CN102089426B - 细胞分化方法及其在血管建立中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及特定氧浓度用于实施使干细胞分化的方法的用途，条件是所述干细胞不是人类胚胎干细胞并且植于合适的培养基中的载体上，其中所述分化引起：-在含氧量正常条件下并在合适的培养基中的第一组特化分化的细胞，或-在低氧条件下的第二组特化分化的细胞，其处于与用于获得第一组特化分化的细胞的培养基性质相同的培养基中，所述第一和第二组特化分化的细胞保留通过天然生物学过程获得的各自相对应的特化分化的细胞的功能特性。
Description
本发明涉及细胞分化方法及其在血管建立中的应用。本发明还涉及特定氧浓度用于实施细胞分化方法的用途。
在发育生物学中，细胞分化是指特化性较低的细胞变成特化性较高的细胞类型的过程。在多细胞生物体发育过程中，随着生物体从单个受精卵变成组织和细胞类型的复杂系统，会发生多次分化。分化也是成体中的常见过程：在组织修复和正常细胞周转过程中，成年干细胞分裂并产生完全分化的子代细胞。细胞分化引起细胞的大小、形状、极性、代谢活性和对信号的响应性的显著改变。这些改变很大程度上是由于基因表达的高度受控的修饰造成的。除了几个例外以外，细胞分化几乎从不涉及DNA序列本身的变化。因此，不同的细胞可以具有差别非常大的物理性质，虽然它们具有相同的基因组。
能够分化成很多细胞类型的细胞称作多能的(pluripotent)。这些细胞在动物中被称为干细胞。能够分化成所有细胞类型的细胞称作全能的。在哺乳动物中，只有受精卵和早期胚胎细胞是全能的。
当精子和卵子发生受精作用并产生具有形成完整生物体的潜力的单个细胞时，发育开始。在受精后的前几个小时，该细胞分裂成相同的细胞。在人类中，在受精后大约4天和细胞分裂数个循环之后，这些细胞开始特化(specialize)，形成细胞的空心球体，称为胚泡。胚泡具有外层细胞，在空心球内有称作内细胞团(inner cell mass)的细胞簇。内细胞团的细胞将继续形成最终的人体的所有组织。虽然内细胞团的细胞最终可以形成人体中发现的每种类型的细胞，但是它们不能形成生物体。这些细胞被称作多能的。
多能(pluripotent)干细胞经过进一步的特化成为多潜能(multipotent)祖细胞，然后，多潜能祖细胞产生功能细胞。干细胞和祖细胞的实例包括：
●来自骨髓的造血干细胞(成年干细胞)，其产生红细胞、白细胞和血小板；
●来自骨髓的间充质干细胞(成年干细胞)，其产生基质细胞、脂肪细胞和多种类型的骨细胞；
●上皮干细胞(祖细胞)，其产生多种类型的皮肤细胞；
●肌卫星细胞(祖细胞)，其促成分化的肌肉组织。
生物体中每种特化的细胞类型表达构成该物种的基因组的所有基因的亚集。每种细胞类型由受调节的基因表达的特定模式所定义。因此，细胞分化是细胞从一种细胞类型到另一种类型的转化，其涉及从一种基因表达模式到另一种的转换。一些进化上保守类型的分子过程通常参与控制这些转换的细胞机制。控制细胞分化的主要类型的分子过程涉及信号传导。在控制细胞分化过程中将信息从一个细胞传递到另一个细胞的很多信号分子被称为生长因子。另一个重要的策略是使亲代细胞内的分子分化控制信号不平均地分配。胞质分裂之后，此类细胞内分化控制信号的数量在子代细胞中是不平均的，这种不平均会导致不同子代细胞的分化的不同模式。广泛研究的实例是果蝇中的身体轴线模式的研究。RNA分子是一种重要的细胞内分化控制信号。
体外扩增，即增殖，以及分化过程在本领域中已进行了深入研究。尤其是用于富集造血干细胞的造血干细胞增殖培养条件是熟知的。
例如，WO 2007/049096公开了扩增造血干细胞并允许其向内皮细胞分化的方法。该方法包括在特定培养基中体外培养干细胞，其中所述干细胞附着到允许/增强其向内皮细胞分化的载体上。
此外，该文献未提及使用CD34-阳性抗原纯化的干细胞可以提供除了内皮细胞之外的其它附着细胞。
所以，虽然科学家对于分化过程的了解越来越多，但是细胞分化的机理和命运仍待阐明。
此外，本领域中尚无文献报道允许从干细胞向分化的细胞分化的方法或特定条件的使用，其中所述分化的细胞在天然生物学过程中不是衍生自所述干细胞。
需要提供一种简单的、独特的或准独特的程序以使干细胞分化为所有想要的分化的细胞。
该需求对于手术治疗和处理与分化过程改变相关的病症、或损伤后器官重建是特别重要的。
尤其重要的是提供工程化组织(例如血管)以治疗患有心血管病或血管疾病(例如栓塞、中风)的个体。
所有的血管都具有相同的基础结构。从内至外有三个层：
·内膜(最薄的层)：通过多糖细胞间基质粘合在一起的单层的简单磷状内皮细胞，周围是内皮下结缔组织的薄层，交错着很多循环排列的弹性带(称为内弹力膜)。
·中膜(最厚的层)：循环排列的弹性纤维、结缔组织、多糖物质，第二层和第三层被另一个厚的弹性带(称作外弹力膜)分开。中膜(尤其是动脉中的中膜)可以富含血管平滑肌，其控制管径。
·外膜：完全由结缔组织构成。它还包含提供肌肉层的神经，以及更大的血管中的营养毛细血管(血管滋养管)。
现有技术中公开了一些在体外产生血管的方法：
WO 2005/003317公开了使用分化的平滑肌细胞和内皮细胞在体外建立血管的方法。此外，该文献还公开了通过使用平滑肌细胞的干细胞(或祖细胞)和内皮细胞的干细胞(或祖细胞)在体外建立血管。
该文献还公开了允许形成功能性的、可移植的、“工程化的”血管的基质。
在该文献的方法中，虽然公开了血管是可移植的，但是需要收集两种类型的干细胞用于构建血管。所以，该方法的缺点在于实施重要的侵入性手术来收集可用的细胞。
WO 2006/099372公开了使用允许隐静脉纯化的内皮细胞或纯化的内皮干细胞附着的基质产生血管的方法。该文献中公开的方法允许形成管状基质，其中植入内皮细胞以建立血管。
但是，该文献没有提及体外产生的血管的可移植性。
L’Heureux等人在两篇文献[FASEB journal，vol 12，pp 47-56(1998)；FASEB journal，vol 15，pp 515-524(2001)]中公开了使用分离自健康新生儿供体的脐带的内皮细胞和平滑肌细胞在体外生产血管的方法。在这些文献中，作者公开了功能性血管的产生，其能够具有收缩特性。
最近，l’Heureux等人.[Nat.Med.，12(3)March，pp 361-364(2006)]公开了皮肤衍生的纤维原细胞用于形成载体的用途，其中平滑肌细胞和内皮细胞能够附着于所述载体上以形成新的血管。
这三篇文献中公开的方法允许在体外使用工程化的血管，但是，所使用的细胞的来源严重降低了移植所述工程化的血管的可能性，并增大了移植物排斥的可能性。
本发明提供了独特的、易于使用的和迅速的使单个干细胞分化的方法。
本发明还提供了用于干细胞分化并且根据条件产生不同的分化的干细胞的培养基。
本发明还提供了使用单一类型的干细胞制备血管的方法。所述血管是功能性的并且易于向提供干细胞的个体移植，而无移植物排斥。
本发明涉及特定氧浓度用于实施使衍生自骨髓或血液或脂肪组织或脐带的干细胞分化的体外方法的用途，条件是所述干细胞不是人类胚胎干细胞并且植于合适的培养基中的载体上，其中所述分化：
-在含氧量正常条件下并在合适的培养基中产生第一组特化分化的细胞，和
-或，在低氧条件下产生第二组特化分化的细胞，其处于与用于获得第一组特化分化的细胞的培养基性质相同的培养基中，其中所述低氧条件不同于缺氧(anoxia)，
所述第一和第二组特化分化的细胞保留通过天然生物学过程获得的各自相对应的特化分化的细胞的功能特性，
所述第一组特化分化的细胞具有与所述第二组特化分化的细胞不同的细胞功能特性。
本发明涉及特定氧浓度用于实施使衍生自骨髓或血液或脂肪组织或脐带的干细胞分化的方法、优选体外方法的用途，条件是所述干细胞不是人类胚胎干细胞并且植于合适的培养基中的载体上，其中所述分化：
-在含氧量正常条件下并在合适的培养基中产生第一组特化分化的细胞，
-或，在低氧条件下产生第二组特化分化的细胞，其处于与用于获得第一组特化分化的细胞的培养基性质相同的培养基中，
所述第一和第二组特化分化的细胞保留通过天然生物学过程获得的各自相对应的特化分化的细胞的功能特性。
本发明源于以下出人预料的发现：当把干细胞植于允许其增殖的培养基中的载体(如下文所述)上时，可以根据特定的培养基氧浓度分化成两种不同的分化的细胞。
本发明的“分化”公开了这样的方法，其在于将未成熟的细胞“转化”为很多不同的成熟细胞。
细胞分化是指这样的过程，通过该过程，特化性较低的细胞变成特化性较高的细胞类型。
细胞命运决定是细胞沿着指定的细胞分化途径的程序设定。通常，以细胞的末端分化状态来讨论细胞。在发育过程中，可以在某些时间指定一些少数细胞的命运。当提及发育命运或细胞命运时，人们谈论的是该细胞以及在发育中该点之后它的后代所发生的所有事件。
细胞定向为某个状态的过程可以分成两个阶段：特化(specification)和决定(determination)。特化不是持久时期，基于不同的指令，细胞可以被逆转。相反，决定是指细胞不可逆地定向为特定命运。该过程受到细胞外环境和细胞基因组内容的作用的影响。决定在显微镜下是不可见的，当细胞变成决定的时，它们不改变其外观。决定之后是分化，生物化学、结构和功能上的实际变化，这些变化导致产生不同类型的细胞。分化可以包括外观以及功能上的变化。
细胞定向的状态也称作其发育潜力。当发育潜力小于或等于发育命运时，细胞显示出嵌合体行为(mosaic behavior)。当发育潜力大于发育命运时，细胞显示出调控行为(regulative behavior)。
细胞分化还与有限的细胞增殖相关。的确，在发育过程中，在特定的条件下，干细胞能够被“动员”以进行干细胞库的自我更新。然后干细胞增殖并根据有丝分裂过程分裂，这允许亲代细胞精确地分裂为含有相同DNA含量、相同形态和生物学及生物化学特性的两个子代细胞。
当干细胞决定分化时，分化过程通过有限的有丝分裂过程开始，所述有丝分裂过程包含至少两次分裂，但是子代细胞在这些有限分裂过程中，逐渐获得那些它们将在分化过程末端具有的特定特征。
所以，在包含生物体或器官的干细胞库的干细胞小生境中，存在自我更新和分化之间的平衡。
根据本发明的方法优选在体外实施，意思是细胞优选在其所衍生而来的生物体之外进行分化。
在本发明中，干细胞定义为能够分化成多种特化的细胞类型的细胞的细胞。根据本发明，这些干细胞定义为，它们具有分化的本性，分化为一(单能)或双(双能)至n(多潜能)分化的细胞，n大于2。
本发明涉及多能细胞，其是全能细胞的子代。在多细胞生物体中，从雄性和雌性配子融合而来的全能细胞能够分化成构成生物体的所有细胞。这种全能细胞的第一次分裂(有丝分裂)产生一些多能细胞。这些多能细胞已经获得特化，并且已经丧失了产生所有的分化细胞的能力。
因此，根据本发明的干细胞涉及多能的(pluripotent)、多潜能的(multipotent)、双能的和单能的细胞。在本发明中，可以使用胚胎干细胞(ESC)，其对应于从雄性和雌性配子融合而来的细胞。
在一个具体实施方式中，来自人的胚胎干细胞“人类胚胎干细胞”(HESC)被排除在实施本发明方法的用途之外。所以，在该具体实施方式中，干细胞涉及所有的动物干细胞，条件是所述干细胞不是人类胚胎干细胞。
根据本发明，术语“衍生自血液或骨髓或脂肪组织或脐带的干细胞”意思是该干细胞分离自相应的组织，即血液或骨髓或脂肪组织或脐带，尤其是渥顿氏胨胶(Wharton’s jelly)。
在血液中，干细胞占总的单核细胞的0.01％至0.0001％[S.S.Khan，M.A.Solomon，J.P.McCoy Jr，Cytometry B Clin.Cytom.2005，64，1]。在经典方法中，通过例如密度梯度分离法，将单核细胞与无核细胞即红细胞分开。本领域已知的其它方法经常用于分离单核细胞。这种梯度导致在密度梯度的界面处形成包含单核细胞的环。这些“白细胞”可以在体外培养于补充了允许内皮细胞增殖的生长因子的合适的培养基中[T.Asahara，T.Murohara，A.Sullivan，M.Silver，R.van derZee，T.Li，B.Witzenbichler，G.Schatteman，J.M.Isner，Science 1997，275，964.]。当在体外培养时，从血液中提取的造血干细胞具有与载体结合的性质，可以通过除掉未结合的细胞容易地将其从其它白细胞中纯化出来。
血液中还含有所有的能够循环的干细胞。例如，血液还含有间充质干细胞。
在本发明中，血液是指外周血和胎盘血。通常，胎盘血是从脐带获得的。在本发明中，胎盘血也称作脐带血。另外，本发明涉及组织和器官中包含的血液。
在骨髓中存在三种类型的干细胞：造血干细胞、间充质干细胞。
造血干细胞是能够分化成所有的循环的白细胞(例如红细胞、巨噬细胞、单核细胞等)的多潜能干细胞。
间充质干细胞是能够分化成所有的器官细胞(即成骨细胞、软骨细胞、肌细胞或脂肪细胞等)的多潜能细胞。
在脂肪组织中，干细胞也称作脂肪组织衍生的干细胞，其能够分化成几种分化的细胞，例如内皮细胞。
在脐带中，渥顿氏胨胶是脐带内的凝胶状物质，由大量的粘多糖(透明质酸和硫酸软骨素)构成，其包含(除了其它细胞之外)成年干细胞，尤其是间充质干细胞。
“合适的培养基”意思是包含培养的细胞存活所需的营养物的培养基。这种培养基具有通常的pH、葡萄糖浓度、生长因子和对于体外细胞存活特异性的营养物组成。
用于补充培养基的生长因子通常衍生自动物血液，例如牛血清。此外，可以加入重组特异性生长因子以特异性地启动特定细胞过程，例如增殖、分化等。
“植于”在本发明中定义为：细胞沉积在载体上并允许附着到所述载体上。其是本领域中的通常做法，术语“植于”涉及体外培养细胞，其是技术人员通常使用并理解的。
在动物中，一些细胞自然生长而不附着到表面，例如存在于血流中的细胞。其它细胞需要表面，例如衍生自固体组织的多数细胞。这些粘附细胞可以在组织培养塑料上生长，可以使用细胞外基质成分包被所述组织培养塑料以增加其粘附性质，并提供生长所需的其它信号。
根据本发明，“特化分化的细胞”意思是这些细胞已经分化至末端过程，并且已经获得了完全的特化功能。在这个分化过程中，从干细胞开始，细胞逐渐获得特定特征和功能，此外逐渐丧失了分化成不同细胞的能力。在分化过程在最后步骤，特化分化的细胞能够实施具体功能(例如分泌激素、肌肉收缩性等)并仍然保持能够倒退至分化过程。所以，它们在功能上是特化的，并且是分化的。
根据本发明，“含氧量正常条件”是指环境中的正常氧气浓度。“含氧量正常”与“含氧量正常条件”相关，是指地球上存在的空气的天然组成。
本发明中环境空气定义为，环境例如房间、盒子、温育箱等中包含的空气。地球上氧气的浓度通常是大约21％，但是根据海拔和温度变化。所以，环境空气取决于做实验的位置。
根据本发明，“低氧条件”是指低于“含氧量正常条件”的异常的氧气浓度。“低氧”与“低氧条件”相关，其对应于大大低于天然浓度的氧浓度。低氧在病理学上与窒息以及所有受到环境空气中低水平氧气加剧或诱导的病症相关。低氧的最终状态是完全不存在O2，这对应于缺氧。根据本发明的低氧条件不同于缺氧，即总是存在O2，即使其浓度非常低。例如在本发明中，低氧对应于定义为0.1％氧气至12％氧气范围内的低氧浓度。
通常，细胞生物学领域技术人员会通过添加已知浓度的CO2来调节温育箱的气体含量。的确，培养的细胞通常生长于包含2％-15％CO2的空气中。最佳的CO2浓度取决于每个细胞以提供增殖和/或其它细胞过程的最佳条件。
然后，通过人工的空气组成和特定的设备，研究氧气影响的技术人员能够获得优选的含氧培养空气。
根据本发明，术语“保留通过天然生物学过程获得的各自相对应的特化分化的细胞的功能特性的特化分化的细胞”意思是通过本发明的方法获得的特化分化的细胞是与取自动物的细胞实质上相同的细胞。
例如，如果本发明的方法允许干细胞分化成特化分化的肌细胞，则获得的肌细胞将能够具有收缩性，以按照与从动物提取的肌细胞相同的方式产生细胞外基质。
同样地，本发明中“具有与第二组特化分化的细胞不同的细胞功能特性的第一组特化分化的细胞”意思是在含氧量正常条件下通过分化方法获得的分化细胞在功能上不同于在缺氧条件下通过分化方法获得的细胞。例如，如果在低氧条件下细胞分化成有收缩性的细胞，则在含氧量正常条件下相同的细胞将分化成具有不同于收缩性的功能的细胞。
技术人员可以通过目检(细胞形态的差异)、特定颜色情况(确定的分化细胞的特定颜色情况)或通过使用本领域已知的任何允许例如鉴定膜标志物的方法(所述膜标志物对于确定的分化细胞是特异性的)容易地确定两组特化分化的细胞之间的差异。
本发明还涉及两种具有特定氧浓度的培养基的二元组用于干细胞分化、优选体外分化的用途，所述每种特定氧浓度的培养基对应于具有特定氧浓度的培养基，所述干细胞源自骨髓或血液或脂肪组织，条件是所述干细胞不是人类胚胎干细胞并且植于载体上，所述分化分别：
-通过在含氧量正常条件下在培养基中的载体上培养所述干细胞获得第一组特化分化的细胞，和
-通过在低氧条件下在与用于获得第一组特化分化的细胞的培养基性质相同的培养基中的载体上培养所述干细胞获得第二组特化分化的细胞，其中所述低氧条件不同于缺氧，
所述第一和第二组特化分化的细胞保留通过天然生物学过程获得的各自相对应的特化分化的细胞的功能特性，
所述第一组特化分化的细胞具有与所述第二组特化分化的细胞不同的细胞功能特性。
所以本发明涉及包含两种具有特定氧浓度的培养基的组的用途，所述组包含：
-两种培养基，其具有细胞增殖和分化必需的营养物和生长因子，
-两个容纳器或表面，其能够包含每种培养基，在所述容纳器或表面中沉积允许细胞附着的载体。
所述两种培养基的区别仅在于环境中氧的浓度不同。
第一种具有特定氧浓度的培养基含有如上文定义的正常氧浓度，并且第二种具有特定氧浓度的培养基含有低氧浓度。
词语“特定氧浓度”意思是二元组中包含的特定氧浓度的培养基中所含的氧浓度是已知的、测定的并且是受控的，以便获得含氧量正常的条件或低氧条件。
根据本发明，第一种具有特定氧浓度的培养基被置于正常氧浓度，并且提供从干细胞进行细胞分化为第一组特化分化的细胞所需的所有细胞。
根据本发明，第二种具有特定氧浓度的培养基被置于低氧浓度，并且提供从与第一种特定氧浓度培养基中所用的相同干细胞进行细胞分化为第二组特化分化的细胞所需的所有细胞，所述第一和第二组特化分化的干细胞以彼此不同的特定功能进行特化。
术语“载体”意思是允许细胞附着的任何生物学或化学分子或聚合物。
术语“表面”定义了可被上述载体涵盖的任何容纳器或容器，并易于盛装液体。
因此，当使用本发明的二元组时，根据本发明的和如上所定义的干细胞被植于沉积在表面上的载体上，所述表面被包含营养物和生长因子的营养培养基覆盖。然后，将附着于沉积在表面上的载体上的第一部分干细胞置于含氧量正常条件下并允许其分化成第一组特化分化的细胞，所述表面被包含营养物和生长因子的营养培养基覆盖；并且将附着于沉积在表面上的载体上的剩余部分的干细胞置于低氧条件下并允许其分化成第二组特化分化的细胞，所述表面被包含营养物和生长因子的营养培养基覆盖。
使用根据本发明的特定氧浓度的二元组的结果是，仅有一组如上文定义的干细胞可以提供两种不同的特化分化的细胞，所述细胞保持分离自动物的对应细胞的天然特性。
在一个有利的实施方式中，本发明涉及如上文定义的用途，其中含氧量正常的条件是指，环境空气中的氧浓度是，总环境气体的13％至21％摩尔含量/体积(mc/v)，优选是总环境气体的15％至20％摩尔含量/体积(mc/v)。
含氧量正常的条件对应于地球大气中含有的天然氧浓度并且与生命相容。地球大气是环绕地球行星的气体层，其被地球重力所保持。其大约含有(按摩尔含量/体积计)78.08％氮气、20.95％氧气、0.93％氩气、0.038％二氧化碳、痕量的其它气体，和数量可变的(平均大约1％)的水蒸汽。
氧气浓度随着压力和温度而变化，本领域普遍接受的是空气中氧气浓度是21+/-1％。
体外细胞培养物的天然氧浓度是大约20％。
但是，哺乳动物组织中观察到的天然氧浓度低于环境空气中的浓度。所以，本领域技术人员通常通过使用人工的和已知的气体组合物调节细胞培养物的氧浓度。
所以，在细胞生物学中，可以在含有较低氧气的空气中培养细胞或细胞系，例如，含有15％的氧气。虽然这些条件与空气中的天然氧浓度不同，但是其与正常细胞增殖是相容的，不会诱导主要的细胞变化，例如细胞调亡或转化。所以，在细胞生物学中，15％+/-2％的氧(取决于测定仪器的精确性)对应于含氧量正常的条件。
在另一个有利的实施方式中，本发明涉及如上文定义的用途，其中低氧条件是指，环境空气中的氧浓度是，总环境气体的2％至12％摩尔含量/体积(mc/v)，优选是总环境气体的3％至8％摩尔含量/体积(mc/v)，更优选是总环境气体的4％至6％摩尔含量/体积(mc/v)。
如上文所定义，对应于低氧浓度的低氧在本发明中也称作低氧条件，其定义为2％的氧气至12％的氧气的范围。在低于1％摩尔含量/体积的氧气时，细胞不能正常地存活并且会通过坏死而死亡(急性低氧)。高于12％时，氧浓度是足够的，条件变成含氧量正常。
在另一个有利的实施方式中，本发明涉及如上文定义的用途，其中所述载体包含或由下列组成：
-白明胶、纤连蛋白、胶原、层粘蛋白、RGD肽或其组合，或
-聚电解质多层，优选是聚阳离子和聚阴离子，优选是交替物，
-所述聚阳离子选自聚烯丙胺(PAH)，聚乙烯亚胺(PEI)，聚乙烯胺，聚氨基酰胺(PAMAM)，聚丙烯酰胺(PAAm)，聚二甲基二烯丙基氯化铵(PDAC)，带正电的多肽、例如聚赖氨酸，以及带负电的多糖、例如壳聚糖，并且
-所述聚阴离子选自聚丙烯酸(PAA)，聚甲基丙烯酸(PMA)，聚苯乙烯磺酸(PSS或SPS)，带负电的多肽、例如聚谷氨酸和聚天冬氨酸，以及带负电的多糖、例如透明质酸盐和藻酸盐，
-优选地选自(PAH-PSS)3、(PAH-PSS)3-PAH和PEI-(PSS-PAH)3，
所述载体沉积于表面上。
根据本发明，将干细胞植于允许细胞附着的载体上。
所述载体可以是人工载体，其模拟或部分再现每个细胞所附着的细胞外基质。
所以载体可以由一种或多种细胞外基质成分的重组组合物构成。
细胞外基质(ECM)是动物组织的细胞外部分，其通常向细胞提供结构支持，另外实施多种其它重要功能。细胞外基质是动物中的结缔组织的特征。ECM的成分是由驻留细胞在细胞内产生的，并且分泌到ECM中。一旦被分泌，它们将与已有的基质聚集。ECM由纤维蛋白和糖胺聚糖(GAG)的联锁网构成。ECM中包含的纤维蛋白有：胶原，其是ECM中最丰富的糖蛋白；纤连蛋白，其是连接细胞与胶原纤维的蛋白；弹性蛋白，其为组织产生弹性；和层粘蛋白。
这些分子上的细胞粘附在本领域已有深入报道：胶原[H.Itoh，Y.Aso，M.Furuse，Y.Noishiki，T.Miyata，Artif.Organs，25，213，2001]，纤连蛋白[A.Rademacher，M.Paulitschke，R.Meyer，R.Hetzer，Int.J.Artif.Organs，24，235，2001]，层粘蛋白[A.Sank，K.Rostami，F.Weaver，D.Ertl，A.Yellin，M.Nimni，T.L.Tuan.Am.J.Surg.164，199，1992]，白明胶[J.S.Budd，P.R.Bell，R.F.James.Br.J.Surg.76，1259，1989]。纤连蛋白是迄今为止最有效的增强细胞附着、分散和保持的蛋白。
所以，其中植入了干细胞的载体包含或由下列组成：纤连蛋白、胶原或层粘蛋白。其它分子例如白明胶或RGD肽也可构成载体。
RGD肽对应于三肽：精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸。
在本发明中，词语“白明胶、纤连蛋白、胶原、层粘蛋白、RGD肽或其组合”意思是载体可以包含上述分子中的一种或这些成分中至少两种的组合，或由上述分子中的一种或这些成分中至少两种的组合组成。可用于本发明的所有成分显示于下表1：
| 白明胶 | 纤连蛋白 | 胶原 | 层粘蛋白 | RGD肽 |
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表1代表可用于本发明的载体的白明胶、纤连蛋白、胶原、层粘蛋白和RGD肽的所有组合。
“聚电解质”在本发明中定义为其中的单体具有电解基团的聚合物。
“聚电解质多层”在本发明中定义为通过聚电解质层的沉积获得的所有的层[G.Decher，J.B.Schlenoff，Multilayer thin films：SequentialAssembly of Nanocomposite Materials，Wiley-VCH，Weinheim，2003]。
提及“聚阳离子”，本发明涉及具有总体正电荷的聚合物。“总体正电荷”意思是总的电荷是阳性的，即大于0，这不排除单体可以个别地带负电荷的事实。
提及“聚阴离子”，本发明涉及具有总体负电荷的聚合物。“总体负电荷”意思是总的电荷是阴性的，即小于0，这不排除单体可以个别地带正电荷事实。
根据本发明的另一个优选的实施方式，载体还可以由选自下列的聚电解质多层组成或包含选自下列的聚电解质多层：(PAH-PSS)3，(PAH-PSS)3-PAH和PEI-(PSS-PAH)3.[a)H.Kerdjoudj等人.AdvFunct Mater 2007，17，2667.b)C.Boura等人.Biomaterials 26，4568，2005，c)V Moby等人.Biomacromolecules 2007，8，2156]。
在另一个有利的实施方式中，本发明涉及如上文定义的用途，其中聚电解质层的层数是1至100，优选为3至50，更优选为5至10，特别是7。
在7层以下，根据本发明的薄层保持对于小分子例如Hoechst33258(分子量623Da)的通透性。
在另一个优选实施方式中，本发明涉及如上文定义的用途，其中所述表面是天然或人工表面，
-所述人工表面选自玻璃、TCPS(细胞培养物处理的聚苯乙烯)、聚硅氧烷、全氟烃基聚醚、生物相容性聚合物(尤其是
)、聚氨酯、聚甲基硅氧烷、聚氯乙烯、
膨体聚四氟乙烯(ePTFE)和任何用于假体和/或植入系统的材料，并且
-所述天然表面选自血管、静脉、心脏、小肠粘膜、动脉(优选脱细胞的脐带动脉)，所述血管、静脉、动脉来自人类器官。
在一个优选的实施方式中，本发明涉及其中沉积了聚电解质多层的天然表面，所述表面的坚硬性足以允许细胞粘附并且柔韧性足以支持生理形变。所述的生理形变在本发明中是指，例如，由于动脉压引起的动脉脉动导致的形变。
所以，其中沉积了聚电解质多层的表面能够抵抗生理压力并且在所述生理压力下发生形变，所述生理压力为10至300mmHg，优选50至250mmHg，优选为80至230mmHg。
这些压力范围是在生理条件下测定的，尤其是在人类中。例如，在人类中，如果压力在180mmHg以上，则认为是高血压状况。低血压定义为压力低于50mmHg。
“生理条件”在本发明中定义为动脉、静脉和血管中测定的健康个体的血压。
在本发明的一个优选的实施方式中，根据本发明的细胞的沉积于表面的载体的涂层对于血流(尤其是体内的)的剪应力具有抗性。
“血流的剪应力”在本发明中是指，血流在载体和覆盖载体的细胞二者的组合上流动时产生的切向摩擦力。
用于本发明的表面可以选自人工或天然表面。
“人工表面”意思是由生理条件下不存在的物质构成的表面。例如，根据本发明的人工表面可以是玻璃、塑料或如上文定义的聚合物。根据本发明的人工表面与体外培养物和体内细胞增殖是相容的。这意味着所述表面以无菌方式制备，以防止细菌、真菌和病毒污染。
表面可以是任何形式。在一个具体实施方式中，用于本发明的表面的尺寸是大约至少20x29mm，优选大约至少30x24mm，更优选大约至少300x170mm，更优选大约至少400x200mm。尺寸为大约300x170mm的表面适合于形成人工的(即体外)功能性和可移植的血管。上述尺寸表示为长度x宽度。在另一个具体的实施方式中，用于本发明的所述表面是技术人员在细胞生物学中通常使用的细胞培养板或培养瓶。所述的培养板或培养瓶的尺寸取决于想要的分化细胞的表面。
特别地，使用尺寸为25x32mm，优选21x29mm的平板来实施本发明的方法。
本发明中定义的表面还可以是选自血管、静脉、动脉(优选脱细胞的脐带动脉)的天然表面。根据本发明，胎盘真皮和膀胱或任何其它源于器官的表面也可用于本发明。
用于本发明的天然表面源于动物或人类器官或组织。
还要着重注意，本发明中定义的表面(其中沉积了上文定义的载体)可以通过可除去的材料分离，所述可除去的材料的坚硬性足以允许载体上的细胞与表面分离，并且柔韧性足以沿着棍卷绕，而不破坏含有细胞的载体。
在另一个有利的实施方式中，本发明涉及如上文定义的用途，其中所述干细胞选自间充质干细胞(MSC)和造血干细胞(HSC)。
根据本发明，本发明中使用的干细胞可以选自造血干细胞或间充质干细胞。优选地，本发明中使用的干细胞是造血干细胞。
HSC存在于成人骨髓中，包括股骨、髋骨、肋骨、胸骨和其它骨的骨髓。可以使用针和注射器从髋骨中直接提取HSC，或者使用细胞因子(例如G-CSF(粒细胞集落刺激因子)，其诱导细胞从骨髓腔中释放出来)进行预处理之后，从血液获得。其它的临床和科研用途的来源包括脐带血、胎盘和经动员的外周血。对于实验目的，动物的胎儿肝脏和胎儿脾也是有用的HSC的来源。
现在已经很好地证明了HSC衍生自成血管多潜能细胞，其也是内皮细胞的前体。已经证明胚胎中的这些前内皮/前造血细胞产生于CD34表型的群体。然后发现成血管细胞也存在于完全发育的个体(例如新生婴儿和成人)的组织中。
现在有越来越多的证据证明成血管细胞持续存在于成人中，因为外周血中循环的干细胞可以产生内皮细胞和造血细胞。这些细胞被认为表达CD34和CD133二者。这些细胞可能衍生自骨髓，并且甚至可以衍生于造血干细胞。
在另一个有利的实施方式中，本发明涉及如上文定义的用途，其中所述第一和第二组特化分化的细胞由选自内皮细胞和平滑肌细胞的细胞组成。
根据本发明，平滑肌细胞定义为参与平滑肌的形成，平滑肌是一种非横纹肌，其存在于例如动脉和静脉中。细胞以片或束排列，通过间隙连接(gap junction)结合在一起。为了进行收缩，细胞含有肌动蛋白丝和称为肌球蛋白的可收缩蛋白。虽然平滑肌中的丝基本上与骨骼肌和心肌中的相同，但是其排列方式是不同的。
平滑肌细胞可以分泌它们自身的复合的细胞外基质，其含有胶原(主要是I和III型)、弹性蛋白、糖蛋白和蛋白聚糖[Rzucidlo，E.M.，Martin，K.A.&Powell，R.J.Regulation of vascular smooth muscle celldifferentiation.J Vasc Surg.45，25-32(2007).]。这些纤维和它们的细胞外基质促成这些组织的粘弹性。平滑肌还具有与这些蛋白相互作用的特定的弹性蛋白和胶原受体。
血管平滑肌的收缩功能对于调节小动脉-细动脉(称为阻力血管)的腔的尺寸具有关键意义。阻力动脉对于血压水平的设定具有重要意义。平滑肌缓慢收缩并可以保持收缩。从细胞的生物化学内容而言，平滑肌细胞表达参与收缩的特定蛋白，例如平滑肌肌动蛋白、平滑肌肌球蛋白和肌间线蛋白。
所以，在本发明中，平滑肌细胞的本质功能特征是分泌上述的细胞外基质成分，以及收缩性潜力。这些特征是平滑肌细胞的天然生物学过程中存在的特征。
根据本发明，内皮细胞形成沿着血管壁的内表面的细胞薄层(内皮)，形成腔内循环血液和其余血管壁之间的界面。内皮由单层的内皮细胞构成。
内皮细胞在血管发育和保持血管功能中具有重要作用。一旦形成血管，内皮细胞会通过引起血管舒张或血管收缩(根据条件)来控制血管张力，从而将壁的机械约束程度控制在恒定水平。它们还可以参与体内血管新生。
在另一个有利的实施方式中，本发明涉及如上文定义的用途，其中所述第一组特化分化的细胞由内皮细胞组成，并且所述第二组特化分化的细胞由平滑肌细胞组成。
所以，根据本发明，根据本发明的方法培养的干细胞分化成：
-内皮细胞，当干细胞生长于如上文定义的含氧量正常的条件时，或
-平滑肌细胞，当干细胞生长于如上文定义的低氧的条件时。
本发明的一个有利的实施方式涉及特定氧浓度用于实施使植于载体上的间充质干细胞或造血干细胞分化的体外方法的用途，其中所述载体沉积于表面上，所述载体包含或由下列组成：
-白明胶、纤连蛋白、胶原、层粘蛋白、RGD肽或其组合，或
-聚电解质多层，优选是聚阳离子和聚阴离子，优选是交替物，
-所述聚阳离子选自聚烯丙胺(PAH)，聚乙烯亚胺(PEI)，聚乙烯胺，聚氨基酰胺(PAMAM)，聚丙烯酰胺(PAAm)，聚二甲基二烯丙基氯化铵(PDAC)，带正电的多肽、例如聚赖氨酸，以及带负电的多糖、例如壳聚糖，并且
-所述聚阴离子选自聚丙烯酸(PAA)，聚甲基丙烯酸(PMA)，聚苯乙烯磺酸(PSS或SPS)，带负电的多肽、例如聚谷氨酸和聚天冬氨酸，以及带负电的多糖、例如透明质酸盐和藻酸盐，
-优选地选自(PAH-PSS)3、(PAH-PSS)3-PAH和PEI-(PSS-PAH)3，
所述载体沉积于表面上，所述表面是处于合适的培养基中的天然或人工表面，并且其中：
-所述人工表面选自玻璃、TCPS(细胞培养物处理的聚苯乙烯)、聚硅氧烷、全氟烃基聚醚、生物相容性聚合物(尤其是)、聚氨酯、聚甲基硅氧烷、聚氯乙烯、
膨体聚四氟乙烯(ePTFE)和任何用于假体和/或植入系统的材料，
-所述天然表面选自血管、静脉、心脏、小肠粘膜下层、动脉(优选脱细胞的脐带动脉)，所述血管、静脉、动脉来自人类器官，
其中所述分化：
-在含氧量正常条件下并在合适的培养基中产生第一组特化分化的细胞，其中所述第一组特化分化的细胞由内皮细胞组成，和
-在低氧条件下产生第二组特化分化的细胞，其中所述低氧条件是指，环境空气中的氧浓度是，总环境气体的2％至12％摩尔含量/体积(mc/v)，优选是总环境气体的3％至8％摩尔含量/体积(mc/v)，更优选是总环境气体的4％至6％摩尔含量/体积(mc/v)；所述第二组特化分化的细胞处于与用于获得第一组特化分化的细胞的培养基性质相同的培养基中，其中所述第二组特化分化的细胞由平滑肌细胞组成。
本发明的另一个有利的实施方式涉及两种具有特定氧浓度的培养基的二元组用于使植于载体上的间充质干细胞或造血干细胞分化的用途，其中所述每种特定氧浓度培养基对应于具有特定氧浓度的培养基，其中所述载体沉积于表面上，所述载体包含或由下列组成：
-白明胶、纤连蛋白、胶原、层粘蛋白、RGD肽或其组合，或
-聚电解质多层，优选是聚阳离子和聚阴离子，优选是交替物，
-所述聚阳离子选自聚烯丙胺(PAH)，聚乙烯亚胺(PEI)，聚乙烯胺，聚氨基酰胺(PAMAM)，聚丙烯酰胺(PAAm)，聚二甲基二烯丙基氯化铵(PDAC)，带正电的多肽、例如聚赖氨酸，以及带负电的多糖、例如壳聚糖，并且
-所述聚阴离子选自聚丙烯酸(PAA)，聚甲基丙烯酸(PMA)，聚苯乙烯磺酸(PSS或SPS)，带负电的多肽、例如聚谷氨酸和聚天冬氨酸，以及带负电的多糖、例如透明质酸盐和藻酸盐，
-优选地选自(PAH-PSS)3、(PAH-PSS)3-PAH和PEI-(PSS-PAH)3，
所述载体沉积于表面上，所述表面是处于合适的培养基中的天然或人工表面，并且其中：
-所述人工表面选自玻璃、TCPS(细胞培养物处理的聚苯乙烯)、聚硅氧烷、全氟烃基聚醚、生物相容性聚合物(尤其是)、聚氨酯、聚甲基硅氧烷、聚氯乙烯、
膨体聚四氟乙烯(ePTFE)和任何用于假体和/或植入系统的材料，
-所述天然表面选自血管、静脉、心脏、小肠粘膜下层、动脉(优选脱细胞的脐带动脉)，所述血管、静脉、动脉来自人类器官，
其中所述分化：
-在含氧量正常条件下并在合适的培养基中产生第一组特化分化的细胞，其中所述第一组特化分化的细胞由内皮细胞组成，和
-在低氧条件下产生第二组特化分化的细胞，其中所述低氧条件是指，环境空气中的氧浓度是，总环境气体的2％至12％摩尔含量/体积(mc/v)，优选是总环境气体的3％至8％摩尔含量/体积(mc/v)，更优选是总环境气体的4％至6％摩尔含量/体积(mc/v)；所述第二组特化分化的细胞处于与用于获得第一组特化分化的细胞的培养基性质相同的培养基中，其中所述第二组特化分化的细胞由平滑肌细胞组成。
本发明还涉及具有特定氧浓度的培养基，其包含：
-合适的培养基，并且
-所述培养基中氧气的浓度是，总气体的2％至12％摩尔含量/体积(mc/v)，优选是总气体的3％至8％摩尔含量/体积(mc/v)，更优选是总气体的4％至6％摩尔含量/体积(mc/v)。
本发明还涉及具有特定氧浓度的培养基，其包含对于细胞存活必不可少的营养物，例如糖、氨基酸、维生素等。该培养基补充了源自动物血清的生长因子，或重组生长因子。作为培养基，可以利用下列可获得的培养基，但不限于此：α-MEM、DMEM、RPMI 1640、Iscove’s培养基、Mac Coy培养基、EBM-2培养基等。
此外，对该培养基进行条件化，使其包含的氧浓度对应于低氧条件。
在本发明中，可以通过使用在培养基中易于扩散的任何化学或生物化合物或分子将具有特定氧浓度的培养基的氧浓度控制在2％至12％的氧。在一个具体的实施方式中，根据本发明的具有特定氧浓度的培养基可以由置于密封空间的上述培养基组成，其中的氧浓度是受控的。
在一个有利的实施方式中，本发明涉及具有如上文定义的具有特定氧浓度的培养基，其与沉积于表面上的载体联合。
本发明还涉及具有特定氧浓度的培养基，其包含：
-合适的培养基，
-所述培养基中的氧气的浓度是，总环境气体的13％至大约21％摩尔含量/体积(mc/v)，优选是总环境气体的15％至21％摩尔含量/体积(mc/v)，
-与沉积于表面上的载体联合。
本发明还涉及两种具有特定氧浓度的培养基的二元组，所述每种具有特定氧浓度的培养基对应于合适的培养基和特定的氧浓度，所述二元组包含：
-合适的培养基，所述培养基中的氧浓度是，总环境气体的2％至12％摩尔含量/体积(mc/v)，优选是总环境气体的3％至8％摩尔含量/体积(mc/v)，更优选是总环境气体的4％至6％摩尔含量/体积(mc/v)，所述培养基与沉积于表面的载体联合，和
-合适的培养基，所述培养基中的氧浓度是，总环境气体的13％至10％摩尔含量/体积(mc/v)，所述培养基与沉积于表面的载体联合。
根据本发明，两种具有特定氧浓度的培养基的二元组包含或由下列组成：置于低氧条件下的第一种合适的培养基，其包含细胞存活所需的营养物、生长因子等，和与第一种合适的培养基性质相同的第二种合适的培养基。
在本发明中“与第一种合适的培养基性质相同的第二种合适的培养基”的意思是第一种和第二种合适的培养基就成分而言具有完全相同的组成，即，两种合适的培养基包含相同的营养物、生长因子等。
在一个有利的实施方式中，本发明涉及如上文定义的具有特定氧浓度的培养基，或如上文定义的两种具有特定氧浓度的培养基的二元组，其中所述载体沉积于表面上，所述载体包含或由下列组成：
-白明胶、纤连蛋白、胶原、层粘蛋白、RGD肽或其组合，或
-聚电解质多层，优选是聚阳离子和聚阴离子，优选是交替物，
-所述聚阳离子选自聚烯丙胺(PAH)，聚乙烯亚胺(PEI)，聚乙烯胺，聚氨基酰胺(PAMAM)，聚丙烯酰胺(PAAm)，聚二甲基二烯丙基氯化铵(PDAC)，带正电的多肽、例如聚赖氨酸，以及带负电的多糖、例如壳聚糖，并且
-所述聚阴离子选自聚丙烯酸(PAA)，聚甲基丙烯酸(PMA)，聚苯乙烯磺酸(PSS或SPS)，带负电的多肽、例如聚谷氨酸和聚天冬氨酸，以及带负电的多糖、例如透明质酸盐和藻酸盐，
-优选地选自(PAH-PSS)3、(PAH-PSS)3-PAH和PEI-(PSS-PAH)3。
在一个有利的实施方式中，本发明涉及如上文定义的具有特定氧浓度的培养基，或两种具有特定氧浓度的培养基的二元组，其中所述表面是天然或人工表面：
-所述人工表面选自玻璃、TCPS(细胞培养物处理的聚苯乙烯)、聚硅氧烷、全氟烃基聚醚、生物相容性聚合物(尤其是
)、聚氨酯、聚甲基硅氧烷、聚氯乙烯、
膨体聚四氟乙烯(ePTFE)和任何用于假体和/或植入系统或培养系统的材料，
-所述天然表面选自血管、静脉、心脏、小肠粘膜、动脉(优选脱细胞的脐带动脉)，所述血管、静脉、动脉来自人类器官。
本发明涉及使衍生自骨髓或血液或脂肪组织的干细胞分化的方法，其包括：
-将源自骨髓或血液或脂肪组织或脐带的干细胞与沉积于合适的培养基中的表面上的载体接触，以获得植于载体上的干细胞，
-改变包含所述植于载体上的干细胞的所述合适的培养基中的氧浓度，以提供含氧量正常的条件或低氧条件，
-使所述植于载体上的干细胞体外分化：
●通过将所述植于载体上的干细胞在含氧量正常的条件下培养而形成第一组特化分化的细胞，
●或，通过将所述植于载体上的干细胞在低氧条件下在与用于获得第一组特化分化的细胞的培养基性质相同的培养基中培养而形成第二组特化分化的细胞，
所述第一和第二组特化分化的细胞保留通过天然生物学过程获得的各自相对应的特化分化的细胞的功能特性。
本发明涉及使衍生自骨髓或血液或脂肪组织或脐带的干细胞体外分化的方法，条件是所述干细胞不是人类胚胎干细胞，并且优选地选自间充质干细胞(MSC)和造血干细胞(HSC)，所述方法包括：
-将源自骨髓或血液或脂肪组织的干细胞与沉积于合适的培养基中的表面上的载体接触，条件是所述干细胞不是人类胚胎干细胞，以获得植于载体上的干细胞，
-改变包含所述植于载体上的干细胞的所述合适的培养基中的氧浓度，以提供含氧量正常的条件或低氧条件，所述低氧条件不同于缺氧，
-使所述植于载体上的干细胞体外分化：
●通过将所述植于载体上的干细胞在含氧量正常的条件下培养而形成第一组特化分化的细胞，
●或，通过将所述植于载体上的干细胞在低氧条件下在与用于获得第一组特化分化的细胞的培养基性质相同的培养基中培养而形成第二组特化分化的细胞，
所述第一和第二组特化分化的细胞保留通过天然生物学过程获得的各自相对应的特化分化的细胞的功能特性，
所述第一组特化分化的细胞具有与所述第二组特化分化的细胞不同的细胞功能特性。
如上文定义的源自所选的器官或体液的干细胞被植于两个不同的表面，所述表面被如上文定义的载体覆盖并且被合适的培养基包被。将附着的干细胞与未附着的细胞分开并在37℃的培养温育箱中放置1至10天，优选4天。
另外，载体包被的、合适培养基覆盖的一个表面(其中植入了干细胞)置于低氧的空气中，而载体包被的、合适培养基覆盖的另一个表面(其中植入了干细胞)置于含氧量正常的空气中。
然后将细胞在相应的空气中静置，直至完成各自的细胞分化过程。根据本发明，在10至20天之后，优选11至18天之后，更优选14天后，达到完整的分化过程。
在该段时间之后，在含氧量正常的条件下生长的细胞分化成第一组特化分化的细胞，在低氧条件下生长的细胞分化成第二组特化分化的细胞。
可以使用经典的表型分型技术来表征根据本发明的方法获得的特化分化的细胞的性质，例如免疫表型分型法、PCR、免疫组化等。
本发明还涉及使用两种具有特定氧浓度的培养基的二元组形成功能性血管的方法，所述每种特定氧浓度的培养基对应于具有特定氧浓度的合适的培养基，所述方法包括以下步骤：
-将源自骨髓或血液或脂肪组织的所述干细胞与沉积于合适的培养基中的表面上的载体接触，以获得植于载体上的干细胞，
-改变包含所述植于载体上的干细胞的所述合适的培养基中的氧浓度，以提供含氧量正常的条件或低氧条件，所述低氧条件不同于缺氧，
-使所述植于载体上的干细胞体外分化：
●通过将所述植于载体上的干细胞在含氧量正常的条件下在培养基中培养而形成第一组特化分化的细胞，和
●通过将所述植于载体上的干细胞在低氧条件下在与用于获得第一组特化分化的细胞的培养基性质相同的培养基中培养而形成第二组特化分化的细胞，
-分别收集第一和第二组特化分化的细胞，和
-建立由外侧的第二组特化分化的细胞层和内侧的第一组特化分化的细胞单层组成的血管，并限定腔，从而允许形成功能性血管。
本发明还涉及使用两种具有特定氧浓度的培养基的二元组在体外形成功能性血管的方法，所述每种特定氧浓度的培养基对应于具有特定氧浓度的合适的培养基，所述方法包括以下步骤：
-将源自骨髓或血液或脂肪组织的所述干细胞与沉积于合适的培养基中的表面上的载体接触，条件是所述干细胞不是人类胚胎干细胞，以获得植于载体上的干细胞，
-改变包含所述植于载体上的干细胞的所述合适的培养基中的氧浓度，以提供含氧量正常的条件或低氧条件，所述低氧条件不同于缺氧，
-使所述植于载体上的干细胞体外分化：
●通过将所述植于载体上的干细胞在含氧量正常的条件下在培养基中培养而形成第一组特化分化的细胞，和
●通过将所述植于载体上的干细胞在低氧条件下在与用于获得第一组特化分化的细胞的培养基性质相同的培养基中培养而形成第二组特化分化的细胞，
-分别收集第一和第二组特化分化的细胞，和
-建立由外侧的第二组特化分化的细胞层和内侧的第一组特化分化的细胞单层组成的血管，并限定腔，从而允许形成功能性血管。
根据本发明，以上描述的方法允许形成、优选在体外形成功能性、可移植的和免疫学上相容的血管。
以上描述的方法允许根据低氧或含氧量正常的条件分化成两种不同的特化分化的细胞。
第一组特化分化的细胞生长于含氧量正常的条件下，以便完全覆盖载体覆盖的表面。
第二组特化分化的细胞生长于低氧条件下，以便完全覆盖载体覆盖的表面。所述表面可以是任何形式。在一个具体实施方式中，用于本发明的表面的尺寸是大约至少20x29mm，优选大约至少30x24mm，更优选大约至少300x170mm，更优选大约至少400x200mm。尺寸为大约300x 170mm的表面适合于形成人工的(即体外)功能性和可移植血管。上述尺寸表示为长度x宽度。
优选地，其中植入了生长于低氧条件下的干细胞的载体可以容易地从表面上除去。该步骤对应于回收第二组特化分化的细胞。
进行第二组特化分化的细胞的回收，从而不破坏细胞形成的层。
然后使用棍使回收的层沿着其自身进行滚动。以前使用的棍不允许细胞粘附，其为例如Teflon棍。棍允许维持形成的管的腔。
然后将滚压的层静置大约2至大约45天，然后置于生物反应器中进行机械着色。
然后，通过技术人员使用的经典技术回收根据本发明的第一组特化分化的细胞。例如，可以使用胰蛋白酶、EDTA处理细胞，或将细胞置于冰上，或刮取细胞。以上实例允许回收所述第一组特化分化的细胞。
然后将第一组特化分化的细胞置于通过卷曲第二组特化分化的细胞的层形成的管的腔内。第一组特化分化的细胞吸附至管的内表面，从而形成新的血管。
在一个优选的实施方式中，本发明涉及如上文定义的方法，其中：
-所述含氧量正常的条件是指，环境空气中的氧气的浓度是，总环境气体的13％至21％摩尔含量/体积(mc/v)，优选是总环境气体的15％至21％摩尔含量/体积(mc/v)，并且，
-所述低氧条件是指，环境空气中的氧气浓度是，总环境气体的2％至12％摩尔含量/体积(mc/v)，优选是总环境气体的3％至8％摩尔含量/体积(mc/v)，更优选是总环境气体的4％至6％摩尔含量/体积(mc/v)。
在另一个有利的实施方式中，本发明涉及如上文定义的方法，其中所述载体包含或由下列组成：
-白明胶、纤连蛋白、胶原、层粘蛋白、RGD肽或其组合，或
-聚电解质多层，优选是聚阳离子和聚阴离子，优选是交替物，
-所述聚阳离子选自聚烯丙胺(PAH)，聚乙烯亚胺(PEI)，聚乙烯胺，聚氨基酰胺(PAMAM)，聚丙烯酰胺(PAAm)，聚二甲基二烯丙基氯化铵(PDAC)，带正电的多肽、例如聚赖氨酸，以及带负电的多糖、例如壳聚糖，并且
-所述聚阴离子选自聚丙烯酸(PAA)，聚甲基丙烯酸(PMA)，聚苯乙烯磺酸(PSS或SPS)，带负电的多肽、例如聚谷氨酸和聚天冬氨酸，以及带负电的多糖、例如透明质酸盐和藻酸盐，
-优选地选自(PAH-PSS)3、(PAH-PSS)3-PAH和PEI-(PSS-PAH)3，
所述载体沉积于表面上。
在另一个有利的实施方式中，本发明涉及如上文定义的方法，其中所述表面是天然或人工表面，
-所述人工表面选自玻璃、TCPS(细胞培养物处理的聚苯乙烯)、聚硅氧烷、全氟烃基聚醚、生物相容性聚合物(尤其是
)、聚氨酯、聚甲基硅氧烷、聚氯乙烯、
膨体聚四氟乙烯(PTFEe)和任何用于假体和/或植入系统的材料，
-所述天然表面选自血管、静脉、心脏、小肠粘膜、动脉(优选脱细胞的脐带动脉)，所述血管、静脉、动脉来自人类器官。
在另一个有利的实施方式中，本发明涉及如上文定义的方法，其中所述干细胞选自间充质干细胞(MSC)和造血干细胞(HSC)。
在另一个有利的实施方式中，本发明涉及如上文定义的方法，其中所述第一组和第二组特化分化的细胞由选自内皮细胞和平滑肌细胞的细胞组成。
在另一个有利的实施方式中，本发明涉及如上文定义的方法，其中所述第一组特化分化的细胞由内皮细胞组成，所述第二组特化分化的细胞由平滑肌细胞组成。
本发明还涉及使衍生自骨髓或血液或脂肪组织的干细胞转分化(transdifferentiation)的方法，其包括：
-将衍生自骨髓或血液或脂肪组织或脐带的所述干细胞与沉积于合适的培养基中的表面上的载体接触，以获得植于载体上的干细胞，
-改变包含植于载体上的干细胞的所述合适的培养基中的氧浓度，以提供含氧量正常的条件或低氧条件，
-使所述植于载体上的干细胞开始进行体外分化，分别：
●通过将所述植于载体上的干细胞在含氧量正常的条件下在培养基中培养而形成第一组特化分化的细胞，和
●通过将所述植于载体上的干细胞在低氧条件下在与用于获得第一组特化分化的细胞的培养基性质相同的培养基中培养而形成第二组特化分化的细胞，所述低氧条件不同于缺氧，
-改变如上文定义的第一组和第二组各自的培养基中的氧浓度，从而
●将已经开始分化过程形成第一组特化分化的细胞的细胞置于低氧条件下，和
●将已经开始分化过程形成第二组特化分化的细胞的细胞置于含氧量正常条件下，
-使所述已经在含氧量正常或低氧条件下开始分化过程、并且已经分别置于低氧或含氧量正常条件下的所述培植的干细胞的体外分化达到：
●通过将所述第二组培植的干细胞在含氧量正常的条件下的培养基中的载体上培养而形成第三组特化分化的细胞，和
●通过将所述第一组培植的干细胞在低氧条件下在与用于获得第一组特化分化的细胞的培养基性质相同的培养基中的载体上培养而形成第四组特化分化的细胞，
所述第一、第二、第三和第四组特化分化的细胞保留通过天然生物学过程获得的各自相对应的特化分化的细胞的功能特性。
本发明还涉及使衍生自骨髓或血液或脂肪组织或脐带的干细胞转分化、优选体外转分化的方法，条件是所述干细胞不是人类胚胎干细胞，所述方法包括：
-将衍生自骨髓或血液或脂肪组织的所述干细胞与沉积于合适的培养基中的表面上的载体接触，以获得植于载体上的干细胞，条件是所述干细胞不是人类胚胎干细胞，
-改变包含植于载体上的干细胞的所述合适的培养基中的氧浓度，以提供含氧量正常的条件或低氧条件，
-使所述植于载体上的干细胞开始进行体外分化，分别：
●通过将所述植于载体上的干细胞在含氧量正常的条件下在培养基中培养而形成第一组特化分化的细胞，和
●通过将所述植于载体上的干细胞在低氧条件下在与用于获得第一组特化分化的细胞的培养基性质相同的培养基中培养而形成第二组特化分化的细胞，
-改变如上文定义的第一组和第二组各自的培养基中的氧浓度，从而
●将已经开始分化过程形成第一组特化分化的细胞的细胞置于低氧条件下，和
●将已经开始分化过程形成第二组特化分化的细胞的细胞置于含氧量正常条件下，
-使所述已经在含氧量正常或低氧条件下开始分化过程、并且已经分别置于低氧或含氧量正常条件下的培植的干细胞的体外分化达到：
●通过将所述第二组培植的干细胞在含氧量正常的条件下的培养基中的载体上培养而形成第三组特化分化的细胞，和
●通过将所述第一组培植的干细胞在低氧条件下在与用于获得第一组特化分化的细胞的培养基性质相同的培养基中的载体上培养而形成第四组特化分化的细胞，
所述第一、第二、第三和第四组特化分化的细胞保留通过天然生物学过程获得的各自相对应的特化分化的细胞的功能特性。
术语“转分化”意思是细胞能够逆转它们已经开始的分化过程。特别地，本发明中的转分化是指细胞保持逆转分化过程的能力，并且能够分化成另一种不同于它们所起始的细胞亚型。
例如，置于低氧条件下的干细胞开始分化过程以产生第一组特化分化的细胞。但是，在分化过程结束之前，改变氧的浓度，并且将细胞置于含氧量正常的条件下。然后，干细胞将分化成第四组特化分化的细胞，就好像它们直接开始进行含氧量正常条件下的分化过程一样。所以，第四组特化分化的细胞实质上与第二组特化分化的细胞相同。
例如，置于含氧量正常条件下的干细胞开始分化过程以产生第二组特化分化的细胞。但是，在分化过程结束之前，改变氧的浓度，并且将细胞置于低氧条件下。然后，干细胞将分化成第三组特化分化的细胞，就好像它们直接开始进行低氧条件下的分化过程一样。所以，第三组特化分化的细胞实质上与第一组特化分化的细胞相同。
本发明涉及使衍生自骨髓或血液的造血干细胞分化、优选体外分化成平滑肌细胞的方法，其包括：
-将源自骨髓或血液的造血干细胞与沉积于合适的培养基中的表面上的载体接触，以获得植于载体上的干细胞，
-改变包含所述植于载体上的干细胞的所述合适的培养基中的氧浓度，以提供低氧条件，
-使所述植于载体上的造血干细胞体外分化成平滑肌细胞，
所述平滑肌细胞保留通过天然生物学分化过程获得的相对应的平滑肌细胞的功能特性。
通过以下实施例和以下附图解释并阐述上文描述的本发明，但不限于此。
图1A-X代表通过光学相差显微镜(20倍物镜)得到的细胞形态学观测，或者通过共聚焦显微镜(40倍物镜)来表征细胞的免疫荧光表型，所述细胞在含氧量正常环境和低氧环境下植于I型胶原和PME中直至汇合。结果显示了特异性SMC收缩标志物(α-肌动蛋白；SM-MHC；钙调节蛋白)或特异性内皮细胞标志物(CD31；vWF)的阳性表达。NA＝0.8，绘制比例尺75μm。
更具体而言：
图1A代表植于I型胶原并置于含氧量正常条件下的细胞的光相位观察。
图1B代表植于I型胶原并置于低氧条件下的细胞的光相位观察。
图1C代表植于PEM并置于含氧量正常条件下的细胞的光相位观察。
图1D代表植于PEM并置于低氧条件下的细胞的光相位观察。
图1E代表植于I型胶原并置于含氧量正常条件下的细胞的抗-CD31抗体荧光免疫染色，并通过共聚焦显微镜观察。
图1F代表植于I型胶原并置于低氧条件下的细胞的抗-CD31抗体荧光免疫染色，并通过共聚焦显微镜观察。
图1G代表植于PEM并置于含氧量正常条件下的细胞的抗-CD31抗体荧光免疫染色，并通过共聚焦显微镜观察。
图1H代表植于PEM并置于含氧量正常条件下的细胞的抗-CD31抗体荧光免疫染色，并通过共聚焦显微镜观察。
图1I代表植于I型胶原并置于含氧量正常条件下的细胞的抗-vWF抗体荧光免疫染色，并通过共聚焦显微镜观察。
图1J代表植于I型胶原并置于低氧条件下的细胞的抗-vWF抗体荧光免疫染色，并通过共聚焦显微镜观察。
图1K代表植于PEM并置于含氧量正常条件下的细胞的抗-vWF抗体荧光免疫染色，并通过共聚焦显微镜观察。
图1L代表植于PEM并置于含氧量正常条件下的细胞的抗-vWF抗体荧光免疫染色，并通过共聚焦显微镜观察。
图1M代表植于I型胶原并置于含氧量正常条件下的细胞的抗-α肌动蛋白抗体荧光免疫染色，并通过共聚焦显微镜观察。
图1N代表植于I型胶原并置于低氧条件下的细胞的抗-α肌动蛋白抗体荧光免疫染色，并通过共聚焦显微镜观察。
图1O代表植于PEM并置于含氧量正常条件下的细胞的抗-α肌动蛋白抗体荧光免疫染色，并通过共聚焦显微镜观察。
图1P代表植于PEM并置于含氧量正常条件下的细胞的抗-α肌动蛋白抗体荧光免疫染色，并通过共聚焦显微镜观察。
图1Q代表植于I型胶原并置于含氧量正常条件下的细胞的抗-平滑肌-肌球蛋白重链(SM-MHC)抗体荧光免疫染色，并通过共聚焦显微镜观察。
图1R代表植于I型胶原并置于低氧条件下的细胞的抗-平滑肌-肌球蛋白重链(SM-MHC)抗体荧光免疫染色，并通过共聚焦显微镜观察。
图1S代表植于PEM并置于含氧量正常条件下的细胞的抗-平滑肌-肌球蛋白重链(SM-MHC)抗体荧光免疫染色，并通过共聚焦显微镜观察。
图1T代表植于PEM并置于含氧量正常条件下的细胞的抗-平滑肌-肌球蛋白重链(SM-MHC)抗体荧光免疫染色，并通过共聚焦显微镜观察。
图1U代表植于I型胶原并置于含氧量正常条件下的细胞的抗-钙调节蛋白抗体荧光免疫染色，并通过共聚焦显微镜观察。
图1V代表植于I型胶原并置于低氧条件下的细胞的抗-钙调节蛋白抗体荧光免疫染色，并通过共聚焦显微镜观察。
图1W代表植于PEM并置于含氧量正常条件下的细胞的抗-钙调节蛋白抗体荧光免疫染色，并通过共聚焦显微镜观察。
图1X代表植于PEM并置于含氧量正常条件下的细胞的抗-钙调节蛋白荧光免疫染色，并通过共聚焦显微镜观察。
图2A-D代表在I型胶原或在PEM上分化的平滑肌细胞分泌的细胞外基质(ECM)和细胞骨架的共聚焦显微镜观察。40倍物镜，NA＝0.8，绘制比例尺75μm。
更具体而言：
图2A代表植于I型胶原并在低氧条件下分化的平滑肌细胞的抗-层粘蛋白抗体的荧光免疫染色，并通过共聚焦显微镜观察。
图2B代表植于PEM并在低氧条件下分化的平滑肌细胞的抗-层粘蛋白抗体的荧光免疫染色，并通过共聚焦显微镜观察。
图2C代表植于I型胶原并在低氧条件下分化的平滑肌细胞的抗-IV型胶原抗体的荧光免疫染色，并通过共聚焦显微镜观察。
图2D代表植于PEM并在低氧条件下分化的平滑肌细胞的抗-IV型胶原抗体的荧光免疫染色，并通过共聚焦显微镜观察。
图3A-C代表以PEM处理的兔子颈动脉的组织学切片图。图上标明了放大倍率。
图3A代表手术后1周以PEM处理的、以H&S(苏木精，伊红，番红花)染色的兔子颈动脉的组织学切片图。黑色箭头指示炎性细胞的存在，虚线箭头指示PEM沉积到动脉的腔表面。
图3B代表手术后12周以PEM处理的、以H&S(苏木精，伊红，番红花)染色的兔子颈动脉的组织学切片图。插入图(黑色方框)代表该部分的放大。
图3C代表手术后12周以PEM处理的兔子颈动脉的区域的放大图(2倍)并着重显示了血管滋养管(vasa vasorum)的形成。
图3D代表在表位恢复之后经过脱石蜡、并且以抗平滑肌α肌动蛋白抗体标记的切片上进行的放大区域的免疫组化研究。
图4代表从血液样品制备平滑肌细胞和内皮细胞的步骤。打圆点的区域
代表由本发明的载体覆盖的表面。
图5代表应用到载体覆盖的表面上的物理修饰，用于形成人造血管。
图6A-F代表，在两种包被的表面(I型胶原和聚电解质多层膜(PEM))上，使用收缩标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、平滑肌肌球蛋白重链(SM-MHC)和钙调节蛋白抗体进行免疫染色之后，通过共聚焦显微镜分析的低氧条件下的表型稳定性。40倍物镜，NA＝0.8，绘制比例尺75μm。
图6A代表以抗-α-平滑肌肌动蛋白抗体进行的植于I型胶原的平滑肌细胞的荧光免疫染色，并通过共聚焦显微镜观察。
图6B代表以抗-平滑肌肌球蛋白重链抗体进行的植于I型胶原的平滑肌细胞的荧光免疫染色，并通过共聚焦显微镜观察。
图6C代表以抗-钙调节蛋白抗体进行的植于I型胶原的平滑肌细胞的荧光免疫染色，并通过共聚焦显微镜观察。
图6D代表以抗-α-平滑肌肌动蛋白抗体进行的植于PEM的平滑肌细胞的荧光免疫染色，并通过共聚焦显微镜观察。
图6E代表以抗-平滑肌肌球蛋白重链抗体进行的植于PEM的平滑肌细胞的荧光免疫染色，并通过共聚焦显微镜观察。
图6F代表以抗-钙调节蛋白抗体进行的植于PEM的平滑肌细胞的荧光免疫染色，并通过共聚焦显微镜观察。
图7A-G代表以
荧光团偶联的抗SMC标志物抗体标记的细胞的流式细胞术分析。
图7A显示83±7％的植于I型胶原的细胞表达α-平滑肌肌动蛋白。
图7B显示96±1％的植于I型胶原的细胞表达平滑肌肌球蛋白重链。
图7C显示83±7％的植于I型胶原的细胞表达钙调节蛋白。
图7D显示83±7％的植于PEM的细胞表达α-平滑肌肌动蛋白。
图7E显示83±7％的植于PEM的细胞表达平滑肌肌球蛋白重链。
图7F显示83±7％的植于PEM的细胞表达钙调节蛋白。
图7G显示使用对照同种型抗体获得的结果。
图8代表相对于对照(成熟的SMC)，使用SMC收缩标志物抗体分析的平均荧光强度。白色条柱代表植于对照载体的细胞，灰色条柱代表植于I型胶原的细胞，黑色条柱代表植于PEM的细胞。A代表使用抗-α-SMA抗体标记的细胞，B代表使用抗SMMHC抗体标记的细胞，C代表使用抗钙调节蛋白抗体标记的细胞。
(§)PEM相对于对照，(＊)胶原相对于对照，(#)PEM相对于胶原，(§，＊和#：p＜0.05，§§§和＊＊＊：p＜0.001)。
图9A-F代表，在两种包被的表面(I型胶原和聚电解质多层膜(PEM))上，使用收缩标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、平滑肌肌球蛋白重链(SM-MHC)和钙调节蛋白抗体进行免疫染色之后，通过共聚焦显微镜分析的含氧量正常条件下的表型稳定性。40倍物镜，NA＝0.8，绘制比例尺75μm。
图9A代表以抗-α-平滑肌肌动蛋白抗体进行的植于I型胶原的平滑肌细胞的荧光免疫染色，并通过共聚焦显微镜观察。
图9B代表以抗-平滑肌肌球蛋白重链抗体进行的植于I型胶原的平滑肌细胞的荧光免疫染色，并通过共聚焦显微镜观察。
图9C代表以抗-钙调节蛋白抗体进行的植于I型胶原的平滑肌细胞的荧光免疫染色，并通过共聚焦显微镜观察。
图9D代表以抗-α-平滑肌肌动蛋白抗体进行的植于PEM的平滑肌细胞的荧光免疫染色，并通过共聚焦显微镜观察。
图9E代表以抗-平滑肌肌球蛋白重链抗体进行的植于PEM的平滑肌细胞的荧光免疫染色，并通过共聚焦显微镜观察。
图9F代表以抗-钙调节蛋白抗体进行的植于PEM的平滑肌细胞的荧光免疫染色，并通过共聚焦显微镜观察。
图10A-G代表以
荧光团偶联的抗SMC标志物抗体标记的细胞的流式细胞术分析。
图10A显示82±2％的植于I型胶原的细胞表达α-平滑肌肌动蛋白。
图10B显示92±5％的植于I型胶原的细胞表达平滑肌肌球蛋白重链。
图10C显示95±2％的植于I型胶原的细胞表达钙调节蛋白。
图10D显示80±2％的植于PEM的细胞表达α-平滑肌肌动蛋白。
图10E显示89±5％的植于PEM的细胞表达平滑肌肌球蛋白重链。
图10F显示94±4％的植于PEM的细胞表达钙调节蛋白。
图10G显示使用对照同种型抗体获得的结果。
图11代表相对于对照(成熟的SMC)，使用SMC收缩标志物抗体分析的平均荧光强度。白色条柱代表植于对照载体的细胞，灰色条柱代表植于I型胶原的细胞，黑色条柱代表植于PEM的细胞。A代表使用抗-α-SMA抗体标记的细胞，B代表使用抗SMMH抗体标记的细胞，C代表使用抗钙调节蛋白抗体标记的细胞。
(§)PEM相对于对照，(＊)胶原相对于对照。(§和＊：p＜0.05，§§和＊＊：p＜0.01，＊＊＊p＜0.001)。
实施例
实施例1：O2含量：祖细胞分化成内皮细胞或平滑肌细胞的有决定意义的调节剂。
在胚胎形成过程中，血管形成是首先启动的过程之一。与此相反，在成人中，新血管的形成起源于已有血管的分枝。最近这些年积累的数据表明，循环的单核细胞(MNC)组分包含骨髓衍生的细胞群，其被称为祖细胞，它们促成损伤血管的血管新生。不同的作者[Asahara T，等人.(1997)Science 275：964-967；Simper D，等人.(2002)Circulation106：1199-1204；Xie SZ，等人.(2008)J Zhejiang Univ Sci B 9：923-930；Liu JY，等人.(2007)Cardiovasc Res 75：618-628 and Yeh ET，等人.(2003)Circulation 108：2070-2073]提出，这些祖细胞能够在存在不同的特异性细胞因子和血管生成性生长因子(血管内皮生长因子(VEGF)、血小板衍生的生长因子BB(PDGF-BB)等)的情况下分化为成熟的和功能性的内皮(EC)或平滑肌(SMC)细胞，这取决于添加的特异性生长因子。在伤口愈合、缺血、血管壁重建或肿瘤发展过程中，在形成新血管之前，在损伤位点会募集MNC，其进一步促进血管形成[Takahashi T，等人.(1999)Nat Med 5：434-438；DavieNJ，等人.(2004)Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 286：L668-L678；Stenmark KR，等人.(2006)Circ Res 99：675-691以及Kerdjoudj H，等人.(2008)J Am Coll Cardiol 52：1589-1597]。多位作者还研究了氧浓度在干细胞分化中的作用，证明了低氧会增加血管生成性生长因子(例如转化生长因子β1、PDGF-BB和VEGF)的产生[Falanga V，等人.(1991)J Invest Dermatol 97：634-637；Payne TR，等人.(2007)J Am CollCardiol 50：1677-1684以及Cramer T，等人.(2004)OsteoarthritisCartilage 12：433-439.]。细胞分化过程中涉及的主要生理因素是血管生成性生长因子(即VEGF、bFGF和IGF)[Simper D，等人.(200)Circulation 106：1199-1204；Xie SZ，等人.(2008)J Zhejiang Univ Sci B9：923-930以及Conway EM，等人.(2001)Cardiovasc Res 49：507-521]和组织中氧水平的降低(低氧)[Yeh ET，等人.(2003)Circulation 108：2070-2073]。氧在生理和病理状态中发挥主要作用[Grayson WL，等人.(2006)J Cell Physiol 207：331-339]；其是有力的生化信号传导分子，对于细胞行为(迁移、分化、增殖等)具有重要的调节作用[Malda J，等人.(2007)Tissue Eng 13：2153-2162；Simon MC and Keith B(2008)Nat Rev Mol Cell Biol 9：285-96以及Gerasimovskaya EV，et al.(2008)Angiogenesis 11：169-182]。但是，迄今为止，从未证明甚至有人提及低氧可能参与MNC分化成SMC的过程。
本发明人在此假设，仅通过氧浓度调整以及促进EC分化的生长因子(VEGF、FGF、EGF、IGF)的组合[Griese DP，等人.(2003)Circulation 108：2710-2715]允许循环的祖细胞分化为成熟的EC或有收缩性的SMC，即体内发现的成熟血管细胞的特征。
本发明人证明：当在完全相同的培养基但是中度低氧的条件(5％O2或36mmHg)下培养时，在含氧量正常条件下(21％O2或151mmHg)在特异性包被的固体基质(通过I型胶原包被，所述I型胶原是动脉壁的化合物，已知其为血管平滑肌细胞体外吸附和增殖的理想基质[Simper D，等人.(2002)Circulation 106：1199-1204]；或通过聚电解质多层膜结构包被，以前已经证明聚电解质多层膜是内皮祖细胞分化为成熟和功能性内皮细胞的重要加速剂[Berthelemy N，等人.(2008)Adv Mater 20：2674-2678])上培养的分离自兔子成分的祖细胞会产生成熟的EC和SMC。虽然普遍证明了培养成熟的SMC会导致与致病表型相关的收缩标志物的降低[Reusch P，等人.(1996)Circ Res79：1046-1053；Rovner AS，等人.(1986)J Biol Chem 261：740-745 andMuto A，等人.(2007)J Vasc Surg 45：A15-24]，但是本发明人着眼于在低氧条件下获得的SMC-样细胞，并且本发明人检查了在进一步的细胞扩增(传代次数的影响)、甚至是在含氧量正常条件下培养之后，收缩表型的维持。
这些实验清楚地证明了氧含量在血管祖细胞分化为构成血管壁(中间和内膜)的成熟的功能性细胞的过程中的决定性作用。
方法
1)聚电解质多层膜(PEM)
按照以前的描述[19，23]，通过阳离子性聚(烯丙胺盐酸)(PAH，MW＝70kDa)和阴离子性聚(4-苯乙烯磺酸钠)(PSS，MW＝70kDa)溶液(Sigma-Aldrich，France)构建PEM。简而言之，在经过0.01M SDS和0.12M HCl在100℃预处理15分钟的盖玻片(CML，Nemours，France)上制备PEM，然后以去离子水彻底润洗。将盖玻片置于24孔平板(Nunc，France)。在存在10mM Tris-(羟甲基)氨基乙烷(Tris)和150mM NaCl，pH 7.4的情况下，将预处理的盖玻片交替浸没于5mg/mL聚电解质溶液(300μL)中10分钟，从而获得PAH-(PSS-PAH)3膜。每次沉积之后，使用10mM Tris和150mM NaCl，pH 7.4将盖玻片润洗三次，持续10分钟。所有的膜在UV光(254nm)下灭菌10分钟。
2)从外周血循环中分离并培养单核细胞
根据“实验室动物管理原则和实验室动物管理及使用规范”(National Institute of Health publication No.80-23，1978年修订)进行实验操作。从新西兰白兔(雄性，平均体重3-3.5kg，CEGAV，France)的颈动脉收集血液(50mL)，收集到肝素化塑料注射器中。使用以前描述的[Berthelemy N，等人.(2008)Adv Mater 20：2674-2678]密度梯度法分离外周血单核细胞(MNC)。然后，将细胞培养于内皮基础培养基(EBM-2：Lonza，Belgium)中，其中补充了血管生成性生长因子(
Lonza，Belgium)。使用Trypan
对细胞进行计数，并以1×106个细胞/cm2的密度植于24-孔平板中，所述平板包含盖玻片，所述盖玻片经过1％的I型胶原(BD Biosciences，France)或PEM膜包被，所述PEM膜由PSS和PAH(Sigma，France)构成，其中最终的PAH-(PSS-PAH)3结构对应于3.5对沉积的PAH/PSS层[Berthelemy N，等人.(2008)Adv Mater 20：2674-2678]。将培养物置于37℃含有5％CO2和21％O2的空气的正常细胞培养温育箱中(O2/CO2温育箱，Sanyo，France)。3天之后，除去培养基以丢弃未附着的细胞。然后，将细胞(之前鉴定为CD34+，CD133+[Berthelemy N，等人.(2008)Adv Mater 20：2674-2678])置于37℃，5％CO2和5％O2的低氧条件下，或置于37℃，5％CO2和21％O2(对照)的含氧量正常条件下，每两天更换培养基。通过相差显微镜(Nikon DIAPHOT 300，Japan)跟踪观察粘附细胞的分化和形态学发展。
3)平滑肌细胞(SMC)和内皮细胞(EC)特异性标志物的免疫染色
在汇合并在三次传代后，将细胞进行SMC和EC特异性标志物的免疫标记。使用3种抗体表征收缩性的SMC表型：i)α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)，ii)平滑肌肌球蛋白重链(SM-MHC)和iii)钙调节蛋白。使用另外2种蛋白表征EC表型：i) CD31，ii)von Willebrand因子(vWF)(均来自Dako，France)。在使用细胞内抗体(α-SMA、SM-MHC、钙调节蛋白和vWF)进行免疫标记之前，使用4％的多聚甲醛(PAF)(w/v，在磷酸盐缓冲液中)将细胞固定10分钟并使用Triton X-1000.5％(w/v，在蒸馏水中)渗透15分钟。对于CD31标记，不进行第二个步骤(渗透处理)。在37℃将细胞与一抗单抗一起温育45分钟，所述单抗在不含苯酚红、含有牛血清白蛋白(0.5％BSA，w/v)的RPMI1640中以1/50进行稀释。以RPMI 1640洗涤两次之后，与
488标记的二抗(以1/100进行稀释)在37℃温育30分钟。使用488nm光谱线，通过荧光共聚焦显微镜(LEICA DMIRE2 HC Fluo TCS1-B，Germany)观察细胞。
4)细胞外基质(ECM)蛋白的免疫染色
在汇合时，使用两种特异性蛋白例如i)层粘蛋白和ii)IV型胶原对低氧分化的细胞进行免疫染色以进行ECM蛋白的表征。使用4％PAF将分化的细胞固定10分钟并在37℃与一抗单抗一起温育45分钟，所述单抗在不含苯酚红、含有0.5％BSA的RPMI 1640中以1/50进行稀释。以RPMI 1640洗涤两次之后，与
488标记的二抗(以1/100进行稀释)在37℃温育30分钟。通过荧光共聚焦显微镜(LEICA DMIRE2 HC Fluo TCS 1-B，Germany)观察细胞。
5)评价SMC表型的维持
为了检查在低氧条件下培养的第一个步骤之后，分化成SMC随着时间的进行是稳定的，将细胞进一步在低氧或含氧量正常条件下培养。分化之后，将在I型胶原和PEM上培养的汇合细胞扩增并分成两批。将第一批保持在低氧条件下(37℃，5％CO2和5％O2)，而第二批置于含氧量正常条件下(37℃，5％CO2和21％O2)。然后在这些不同的条件下培养细胞直至第三次传代(P3)，在相同的条件下培养的来自兔子主动脉的成熟SMC用作对照。
6)荧光激活的细胞分选(FACS)
进行FACS分析(EPICS XL，Beckman Coulter，France)以定量阳性细胞的百分率和分化的SMC表达的特异性收缩标志物的荧光强度。P3之后进行FACS以鉴定细胞中的细胞内抗原。为此，按照以前的描述将胰蛋白酶处理的分化的细胞进行标记。通过仅以二抗温育细胞来评估非特异性结合。在分化的细胞区域(按照正向和侧向散射确定)，收集10,000个事件，测定阳性细胞的百分率和平均荧光强度(MFI)。
7)统计
数据表示为每个条件下的平均值±平均值的标准误差(s.e.m.)。每个实验以一式三份独立地重复三次。通过非配对t-检验(Statview IV，Abacus Concepts Inc，Berkley，CA，USA)比较平均值，其中p代表等均值的零假设的排斥水平。
结果和讨论
以下结果是使用外周血单核细胞获得的。使用分离自骨髓、脂肪组织、脐带血或渥顿氏胨胶的MNC获得了相似的结果(数据未显示)。
分离含有祖细胞的外周血单核细胞(MNC)组分并植于24孔平板，所述平板包含盖玻片，所述盖玻片以I型胶原或以聚电解质多层膜(PEM)包被(1×106个细胞/cm2)。本发明人使用已知为血管祖细胞培养物的理想基质的I型胶原[Simper D，等人.(2002)Circulation106：1199-1204]和具有推进祖细胞分化的高潜能的PEM[BerthelemyN，等人.(2008)Adv Mater 20：2674-2678]。在含氧量正常条件下培养4天后，除去未附着的细胞，将粘附的细胞(CD34+，CD133+)分成两部分，并置于低氧条件下(5％CO2和5％O2)或含氧量正常(5％CO2和21％O2)条件下直至汇合(2至4周)。在汇合时，对于两种类型的表面，相差显微镜细胞观察显示含氧量正常条件下的鹅卵石形态(图1A，1C)和低氧条件下的纺锤样形态(图1B，1D)。
为了评价分化细胞的细胞表型，本发明人检查了血管细胞(SMC和EC)的特异性标志物的表达，即α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、平滑肌肌球蛋白重链(SM-MHC)和钙调节蛋白，已知它们能评估血管SMC的分化及其收缩功能[Simper D，等人.(2002)Circulation 106：1199-1204；Babu等人.(2004)Am J Physiol Cell Physiol 287：723-729and Li S，等人.(2001)Circ Res 89：517-525]，以及CD31和vonWillebrand因子(vWF)，它们用于评估EC表型[Newman PJ，等人.(1990)Science 247：1219-1222 and Meyer D，at al.(1991)Mayo ClinProc 66：516-523]。如所预期的那样，在含氧量正常条件下，共聚焦显微镜观察显示了EC标志物阳性细胞的存在[图1E和1I(对于I型胶原包被)，1G和1K(对于PEM包被)]以及SMC标志物阴性的细胞的存在[图1M，1Q和1U(对于I型胶原)，1O，1S和1W(对于PEM)]。在低氧条件下，观察到令人惊奇的SMC标志物的阳性表达[图1N，1R和1V(对于I型胶原)，1P，1T和1X(对于PEM)]。在该条件下，无论使用哪种包被，都没有观察到EC标志物的表达[图1F和1J(对于I型胶原)，图1H和1L(对于PEM)]，因此这表明在低浓度O2时，完全不存在向EC的细胞分化。所有这些观察构成祖细胞向SMC表型转变的标志。这些结果说明，第一，在低氧环境中MNC细胞分化成SMC表型的潜力；第二，特异性标志物的表达确认了这些细胞的收缩表型[Owens GK(1995)Physiol Rev 75：487-517](类似于体内的SMC)。在文献中，造血干细胞分化为成熟的和功能性SMC需要补充了特异性生长因子尤其是PDGF-BB的培养基[Simper D，等人.(2002)Circulation 106：1199-1204以及Xie SZ，等人.(2008)J Zhejiang Univ Sci B 9：923-930]。我们的结果证明，仅调节氧浓度允许将表型转换为内皮细胞或平滑肌细胞。
细胞外基质(ECM)促成细胞功能的控制，并参与维持细胞在分化状态[Ingber DE，等人.(1994)Iht Rev Cytol 150：173-224以及BissellMJ and Barcellos-Hoff MH(1987)J Cell Sci 8：327-343]。在血管形成过程中，SMC通过蛋白(纤连蛋白、层粘蛋白、胶原等)的分泌负责细胞外基质的形成[Rzucidlo EM，等人.(2007)J Vasc Surg 45：25-32]。ECM沉积通过不同的信号途径(激酶途径激活)在体内和体外(组织工程方法)促成动脉壁构成和细胞功能[Rzucidlo EM，等人.(2007)J VascSurg 45：25-32以及Davis MJ，等人.(2001)Am J Physiol Heart CircPhysiol.280：H1427-H1433]。本发明人研究了低氧条件下分化细胞合成其自身ECM的能力，并且本发明人评估了两种细胞外蛋白(层粘蛋白和IV型胶原)的分泌，它们在ECM合成中具有主要作用，并且促成分化细胞的收缩表型的维持[Rzucidlo EM，等人.(2007)J Vasc Surg45：25-32]。共聚焦显微镜观察显示了这两种蛋白的沉积。此外，两种表面的对比显示出在PEM上培养的细胞的较强的ECM合成(图 2A-D)。这些在低氧条件下获得的数据确认了MNC分化成SMC的能力，所述SMC表现出收缩表型、正确的生理状态和ECM完整性的标志。这种完整性对于保持该状态具有重要意义，并且表明了在长时间段内的稳定性。在低氧条件下培养的MNC衍生的SMC在长时间段内的表型稳定性是在例如组织工程中使用该途径的主要问题。在低或高氧气浓度研究了SMC的表型稳定性。在低氧分化的细胞(对于SMC标志物呈阳性的细胞)的第一次传代后，将获得的细胞在两种条件下扩增。对于第一个检验，本发明人将细胞维持在低氧条件下；对于第二个检验，本发明人将细胞置于含氧量正常条件下。为了检查在这些条件下SMC表型的稳定性，进行数次传代(P3)。不论实验条件(低氧和含氧量正常条件)是什么，本发明人都没有检测到EC标志物(数据未显示)。
在低氧条件下，细胞表征显示出对于SMC标志物的阳性染色，对于两种类型的包被(I型胶原和PEM)，所有观察到的SMC标志物都具有常规的细胞质分布(图6A-F)。这些数据与FACS分析关联，FACS分析表明，在第3次传代后，对于两种表面，80％以上的细胞都是阳性的(图7A-G)。此外，本发明人比较了分化细胞与在相同培养基中在含氧量正常和低氧条件下培养的从兔子主动脉提取的成熟SMC的表达的SMC收缩标志物的平均荧光强度(MFI)。成熟SMC培养于常规使用的组织培养塑料表面(TCPS)[L′Heureux N，等人.(2001)FASEB J 15：515-24]，未显示出与在I型胶原和PEM上进行的对照之间的差异。对于在I型胶原和PEM包被的表面上培养的细胞而言，分化细胞的α-SMA、SM-MHC和钙调节蛋白都显著高于成熟SMC，虽然胶原包被的表面上的α-SMA的显著性较低(图8)。
在含氧量正常条件下，还通过共聚焦显微镜观察和FACS分析定性和定量地表征了扩增的细胞。对于低氧条件，显示的细胞对于SMC收缩标志物是阳性的，同样也是常规的细胞质分布(图9A-F)。FACS分析还显示，80％以上的分化细胞对于SMC收缩标志物是阳性的(图 10A-G)。对于两种表面包被而言，分化细胞的收缩标志物的MFI显著高于成熟的SMC，在I型胶原和PEM包被的表面上培养的分化细胞之间没有差异(图11)。有重要意义的是，还注意到：当比较在低氧和含氧量正常条件下获得的数据时，没有发现3种收缩标志物的表达上的显著性差异。
众所周知的是，从血管提取的体外的成熟SMC的表型从可收缩性(健康)转换为增殖性(病理)表型[Cha JM，等人.(2005)Artif Organs30：250-258以及Bach AD，等人.(2003)Clin Plast Surg 30：589-599]。这种转换构成血管组织工程的巨大限制。本发明的分化方法允许我们获得SMC的“健康”表型，其可以构成血管组织工程的替代品。本发明人有效地观察到，相对于成熟的SMC而言，分化细胞的收缩标志物的表达要强烈得多。在体内，血管损伤之后，炎性反应(涉及MNC)参与愈合过程。因此研究了兔子主动脉旁路术之后的血管壁重建。植入了具有适当的机械特性的抗血栓形成的移植物[Kerdjoudj，H.等人.Adv.Funct.Mater.17，2667-2673(2007)；Kerdjoudj H，等人.(2008)JAm Coll Cardiol 52：1589-1597]。跟踪壁移植物的行为，持续12周。移植后1个月之内，组织学分析揭示了移植物壁坏死导致的血管细胞(SMC)的完全丧失，这是由于缺少血管滋养管(其负责血管形成)[L′Heureux，N.等人.Nat Med.12，361-365(2006)]并存在包围血管的炎性细胞(图3)。移植后12周，出现了与之前的观察相比显著不同的壁结构上的差异。除了保持对血流通透的能力之外，组织学观察显示：i)炎性细胞的完全消溶，和ii)血管壁的重新定殖。细胞鉴定证明了SMC表型标志物α-SMA阳性的细胞的存在。已经证明[L′Heureux，N.等人.Nat Med.12，361-365(2006)]：移植之后1个月形成的血管滋养管允许氧气进入(2％至9％的浓度范围，与体外低氧条件是相当的)。此外，H&S染色显示胶原主要存在于外膜，弹性蛋白主要存在于中间膜。几个血管组织工程研究得到了相同的观察结果，它们没有显示SMC的来源[Mellander，S.，等人.(2005)Eur J Vasc Endovasc Surg.30，63-70；L′Heureux，N.等人.(2006)Nat Med.12，361-365；Chaouat，M.，等人.(2006)Biomaterials 27，5546-53]。本发明的数据着重强调了炎性细胞在愈合过程中的作用，其与血管壁中的低氧水平一起参与血管壁重建。
总而言之，本发明人证明了，在低氧条件下且没有增强SMC分化的特异性生长因子的情况下培养的祖细胞显示出SMC的形态学和表型特征，如SMC收缩标志物的表达所示。此外，当置于含氧量正常条件下时，这些分化的SMC保持其可收缩的表型，这表明这些细胞获得了与功能性血管中存在的生理性SMC相当的稳定的和功能性表型。
这些结果突出了组织环境、尤其是O2含量在血管祖细胞分化过程中的关键作用。这些发现与以前的发现[Berthelemy N，等人.(2008)AdvMater 20：2674-2678]联合在一起可以构成组织工程的基础和体外组织重建的临床应用策略。例如，在血管组织工程中，从培养于PEM和相同的培养基中，但是在含氧量正常或低氧条件下的单一的外周血样品开始，可以在一个月之内获得成熟EC(21％O2)或可收缩性SMC(5％O2)。可以将不同的层(中膜和内膜)联合在一起以建立例如天然的和自体同源的血管移植物。
实施例2：从造血干细胞分化构建功能性血管
本实施例公开了根据本发明的方法建立体外血管的程序的实例。该实施例通过图4和图5阐释。下文中，“单核”细胞是指包含细胞核的正常细胞。因此，红细胞、调亡细胞和细胞碎片等排除在该定义之外。因此，单核细胞是干细胞和分化的细胞。
基质制备(载体)
首先，按照上文描述建立载体，并将其沉积在合适的表面上。
将细胞沉积在载体上。
可以通过改变离子强度(离子浓度)、温度或pH，或通过本领域已知的任何方法将分化细胞从载体上分离，以允许回收功能性活细胞。
细胞分化(图4)
本方法中可以使用造血干细胞和间充质干细胞。这些干细胞可以从以下来源纯化而来：
-血液(B)
-骨髓(BM)
-渥顿氏胨胶(WJ)
-脐带血(UCB)或
-脂肪组织(AT)
以下程序阐释了纯化上述干细胞的方法。根据生产商的说明书，技术人员可以容易地对这些程序进行修改，尤其是通过改变血清浓度。
-从血液中制备细胞
从个体中采取血液，并置于含有密度梯度的离心管(a)中(例如，对于兔子细胞使用Histopaque 1077，对于人类细胞使用Lymphoprep)。离心(500g，10分钟)之后，从含有红细胞的沉淀物(b)中分离单核细胞。
然后将分离的单核细胞置于表面(c)，其被合适的培养基中的载体覆盖，所述培养基为内皮细胞基础培养基EBM-2(Clonetics，Belgium)]，补充了5％血清并包含生长因子(VEGF、R3-IGF、rhFGFb、抗坏血酸、rhEGF、肝素、氢化可的松)。
将细胞在培养基中放置4天，允许细胞附着(d1和d2)。然后除掉未植入的细胞(e1和e2)，将植入的细胞置于含有适当O2的空气中，即含有低浓度氧气(5％，低氧，f1)的空气，或含有正常氧浓度(20％，正常氧含量，f2)的空气。
-从骨髓制备细胞
使用到达骨中心的大针头，通过穿孔法从供体的大的骨(通常是骨盆)获得骨髓。将骨髓细胞置于离心管(a)，并且，
-离心(500g，10分钟)以沉淀包含干细胞的单核细胞，
-或者使用白细胞采集术收集从红细胞分离的单核细胞。
然后将分离的单核细胞置于表面(c)，其被合适的培养基中的载体覆盖，所述培养基为αMEM(Lonza)，补充了10％血清、两性霉素B(Gibco，France)2.5μg/mL、青霉素50UI/mL+链霉素(Gibco，France)50μg/mL、L-谷氨酰胺(Gibco，France)5mM和FGF2(R&D systems)0.6ng/mL。
将细胞在培养基中放置2天，允许细胞附着(d1和d2)。然后除掉未植入的细胞(e1和e2)，将植入的细胞置于含有适当O2的空气中，即含有低浓度氧气(5％，低氧，f1)的空气，或含有正常氧浓度(20％，正常氧含量，f2)的空气。
-从脐带血制备细胞
从知情同意的母亲从出生后脐带分离脐带血，并置于含有密度梯度的离心管(a)中(例如，对于人类细胞使用Histopaque 1077、Lymphoprep)。离心(450g，30分钟，25℃)之后，从含有红细胞的沉淀物中(b)分离单核细胞。
然后将分离的单核细胞置于表面(c)，其被合适的培养基中的载体覆盖，所述培养基为内皮细胞基础培养基EBM-2(Clonetics，Belgium)]，补充了5％血清并包含生长因子(VEGF、R3-IGF、rhFGFb、抗坏血酸、rhEGF、肝素、氢化可的松)。
将细胞在培养基中放置7天，允许细胞附着(d1和d2)。然后除掉未植入的细胞(e1和e2)，将植入的细胞置于含有适当O2的空气中，即含有低浓度氧气(5％，低氧，f1)的空气，或含有正常氧浓度(20％，正常氧含量，f2)的空气。
-从渥顿氏胨胶制备细胞
从知情同意的母亲从出生后脐带分离脐带，并置于合适的培养基中，所述培养基为αMEM(Lonza)，补充了10％血清、两性霉素B(Gibco，France)2.5μg/mL、青霉素50UI/mL+链霉素(Gibco，France)50μg/mL、L-谷氨酰胺(Gibco，France)5mM和FGF2(R&D systems)0.6ng/mL(a)。除去静脉和动脉，将脐带切碎，将从渥顿氏胨胶的分解得到的细胞置于表面(c)，其被合适的培养基中的载体覆盖，所述培养基为αMEM(Lonza)，补充了10％血清、两性霉素B(Gibco，France)2.5μg/mL、青霉素50UI/mL+链霉素(Gibco，France)50μg/mL、L-谷氨酰胺(Gibco，France)5mM和FGF2(R&D systems)0.6ng/mL(b)。
将细胞在培养基中放置7天，允许细胞附着(d1和d2)。然后通过洗涤除掉未植入的细胞(e1和e2)，将植入的细胞置于含有适当O2的空气中，即含有低浓度氧气(5％，低氧，f1)的空气，或含有正常氧浓度(20％，正常氧含量，f2)的空气。
-从脂肪组织制备细胞(另参见Locke等人.ANZ J Surg 79(2009)235-244)
从例如个体的抽脂术(lipoaspiration)获得脂肪组织，并置于离心管(a)中。通过标准程序(例如Tris 10mM/MgCl2 10mM/NaCl 10mM，或NH4HCO3 0.9mM/NH4Cl 131mM，或Tris 20mMpH7.5/MgCl2 5mM或Tris 10mM pH7.4/EDTA(乙二胺四乙酸)10mM，持续20-30分钟，4℃)裂解残余的红细胞。使用胶原酶消化脂肪。离心(450g，30分钟，25℃)之后，获得低相中包含的单核细胞并将其置于表面(c)，其被合适的培养基中的载体覆盖，所述培养基为αMEM(Lonza)，补充了10％血清、两性霉素B(Gibco，France)2.5μg/mL、青霉素50UI/mL+链霉素(Gibco，France)50μg/mL、L-谷氨酰胺(Gibco，France)5mM和FGF2(R&D systems)0.6ng/mL(b)。
将细胞在培养基中放置7天，允许细胞附着(d1和d2)。然后通过洗涤除掉未植入的细胞(e1和e2)，将植入的细胞置于含有适当O2的空气中，即含有低浓度氧气(5％，低氧，f1)的空气，或含有正常氧浓度(20％，正常氧含量，f2)的空气。
然后将细胞在其培养基中在其空气中放置14天，以实现细胞分化。
在含氧量正常条件下生长的细胞分化为内皮细胞，而在低氧条件下生长的细胞分化为平滑肌细胞。
血管的建立(图5)
然后使用生长因子例如抗坏血酸刺激从以上步骤获得的平滑肌细胞，以增大平滑肌细胞层的密度。该处理允许回收从表面取下的层(pH改变)。
另外，可以通过离子变化和温度变化从表面取下平滑肌层。
然后，沿着疏水柱(例如由构成)滚动平滑肌细胞层(a&b)。
将沿着柱滚动的管置于生物反应器(产生修剪和延展)以诱导巩固管(consolidated tube)的形成，并形成中膜(c)。
然后，从巩固管中除掉柱(d)，向所述管的腔内加入以上步骤获得的内皮细胞(e)。
将具有内皮细胞的管放置1周以允许通过单层内皮细胞恢复腔，即内膜(f)。
然后将管置于生物反应器(产生修剪和延展)以诱导巩固管的形成，并允许形成定向的内膜(g)。
然后形成功能性血管。
Claims (15)
1.特定氧浓度用于实施使衍生自骨髓或血液或脐带的干细胞分化的体外方法的用途，所述干细胞是造血干细胞或间充质干细胞并且植于合适的培养基中的载体上，其中所述分化：
—在含氧量正常条件下并在合适的培养基中产生第一组特化分化的细胞，所述第一组特化分化的细胞由内皮细胞组成，和
—在低氧条件下产生第二组特化分化的细胞，其处于与用于获得第一组特化分化的细胞的培养基性质相同的培养基中，所述第二组特化分化的细胞由平滑肌细胞组成，其中所述低氧条件不同于缺氧，
所述第一和第二组特化分化的细胞保留通过天然生物学过程获得的各自相对应的特化分化的细胞的功能特性；
其中所述含氧量正常的条件是指，氧浓度是总环境气体的13%至21%摩尔含量/体积；并且
其中所述低氧条件是指，氧浓度是总环境气体的2%至12%摩尔含量/体积；
其中所述载体包含或由下列组成：
—白明胶、纤连蛋白、胶原、层粘蛋白、RGD肽或其组合，或
—聚阳离子和聚阴离子的聚电解质多层，
—所述聚阳离子选自聚烯丙胺（PAH）和壳聚糖，并且
—所述聚阴离子选自聚苯乙烯磺酸（PSS或SPS），透明质酸盐和藻酸盐，
其中聚电解质层的层数是3至50，
所述载体沉积于人工表面上，所述人工表面选自生物相容性聚合物和任何用于假体和/或植入系统的材料。
2.两种具有特定氧浓度的培养基的二元组用于干细胞体外分化的用途，每种特定氧浓度的培养基对应于培养基和特定的氧浓度，所述干细胞源自骨髓或血液或脐带，所述干细胞是造血干细胞或间充质干细胞并且植于载体上，所述分化分别：
—在含氧量正常条件下在合适培养基中获得第一组特化分化的细胞，所述第一组特化分化的细胞由内皮细胞组成，和
—在低氧条件下在与用于获得第一组特化分化的细胞的培养基性质相同的培养基中获得第二组特化分化的细胞，所述第二组特化分化的细胞由平滑肌细胞组成，其中所述低氧条件不同于缺氧，
所述第一和第二组特化分化的细胞保留通过天然生物学过程获得的各自相对应的特化分化的细胞的功能特性；
其中所述含氧量正常的条件是指，氧浓度是总环境气体的13%至21%摩尔含量/体积；并且
其中所述低氧条件是指，氧浓度是总环境气体的2%至12%摩尔含量/体积；
其中所述载体包含或由下列组成：
—白明胶、纤连蛋白、胶原、层粘蛋白、RGD肽或其组合，或
—聚阳离子和聚阴离子的聚电解质多层，
—所述聚阳离子选自聚烯丙胺（PAH）和壳聚糖，并且
—所述聚阴离子选自聚苯乙烯磺酸（PSS或SPS），透明质酸盐和藻酸盐，
其中聚电解质层的层数是3至50，
所述载体沉积于人工表面上，所述人工表面选自生物相容性聚合物和任何用于假体和/或植入系统的材料。
3.权利要求1或2的用途，其中所述聚电解质多层是交替的。
4.权利要求1或2的用途，其中所述聚阳离子是壳聚糖。
5.权利要求1或2的用途，其中所述聚阴离子是透明质酸盐或藻酸盐。
6.权利要求1或2的用途，其中所述生物相容性聚合物选自
聚氨酯、聚甲基硅氧烷、聚氯乙烯、
和膨体聚四氟乙烯（ePTFE）。
7.权利要求1或2的用途，其中所述载体包含或由下列组成：选自(PAH-PSS)3和(PAH-PSS)3-PAH的聚电解质多层。
8.权利要求1或2的用途，其中所述生物相容性聚合物和所述任何用于假体和/或植入系统的材料选自玻璃、TCPS（细胞培养物处理的聚苯乙烯）、聚硅氧烷和全氟烃基聚醚。
9.使衍生自骨髓或血液或脐带的干细胞体外分化的方法，所述干细胞是间充质干细胞或造血干细胞，所述方法包括：
—将源自骨髓或血液或脐带的干细胞与沉积于合适的培养基中的表面上的载体接触，以获得植于载体上的干细胞，
—改变包含所述植于载体上的干细胞的所述合适的培养基中的氧浓度，以提供含氧量正常的条件或低氧条件，所述低氧条件不同于缺氧，
—使所述植于载体上的干细胞体外分化：
●通过将所述植于载体上的干细胞在含氧量正常的条件下培养而形成第一组特化分化的细胞，所述第一组特化分化的细胞由内皮细胞组成，
●或，通过将所述植于载体上的干细胞在低氧条件下在与用于获得第一组特化分化的细胞的培养基性质相同的培养基中培养而形成第二组特化分化的细胞，所述第二组特化分化的细胞由平滑肌细胞组成，
所述第一和第二组特化分化的细胞保留通过天然生物学过程获得的各自相对应的特化分化的细胞的功能特性；
其中所述含氧量正常的条件是指，氧浓度是总环境气体的13%至21%摩尔含量/体积；并且
其中所述低氧条件是指，氧浓度是总环境气体的2%至12%摩尔含量/体积；
其中所述载体包含或由下列组成：
—白明胶、纤连蛋白、胶原、层粘蛋白、RGD肽或其组合，或
—聚阳离子和聚阴离子的聚电解质多层，
—所述聚阳离子选自聚烯丙胺（PAH）和壳聚糖，并且
—所述聚阴离子选自聚苯乙烯磺酸（PSS或SPS），透明质酸盐和藻酸盐，
其中聚电解质层的层数是3至50，
所述载体沉积于人工表面上，所述人工表面选自生物相容性聚合物和任何用于假体和/或植入系统的材料。
10.根据权利要求9的方法，其中所述聚电解质多层是交替的。
11.根据权利要求9或10的方法，其中所述聚阳离子是壳聚糖。
12.根据权利要求9或10的方法，其中所述聚阴离子是透明质酸盐或藻酸盐。
13.权利要求9或10的方法，其中所述生物相容性聚合物选自
聚氨酯、聚甲基硅氧烷、聚氯乙烯、
和膨体聚四氟乙烯（ePTFE）。
14.权利要求9或10的方法，其中所述载体包含或由下列组成：选自(PAH-PSS)3和(PAH-PSS)3-PAH的聚电解质多层。
15.权利要求9或10的方法，其中所述生物相容性聚合物和所述任何用于假体和/或植入系统的材料选自玻璃、TCPS（细胞培养物处理的聚苯乙烯）、聚硅氧烷和全氟烃基聚醚。
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Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1167146A (zh) * | 1996-06-04 | 1997-12-10 | 诺博实验室股份有限公司 | 胞内劳森氏菌培养、抗该菌的疫苗和诊断试剂 |
| CN1198758A (zh) * | 1996-06-03 | 1998-11-11 | 埃勒夫阿托化学有限公司 | 凝聚的聚合物胶乳粒子的制备方法 |
| CN1396942A (zh) * | 2000-02-01 | 2003-02-12 | 阿托菲纳公司 | 基于热塑性甲基丙烯酸(共)聚合物的耐冲击组合物 |
| CN101285076A (zh) * | 2008-06-05 | 2008-10-15 | 重庆大学 | 一种番茄红素的制备方法 |
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1198758A (zh) * | 1996-06-03 | 1998-11-11 | 埃勒夫阿托化学有限公司 | 凝聚的聚合物胶乳粒子的制备方法 |
| CN1167146A (zh) * | 1996-06-04 | 1997-12-10 | 诺博实验室股份有限公司 | 胞内劳森氏菌培养、抗该菌的疫苗和诊断试剂 |
| CN1396942A (zh) * | 2000-02-01 | 2003-02-12 | 阿托菲纳公司 | 基于热塑性甲基丙烯酸(共)聚合物的耐冲击组合物 |
| CN101285076A (zh) * | 2008-06-05 | 2008-10-15 | 重庆大学 | 一种番茄红素的制备方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
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| DONALD P. LENNON.Cultivation of Rat Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells in Reduced Oxygen Tension: Effects on In Vitro and In Vivo Osteochondrogenesis.《JOURNAL OF CELLULAR PHYSIOLOGY》.2001,第187卷345-355. * |
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