其中每个区段根据预定的模式用所述微囊进行生物打印；
优选地，所述生物打印步骤不会对微囊内的细胞造成机械损伤；例如，所述微囊内至少80％、85％、87.5％、90％、92.5％、95％、或98％的细胞在生物打印后能够存活、增殖、分化、分泌、迁移和/或具有正常的新陈代谢；
优选地，所述生物打印步骤不使用支架。
11.权利要求1-10任一项的方法，其中，在步骤(4)中，在允许微囊内的细胞增殖、分化、迁移、分泌和/或新陈代谢的条件下，培养所获得的构建体；例如，培养所获得的构建体至少0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、25、或30天；优选地，在步骤(4)中，在相同的培养体系中培养经过排布的m种微囊(即，构建体)；优选地，在3D培养箱或生物反应器中培养所获得的构建体；优选地，在培养过程中对构建体施加物理刺激(例如压力，剪切力，光照，加热等)和/或化学刺激(例如激素，细胞因子，化学试剂等)；优选地，微囊的核层和/或壳层和/或载体中的生物可降解材料在培养过程中至少一部分被降解；优选地，微囊内的和/或微囊之间的细胞在培养过程中彼此连接；
优选地，所述培养步骤产生了尺寸为至少30μm、50μm、100μm、200μm、500μm、1mm、2mm、5mm、1cm、2cm、5cm、10cm、20cm、或50cm的复合结构；
优选地，所述复合结构具有预定的模式，例如任何预定的形状；例如，所述复合结构是片状结构(例如长方形，正方形，圆形，椭圆形，六角形或不规则形状的片状结构)，或中空管状结构，或中空三维结构(例如中空立方体，中空球体，中空的矩形棱柱体，中空圆柱体，或中空的不规则形状的三维结构)，或实心三维结构(例如实心立方体，实心球体，实心矩形棱柱体，实心圆柱体，或实心不规则形状的三维结构)，或其任何组合；
优选地，所述复合结构的形状模拟天然组织或器官(例如骨组织，软骨组织，和关节组织)的形状。
12.通过权利要求1-11任一项的方法制备的复合结构；
优选地，所述复合结构是骨组织，软骨组织，或关节组织，或包含骨和软骨的复合结构；
优选地，所述复合结构包含内皮细胞和平滑肌细胞。
13.权利要求12的复合结构的用途，其用于研究干细胞分化，用于药物发现，用于药物筛选，用于体内或体外测定，用于植入宿主体内，用于组织工程，用于组织再生，用于分析细胞在体内响应刺激或试剂而产生的变化(例如形态变化或功能变化)，用于研究体内微环境的影响，用于治疗有此需要的受试者，用于评估因子(例如，化学试剂，例如化合物；物理刺激，例如辐射或加热)对组织或组织中的细胞的作用，用于三维组织培养，或用于修复受试者中损伤组织；或者，其用于制备试剂盒，所述试剂盒用于研究干细胞分化，用于药物发现，用于药物筛选，用于体内或体外测定，用于植入宿主体内，用于组织工程，用于组织再生，用于分析细胞在体内响应刺激或试剂而产生的变化(例如形态变化或功能变化)，用于研究体内微环境的影响，用于治疗有此需要的受试者，用于评估因子(例如，化学试剂，例如化合物；物理刺激，例如辐射或加热)对组织或组织中的细胞的作用，用于三维组织培养，或用于修复受试者中损伤组织。
14.一种试剂盒，其包含权利要求12的复合结构。
15.一种药物组合物，其包含权利要求12的复合结构；并且，任选地还包含药学可接受的载体，赋形剂，稳定剂或能够为所述药物组合物的施用(例如施用给人受试者)提供有利性质的其他试剂；优选地，所述药物组合物用于组织再生，或细胞疗法。
16.权利要求12的复合结构用于制备药物组合物的用途，所述药物组合物优选用于组织再生，或细胞疗法。
17.一种评估因子(例如，化学试剂，例如化合物；物理刺激，例如辐射或加热)对组织或组织中的细胞的作用的方法，其包括，将权利要求12的复合结构暴露于所述因子，和，评估所述复合结构中的细胞响应所述因子的变化(例如形态变化或功能变化)，从而确定所述因子对组织或组织中的细胞的作用；优选地所述组织选自骨组织，软骨组织，和关节组织；优选地，所述组织包含内皮细胞和平滑肌细胞。
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