CN108525011A - 组织工程人工肝样组织构建的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种组织工程人工肝样组织构建的方法，其包括以下步骤：肝细胞悬液进行三维培养以形成细胞聚球；将若干个所述细胞聚球环绕一个中心预留孔组装形成聚球微阵列；将多个所述聚球微阵列紧密排布并封装固定，形成人工肝样组织。本发明组织工程人工肝样组织构建的方法操作简便，有利于形成规模化生产，并且所获得的人工肝样组织仿生程度较高，具有临床使用前景。

Description

组织工程人工肝样组织构建的方法
技术领域
本发明涉及组织工程领域，尤其涉及一种组织工程人工肝样组织构建的方法。
背景技术
组织工程学是20世纪80年代末发展起来的一门新兴交叉学科，近年来，随着生命科学、材料科学和工程科学的发展，科研人员相机在多种组织、器官体外再造的研究方面取得突破性进展，其中，一些组织工程产品如软骨、皮肤已实现商品化。肝脏组织工程是组织工程研究领域的重要研究方向之一，其目标是构建一个可供移植的肝脏组织或类器官，从而对肝功能受损的患者进行治疗。现今，科学家已模拟体内自然肝脏，成功构建出具有一定功能和活力的组织工程化人造肝脏系统。然而，由于肝脏组织结构和生理功能的复杂性，构建一个具有功能和可以值得组织工程人工肝样组织的工作仍面临严峻的挑战。
肝脏是人体最重要的器官之一，具有复杂的结构和多种生理功能。急慢性肝脏疾病，尤其是肝功能衰竭严重威胁人类健康。肝替代疗法是肝功能失代偿或肝衰竭时的主要治疗策略。肝移植是目前效果最佳的治疗手段，受供体短缺等因素制约，只有极少数人能有机会接受肝移植治疗。因而，人工肝替代疗法是替代疗法的理想出路。构建功能良好又安全性高的人工肝是所有肝组织工程研究者共同的追求。采用仿生法构建人工肝样组织是一种被肯定的研究策略，但肝脏的结构及组成十分复杂，采用人工法构建难度极高。为了实现这一目标，研究者们设计出各种支架材料以及微模具，来使单细胞状态的肝细胞，形成具有三维仿生结构的人工肝样组织。本发明涉及一种人工肝样组织的构建技术方法。该方法根据仿生学原理，利用设计的微模具将肝细胞培养并组装成大小、结构、组成均很接近正常肝小叶结构的人工肝样组织，有望进一步提高体外构建的人工肝样组织的功能。
种子细胞、支架材料及培养方式是构建高效人工肝样组织的三个要素，三者缺一不可。
目前种子细胞来源主要分为原代肝细胞、肝干细胞及肝细胞系。文献中报道具体的有：动物以及人原代肝细胞、动物以及人干细胞、人肝肿瘤细胞系、人永生化肝细胞。
用到的支架材料主要分为天然材料、合成材料及复合材料，文献中报道的具体有：动物以及人脱细胞支架材料、胶原及类似物、蚕丝蛋白及类似物、透明质酸及类似物、多糖及类似物、人工高分子聚合物、复合生物材料。
细胞培养方式主要有：悬浮培养、二维培养和三维培养。文献中单纯采用悬浮培养的极少，常与微囊包裹、微载体结合使用；二维培养法包括单层平板和多层平板法；三维培养方法用到最多，具体有三明治法、聚球培养法、细胞片层堆叠法、脱细胞支架再细胞化、微组织芯片法。
提高人工肝样组织在体外培养条件下的功能状态是肝组织工程研究的重点，提高人工肝样组织在体外培养条件下功能状态策略主要有：1)种子细胞改良，即培育功能更好的细胞系，或对动物细胞改造使其可安全用于人体；2)培养液改良，添加各种营养成分改善肝细胞功能；3)与其他非实质细胞共培养，通过自分泌旁分泌以及生物信号转导等措施促进肝细胞功能；4)培养方式改良，改变肝细胞分布排列状态，使肝细胞三维立体生长，模拟肝细胞体内状态。以上4点对于肝组织工程研究都非常重要，相对来说策略4，即培养方式改良在近年来的研究进展最显著，是目前研究的热点。
平板二维培养是经典的细胞体外培养方法，适用于绝大多数贴壁生长的细胞。肝细胞属于上皮细胞来源，原代分离的肝细胞在体外二维培养条件下能贴壁生长，但功能状态通常仅能维持3-10天左右。研究者通过改良培养条件显著提高了肝细胞在体外生存以及功能维持的时间。近年来研究证实，在培养液和种子细胞相同的前提下，三维培养对肝细胞体外培养效果的改良效果显著，可大大延长体外原代肝细胞功能状态维持时间。原因可能与三维状态下，改变了肝细胞分布排列的方式，使肝细胞能够更好的恢复体内状态下的极性结构有关。肝小叶是发挥肝脏功能的基本单位，其大小约2mm*1mm2。其细胞构成主要有3种：肝细胞(物质合成转化)、肝窦内皮细胞(维持肝细胞极性、物质转运)、星状细胞(分泌细胞外基质及细胞因子)。3者可协同发挥作用。肝细胞像其他上皮细胞一样，位于器官外表和内环境中间，组织大分子物质在两个界面间定向交换。这种物质定向交换功能的基础是细胞恢复其极性，所谓极性就是细胞的形状、细胞内的细胞器、蛋白质以及产生极性所必需的细胞骨架等的不对称分布。肝细胞的极性体现在其基底面(两个面)与细胞外基质和肝窦内皮细胞接触，侧面与肝细胞相连接，形成肝板样结构，肝细胞之间通过细胞膜凹陷和紧密连接形成胆小管，胆小管逐渐汇集成较大的小叶间胆管，最终汇入肝内胆管系统，与消化道相通。肝细胞是一种特化了的极性上皮细胞,它的顶端膜形成胆汁腔面(bile canalicularmembrane domain),而基底侧膜则形成窦状间隙面(sinusoidal membranedomain)。肝细胞质膜不同区域的膜蛋白通过各自特殊的转运机制到达细胞的特定部位,从而行使不同的功能,称为膜蛋白的极性分选和靶向转运。这是一个涉及多种信号调控的复杂而重要的细胞生物学过程,对肝细胞质膜极性的建立与维持具有重要意义。物质从肝窦血管的内环境中被吸收，经过加工代谢，从胆汁中排出，是肝细胞区别于其他上皮细胞的特异性极性特征。这种特征在二维培养条件下仅能部分实现，而通过三维共培养则可较好的实现。
三维培养，意味着肝细胞不是贴壁成饼状生长，而是恢复立方体形状生长。肝细胞立体生长有2个特点：1)单个肝细胞呈立方体状生长；2)肝细胞间形成接触面。细胞外侧被基质包裹。目前肝细胞三维生长的方法有：胶原三明治法包裹、搅拌、震动、低粘附培养板、微囊包裹、支架培养、模具培养等等。模具培养法可使细胞根据模具形态组装成研究者设计的形态，便于规模化、标准化研究。近年来光刻胶技术、3D打印等微加工技术的进步极大促进了肝组织工程培养模具的研制，使之成为目前肝组织工程研究的热点。
发明内容
本发明的目的是为克服现有技术的不足，提供一种仿生程度较高、可实现规模化生产的的组织工程人工肝样组织构建的方法。
为达到以上技术目的，本发明采用的技术方案如下：
一种组织工程人工肝样组织构建的方法，其包括以下步骤：
将肝细胞悬液进行三维培养以形成细胞聚球；
将若干个所述细胞聚球环绕一个中心预留孔组装形成聚球微阵列；
将多个所述聚球微阵列紧密排布并封装固定，形成人工肝样组织。
具体地，所述肝细胞选自传代培养的肝细胞或原代肝细胞。
优选地，所述肝细胞悬液的浓度为1～3×106cell/ml。
更优选地，所述进行三维培养时还需要加入内皮细胞和星状细胞。
进一步优选地，所述肝细胞、内皮细胞和星状细胞的混合比例为12：4：1。
进一步地，所述进行三维培养的场所是细胞聚球培养模具，所述细胞聚球培养模具的中部设有凹陷的培养面板，该培养面板的表面设有若干凹陷的底部呈球缺形的培养孔。
在一种可能的实现方式中，所述培养孔还包括连通所述球缺形底端并延伸至平齐所述培养面板表面呈圆柱体形的柱状部。
优选地，所述培养孔的直径为200～400um，所述培养孔的深度为300～400um。
更优选地，所述细胞聚球培养模具由琼脂糖制成。
进一步优选地，所述每个培养孔的所接种的细胞个数为500～3000个。
进一步地，5～7个所述细胞聚球环绕一个中心预留孔进行聚球微阵列的组装。
在一种可能的实现方式中，所述进行聚球微阵列组装的场所是人工肝样组织构建模具，所述人工肝样组织构建模具包括设有接种细胞聚球的阵列槽的模具主体，每个所述阵列槽的横截面呈六边形，并且所述六边形的中央凸起形成中央凸台。
为达到本发明的目的，所述阵列槽的深度大于所述细胞聚球的球径；所述阵列槽的边缘到所述中央凸台的最小距离大于所述细胞聚球的球径；所述中央凸台的端面低于所述阵列槽的上边缘。
优选地，所述阵列槽的侧壁与所述中央凸台的侧壁在该阵列槽的底部相接壤，使该阵列槽的纵切截面呈V形。
进一步优选地，多个所述阵列槽紧密排布，并且在所述模具主体的外周形成高于所述阵列槽上边缘的围板。
可选择地，所述封装聚球微阵列的材料为凝胶材料。
更优选地，所述凝胶材料由海藻酸钠制成。
进一步地，所述聚球微阵列的封装过程包括以下步骤：
用溶解的海藻酸钠包裹已经形成聚球微阵列的细胞聚球；
用钙盐滴加在所述海藻酸钠中促使其凝胶化；
脱模后得到人工肝样组织。
在一种优选的实现方式中，所述海藻酸钠的浓度为1％，所述钙盐的浓度为1％。
在另一种优选的实现方式中，滴加钙盐的前置步骤是，用透析膜覆盖包裹有海藻酸钠的聚球微阵列的表面。
优选地，所滴加的钙盐滴加在所述透析膜的表面，使钙盐透过该透析膜作用到所述海藻酸钠。
更优选地，所述海藻酸钠凝胶化之后，剥离所述透析膜。
与现有技术相比较，本发明具有如下优势：
(1)利用了仿生学原理，通过聚球共培养方式，模拟肝脏细胞构成，使肝细胞呈三维生长，分布排列接近体内状态，恢复肝细胞的极性，提高肝细胞功能，解决了仿生构建水平低的问题；
(2)共培养的肝细胞系与内皮细胞系及肝星状细胞系以6：2：0.5的比例共培养，所形成的细胞聚球在细胞组成和比例与正常肝小叶基本一致。这三种细胞是与肝脏功能关系最密切的；
(3)通过三维聚球共培养方式，从结构以及生理上仿生，使肝细胞功能得到了明显提高，构建出的人工肝样组织的治疗作用大大提高，并且人永生化肝细胞系细胞和人原代肝细胞都可以进行应用，且能够达到理想的临床效果；
(4)所述聚球培养模具可简单快速制备大量尺寸一致、功能高效的细胞聚球，并且该聚球培养模具由琼脂糖制成，细胞在琼脂糖表面聚球生长效果更好，进一步地，其中的培养孔具有足够的深度，细胞聚球在培养过程中不容易逸出，减少培养过程中细胞聚球损失；
(5)通过细胞聚球再组装构建出仿肝小叶结构的人工肝样组织，在不影响物质弥散的前提下，提高组织工程人工肝样组织的功效比，解决了规模化水平低的问题；
(6)人工肝样组织构建模具所提供的阵列槽能够使细胞聚球简单快速地呈仿肝小叶状分布排列，可进一步提高人工肝样组织单位体积功效，且不影响物质交换效率，避免了细胞聚球再组装时为无序堆叠，致物质交换效率有所下降，移植后再血管化难度大等问题；
(7)使用凝胶材料对形成聚球微阵列细胞聚球进行封装，一方面不阻碍细胞体外培养时易于营养物质摄入的特点，另一方面在用于移植时可对细胞聚球提供空间支撑作用以及免疫隔离保护作用；
(8)本发明控制细胞聚球大小为直径约250um，保证细胞活性，再对其进行有序再组装，在不影响细胞活性的前提下，进一步提高单位体积内肝细胞的数量，可获得cm2级、107/ml的人工肝样组织，提高了功效比。制作出的模具可反复利用，便于大量制备且成本低廉。
附图说明
图1为本发明组织工程人工肝样组织构建的方法中进行三维培养的状态图。
图2为本发明组织工程人工肝样组织构建的方法中采用的细胞聚球培养模具的立体结构示意图。
图3为本发明组织工程人工肝样组织构建的方法中细胞聚球培养模具中单个培养孔的纵向剖视图。
图4为本发明组织工程人工肝样组织构建的方法中三维培养初期细胞聚球的生长情况图。
图5为本发明组织工程人工肝样组织构建的方法中三维培养中期细胞聚球的生长情况图。
图6为本发明组织工程人工肝样组织构建的方法中三维培养后期细胞聚球的生长情况图。
图7为采用本发明组织工程人工肝样组织构建的方法所培养的细胞的染色情况。
图8为采用本发明组织工程人工肝样组织构建的方法所培养的细胞的ALB基因的表达情况。
图9为采用本发明组织工程人工肝样组织构建的方法所培养的细胞的TF基因的表达情况。
图10为采用本发明组织工程人工肝样组织构建的方法所培养的细胞的CPS1基因的表达情况。
图11为采用本发明组织工程人工肝样组织构建的方法所培养的细胞的CYP3A4基因的表达情况。
图12为采用本发明组织工程人工肝样组织构建的方法所培养的细胞的MRP1基因的表达情况。
图13为采用本发明组织工程人工肝样组织构建的方法所培养的细胞的MDR1基因的表达情况。
图14为本发明组织工程人工肝样组织构建的方法中聚球微阵列在人工肝样组织构建模具中的排列情况。
图15为本发明组织工程人工肝样组织构建的方法中人工肝样组织构建模具中单个阵列槽的俯视图。
图16为图15的纵切剖视图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细描述。
本发明组织工程人工肝样组织构建的方法包括如下步骤：
S1：将肝细胞悬液进行三维培养以形成细胞聚球。
在进行三维培养之前，需要将肝细胞进行常规的传代培养，即进行平板培养，以便获得有较佳活力的肝细胞；或者从新鲜的肝脏中分离出原代肝细胞。在准备进行三维培养之时，将在平板培养达到80％融合状态的肝细胞进行消化重悬，以获得处于对数生长期的肝细胞悬液。所谓“80％融合状态”一般是指肉眼观察下贴壁生长的肝细胞之间还留有少量空隙的状态。进一步地，调整所述肝细胞悬液的浓度至1×106cell/ml(原代肝细胞悬液的浓度调整为2～3×106cell/ml)，以备转移到三维培养模具中进行进一步的培养。
参考图1，在一种可能的实现方式中，在12孔培养板的每个培养孔中，都被液体培养基浸没一个细胞聚球培养模具，所述肝细胞悬液在所述细胞聚球培养模具中培养若干天，即自动生长成具有特定球径的细胞聚球。
具体地，参考图2和图3，作为细胞聚球三维培养的场所，所述细胞聚球培养模具1基本呈板状，其中部设有凹陷的培养面板11，相对地，所述培养面板11外周上边缘高于该培养面板11端面的结构形成围合该培养面板11的围板3。
进一步地，所述培养面板11的表面设有若干凹陷的培养孔13，如图3所示的一种实现方式，所述培养孔13包括呈球缺形的底部131和连通该球缺形底部131并且延伸至平齐所述培养面板11端面的呈圆柱形的柱形部132。在一种优选的实施例中，所述底部131为半球形，所述柱状部132的直径与底部131的直径相同。因而柱状部132与底部131之间的过渡更加圆滑，培养孔4的内壁更加光滑，更有利于形成三维立体结构的细胞聚球，并且无棱角的培养环境可以降低损伤细胞的风险。更进一步的，较优地，所述培养孔13的直径为200～400um，所述培养孔13的深度为300～400um。该尺寸的培养孔限制了单个肝细胞聚球的大小，使生成的细胞聚球的球径在250um左右，以便于后续对肝细胞聚球的移植培养，也防止细胞聚球在培养过程中从所述培养孔13中溢出。所述培养孔13可以分布于培养面板11的整个表面，也可以仅在培养面板11表面的部分区域分布。其分布方式可以是均匀规律的分布，也可以是不均匀的无序分布。当然，为了规模化培养细胞聚球，该培养孔13的分布方式优选为均匀规律分布，具体可以呈点阵状分布。
更进一步地，所述细胞聚球培养模具1的横截面形状可以是如图2所示的方形，在不影响正常使用的前提下，该细胞聚球培养模具1的横截面形状也可以是圆形、菱形、六边形或其他形状，无论是什么形状，该细胞聚球培养模具1的横截面的最大宽度不应超过多孔培养板的单个培养孔的直径，以便于该细胞聚球培养模具1能够浸没在多孔培养板中。对应的，所述围板12的外轮廓形状应该与该细胞聚球培养模具1的横截面相同，而所述培养面板11的横截面形状则可以不作限制。本领域技术人员可以根据实际需要确定所述培养面板11和围板12的具体形状和尺寸。
优选地，所述细胞聚球培养模具1由生物相容性良好的凝胶材料制成，优选采用1～3％的琼脂糖。
肝小叶是发挥肝脏功能的基本单位，其细胞构成主要有3种：肝细胞(物质合成转化)、肝窦内皮细胞(维持肝细胞极性、物质转运)、星状细胞(分泌细胞外基质及细胞因子)，三者协同发挥作用。肝细胞像其他上皮细胞一样，位于器官外表和内环境中间，组织大分子物质在两个界面间定向交换。这种物质定向交换功能的基础是细胞恢复其极性，所谓极性就是细胞的形状、细胞内的细胞器、蛋白质以及产生极性所必需的细胞骨架等的不对称分布。因此，仅由肝细胞构成的细胞聚球并不能很好地恢复肝细胞的极性。由此，在进行三维培养时还需要加入内皮细胞和星状细胞。所述内皮细胞和星状细胞在准备进行三维培养时也应当参考肝细胞悬液的准备过程分别先进行常规培养，后进行重悬以获得细胞悬液，然后将肝细胞悬液、内皮细胞悬液和星状细胞悬液按照12：4：1的体积比进行混合获得混合细胞悬液，以便于将该混合细胞悬液移植到所述细胞聚球培养模具1中进行三维培养，并且控制所述细胞聚球培养模具1中的每个培养孔13所接种的细胞个数在500～1000个(原代肝细胞的接种个数调整为2000～3000个)。
参考图4～5，共培养的所述肝细胞、内皮细胞和星状细胞在所述细胞聚球培养模具的培养孔中从培养初期开始就紧密连接成团(见图4)，并且在不断的增殖的过程中依然保持聚球状态(见图5)，直至几乎长满整个培养孔(见图6)。
参考图7，对聚球细胞进行苏木精-伊红染色(HE染色)，以便于在光镜下观察细胞聚球内每个细胞的形态特征，如左上角的照片所示，细胞聚球内的细胞大部分形态正常，细胞核较大，处于旺盛的分裂期；对细胞聚球进行occludin免疫组化染色和occludin免疫荧光染色，以便于细胞聚球内细胞和细胞之间的联接状态，右上角照片所示的褐色染色和右下角的照片所示的红色荧光都表明了细胞聚球内的细胞之间存在丰富的occludin蛋白，所述occludin蛋白是与胞间紧密连接相关的跨膜蛋白，参与紧密连接功能的调节，由此表明细胞聚球内的细胞之间能够建立良好的胞间通信，有助于提高细胞聚球的生理功能；对细胞聚球进行钙黄绿素-碘化丙啶双荧光染色，以便于同时区分细胞群体内的活细胞(绿色荧光)和死细胞(红色荧光)，如左下角的照片所示，细胞聚球内的细胞死细胞占比相对较少，细胞聚球大部分由活细胞构成，保证了细胞聚球的活力。
参考图8～13，针对人工肝样组织，采用了C3A细胞作为构成细胞聚球的肝细胞，在形成细胞聚球之后还对一系列与肝功能相关的基因的表达情况进行检测，以进一步验证细胞聚球生理功能的完整性。在图8～13所示的实验数据中，以平板培养单培养的C3A细胞(C3A单2D)、平板培养共培养的C3A细胞(C3A共2D)、三维培养单培养的C3A细胞(C3A共3D)作为对照组，与三维培养共培养的C3A细胞(C3A共3D)的各种指标进行比较。这里所述的“平板培养”(用2D表示)指常规的培养方法，“三维培养”(用3D表示)指前文所述的利用细胞聚球培养模具1进行细胞聚球化培养的过程，“单培养”(用单表示)指培养过程仅含C3A细胞的情况，“共培养”(用共表示)指培养过程将C3A细胞、内皮细胞和星状细胞按照前述的比例(6：2：0.5的体积比)进行共同培养。
其中，如图8和图9所示，ALB(白蛋白基因)和TF(转录因子基因)的表达量反映了各实验组的细胞白蛋白的合成和分泌功能，实验结果表明，C3A共3D组的白蛋白合成量是有明显增加的，而转录因子的表达量明显较高的C3A共2D组，可能在非三维培养环境下诱导了其他非目标蛋白(如白蛋白)的合成，这并不符合本发明的目的。
如图10和图11所示，CPS1基因和CYP3A4基因的表达量反映了各实验组的细胞所具有的肝功能的情况，特别是药物代谢的功能强弱的情况，实验结果表明，C3A共3D组的这两个基因的表达量是明显高于其他实验组的，即说明如前文所述的三维培养以及共培养能够明显部分恢复离体肝细胞的生理功能。
如图12和图13所示，MRP1基因和MDR1基因的表达量反映了各实验组的细胞所具有的抗药性和耐药性，主要反映所培养的细胞是否发生了癌变。结果表明，C3A共2D组的这两个基因的表达量都较高，该组细胞虽没有癌变，但是均在较高的抗药耐药风险，不适合进行后续的药物研究或者临床引用；而C3A共3D组的这两个基因的表达量仅次于所述C3A共2D组，在保证细胞没有癌变的前提下，其抗药耐药性在合理范围内，更接近体内的情况，适合科研和医药上的应用。
由上述各项实验结果表明，含有三种细胞(肝细胞、内皮细胞和星状细胞)的通过三维培养所形成的细胞聚球能够很大程度还原了肝细胞在体内的生理状态。
S2：将若干个所述细胞聚球环绕一个中心预留孔组装形成聚球微阵列。
肝小叶呈多角棱柱体，约1×2mm大小，肝小叶的中轴贯穿一条静脉，为中央静脉，中央静脉的管壁由内皮细胞组成。肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列，形成肝细胞索。肝细胞相互吻合成网，网眼间有窦状隙和血窦。肝细胞间的管状间隙成毛细胆管。
由此，由细胞聚球的形态过渡到肝小叶的形态，需要经过人工的诱导组装，优选是要将能够构成一个肝小叶的若个细胞聚球进行组装，每个细胞聚球在后续的培养中预计会各自形成一个肝细胞索。进一步地，为了给所述中央静脉留有足够的预生长空间，需要将所述若干个细胞聚球环绕一个中心预留孔进行排列，以形成聚球微阵列，该聚球微阵列相当于肝小叶的雏形。为了达到规模化组装的需求，设计了专门进行聚球微阵列组装用的模具——人工肝样组织构建模具。
参考图14，为细胞聚球聚球微阵列在人工肝样组织构建模具中的排列情况。在理想化的状态下，6个细胞聚球呈六边形排列，并且预留了中间位置形成空缺，由此形成了聚球微阵列。进一步地，为了达到一定的规模以实现一定的肝细胞功能，多个所述聚球微阵列紧密排列，并且为了空间利用的最大化，所述紧密排列的聚球微阵列也形成六边形的外轮廓。
具体地，参考图14～16，所述人工肝样组织构建模具2包括设有接种细胞聚球的阵列槽21的模具主体，所述模具主体含有基面22，所述阵列槽21相对于所述基面22向下凹陷。每个所述阵列槽21的横截面呈六边形，并且所述六边形的中央凸起形成中央凸台211，由此，所述中央凸台211周围形成用于容纳所述细胞聚球的容纳区212。
进一步地，对所述人工肝样组织构建模具2设置合适的尺寸有利于将从所述细胞聚球模具1中重悬的无序的细胞聚球快速形成所需要的聚球微阵列。优选地，所述阵列槽21相对于所述基面22的深度大于所述细胞聚球的球径(单个细胞聚球的球径约250um)；所述阵列槽21与上述基面22接壤的上边缘到所述中央凸台211的最小距离大于所述细胞聚球的球径；所述中央凸台211的端面低于所述阵列槽21的所述上边缘。在一种可能的实施方式中，所述中央凸台211的相对于所述容纳区212的底部的深度为250um，所述上边缘相对于所述容纳区212底部的深度为300um，由此，所述中央凸台211周围的容纳区212设置为适合容纳5～8个的球径尺寸相差不大的细胞聚球。
考虑到后续的封装步骤，所述人工肝样组织构建模具2还可以进行以下至少一项的优化手段：
其一，优化所述容纳区212的形状。进一步参考图16，所述容纳区212由所述阵列槽21接壤所述基面22的侧壁221与所述中央凸台211的侧壁2111在该阵列槽21的底部相接壤限定而成，并且从纵切截面视角观察，所述容纳区212呈V形，进一步使所述阵列槽21的呈V形。所述V形的容纳区212或V形的阵列槽21，在使用凝胶材料对聚球微阵列进行封装之后，有利于凝胶材料的脱模，从而保证细胞聚球和聚球微阵列的完整性。
其二，增加所述人工肝样组织构建模具2的容积。在一种可能的实施方式中，可以在所述模具主体的外周形成高于所述阵列槽212上边缘(即基面22)的围板(未图示)。所述围板可以与上述基面22一体成型，或者通过嵌套的形式与所述模具主体配合以作为该模具主体的增高体。
S3：将多个所述聚球微阵列紧密排布并封装固定，形成人工肝样组织。
综合考虑了生物相容性、物质交换的难易程度、操作的便利性和成本等因素之后，采用了海藻酸钠作为封装聚球微阵列的材料的凝胶材料。具体地，所述聚球微阵列的封装过程包括以下步骤：
(1)用溶解的海藻酸钠包裹已经形成聚球微阵列的细胞聚球；对这一个步骤的具体操作方式可以有两种：一种是将细胞聚球预先与溶解的海藻酸钠混合，然后注入到所述人工肝样组织构建模具2中；另一种是将细胞聚球悬液(保留少量的培养液)先注入到所述人工肝样组织构建模具2中，吸走绝大部分的培养液之后加入溶解的海藻酸钠，以包裹细胞聚球。但无论是第一种操作方式，还是第二种操作方式，所形成的聚球微阵列也未必如理想状态下每个所述阵列槽21都落入了6个细胞聚球，实际情况是绝大多数的所述阵列槽21都落入了细胞聚球，并且细胞聚球的数量在5～8个不等，但是，这不妨碍所形成的人工肝样组织发挥应有的生理功能。
(2)用透析膜覆盖包裹有海藻酸钠的聚球微阵列的表面；本领域技术人员知晓，溶解状态的海藻酸钠在加入铝、钡、钙、铜、铁、铅、锌、镍等金属盐之后，会生成不溶性的藻酸盐，即呈凝胶状态。在通常的状态下，在存放了溶解的海藻酸钠的开放容器中直接滴加上述列举的任一金属盐促使海藻酸钠的凝胶化之后，所形成的凝胶表面无法保证平整性，因此，利用透析膜作为“工装”，用于辅助形成表面平整的凝胶块。
(3)用钙盐滴加在所述透析膜的表面使透析膜下的海藻酸钠凝胶化；在一种可能的实现方式中，选用氯化钙作为促使海藻酸钠凝胶化的金属盐。本领域技术人员公知，氯化钙属于小分子金属盐，极容易穿过透析膜，因此将氯化钙滴加在所述透析膜的表面之后，所述氯化钙能够顺利通过透析膜上孔径均匀的微孔，从而可以与该透析膜下的海藻酸钠相互反应。在优选的方案中，所述海藻酸钠的浓度为1％，所述氯化钙的浓度为1％。
(4)脱模并且剥离所述透析膜后得到人工肝样组织；如上文所述，为了便于脱模，将所述阵列槽设置为V形槽；所述透析膜可以在脱模之前进行剥离，也可以在脱模之后进行剥离。
最后所得到的人工肝样组织形状规则、肝细胞密度高、肝细胞生物活性高，便于后续进行生理生化研究，或临床的移植应用。
综上所述，本发明组织工程人工肝样组织构建的方法操作简便，有利于形成规模化生产，并且所获得的人工肝样组织仿生程度较高，具有临床使用前景。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但并不仅仅受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，均包含在本发明的保护范围之内。

Claims (22)

1.一种组织工程人工肝样组织构建的方法，其特征在于，其包括以下步骤：
将肝细胞悬液进行三维培养以形成细胞聚球；
将若干个所述细胞聚球环绕一个中心预留孔组装形成聚球微阵列；
将多个所述聚球微阵列紧密排布并封装固定，形成人工肝样组织。
2.如权利要求1所述的组织工程人工肝样组织构建的方法，其特征在于，所述肝细胞选自传代培养的肝细胞，或原代肝细胞。
3.如权利要求2所述的组织工程人工肝样组织构建的方法，其特征在于，所述肝细胞悬液的浓度为1～3×106cell/ml。
4.如权利要求1所述的组织工程人工肝样组织构建的方法，其特征在于，所述进行三维培养时还需要加入内皮细胞和星状细胞。
5.如权利要求4所述的组织工程人工肝样组织构建的方法，其特征在于，所述肝细胞、内皮细胞和星状细胞的混合比例为12：4：1。
6.如权利要求1所述的组织工程人工肝样组织构建的方法，其特征在于，所述进行三维培养的场所是细胞聚球培养模具，所述细胞聚球培养模具的中部设有凹陷的培养面板，该培养面板的表面设有若干凹陷的底部呈球缺形的培养孔。
7.如权利要求6所述的组织工程人工肝样组织构建的方法，其特征在于，所述培养孔还包括连通所述球缺形底端并延伸至平齐所述培养面板表面呈圆柱体形的柱状部。
8.如权利要求6所述的组织工程人工肝样组织构建的方法，其特征在于，所述培养孔的直径为200～400um，所述培养孔的深度为300～400um。
9.如权利要求6所述的组织工程人工肝样组织构建的方法，其特征在于，所述细胞聚球培养模具由琼脂糖制成。
10.如权利要求6所述的组织工程人工肝样组织构建的方法，其特征在于，所述每个培养孔的所接种的细胞个数为500～3000个。
11.如权利要求1所述的组织工程人工肝样组织构建的方法，其特征在于，5～7个所述细胞聚球环绕一个中心预留孔进行聚球微阵列的组装。
12.如权利要求11所述的组织工程人工肝样组织构建的方法，其特征在于，所述进行聚球微阵列组装的场所是人工肝样组织构建模具，所述人工肝样组织构建模具包括设有接种细胞聚球的阵列槽的模具主体，每个所述阵列槽的横截面呈六边形，并且所述六边形的中央凸起形成中央凸台。
13.如权利要求12所述的组织工程人工肝样组织构建的方法，其特征在于，所述阵列槽的深度大于所述细胞聚球的球径；所述阵列槽的边缘到所述中央凸台的最小距离大于所述细胞聚球的球径；所述中央凸台的端面低于所述阵列槽的上边缘。
14.如权利要求12所述的组织工程人工肝样组织构建的方法，其特征在于，所述阵列槽的侧壁与所述中央凸台的侧壁在该阵列槽的底部相接壤，使该阵列槽的纵切截面呈V形。
15.如权利要求12所述的组织工程人工肝样组织构建的方法，其特征在于，多个所述阵列槽紧密排布，并且在所述模具主体的外周形成高于所述阵列槽上边缘的围板。
16.如权利要求1所述的组织工程人工肝样组织构建的方法，其特征在于，所述封装聚球微阵列的材料为凝胶材料。
17.如权利要求16所述的组织工程人工肝样组织构建的方法，其特征在于，所述凝胶材料由海藻酸钠制成。
18.如权利要求17所述的组织工程人工肝样组织构建的方法，其特征在于，所述聚球微阵列的封装过程包括以下步骤：
用溶解的海藻酸钠包裹已经形成聚球微阵列的细胞聚球；
用钙盐滴加在所述海藻酸钠中促使其凝胶化；
脱模后得到人工肝样组织。
19.如权利要求18所述的组织工程人工肝样组织构建的方法，其特征在于，所述海藻酸钠的浓度为1％，所述钙盐的浓度为1％。
20.如权利要求18所述的组织工程人工肝样组织构建的方法，其特征在于，滴加钙盐的前置步骤是，用透析膜覆盖包裹有海藻酸钠的聚球微阵列的表面。
21.如权利要求20所述的组织工程人工肝样组织构建的方法，其特征在于，所滴加的钙盐滴加在所述透析膜的表面，使钙盐透过该透析膜作用到所述海藻酸钠。
22.如权利要求21所述的组织工程人工肝样组织构建的方法，其特征在于，所述海藻酸钠凝胶化之后，剥离所述透析膜。
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