CN102114275B

CN102114275B - 类肝小叶生物反应器

Info

Publication number: CN102114275B
Application number: CN201110064200A
Authority: CN
Inventors: 李兰娟; 喻成波; 章益民; 潘小平; 杜维波; 曹红翠; 吕国良; 黄建荣
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2011-03-17
Filing date: 2011-03-17
Publication date: 2012-10-17
Anticipated expiration: 2031-03-17
Also published as: US8735143B2; CN102114275A; US20140087454A1; WO2012122719A1

Abstract

本发明公开一种类肝小叶生物反应器，属于生物医学设备领域。在其外壳内设有纳米纤维支架网，肝内纤维血管网、毛细胆管网、上肝胆管、下肝胆管、胆总管和肝细胞胶原纤维微管道分布于整个纳米纤维支架网中，且毛细胆管网分布于肝细胞胶原纤维微管道的周围；上肝胆管和下肝胆管通过胆总管连通；毛细胆管网中的毛细胆管设有两个以上毛细胆管上皮细胞入口；肝细胞胶原纤维微管道设有两个以上肝细胞注入口；肝内纤维血管网设有液体进口和液体出口；毛细胆管上皮细胞入口、肝细胞注入口、液体进口、液体出口和胆总管的下端出口穿过所述外壳。本发明真实地模拟了肝小叶的结构，发挥了肝脏的代谢解毒和排泄等功能，为以往任何生物反应器所不具备。

Description

类肝小叶生物反应器

技术领域

本发明属于生物医学设备领域，涉及一种类肝脏结构单元的仿生肝组织工程，特别涉及一种为生物型或混合型生物人工肝治疗的核心装置—人工肝用类肝小叶生物反应器。

背景技术

肝脏是机体最重要的生命器官之一，具有复杂的结构和多种生理功能，急、慢性肝脏疾病，尤其是肝功能衰竭严重影响着人们的健康。肝脏移植是从根本上治疗慢性肝病与肝功能衰竭的方法，但受到供体肝脏匮乏、异种移植失败和需要长期使用免疫抑制剂的限制。因此，肝脏疾病治疗急需寻求新的方法，肝脏组织工程为肝病的治疗带来了新的希望。

组织工程学是20世纪80年代末发展起来的一门新兴交叉学科。近年来，随着生命科学、材料科学和工程科学的发展，科研人员相继在多种组织、器官体外再造的研究方面取得突破性进展，其中，一些组织工程产品如软骨、皮肤已实现商品化。肝脏组织工程是组织工程研究领域中的重要研究方向之一，其目标是构建一个可供移植的肝脏组织或类器官，从而对肝功能受损的患者进行治疗。肝脏是人体内化学合成、解毒、生物转化、营养加工厂，是人体复杂供需调节的场所，肝脏组织结构和生理功能复杂，肝脏由很多肝小叶构成，肝小叶是肝脏的结构和功能的基本单位，肝小叶是由肝细胞、毛细胆管、血窦所构成。这种基本的结构功能单元能够完全体现肝脏的代谢、营养及排泄胆汁等功能。如何在体外构建一个具有完整功能或可移植的组织工程化肝脏的工作仍面临极为严峻的挑战。

生物反应器是生物人工肝的核心装置，是外源性肝细胞和病人血液或血浆进行物质交换的场所，当今在世界范围内生物反应器发展迟缓，现有的装置在材料、结构设计及效果等方面均远未达到理想的程度，如何使生物反应器最大限度地模仿正常肝脏的组织结构，为培养肝细胞提供类似于体内的生存及代谢环境是今后研究难点所在。目前生物人工肝所研究的生物反应器如平板型生物反应器、中空纤维型反应器、微囊悬浮型反应器、支架灌流型生物反应器等与人体肝脏结构相差甚远，缺乏胆汁排出系统，并且物质交换效率不高，因此必须开发新型材料及改进设计生物反应器，使之在流体力学及几何学等方面更接近生理状态。目前国内外尚未检索到有关类肝小叶生物反应器。

发明内容

本发明的目的在于提供一种类肝小叶结构生物反应器，该反应器的结构模拟肝脏结构，以期发挥生物反应器的更强大功能。

为实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：其类肝小叶生物反应器包括封闭式外壳，在外壳内设有纳米纤维支架网，肝内纤维血管网、毛细胆管网、上肝胆管、下肝胆管、胆总管和肝细胞胶原纤维微管道分布于整个纳米纤维支架网中，且毛细胆管网分布于肝细胞胶原纤维微管道的周围；上肝胆管和下肝胆管通过胆总管连通；毛细胆管网中的毛细胆管设有两个以上毛细胆管上皮细胞入口，胆管上皮细胞能够经毛细胆管上皮细胞入口分布于毛细胆管网而培养形成类胆管样结构；肝细胞胶原纤维微管道设有两个以上肝细胞注入口；肝内纤维血管网设有液体进口和液体出口，肝细胞能够在肝细胞胶原纤维微管道内生长形成类肝小叶肝板样结构；所述毛细胆管上皮细胞入口、肝细胞注入口、液体进口、液体出口和胆总管的下端出口穿过所述外壳；毛细胆管分泌的胆汁经上肝胆管、下肝胆管汇合于胆总管，最后胆汁经胆总管的下端出口排出体外；肝内纤维血管网为所述反应器提供物质代谢交换的场所。

进一步地，本发明所述液体进口连接有膜氧合器，所述液体出口连接有吸附免疫大分子的免疫吸附器。

进一步地，本发明所述外壳的材料为聚丙烯或聚乙烯。

进一步地，本发明所述肝内纤维血管网由聚氨酯或膨体聚四氟乙烯制成。

进一步地，本发明所述肝内纤维血管网中肝内纤维血管的直径为50μm～6mm，肝内纤维血管的孔隙率为85～95%。

进一步地，本发明所述肝细胞胶原纤维微管道所用的材料为聚丙烯、聚砜、聚醚砜、聚醚酯、聚乙烯、聚偏二氟乙烯或聚醚醚酮的中空纤维。

进一步地，本发明所述肝细胞胶原纤维微管道的直径为600μm-1mm。

进一步地，本发明所述毛细胆管网所用的材料为聚丙烯、聚砜、聚醚砜、聚醚酯、聚乙烯、聚偏二氟乙烯或聚醚醚酮。

进一步地，本发明所述纳米纤维支架网所用的材料为聚己内酯、以海藻酸钠、壳聚糖和聚乳酸-乙醇酸、左旋聚乳酸、壳聚糖-胶原、聚乙醇酸中的任一种或任几种的混合。

进一步地，本发明所述纳米纤维支架网中支架的直径为20nm-500nm，所述支架的孔隙率>80%。

本发明将生物材料构建的生物反应器应用于生物人工肝并通过内部合理布局，优化内部结构对生物反应器进行改进，从而提高生物型人工肝的临床效能。针对上述问题，本发明在对人工肝生物反应器的改进中应用生物相容性良好的生物材料构建模拟肝内血管网供血液（血浆）或营养液进出反应器，利于提供反应器中肝细胞的营养以及进行物质交换；编制生物材料肝内毛细胆管网，胆管内皮细胞接种毛细胆管内定植，利于肝细胞分泌胆红素通过胆管内皮细胞排泌至毛细胆管，最后供胆汁经胆总管排出体外，以期经过胆红素的排泄减低肝衰竭动物或人的血液中胆红素的水平。构筑类肝小叶肝板样结构，肝细胞接种于生物纤维管道中进行培养形成条索状肝板，条索状肝板分布在毛细胆管周围，以此肝细胞进行解毒、物质代谢、合成以及胆红素等有害物质经过毛细胆管或肝内血管物质交换，设计中使肝内血管、肝内毛细胆管及肝板三者有机结合分布于生物反应器装置中，最大限度地模拟了肝脏的肝小叶结构。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1.本发明生物反应器最大程度地模拟肝小叶结构，具备了供血或供给肝细胞营养肝小叶静脉血管网络，具有肝脏代谢功能的肝板样结构，以及具有排泄胆汁的肝内胆管系统，从生理结构的角度与以往的任何生物反应器相比具有显著的优越性。目前已有的反应器如：平板型生物反应器、中空纤维生物反应器、支架灌流型生物反应器、微囊悬浮型生物反应器都缺乏真正意义上的血管网络，更重要的是缺乏关键的胆汁排泄系统，这是本发明反应器的最大亮点所在。

2.本发明生物反应器中，肝板微管道以及肝内胆管网采用生物相容性好、安全无毒的生物材料或经过改性的生物材料适合肝细胞或胆管上皮细胞生长，反应器中培养肝细胞形成条索状肝板，肝内胆管胶原化改性后肝细胞与胆管上皮细胞共培养形成固有的肝内胆管功能性胆管内皮细胞。

3.本发明生物反应器中具有特殊的纳米纤维支架网，在体外试验中发现，该纳米纤维支架网具有良好传质功能，有利于代谢物质的传递。本发明的纳米纤维支架网相当于广泛分布于肝脏中的胶原支架网。

4.本发明人工肝用类肝小叶生物反应器系统结构更接近真实的肝脏，以全新概念为人工肝开辟了新途径，功能更为全面，设计更加科学；该生物反应器设计新颖，反应器胆汁排泄系统应用于生物反应器在国内外尚属首次，而且引用了纳米纤维支架网增加物质的传递效能，以上这些都是此反应器的亮点，相信此类反应器在生物人工肝以及今后进一步在反应器设计发展上具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明人工肝用类肝小叶生物反应器的结构示意图；

图2为图1的矢状面缩小结构示意图；

图3为图1的冠状面缩小结构示意图；

图4为本发明生物反应器使用时的工作示意图。

具体实施方式

如图1至图3所示，本发明类肝小叶生物反应器有一封闭式外壳14，在外壳14内设有纳米纤维支架网15。肝内纤维血管网9、毛细胆管网12、上肝胆管7、下肝胆管8、胆总管10和肝细胞胶原纤维微管道13分布于整个纳米纤维支架网15中，且毛细胆管网12分布于肝细胞胶原纤维微管道13的周围。其中，上肝胆管7和下肝胆管8通过胆总管10连通；毛细胆管网12中的毛细胆管设有两个以上毛细胆管上皮细胞入口；肝细胞胶原纤维微管道13设有两个肝细胞注入口2、3。本发明中，毛细胆管上皮细胞入口和肝细胞注入口均可为三个或三个以上。肝内纤维血管网9设有液体进口1和液体出口6；所述毛细胆管上皮细胞入口、肝细胞注入口、液体进口1、液体出口6和胆总管10的下端出口穿过外壳14。

作为本发明的改进方案，液体进口1连接有膜氧合器16，且液体出口6连接有吸附免疫大分子的免疫吸附器17；外壳14的材料优选为聚丙烯或聚乙烯；肝内纤维血管网9由聚氨酯或膨体聚四氟乙烯制成；肝内纤维血管网9中肝内纤维血管的直径为50μm～6mm，肝内纤维血管的孔隙率为85～95%；肝细胞胶原纤维微管道13所用的材料为聚丙烯、聚砜、聚醚砜、聚醚酯、聚乙烯、聚偏二氟乙烯或聚醚醚酮的中空纤维；肝细胞胶原纤维微管道4的直径为600μm-1mm；毛细胆管网12所用的材料为聚丙烯、聚砜、聚醚砜、聚醚酯、聚乙烯、聚偏二氟乙烯或聚醚醚酮；纳米纤维支架网15所用的材料为聚己内酯、以海藻酸钠、壳聚糖和聚乳酸-乙醇酸、左旋聚乳酸、壳聚糖-胶原、聚乙醇酸中的任一种或任几种的混合；纳米纤维支架网15中支架的直径为20nm-500nm，所述支架的孔隙率>80%。

本发明人工肝用类肝小叶生物反应器整个外壳14可用改性的聚丙烯或聚乙烯封装，毛细胆管上皮细胞入口4、毛细胆管上皮细胞入口5、肝细胞注入口2、肝细胞注入口3、液体进口1、液体出口6和胆总管10的下端出口穿过外壳14，且各入口和出口如图1所示分别布局在外壳14的两端，用医用胶水封装，反应器内为肝内静脉、肝细胞微管道、肝内胆管的肝小叶功能单元。一般，本发明类肝小叶生物反应器大小尺寸为：长15-25cm，直径约6-8cm，容积为200-600ml。本发明反应器在实际制作时可根据需要放大或缩小，制定所需要的尺寸。

如图1至图4所示，本发明生物反应器18使用时：培养液/血液/或血浆经液体进口1后在反应器肝内静脉中循环；2、3为肝细胞注入口；胆管上皮细胞经毛细胆管上皮细胞入口4、5使胆管细胞分布于毛细胆管网适时培养1-10天形成类胆管样结构；液体出口6为反应器物质代谢交换后的培养液/血液/或血浆经肝内血管网汇合后的流出道；肝内毛细胆管分泌的胆汁汇总至上肝胆管7、下肝胆管8；肝内纤维血管网9为液体流经反应器的肝内毛细血管网进行物质交换的场所；胆汁经上肝胆管7、下肝胆管8汇合于胆总管10；最后胆汁经胆总管出口11排出体外，其中直接胆红素排出体外，机体内的直接胆红素下降；毛细胆管网12提供肝细胞及肝内胆管上皮细胞进行分泌及排泄胆红素的场所；肝细胞胶原纤维微管道13提供肝细胞在此生长形成类肝小叶肝板样结构；纳米纤维支架网15为支撑肝小叶各结构，纳米纤维支架通过纺丝的原理进行制备，在反应器内形成无纺布结构，增加各肝小叶结构的物质传质效能；外壳14为整个反应器的医用级的反应器的外壳，各种接口主要分布在外壳14的两侧，左侧为入口，右侧为出口，接口连接处用医用胶水密封；氧合器16使血浆/培养液氧合携带氧供给类肝小叶生物反应器中肝细胞所需氧；免疫吸附器17可吸附免疫大分子物质（IgG、IgM及补体系列），防止进入机体发生免疫反应。

体外设计上只有从外形和结构上越接近肝小叶，反应器的功能发挥才愈发接近肝脏的代谢解毒和排泄功能，本发明为从构建类似肝小叶的肝内静脉网络、肝板、肝内胆管以及胆总管等更加真实地模拟了肝小叶的结构，为以往任何其它生物反应器所不具备的，体现了先进的设计理念。

对本发明的类肝小叶生物反应器按如下方法进行验证：采取D-氨基半乳糖致大动物猪肝衰竭造模的方式，原代猪肝细胞、胆管内皮细胞分离培养在类肝小叶生物反应器中的肝细胞胶原微管道及毛细胆管中1-3天后，利用建立体外循环，把理想造模的肝衰竭猪的全血引出体外，先经过血浆分离器分离后，肝衰竭猪的血浆经过类肝小叶生物反应器进行代谢，同时在类肝小叶生物反应器下游再经过免疫吸附器吸附免疫大分子减少免疫大分子的排异反应，每治疗例次的的时间为4-6小时，治疗前观察大动物猪的精神状态、食欲以及肝功能、血氨测定检查，结果显示猪精神状态明显好转，想进食，肝功能酶学及黄疸指数下降，血氨水平在治疗后有所下降，表明以此类肝小叶反应器为核心构建的生物人工肝对急性肝衰竭有治疗作用，减轻肝损伤。

Claims

1.一种类肝小叶生物反应器，其特征是：包括封闭式外壳（14），在外壳（14）内设有纳米纤维支架网（15），肝内纤维血管网（9）、毛细胆管网（12）、上肝胆管（7）、下肝胆管（8）、胆总管（10）和肝细胞胶原纤维微管道（13）分布于整个纳米纤维支架网（15）中，且毛细胆管网（12）分布于肝细胞胶原纤维微管道（13）的周围；上肝胆管（7）和下肝胆管（8）通过胆总管（10）连通；毛细胆管网（12）中的毛细胆管设有两个以上毛细胆管上皮细胞入口，胆管上皮细胞能够经毛细胆管上皮细胞入口分布于毛细胆管网而培养形成类胆管样结构；肝细胞胶原纤维微管道（13）设有两个以上肝细胞注入口，肝细胞能够在肝细胞胶原纤维微管道（13）内生长形成类肝小叶肝板样结构；肝内纤维血管网（9）设有液体进口（1）和液体出口（6）；所述毛细胆管上皮细胞入口、肝细胞注入口、液体进口（1）、液体出口（6）和胆总管（10）的下端出口穿过所述外壳（14），毛细胆管分泌的胆汁经上肝胆管（7）、下肝胆管（8）汇合于胆总管（10），最后胆汁经胆总管的下端出口排出体外；肝内纤维血管网（9）为所述反应器提供物质代谢交换的场所。

2.根据权利要求1所述的类肝小叶生物反应器，其特征是：所述液体进口（1）连接有膜氧合器（16），所述液体出口（6）连接有吸附免疫大分子的免疫吸附器(17)。

3.根据权利要求1所述的类肝小叶生物反应器，其特征是：所述外壳（14）的材料为聚丙烯或聚乙烯。

4.根据权利要求1所述的类肝小叶生物反应器，其特征是：所述肝内纤维血管网（9）由聚氨酯或膨体聚四氟乙烯制成。

5.根据权利要求1或4所述的类肝小叶生物反应器，其特征是：所述肝内纤维血管网（9）中肝内纤维血管的直径为50μm～6mm，肝内纤维血管的孔隙率为85～95%。

6.根据权利要求1所述的类肝小叶生物反应器，其特征是：所述肝细胞胶原纤维微管道（13）所用的材料为聚丙烯、聚砜、聚醚砜、聚醚酯、聚乙烯、聚偏二氟乙烯或聚醚醚酮的中空纤维。

7. 根据权利要求1或6所述的类肝小叶生物反应器，其特征是：所述肝细胞胶原纤维微管道（13）的直径为600μm-1mm。

8.根据权利要求1所述的类肝小叶生物反应器，其特征是：所述毛细胆管网（12）所用的材料为聚丙烯、聚砜、聚醚砜、聚醚酯、聚乙烯、聚偏二氟乙烯或聚醚醚酮。

9.根据权利要求1所述的类肝小叶生物反应器，其特征是：所述纳米纤维支架网（15）所用的材料为聚己内酯、以海藻酸钠、壳聚糖和聚乳酸-乙醇酸

、左旋聚乳酸、壳聚糖-胶原、聚乙醇酸中的任一种或任几种的混合。

10.根据权利要求1或9所述的类肝小叶生物反应器，其特征是：所述纳米纤维支架网（15）中支架的直径为20nm-500nm，所述支架的孔隙率>80%。