CN108026508A - 连续生物打印的多层组织结构 - Google Patents

Abstract

本文提供了合成活组织结构，其包含从3D生物打印机以固化形式沉积的多层纤维；以及与所述合成活组织结构相关的试剂盒和使用方法。所述纤维包括分配在固化生物相容性基质内的多个哺乳动物细胞。所述纤维的结构完整性在沉积之时和之后在没有任何额外交联的情况下得以维持。所述纤维被连续地生物打印通过所述结构的至少两个层。在一个方面，合成肌肉组织结构表现出易于测定的收缩功能性。

Description

连续生物打印的多层组织结构

相关申请的交叉引用

本申请要求2015年6月16日提交的美国临时申请序列第62/180,174号和2016年3月8日提交的美国临时申请序列第62/180,174号的权益，这两个临时申请的全部内容据此均通过引用并入本文。

发明领域

本发明涉及含有肌细胞的生物工程化组织，所述肌细胞用于测试响应于不同刺激的肌肉收缩和松弛。本发明还涉及用于制造这种组织的生物打印方法。

发明背景

骨骼肌系统代表了人体的基本结构和功能性的基本部分，而平滑肌在许多生物系统如血管系统、呼吸系统、淋巴系统和胃肠系统中起着重要的作用，而且也见于皮肤、眼睛、膀胱和其它几种器官中。这两种类型的组织在与这些系统有关的许多疾病中起到至关重要的作用。因此，对于学术界和制药业的研究人员来说，重要的是通过测试骨骼和平滑肌组织对各种化合物或其它刺激物的反应，获得生理相关的组织模型以更好地理解疾病途径和基础生理。

先前已经尝试过建立这种模型，并且通常包括使用模具将细胞(悬浮在基质中或形成聚集体)模制成特定形式，或者将细胞接种到预先形成的支架的外部。尽管最先进的模型能够概括平滑肌组织的某些功能，例如收缩，但是它们的制造是人工完成的，导致在再现性方面存在挑战。在其它模型中，制造的复杂性降低，但丧失了组织收缩的能力。

最近，3D打印(一种增材制造(AM)形式)已被应用于直接从数字文件创建三维物体，其中该物体被逐层构建以实现所需的三维结构。与上述惯例一致的是，使3D打印技术适用于产生细胞构建体和组织的最初努力(称为3D生物打印)也集中在首先打印支架材料，而细胞材料的直接接种或后续打印是独立进行的。参见例如美国专利第6,139,574号；第7,051,654号；第8,691,274号；第9,005,972号和第9,301,925号。然而，遗憾的是，通常用于形成现有技术支架的聚合物虽然通常被认为是生物相容的，但不是生理相容的。如此，这种方法牺牲了细胞活力以支持所需支架的机械稳定性。

还已经描述了另一种侧重相反情况的3D生物打印技术，其中为了支持细胞活力而牺牲机械结构和形状保真度。这些生物打印系统通过分配在生物相容性基质内的细胞材料产生合成组织，所述基质在沉积后交联或以其它方式固化，从而产生固体或半固体组织结构。参见例如美国专利第9,227,339号、第9,149,952号、第8,931,880号和第9,315,043号；美国专利公开第2012/0089238号；第2013/0345794号；第2013/0164339号和第2014/0287960号。然而，对于所有这些系统，沉积和交联步骤之间的时间延迟总是导致缺少对打印结构的几何形状以及该结构的细胞和基质组成的控制。此外，不管怎样，细胞活力通常仍然受到后续的交联或固化事件的损害。

而作为这个问题的另一个例子，Markstedt等人描述了一种其中水凝胶如胶原、透明质酸、壳聚糖和藻酸盐与非生理性增强纤维材料如纳米原纤化纤维素被组合起来用作3D生物打印的生物墨水的系统。BioMacromolecules 16：1489-96(2015)。这种生物墨水沉积为2D材料层，其被浸没在二价阳离子浴(CaCl₂)中以交联十分钟并使第一层固化，然后在第一层上沉积另一层。虽然活细胞被成功地并入其生物墨水中，但是细胞活力分析表明，由于交联过程，细胞活力从嵌入前的～95.3％显著降低至嵌入和交联后的～69.9％。此外，与非打印的对照相比较显示，细胞活力的降低可能是由于生物墨水本身的制备和混合，而不是实际的3D打印过程。

因此，现有的3D生物打印技术和材料不能令人满意地解决一方面结构完整性和形状保真度与另一方面生理相容性和细胞活力之间的技术冲突。本发明解决了这些和其它未满足的需求。

现有技术

文献

·Cyrille Norotte、Francois S.Marga、Laura E.Niklason和Gabor Forgacs，“Scaffold-free vascular tissue engineering using bioprinting”，Biomaterials，第30卷，2009，第5910-5917页。

·Jin-yau Lai、Cheol Yong Yoon、James J.Yoo、Tina Wulf和Anthony Atala，“Phenotypic and fumctional characteristics of in vivo tissue engineeredsmooth muscle from normal and pathological bladders”，Journal of Urology，第168卷，2002，第1853-1858页。

·Byung-Soon Kim和David J.Mooney“Scaffolds for engineering smoothmuscle under cyclic mechanical strain conditions”，J.Biomech Eng，第122(3_卷，2000，第210-215页。

专利

·US20140287960

·US20130345794

·US20140377232

·US7368279

发明概要

本发明成功地解决了先前在3D生物打印技术中存在的结构完整性和细胞活力两种目的之间相互冲突，提供以固化形式沉积的合成活组织结构，其具有改善的细胞存活和生理功能性，并且不需要交联或其它后续的固化步骤。本发明的方面包括合成活组织结构，所述合成活组织结构包含合成组织纤维，其包含从生物打印机分配的位于固化生物相容性基质内的多个哺乳动物细胞，其中所述纤维的结构完整性在沉积之时和之后以及没有任何额外的交联步骤的情况下得以维持。在优选的实施方案中，本发明提供包含连续的合成组织纤维的重叠层的合成活组织结构，其中所述重叠层可以是结构上分离的。在具体的实施方案中，提供了合成肌肉组织结构，其包含两层或更多层连续的合成组织纤维，所述连续的合成组织纤维包含从生物打印机分配的位于固化生物相容性基质内的多个哺乳动物肌细胞。

在一个方面，本发明提供了一种合成活组织结构，其包含从生物打印机分配的合成组织纤维，所述纤维包含从生物打印机分配的位于固化生物相容性基质内的多个哺乳动物细胞，其中所述纤维的结构完整性在从打印头分配之后得以维持，而不需要在接触沉积表面后使所述基质交联。在优选的实施方案中，本发明提供了合成活组织结构，其包含从生物打印机分配并分散在生物相容性基质内的哺乳动物细胞的连续重叠纤维，其中所述纤维被连续地生物打印通过所述结构的至少两个或更多个层，更优选通过至少三个或四个层，还更优选通过所述组织结构的至少五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个层。哺乳动物细胞优选包含在能够维持纤维的结构完整性和形状保真度的固化生物相容性基质内，这样使得在纤维的重叠片段之间存在可视边界。

固化的生物相容性基质可以包含支持活细胞的活力的多种天然或合成聚合物中的任一种，包括例如藻酸盐、层粘连蛋白、纤维蛋白、透明质酸、聚乙二醇基凝胶、明胶、壳聚糖、琼脂糖或其组合。在优选的实施方案中，固化的生物相容性基质包含藻酸盐或任何其它合适的生物相容性聚合物，其可以在从打印头分配时瞬间固化。

在特别优选的实施方案中，固化的生物相容性基质是生理上相容的，即有利于细胞生长、分化和通讯。在一些这样的实施方案中，生理上相容的基质包含藻酸盐与胶原、纤连蛋白、血小板反应蛋白、糖胺聚糖(GAG)、脱氧核糖核酸(DNA)、粘附糖蛋白、弹性蛋白及其组合中的一种或多种的组合。在具体实施方案中，胶原选自由以下组成的组：I型胶原、II型胶原、III型胶原、IV型胶原、V型胶原、VI型胶原或XVIII型胶原。在具体实施方案中，GAG选自由以下组成的组：透明质酸、6-硫酸软骨素、硫酸皮肤素、4-硫酸软骨素或硫酸角蛋白。

在本文例示的优选实施方案中，哺乳动物细胞包括肌细胞，例如平滑肌细胞、骨骼肌细胞和/或心肌细胞。在替代的实施方案中，所述组织或组织结构还包含至少另一种细胞类型，例如成纤维细胞、内皮细胞和/或上皮细胞、干细胞等。在一个这样的实施方案中，至少另一种细胞类型分散在所述纤维内。在另一个这样的实施方案中，所述至少另一种细胞类型被同心地布置在所述纤维的外部周围作为外层/第二层。在特别优选的实施方案中，哺乳动物细胞是人细胞。有利的是，与打印前的细胞活力相比，这些合成活组织结构内的细胞活力在生物打印后介于约70％多至约100％的范围内，例如约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约98％、约99％、约99.5％或约99.9％。

在一个实施方案中，所述结构包括圆筒/管，并且所述纤维大体上连续地通过圆筒的每一层。在一个替代的实施方案中，所述结构包括平面片材，并且所述纤维在整个平面片材中是大体上连续的。在特别优选的实施方案中，合成肌肉结构表现出收缩功能性，并且收缩功能性可通过所述结构的直径和/或周长的变化来确定。

在另一方面，提供了包含主题合成组织和组织结构的试剂盒，以及适当的包装和/或使用说明书。

在另一方面，提供了用于评估测试剂和/或条件对哺乳动物肌细胞的收缩功能的影响的方法，其包括以下步骤：a)使主题合成活组织结构与测试剂和/或条件接触；和b)通过评估肌肉功能(例如通过测量尺寸变化(如例如所述结构的面积、直径和/或长度))和/或通过分析诸如细胞活力、增殖、极化和/或基因表达(包括例如平滑肌肌动蛋白、钙调蛋白或钙调结合蛋白的表达)、抗平滑肌细胞抗体(ASMA)的结合等的度量，确定所述试剂和/或条件对哺乳动物肌细胞的影响。在优选的实施方案中，所述结构包括圆筒/管，并且确定步骤包括测量圆筒的直径和/或周长的变化。

在优选的实施方案中，生物打印机通过单孔分配包含多个哺乳动物细胞的固化生物相容性基质。在特别优选的实施方案中，单孔包含在如WO2014/197999中所描述和要求保护的打印头内，该文献的公开内容通过引用整体并入本文。

附图简述

图1是凝胶细丝逐层沉积过程的示意图。

图2示出了收缩之前和之后的平滑肌环的两个俯视图。

图3是示出了凝胶细丝内的平滑肌细胞生长的俯视透射光显微照片。

图4是包括平滑肌细胞和另一种细胞类型的同轴排列管的示意图。

图5是由具有同轴排列的平滑肌细胞和另一种细胞类型的凝胶细丝构成的管的示意图。

详述

本发明的方面包括合成活组织结构，所述合成活组织结构包含合成组织纤维，其包含从生物打印机分配的位于固化生物相容性基质内的多个哺乳动物细胞，其中所述纤维的结构完整性和形状保真度在沉积之时和之后以及没有任何额外的交联步骤的情况下得以维持。在优选的实施方案中，本发明提供包含连续的合成组织纤维的重叠层的合成活组织结构，其中所述重叠层可以是结构上分离的。本发明的其它方面包括用于药物筛选和肌肉功能评估的合成肌肉组织结构，其包含两层或更多层连续的合成组织纤维，所述连续的合成组织纤维包含从生物打印机分配的位于固化生物相容性基质内的多个哺乳动物肌细胞。

如图1所提供，将包含多个哺乳动物细胞(例如人平滑肌细胞、骨骼肌细胞或心肌细胞)的固化生物相容性基质从形成合成组织纤维的生物打印机分配到沉积表面上。如此，在从打印头分配已经固化的基质之后，后续的交联或其它固化步骤是不必要的。这样，合成组织纤维的第二层和后续层可以连续地沉积在第一层之上以形成多层结构，同时保持每一层的结构完整性和形状保真度。这个过程持续一段确定的时间，直到产生具有所需高度的结构。

固化的生物相容性基质可以有利地包含藻酸盐或可以在从打印头分配时瞬间固化的任何其它合适的生物相容性聚合物。如本文所用的术语“固化”是指在沉积时保持其形状保真度和结构完整性的固体或半固体状态的材料。如本文所用的术语“形状保真度”意指材料维持其三维形状的能力。在一些实施方案中，固化材料是能够将其三维形状维持约30秒或更长，例如约1、10或30分钟或更长，例如约1、10、24或48小时或更长的时间的材料。如本文所用的术语“结构完整性”意指材料在包括其自重的负载下保持结合在一起且同时抵抗破裂、弯曲或坍塌的能力。

在一些实施方案中，固化的生物相容性基质是弹性模量大于约15、20或25千帕(kPa)，更优选大于约30、40、50、60、70、80或90kPa，还更优选大于约100、110、120或130kPa的生物相容性基质。用于主题生物打印的合成组织纤维的优选弹性模量范围包括从约15、25或50kPa至约80、100、120或140kPa。

在一个优选的实施方案中，基于藻酸盐的基质被打印并通过在从打印头分配之前或之时与二价阳离子交联溶液(例如CaCl₂溶液)接触而在打印的同时交联。在特别优选的实施方案中，基于藻酸盐的生物相容性基质还包含一种或多种生理材料，如本文中更详细描述。在进一步优选的实施方案中，固化的生物相容性基质在每个合成组织纤维的整个径向横截面中包含均匀的藻酸盐组成。

本发明的主要优点之一在于它是使用基于纤维的3D生物打印方法进行制造，允许将组织容易地制成环形，其高度和宽度可以通过编程来修改。它还提供了实现重复的结构完整性和形状保真度的手段。如果使用包括层厚度、层数、层几何形状、细胞密度、材料组成和细胞类型的相同参数集打印几种组织，它们将全部大体上相似。本发明的一个显著优点是肌细胞在打印之后保留或重新发展其收缩能力，从而使得能够量化不同的刺激对肌肉收缩和随后的松弛的影响。不受理论的束缚，本文所述的多层连续纤维可以在纤维的各个层内产生一定程度的限制，从而促进细胞大体上沿纤维的方向而不是纤维的横截面增殖，这继而允许细胞在一致的方向上收缩，就如同自然发生的那样。根据我们最充分的了解，这是首次说明使用连续逐层沉积过程制造的肌肉组织的收缩。

在一个实施方案中，本文描述了肌肉组织的多层管。所述管是使用逐层沉积过程制成，由此肌细胞被分散在固化的生物相容性基质中并被生物打印成连续纤维的形式。在一个实施方案中，所述纤维沉积为环状形式以形成层。这些层堆叠形成管，其高度可以通过改变层数以受控的方式发生变化。优选地，基质组合物是生理上相容的，从而允许肌细胞完全分化成收缩表型。在生物打印时，管不收缩。为了实现收缩性，管在形成后一般被浸在细胞培养基中，并在细胞培养孵育箱中培养，通常历时数天，在此期间细胞重新获得其收缩能力。一旦能收缩，管就可以用于研究响应于不同刺激的肌肉收缩或松弛，并且这是通过测量管在收缩或松弛时的直径和/或周长变化来完成。

为了制备用于生物打印成管状结构的肌细胞，必须首先分离和培养足以形成生物打印结构的数量的细胞。细胞密度必须足够高以提供可测量的收缩，并且通常在每mL凝胶材料100万至1亿个细胞的范围内。肌细胞可以从许多不同的潜在来源分离，所述来源包括：捐赠的人体器官或组织、分化胚胎或诱导多能干细胞、永生化细胞系或从动物组织分离或获得的细胞。然后使分离的细胞以未固化的形式悬浮并装载到生物打印机中。细胞在这个过程中丧失其收缩表型。

在生物打印后，必须将肌肉结构浸入细胞培养基中，并置于具有温度和二氧化碳水平控制的细胞培养孵育箱中。在细胞培养一段时间(通常为数天)后，细胞将恢复其收缩表型并获得收缩和松弛的能力。图2示出了已经培养14天并且其中收缩已受到刺激的肌肉管的俯视图。收缩在40分钟的时间段内逐渐发生。白色虚线表示管在松弛状态下的直径。在收缩状态下，管具有较小的直径，并且这种变化是可测量的。在这个例子中，使用组胺来引发收缩，然而许多化合物或其它刺激也可能引发收缩。一些实例包括：氯化钾、乙酰胆碱、组胺和电荷。在优选的实施方案中，通过视觉观察管直径的变化来测量收缩和松弛。这可以通过在低倍率下通过显微镜物镜观察管并使用连接在显微镜上的数字照相机记录视频来完成。或者，可以将具有适当放大水平的照相机放置在平滑肌管的上方，从而记录管在俯视角度下的录像片段。软件可用于使用边缘检测算法或通过人工定义边缘来分离录像片段中的肌肉管结构。可以量化肌肉管的面积、半径、直径或周长的变化。有许多可用的软件工具可以容易地完成这个功能，Mathworks Matlab就是一个实例。

图3示出了14天后细丝内的培养的平滑肌细胞的透射光显微照片。如其中所示，平滑肌细胞倾向于沿着纤维的长度而不是其横截面生长，这可以实现或增强协调收缩反应。不受理论的束缚，如果肌细胞在各个方向均匀生长，则收缩反应或许是不可能的，或者不是那么显著。因此，在优选的实施方案中，合成肌肉组织纤维在生物打印过程之后保持其结构完整性和形状保真度，从而使得每个连续层之间的材料结合程度最小。优选地，这些层在结构上将是彼此分离的，如图3中在视觉上所示。最优选地，采用生理上相容的生物相容性基质材料，并避免在将纤维层沉积到打印表面上之时或之后需要交联步骤。

生物相容性基质材料：

固化的生物相容性基质可以包含支持活细胞的活力的多种天然或合成聚合物中的任一种，包括例如藻酸盐、层粘连蛋白、纤维蛋白、透明质酸、聚乙二醇基凝胶、明胶、壳聚糖、琼脂糖或其组合。在优选的实施方案中，固化的生物相容性基质包含藻酸盐或可以在从打印头分配时瞬间固化的其它合适的生物相容性聚合物。在进一步优选的实施方案中，固化的生物相容性基质在每个合成组织纤维的整个径向横截面中包含均匀的藻酸盐组成。

在特别优选的实施方案中，固化的生物相容性基质是生理上相容的，即有利于细胞生长、分化和通讯。“生理基质材料”意指在天然哺乳动物组织中发现的生物材料。此类生理基质材料的非限制性实例包括：纤连蛋白、血小板反应蛋白、糖胺聚糖(GAG)(例如，透明质酸、6-硫酸软骨素、硫酸皮肤素、4-硫酸软骨素或硫酸角质素)、脱氧核糖核酸(DNA)、粘附糖蛋白和胶原(例如，胶原I、胶原II、胶原III、胶原IV、胶原V、胶原VI或胶原XVIII)。

生物相容性基质可以由支持活细胞的生长和活力的多种天然或合成聚合物组成。这些材料的实例包括但不限于：胶原、藻酸盐、层粘连蛋白、弹性蛋白、纤维蛋白、透明质酸、聚乙二醇基凝胶、明胶、壳聚糖、琼脂糖、肽或其组合。肌肉管的直径由生物打印机限定，并且可以以受控的方式变化，但在优选的实施方案中，为了将组织放置在多孔细胞培养板内，直径是在2mm至30mm的范围内。细丝直径将通常在10μm至300μm的范围内。

哺乳动物细胞类型：

可用于受试者半月板植入物的哺乳动物细胞类型的非限制性实例包括：平滑肌细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、上皮细胞、内皮细胞、成肌细胞、成纤维细胞、胚胎干细胞、间充质干细胞、诱导多能干细胞、分化干细胞、组织来源的细胞及其任何组合。细胞可以从供体(同种异体)或从受体(自体)获得。细胞还可以来自确立的细胞培养系，或者可以是已经历基因工程改造和/或操作以实现表型的所需基因型的细胞。

在一个优选的实施方案中，合成组织纤维包含人肌细胞，例如其平滑肌、骨骼肌和/或心肌细胞和/或成肌细胞。在一个实施方案中，合成组织结构进一步包含至少另一种细胞类型，其分散在肌肉组织纤维内或布置在肌肉组织纤维的周围，包括例如成纤维细胞、内皮细胞、上皮细胞、干细胞等。

在一些实施方案中，细胞可以从合适的供体(人或动物)或从要被植入细胞的受试者获得。哺乳动物种类包括但不限于人、猴、狗、牛、马、猪、绵羊、山羊、猫、小鼠、兔、大鼠。在一个实施方案中，细胞是人细胞。在其它实施方案中，细胞可以源于动物，如狗、猫、马、猴或任何其它哺乳动物。

哺乳动物细胞的合适生长条件在本领域中是熟知的(Freshney，R.I.(2000)Culture of Animal Cells，a Manual of Basic Technique.Hoboken N.J.，John Wiley&Sons；Lanza等人Principles of Tissue Engineering，Academic Press，第2版，2000年5月15日；以及Lanza和Atala，Methods of Tissue Engineering Academic Press，第1版，2001年10月)。细胞培养基通常包括必需营养物和任选的其它元素，例如生长因子、盐、矿物质、维生素等，其可以根据培养的细胞类型来选择。可以选择特定的成分来促进细胞生长、分化、分泌特定蛋白质等。通常，标准生长培养基包括低葡萄糖杜氏改良伊格尔培养基(Dulbecco′s Modified Eagle Medium)(DMEM)，其中含有110mg/L丙酮酸盐和谷氨酰胺并补充有10-20％胎牛血清(FBS)或小牛血清，并且100U/ml青霉素是适当的，正如本领域技术人员熟知的各种其它标准培养基一样。生长条件将根据使用的哺乳动物细胞类型和所需的组织而变化。

人细胞的其它来源包括但不限于间充质干细胞(MSC)。MSC对于再生医学目的是有吸引力的，因为它们可以从患者分离，并容易被扩增来用作自体移植组织替代物。与供体同种异体移植物不同，受体来源的MSC自体移植物没有人际疾病传播或免疫介导组织排斥的风险。MSC的另一个优点是已经确定了有关MSC定居和随后分化成骨骼肌细胞的关键因素。(Torihashi等人，J.Biol.Chem.290：22771-81(2015)。

在一个实施方案中，肌肉管将包含另外的一种或多种细胞类型，例如成纤维细胞、内皮细胞或上皮细胞，其位于细丝内或附着于细丝的外部。

在另一个实施方案中，所述一种或多种细胞类型位于肌肉管的外侧和/或内侧，使得管是同轴的(如图4所示)，其中细胞类型1、细胞类型2或细胞类型3中的任一种是收缩性肌细胞。

在又一个实施方案中，所述一种或多种细胞类型位于肌细胞之上或之下，形成夹层型结构(未示出)。

在又一个实施方案中，所述一种或多种细胞类型被布置在细丝内，使得一种细胞类型以同轴排列形式围绕另一种细胞类型(如图5所示)，其中细胞类型1或细胞类型2是收缩性平滑肌细胞。

在一些实施方案中，在进行生物打印并且已经将所得的肌肉管细胞培养超过数小时之后，将细丝溶解或以其它方式去除，产生大体上不含非细胞材料的管，其有时被称为“无支架”。由于细胞形成相互连接的网络，所以即使在去除细丝之后，肌肉管的总体结构仍然得以维持。

筛选方法

本发明的方面包括用于评估测试剂和/或条件对哺乳动物肌细胞的收缩功能的影响的方法，其包括以下步骤：a)使主题合成活组织结构与测试剂和/或条件接触；和b)通过评估肌肉功能(例如通过测量尺寸变化(如例如所述结构的面积、直径和/或长度))和/或通过分析诸如细胞活力、增殖、极化和/或基因表达(包括例如平滑肌肌动蛋白、钙调蛋白或钙调结合蛋白的表达)、抗平滑肌细胞抗体(ASMA)的结合等的度量，确定所述试剂和/或条件对哺乳动物肌细胞的影响。在优选的实施方案中，所述结构包括圆筒/管，并且确定步骤包括测量圆筒的直径和/或周长的变化。

在一些实施方案中，肌肉管被用作用于测试药物化合物的功效或毒性的模型。

在一些实施方案中，通过力传感器来测量肌肉管的收缩。

在一些实施方案中，评估另外的度量，如细胞活力、增殖、极化和/或基因表达(包括例如平滑肌肌动蛋白、钙调蛋白或钙调结合蛋白的表达)，或测量抗平滑肌细胞抗体(AMSA)或其它蛋白质的结合。

修复肌肉缺损的方法

本发明的方面包括用于修复和/或替换受试者的肌肉的至少一部分的方法。可以将本文所述的任何合成肌肉纤维组织和管植入有需要的受试者中，以实现肌肉修复和/或再生。因此，本文还提供了修复受试者的肌肉缺损或促进肌肉再生的方法。在一个实施方案中，方法包括将如本文所述的合成肌肉组织结构植入需要肌肉修复或再生的缺损部位。

术语“受试者”包括但不限于人、非人灵长类动物如黑猩猩和其它猿和猴物种；农场动物，如牛、绵羊、猪、山羊和马；家养哺乳动物如狗和猫；实验动物，包括啮齿动物如小鼠、大鼠和豚鼠等。该术语不表示特定年龄或性别。因此，包括成人和新生受试者以及胎儿，无论男性或女性。在一个实施方案中，受试者是哺乳动物。在一个实施方案中，受试者是人受试者。

在一些实施方案中，方法可以包括将肌肉植入物或其部分固定在缺损部位，和/或将肌肉植入物的一个或多个部分固定到受试者体内的至少一种解剖结构上。在一些实施方案中，方法可以进一步包括去除受试者的缺损肌肉的至少一部分。

本文所参考的所有专利和专利公开在此通过引用并入。

本领域技术人员在阅读前面的描述后将会想到某些修改和改进。应该理解的是，为了简明和易读性起见，所有这些修改和改进已从本文中删除，但是恰当地包含在以下权利要求的范围内。

Claims (18)

1.一种合成活组织结构，其包含从生物打印机分配的位于固化生物相容性基质内的哺乳动物细胞的重叠纤维，所述生物相容性基质能够维持所述纤维在沉积后的结构完整性和形状保真度，其中所述固化生物相容性基质在径向横截面中是均匀的；且其中所述纤维被连续地生物打印通过所述结构的至少两个层。

2.根据权利要求1所述的合成活组织，其中所述纤维被连续地生物打印通过所述结构的至少三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个层。

3.根据权利要求1所述的合成活组织结构，其中所述纤维的重叠层在生物打印后仍然是结构上分离的。

4.根据权利要求1所述的合成活组织结构，其中所述生物相容性基质是生理上相容的。

5.根据权利要求2所述的合成活组织结构，其中所述结构包括圆筒/管，且其中所述细丝大体上连续地通过所述圆筒的每一层。

6.根据权利要求2所述的合成活组织结构，其中所述结构包括平面片材，且其中所述细丝大体上连续地通过所述平面片材。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的组织结构，其中所述哺乳动物细胞是肌细胞。

8.根据权利要求1-6中任一项所述的组织结构，其中所述肌细胞是平滑肌细胞。

9.根据权利要求1-6中任一项所述的组织结构，其中所述肌细胞是骨骼肌细胞。

10.根据权利要求1-6中任一项所述的组织结构，其中所述肌细胞是心肌细胞。

11.根据权利要求7-10中任一项所述的组织结构，其中所述结构包括收缩功能，并且其中所述收缩功能性可通过所述结构的直径和/或周长的变化来确定。

12.根据权利要求7-10中任一项所述的组织结构，其进一步包含至少另一种细胞类型。

13.根据权利要求12所述的组织结构，其中所述至少另一种细胞类型分散在所述细丝内。

14.根据权利要求12所述的组织结构，其中所述至少另一种细胞类型被布置在所述细丝的外部周围作为外层/第二层。

15.根据权利要求1-14中任一项所述的组织结构，其中所述哺乳动物细胞是人细胞。

16.一种试剂盒，其包含根据权利要求1-15中任一项所述的组织结构。

17.一种用于评估测试剂和/或条件对哺乳动物肌细胞的收缩功能的影响的方法，其包括以下步骤：a)使根据权利要求7-10中任一项所述的合成活组织结构与所述测试剂和/或条件接触；和b)通过测量所述结构的尺寸变化来确定所述试剂和/或条件对所述哺乳动物肌细胞的影响。

18.根据权利要求15所述的方法，其中所述结构包括圆筒/管，且所述确定步骤包括测量所述圆筒的面积、直径和/或周长的尺寸变化。