CN103614297A - 仿肝板结构肝细胞三维培养装置及其培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种仿肝板结构肝细胞三维培养装置，包括微流控芯片；微流控芯片内开设依次直线连接且相通的第一主通道、第二主通道和第三主通道；第一主通道远离第二主通道的一端、第一主通道与第二主通道的连接处及第二主通道与第三主通道的连接处均对称延伸形成两个分支通道，第一主通道远离第二主通道的一端同时直线延伸形成一分支通道；分支通道的末端均设置与相应分支通道导通的导料管，导料管内开设有导通孔且导料管垂直于相应的分支通道所在面，以用于通入形成肝板结构所需的原料。本发明还公开一种利用上述装置的仿肝板结构肝细胞三维培养方法。通过上述方式，以便在体外实现肝细胞在体内肝脏中肝板结构一样的三维生长环境。

Description

仿肝板结构肝细胞三维培养装置及其培养方法

技术领域

本发明涉及肝脏组织工程和生物人工肝领域，特别是涉及一种仿肝板结构肝细胞三维培养装置及其培养方法。

背景技术

目前，治疗各种终末期肝脏疾病的有效手段依然是肝移植，但供体肝来源的严重缺乏和移植排斥等问题限制肝移植的广泛应用。因此，以实现肝脏功能修复、替代及重建为目标的生物人工肝和肝脏组织工程成为肝衰竭治疗的新方向。

生物人工肝和肝脏组织工程所共性的难题之一是如何在体外模拟肝细胞在体的三维培养微环境。目前生物人工肝有中空纤维型、多层平板型、填充床式及包裹悬浮型等三维培养模式；肝脏组织工程有借助于快速成型技术的生物支架材料、细胞片层及去细胞化肝脏再灌注细胞等三维培养模式。

尽管现有肝细胞三维培养模式较多，但大部分培养模式都只是实现肝细胞在三维生长环境下培养，并未真正再现肝细胞在体内状态下的培养，而且肝细胞的功能状态也与体内肝细胞相差甚远。

体内肝细胞处于一种三维环境中，细胞间相互作用有助于调节细胞的生长和功能分化，某种意义上说，肝脏本身就是一个极佳的肝细胞培养器，其内肝细胞不仅达到数量和密度上的要求，还呈现有序极性排列。肝细胞处于三维环境具体表现为：肝细胞与其周围的肝血窦内皮细胞、肝星状细胞、Kupffer细胞及细胞外基质等相互作用；肝脏内血管和胆道系统为肝细胞提供氧气和营养物质，同时带走肝细胞的代谢废物。而肝脏的基本结构功能单位为肝小叶，肝小叶又由肝板间隔肝血窦构成。

如何构建体外肝细胞培养的三维环境，是目前生物人工肝和肝脏组织工程亟待解决的问题之一。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是提供一种仿肝板结构肝细胞三维培养装置及其培养方法，以便在体外实现肝细胞在体内肝脏中肝板结构一样的生长环境。

为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种仿肝板结构肝细胞三维培养装置，包括微流控芯片；所述微流控芯片内开设依次直线连接且相通的第一主通道、第二主通道和第三主通道；所述第一主通道远离第二主通道的一端、第一主通道与第二主通道的连接处及第二主通道与第三主通道的连接处均对称延伸形成两个分支通道，所述第一主通道远离第二主通道的一端同时直线延伸形成一分支通道；所述分支通道的末端均设置与相应分支通道导通的导料管，导料管内开设有导通孔且导料管垂直于相应的分支通道所在面，以用于通入形成肝板结构所需的原料。

其中，所述芯片为聚二甲硅氧烷微流控芯片。

其中，所述主通道和分支通道的深度均为160μm。

其中，所述第一主通道的长、宽为300μm、100μm；所述第二主通道的长、宽为300μm、200μm；所述第三主通道的长、宽为50mm、400μm。

其中，所述第一主通道远离第二主通道的一端对称延伸形成的两个分支通道的夹角为60°；所述第一主通道与第二主通道连接处对称延伸形成的两个分支通道的夹角为120°；所述第二主通道与第三主通道连接处对称延伸形成的两个分支通道的夹角为180°。

其中，所述每个分支通道的宽度均为100μm；所述第一主通道远离第二主通道的一端直线延伸形成的分支通道的长度为300μm；所述第一主通道远离第二主通道的一端对称延伸形成的两个分支通道，其与第一主通道相接的一边长均为560μm，与第一主通道直线延伸的分支通道相接的一边长均为416μm；所述第一主通道与第二主通道的连接处对称延伸形成的两个分支通道的边长为693μm；所述第二主通道与第三主通道的连接处对称延伸形成的两个分支通道，其与第二主通道相接的一边长均为500μm，与第三主通道相接的一边长均为400μm。

其中，导料管的高度为2420μm，其导通孔的直径为100μm。

为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种仿肝板结构肝细胞三维培养方法，包括步骤：将含肝细胞的海藻酸钠溶液、含内皮细胞的海藻酸钠溶液、缓冲液及胶凝液分别加入仿肝板结构肝细胞三维培养装置；将仿肝板结构肝细胞三维培养装置形成的包裹有肝板结构的水凝胶导出装置，并置于培养基中进行培养；培养完成后，降解水凝胶，获得肝板组织；仿肝板结构肝细胞三维培养装置包括微流控芯片；微流控芯片内开设依次直线连接且相通的第一主通道、第二主通道和第三主通道；第一主通道远离第二主通道的一端、第一主通道与第二主通道的连接处及第二主通道与第三主通道的连接处均对称延伸形成两个分支通道，第一主通道远离第二主通道的一端同时直线延伸形成一分支通道；分支通道的末端均设置与相应分支通道导通的导料管，导料管内开设有导通孔且导料管垂直于相应的分支通道所在面，以用于通入含肝细胞的海藻酸钠溶液、含内皮细胞的海藻酸钠溶液、缓冲液及胶凝液。

其中，将含肝细胞的海藻酸钠溶液、含内皮细胞的海藻酸钠溶液、缓冲液及胶凝液分别加入仿肝板结构肝细胞三维培养装置的步骤包括：通过第一主通道与第二主通道连接处的两个分支通道末端的导料管分别通入缓冲液；通过第一主通道一端直线延伸形成的分支通道末端的导料管通入含肝细胞的海藻酸钠溶液，同时，通过第一主通道的一端对称延伸形成的两个分支通道末端的导料管分别通入含内皮细胞的海藻酸钠溶液；通过第二主通道与第三主通道连接处的两个分支通道末端的导料管分别通入胶凝液。

其中，缓冲液包括10%（w/v）葡聚糖、0.9%（w/v）NaCl及10mmol/LHEAPS；含肝细胞的海藻酸钠溶液包括0.7%（w/v）海藻酸钠、0.9%（w/v）NaCl、0.05%（w/v）去端肽胶原、1%（w/v）牛血清白蛋白、10mmol/LHEAPS及3×10⁷个/ml肝细胞；含内皮细胞的海藻酸钠溶液包括0.7%（w/v）海藻酸钠、0.9%（w/v）NaCl、0.05%（w/v）去端肽胶原、1%（w/v）牛血清白蛋白、10mmol/L HEAPS及1×10⁷个/ml内皮细胞；胶凝液包括10%（w/v）葡聚糖、20mmol/L BaCl₂、0.72%（w/v）NaCl及10mmol/L HEAPS。

其中，缓冲液、含肝细胞的海藻酸钠溶液、含内皮细胞的海藻酸钠溶液及胶凝液的通入速度依次为1-9μl/min、15-25μl/min、5-15μl/min及95-105μl/min。

其中，降解水凝胶，获得肝板组织的步骤具体为，利用含1U/ml藻酸盐裂解酶的PBS磷酸盐缓冲液降解水凝胶，以获得包裹在其内的肝板组织。

本发明的有益效果是：区别于现有技术的情况，本发明仿肝板结构肝细胞三维培养装置包括依次直线连接且相通的第一主通道、第二主通道和第三主通道，且第一主通道远离第二主通道的一端、第一主通道与第二主通道的连接处及第二主通道与第三主通道的连接处均对称延伸形成两个分支通道，同时，第一主通道远离第二主通道的一端还直线延伸形成一分支通道。每一分支通道的末端都有一导料管用于通入形成肝板结构所需的原料，如：含肝细胞的海藻酸钠溶液、含内皮细胞的海藻酸钠溶液、缓冲液及胶凝液。通过加入上述原料，仿肝板结构肝细胞三维培养装置可形成包裹有肝板结构的水凝胶，对包裹有肝板结构的水凝胶进行培养，培养完成后，降解水凝胶，获得肝板组织，从而在体外实现肝细胞在体内肝脏中肝板结构一样的三维生长环境，促进了肝细胞功能的发挥及肝细胞形态活力的维持。

附图说明

图1是本发明仿肝板结构肝细胞三维培养装置一实施例的结构透视图；

图2是图1所示装置与管体连接的结构透视图；

图3是图1所示装置形成的包裹有肝板结构的水凝胶的示意图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

请参阅图1，图1是本实施例仿肝板结构肝细胞三维培养装置的结构透视图，如图1所示，本实施例的装置为内部设有通道的聚二甲基硅氧烷（PDMS）微流控芯片。

通道包括主通道和与主通道相通的分支通道，主通道包括依次直线连接且相通的第一主通道11、第二主通道12和第三主通道13。

第一主通道11远离第二主通道12的一端、第一主通道11与第二主通道12的连接处及第二主通道12与第三主通道13的连接处均对称延伸形成两个分支通道。具体为，第一主通道11远离第二主通道12的一端的上下两侧对称延伸形成第一分支通道21和第二分支通道22；第一主通道11与第二主通道12的连接处的上下两侧对称延伸形成第三分支通道23和第四分支通道24；第二主通道12与第三主通道13的连接处的上下两侧对称延伸形成第五分支通道25和第六分支通道26；同时，第一主通道11远离第二主通道12的一端还直线延伸形成第七分支通道27。

在本实施例中，第一分支通道21、第二分支通道22、第三分支通道23、第四分支通道24、第五分支通道25、第六分支通道26及第七分支通道27的末端均设置与相应分支通道导通的导料管31，导料管31内开设有导通孔，且导料管31垂直于相应的分支通道所在面，以用于通入形成肝板结构所需的原料。

在本实施例中，仿肝板结构肝细胞三维培养装置采用软光刻和再铸模技术制作而成，该装置在仿肝板结构肝细胞培养前，需进行高压灭菌、消毒烤干的处理。

在本实施例中，主通道和分支通道的尺寸如下：

主通道和分支通道的深度均为160μm，且分支通道的宽度均为100μm。

第一主通道11的长、宽为300μm、100μm；第二主通道12的长、宽为300μm、200μm；第三主通道13的长、宽为50mm、400μm。

第一分支通道21和第二分支通道22的夹角为60°；第三分支通道23和第四分支通道24的夹角为120°；第五分支通道25和第六分支通道26的夹角为180°。

第七分支通道27的长度为300μm；第一分支通道21或第二分支通道22与第一主通道11相接的一边长为560μm，与第七分支通道27相接的一边长为416μm；第三分支通道23或第四分支通道24的长度为693μm；第五分支通道25或第六分支通道26与第二主通道12相接的一边长为500μm，与第三主通道13相接的一边长为400μm。

导料管31的高度为2420μm，其导通孔的直径为100μm。将直径为100μm的聚四氟乙烯（polytetrafluoroethylene，PTFE）超细管或其他符合直径要求的管子插入导料管31，以使液体由导通孔进入相应的通道，从而形成如图2所示的结构。

在本实施例中，所述微流控芯片的长、宽、高为6cm、3cm、5mm。通道位于芯片的中央，第三主通道13距芯片上下两个侧边的距离均为14800μm。每个通道的底部至相应导料管31顶部之间的高度为2580μm，通道底部距芯片底部的距离为2420μm。

肝小叶是肝脏的基本功能单位，肝小叶可以看作是一个微型化的肝脏，而肝小叶又由肝板间隔肝血窦构成，因此，本实施例仿肝板结构肝细胞三维培养装置在体外构建仿生理结构的肝细胞三维培养环境具有极其重要的意义。

下面详细阐述利用本实施例的仿肝板结构肝细胞三维培养装置进行仿肝板结构肝细胞三维培养的方法。

本实施例需使用的器材包括：细胞消化用器材、微量注射泵、注射器、培养皿和玻璃棒，上述器材使用前均在超净台内由紫外照射消毒。

仿肝板结构肝细胞三维培养方法具体如下：

A.制备包裹有肝板结构的水凝胶

a.制备缓冲液、海藻酸钠溶液及胶凝液

缓冲液包括10%（w/v）葡聚糖、0.9%（w/v）NaCl及10mmol/LHEAPS；海藻酸钠溶液包括0.7%（w/v）海藻酸钠、0.9%（w/v）NaCl、0.05%（w/v）去端肽胶原、1%（w/v）牛血清白蛋白及10mmol/L HEAPS；胶凝液包括10%（w/v）葡聚糖、20mmol/L BaCl₂、0.72%（w/v）NaCl及10mmol/L HEAPS。将制备好的溶液放在超净工作台内用0.22μm无菌滤器除菌，然后在4℃的温度下保存待用。

b.制备含肝细胞的海藻酸钠溶液和含内皮细胞的海藻酸钠溶液

本实施例使用的细胞为人肝细胞株C3A及人脐静脉内皮细胞株EA.hy926复苏传代培养的细胞，细胞状态最佳，活力超过90%以上。

将制备好的缓冲液、海藻酸钠溶液及胶凝液在室温下放置备用。

用胰酶将培养皿中的C3A细胞和EA.hy926细胞消化下来分别移入离心管内，离心5min，1000转/min，弃去上清离心液，然后在两个离心管中加入制备好的海藻酸钠溶液，玻璃棒轻轻搅拌，使细胞均匀分散在海藻酸钠溶液中，制成含C3A细胞的海藻酸钠溶液和含EA.hy926细胞的海藻酸钠溶液。其中，C3A细胞和EA.hy926细胞的浓度比为3:1。

c.在仿肝板结构肝细胞三维培养装置中注入配置好的溶液

用1ml注射器分别取1ml含C3A细胞的海藻酸钠溶液、含EA.hy926细胞的海藻酸钠溶液、缓冲液、胶凝液，在微量注射泵的作用下，将各溶液通入芯片内。其中，各溶液的注入顺序依次为缓冲液、含细胞的海藻酸钠溶液和胶凝液。缓冲液需提前注入通道，以防止过快成胶，导致通道堵塞。

各溶液在芯片的具体灌注位置为，缓冲液分别通入第三分支通道23和第四分支通道24；含C3A细胞的海藻酸钠溶液通入第七分支通道27，同时含EA.hy926细胞的海藻酸钠溶液分别通入第一分支通道21和第二分支通道22；胶凝液分别通入第五分支通道25和第六分支通道26。

其中，缓冲液、含C3A细胞的海藻酸钠溶液、含EA.hy926细胞的海藻酸钠溶液及胶凝液的通入速度分别为5μl/min、20μl/min、10μl/min及100μl/min。

请参阅图3，图3是图1所示装置形成的包裹有肝板结构的水凝胶的示意图。由于C3A细胞41、EA.hy926细胞42达到稳定层流排布，细胞所处的天然细胞外基质材料海藻酸钠溶液会与最外围的氯化钡盐溶液接触，从而发生离子交联形成水凝胶，产生包裹有肝板结构的水凝胶。

其中，第三主通道13为成胶区。

B.将仿肝板结构肝细胞三维培养装置形成的包裹有肝板结构的水凝胶导出装置，并置于培养基中进行培养。

水凝胶会自动从芯片出口喷出掉入装有培养基的培养皿内，然后对其进行培养。

C.培养完成后，降解水凝胶，获得肝板组织。

培养约7天后，随着肝细胞与内皮细胞连接的紧密，细胞间作用更加密切，这时可采用海藻酸钠裂解酶浸泡水凝胶，从而降解掉水凝胶外包被，获取完整的肝板样组织结构。

其中，海藻酸钠裂解酶为含1U/ml藻酸盐裂解酶的PBS磷酸盐缓冲液。

综上所述，本发明的总体设计为，通过传统软光刻及再铸模技术制备聚二甲硅氧烷反应芯片，在微量注射泵的作用下，将肝细胞海藻酸钠溶液和内皮细胞海藻酸钠溶液、缓冲液、胶凝液注入反应芯片内。由于肝细胞海藻酸钠溶液与内皮细胞海藻酸钠溶液在微流控技术下达到层流排布，即肝板样排布，而且细胞所处的溶液为天然细胞外基质生物材料海藻酸钠溶液，海藻酸钠可通过离子交联而形成水凝胶，从而将肝板样结构包裹，形成的包裹肝板样结构的水凝胶。包裹有肝板样结构的水凝胶可直接从芯片出口自动导出，转入培养基内培养，培养7天后，水凝胶内细胞间连接更加紧密，细胞间作用更加密切。最后将水凝胶浸泡在海藻酸钠裂解酶中，降解水凝胶，获取完整的肝板样组织。

上述设计相比其他肝细胞三维培养模式，更好的模拟了肝细胞在体内状态下的三维生长环境—肝板，且本发明装置形成的肝板结构由海藻酸钠水凝胶包裹，肝细胞处于天然细胞外基质海藻酸钠水凝胶内，与内皮细胞形成极向有序共培养，极大地促进肝细胞功能的发挥及肝细胞形态活力的维持，为肝脏组织工程及生物人工肝中肝细胞三维培养环境的构建提供新的思路，同时此仿肝板组织结构也是药物检测的有效评价工具。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (12)

1.一种仿肝板结构肝细胞三维培养装置，其特征在于，包括微流控芯片；所述微流控芯片内开设依次直线连接且相通的第一主通道、第二主通道和第三主通道；所述第一主通道远离第二主通道的一端、第一主通道与第二主通道的连接处及第二主通道与第三主通道的连接处均对称延伸形成两个分支通道，所述第一主通道远离第二主通道的一端同时直线延伸形成一分支通道；所述分支通道的末端均设置与相应分支通道导通的导料管，所述导料管内开设有导通孔且导料管垂直于相应的分支通道所在面，以用于通入形成肝板结构所需的原料。

2.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述芯片为聚二甲硅氧烷微流控芯片。

3.根据权利要求2所述的装置，其特征在于，所述主通道和分支通道的深度均为160μm。

4.根据权利要求3所述的装置，其特征在于，所述第一主通道的长、宽为300μm、100μm；

所述第二主通道的长、宽为300μm、200μm；

所述第三主通道的长、宽为50mm、400μm。

5.根据权利要求4所述的装置，其特征在于，所述第一主通道远离第二主通道的一端对称延伸形成的两个分支通道的夹角为60°；

所述第一主通道与第二主通道连接处对称延伸形成的两个分支通道的夹角为120°；

所述第二主通道与第三主通道连接处对称延伸形成的两个分支通道的夹角为180°。

6.根据权利要求5所述的装置，其特征在于，所述每个分支通道的宽度均为100μm；

所述第一主通道远离第二主通道的一端直线延伸形成的分支通道的长度为300μm；

所述第一主通道远离第二主通道的一端对称延伸形成的两个分支通道，其与第一主通道相接的一边长均为560μm，与第一主通道直线延伸的分支通道相接的一边长均为416μm；

所述第一主通道与第二主通道的连接处对称延伸形成的两个分支通道的边长为693μm；

所述第二主通道与第三主通道的连接处对称延伸形成的两个分支通道，其与第二主通道相接的一边长均为500μm，与第三主通道相接的一边长均为400μm。

7.根据权利要求6所述的装置，其特征在于，所述导料管的高度为2420μm，其导通孔的直径为100μm。

8.一种仿肝板结构肝细胞三维培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

将含肝细胞的海藻酸钠溶液、含内皮细胞的海藻酸钠溶液、缓冲液及胶凝液分别加入仿肝板结构肝细胞三维培养装置；

将所述仿肝板结构肝细胞三维培养装置形成的包裹有肝板结构的水凝胶导出所述装置，并置于培养基中进行培养；

培养完成后，降解所述水凝胶，获得肝板组织；

所述仿肝板结构肝细胞三维培养装置包括微流控芯片；所述微流控芯片内开设依次直线连接且相通的第一主通道、第二主通道和第三主通道；所述第一主通道远离第二主通道的一端、第一主通道与第二主通道的连接处及第二主通道与第三主通道的连接处均对称延伸形成两个分支通道，所述第一主通道远离第二主通道的一端同时直线延伸形成一分支通道；所述分支通道的末端均设置与相应分支通道导通的导料管，所述导料管内开设有导通孔且导料管垂直于相应的分支通道所在面，以用于通入所述含肝细胞的海藻酸钠溶液、含内皮细胞的海藻酸钠溶液、缓冲液及胶凝液。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述将含肝细胞的海藻酸钠溶液、含内皮细胞的海藻酸钠溶液、缓冲液及胶凝液分别加入仿肝板结构肝细胞三维培养装置的步骤包括：

通过第一主通道与第二主通道连接处的两个分支通道末端的导料管分别通入缓冲液；

通过第一主通道一端直线延伸形成的分支通道末端的导料管通入含肝细胞的海藻酸钠溶液，同时，通过第一主通道的一端对称延伸形成的两个分支通道末端的导料管分别通入含内皮细胞的海藻酸钠溶液；

通过第二主通道与第三主通道连接处的两个分支通道末端的导料管分别通入胶凝液。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述缓冲液包括10%（w/v）葡聚糖、0.9%（w/v）NaCl及10mmol/L HEAPS；

所述含肝细胞的海藻酸钠溶液包括0.7%（w/v）海藻酸钠、0.9%（w/v）NaCl、0.05%（w/v）去端肽胶原、1%（w/v）牛血清白蛋白、10mmol/LHEAPS及3×10⁷个/ml肝细胞；

所述含内皮细胞的海藻酸钠溶液包括0.7%（w/v）海藻酸钠、0.9%（w/v）NaCl、0.05%（w/v）去端肽胶原、1%（w/v）牛血清白蛋白、10mmol/L HEAPS及1×10⁷个/ml内皮细胞；

所述胶凝液包括10%（w/v）葡聚糖、20mmol/L BaCl₂、0.72%（w/v）NaCl及10mmol/L HEAPS。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述缓冲液、含肝细胞的海藻酸钠溶液、含内皮细胞的海藻酸钠溶液及胶凝液的通入速度依次为1-9μl/min、15-25μl/min、5-15μl/min及95-105μl/min。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述降解水凝胶，获得肝板组织的步骤具体为，利用含1U/ml藻酸盐裂解酶的PBS磷酸盐缓冲液降解所述水凝胶，以获得包裹在其内的肝板组织。

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