CN103946374A - 用于体外研究用途的工程化组织、其阵列及其制备方法 - Google Patents

用于体外研究用途的工程化组织、其阵列及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN103946374A
CN103946374A CN201280055564.4A CN201280055564A CN103946374A CN 103946374 A CN103946374 A CN 103946374A CN 201280055564 A CN201280055564 A CN 201280055564A CN 103946374 A CN103946374 A CN 103946374A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
tissue
biometric print
construction body
tissue construction
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201280055564.4A
Other languages
English (en)
Inventor
基思·墨菲
奇拉格·卡蒂瓦拉
斯科特·多尔夫曼
本杰明·谢佛德
莎伦·普雷斯内尔
贾斯汀·罗宾斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Organovo Inc
Original Assignee
Organovo Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Organovo Inc filed Critical Organovo Inc
Priority to CN201810506160.1A priority Critical patent/CN108619572A/zh
Publication of CN103946374A publication Critical patent/CN103946374A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5082—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms
    • G01N33/5088—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms of vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/28—Materials for coating prostheses
    • A61L27/34—Macromolecular materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3886—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells comprising two or more cell types
    • A61L27/3891—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells comprising two or more cell types as distinct cell layers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/069—Vascular Endothelial cells
    • C12N5/0691—Vascular smooth muscle cells; 3D culture thereof, e.g. models of blood vessels
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0697—Artificial constructs associating cells of different lineages, e.g. tissue equivalents
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5082—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/27—Lung cells, respiratory tract cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/28—Vascular endothelial cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2513/00—3D culture

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了用于体外科学和医学研究的活的三维组织构建体、其阵列及制备所述组织和阵列的方法。

Description

用于体外研究用途的工程化组织、其阵列及其制备方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2011年9月12日提交的美国申请序列号61/533,757、2011年9月12日提交的美国申请序列号61/533,753和2011年9月12日提交的美国申请序列号61/533,761的权益，所有这些申请通过引用以其整体并入本文中。
背景技术
一种新的药物化合物的研发成本约为18亿美元。参见Paul等(2010).How to improve R&D productivity:the pharmaceutical industry'sgrand challenge，Nature Reviews Drug Discovery9(3)：203-214。药物发现是发现和/或设计药物的过程。药物发现的过程通常至少包括以下步骤：确认候选物、合成、表征、筛选和分析治疗效果。虽然在技术上和对生物系统的了解上具有进展，但药物发现仍旧是一个冗长、昂贵且低效的过程，且新治疗剂发现率较低。
发明内容
存在对如下材料、工具和技术的需求：其大幅增加创新的、具有成本效益的新药物的数量和质量，而不会导致不可承受的研发成本。因此，本发明人在本文中描述了工程化的哺乳动物组织和血管壁节段、其阵列及其制备方法，其在组织和器官工程、体外分析、药物发现及其它领域是有用的。
在一个方面，本文中公开了活的三维组织构建体，其包含：至少一种粘附细胞类型，该至少一种粘附细胞类型凝聚并融合以形成活的三维组织构建体，该三维组织构建体具有不是血管的多层结构，该组织构建体用于体外使用，条件是该组织构建体的至少一个部分是生物打印的。在一些实施方案中，在生物打印时或者在使用时，该组织构建体基本上不含任何预形成的支架(scaffold)。在一些实施方案中，该组织构建体包含至少一个包括多种细胞类型的层，该细胞类型相对于彼此空间排列，以构建平面几何形状。在一些实施方案中，该组织构建体包含多个层，至少一个层在组成上或结构上与至少一个其它层不同，以构建层状几何形状。在一些实施方案中，该组织构建体进一步包含非粘附细胞类型。在一些实施方案中，该组织构建体被固定到生物相容性表面。在进一步的实施方案中，该生物相容性表面为多孔膜。在进一步的实施方案中，该生物相容性表面用如下物质中的一种或多种包被：生物相容性水凝胶、蛋白质、化学品、肽、抗体或生长因子。在更进一步的实施方案中，该组织构建体在一个或多个侧面经受由流体流动引起的剪切力。在一些实施方案中，在生物打印时，该组织构建体在其最小维度上为至少约25μm。在一些实施方案中，在生物打印时，该组织构建体在其最大维度上不大于约3cm。在一些实施方案中，该组织构建体用于体外分析。在进一步的实施方案中，该组织构建体用于药物测试。在一些实施方案中，该粘附细胞为分化的细胞。在其它实施方案中，该粘附细胞为未分化的细胞。在一些实施方案中，该粘附细胞来源于选自下组的组织：肝脏、胃肠、胰腺、肾、肺、气管、血管、骨骼肌、心脏、皮肤、平滑肌、结缔组织、角膜、泌尿生殖系统、乳腺、生殖、内皮、上皮、成纤维细胞、神经、施万(Schwann)、脂肪、骨、骨髓、软骨、周细胞、间皮、内分泌、间质、淋巴、血液、内胚层、外胚层和中胚层。在一些实施方案中，该组织构建体为血管壁节段。
在另一方面，本文中公开了活的三维组织构建体的阵列，每个组织构建体包含：至少一种粘附细胞类型，该至少一种粘附细胞类型凝聚并融合以形成活的三维组织构建体，每个组织构建体具有多层结构，每个组织构建体用于体外使用，条件是每个组织构建体的至少一个部分是生物打印的。在一些实施方案中，在生物打印时或者在使用时，每个组织构建体基本上不含任何预形成的支架。在一些实施方案中，该粘附细胞选自：肝细胞、胃肠细胞、胰腺细胞、肾细胞、肺细胞、气管细胞、血管细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、皮肤细胞、平滑肌细胞、结缔组织细胞、角膜细胞、泌尿生殖细胞、乳腺细胞、生殖细胞、内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、神经细胞、施万细胞、脂肪细胞、骨细胞、骨髓细胞、软骨细胞、周细胞、间皮细胞、来源于内分泌组织的细胞、间质细胞、干细胞、祖细胞、淋巴细胞、血细胞、内胚层来源的细胞、外胚层来源的细胞、中胚层来源的细胞及其组合。在一些实施方案中，该阵列中的每个组织构建体基本相似。在其它实施方案中，该阵列中的一个或多个组织构建体是独特的。在一些实施方案中，该阵列中的一个或多个个体组织代表选自下组的人体组织：血或淋巴管、肌肉、子宫、神经、粘膜、间皮、网膜、角膜、皮肤、肝、肾、心脏、气管、肺、骨、骨髓、脂肪、结缔组织、膀胱、乳腺、胰腺、脾、脑、食管、胃、肠、结肠、直肠、卵巢、前列腺、内分泌组织、内胚层、中胚层和外胚层。在一些实施方案中，每个组织构建体存在于生物相容性多孔容器的孔中。在进一步的实施方案中，该孔用如下物质中的一种或多种包被：生物相容性水凝胶、蛋白质、化学品、肽、抗体或生长因子。在进一步的实施方案中，将每个组织构建体放置在容器的孔内的多孔生物相容性膜上。在进一步的实施方案中，该容器与自动或半自动的药物筛选过程相匹配。在一些实施方案中，每个组织构建体被固定到生物相容性表面。在进一步的实施方案中，该生物相容性表面为多孔膜。在进一步的实施方案中，该生物相容性表面用如下物质中的一种或多种包被：生物相容性水凝胶、蛋白质、化学品、肽、抗体或生长因子。在更进一步的实施方案中，每个组织构建体在一个或多个侧面经受由流体流动引起的剪切力。在一些实施方案中，该阵列中的每个组织构建体被独立地培养维持。在其它实施方案中，该阵列中的两个或更多个个体组织构建体交换可溶性因子。在一些实施方案中，该阵列用于体外分析。在进一步的实施方案中，该阵列用于药物测试。在一些实施方案中，该阵列中的至少一个组织是血管壁节段。
在另一个方面，本文中公开了活的三维组织构建体，该三维组织构建体包含：一个或多个层，其中每个层含有一种或多种细胞类型，该一个或多个层凝聚以形成活的三维组织构建体，该组织构建体的特征在于具有如下的至少一种：至少一个包含多种细胞类型的层，该细胞类型相对于彼此空间排列，以构建平面几何形状；和多个层，至少一个层在组成上或结构上与至少一个其它层不同，以构建层状几何形状。在一些实施方案中，该组织构建体的至少一个部分是生物打印的。在进一步的实施方案中，在生物打印时或者在使用时，该组织构建体基本上不含任何预形成的支架。在一些实施方案中，该组织构建体用于体外分析。在进一步的实施方案中，该组织构建体用于药物测试。
在另一个方面，本文中公开了用于构建活的三维组织构建体的方法，该方法包括如下步骤：将包含至少一种粘附细胞类型的生物墨水生物打印到形式(form)中或形式上；将生物墨水融合成活的三维组织构建体；条件是该组织构建体用于体外使用，并且不是血管。在一些实施方案中，在生物打印时或者在使用时，该组织构建体不含任何预形成的支架。在一些实施方案中，该形式是生物打印的。在进一步的实施方案中，该形式与生物墨水基本上同时被生物打印。在一些实施方案中，该方法进一步包括溶解该形式的步骤。
在另一个方面，本文中公开了用于构建活的三维组织构建体的方法，该方法包括如下步骤：制备一个或多个包含哺乳动物细胞的凝聚的多细胞聚集体；将所述一个或多个凝聚的多细胞聚集体放置在载体上，以形成如下的至少一种：至少一个包含多种细胞类型的层，该细胞类型相对于彼此空间排列，以构建平面几何形状；和多个层，至少一个层在组成上或结构上与至少一个其它层不同，以构建层状几何形状；并孵育所述一个或多个多细胞聚集体，以使其凝聚并形成活的三维组织构建体。在一些实施方案中，该组织构建体的至少一个部分是生物打印的。在进一步的实施方案中，在生物打印时或者在使用时，该组织构建体不含任何预形成的支架。
在另一个方面，本文中公开了用于构建活的三维组织构建体的阵列的方法，该方法包括如下步骤：制备包含哺乳动物细胞的凝聚的多细胞聚集体；将所述凝聚的多细胞聚集体放置在生物相容性载体上；其中所述集合体以适合于组织阵列的形式空间排列；并孵育所述多细胞聚集体，以使所述多细胞聚集体凝聚并形成活的三维组织构建体的阵列。在一些实施方案中，每个组织构建体的至少一个部分是生物打印的。在进一步的实施方案中，在生物打印时或者在使用时，每个组织构建体基本上不含任何预形成的支架。
附图说明
在所附权利要求书中详细阐明了本发明的新特征。通过参考以下阐明了说明性实施方案的发明详述(其中利用了本发明的原理)和附图，将获得对本发明特征和优点的更好理解，附图中：
图1描述了由圆柱形式的多型SMC:EC生物墨水构建的生物打印血管壁节段的非限制性实施例。示出了各种染色条件，以指示细胞类型的分布和位置。
图2a为描绘采用85:15比例的HASMC:HAEC的多型生物墨水圆柱体构建的生物打印血管壁节段的非限制性实施例的宏观图像。
图2b描述了采用85:15比例的HASMC:HAEC组成的生物墨水构建的生物打印血管壁节段的非限制性实施例。HAEC针对CD31染色。
图3描绘了生物打印的血管壁节段的非限制性实例，该生物打印的血管壁节段采用单SMC生物墨水圆柱体，随后生物打印由EC浓缩物组成的第二层而构建，从而创建层状结构。示出了各种染色条件，以指示细胞类型的分布和位置。
图4a描绘了生物打印的血管壁节段的非限制性实例，该生物打印的血管壁节段通过将HASMC生物打印在第一层人类皮肤成纤维细胞(HDFa)上方且随后层叠HAEC而构建，从而创建三层层状结构。HASMC针对α-SMA染色。
图4b为描绘了如下的HASMC生物墨水的非限制性实例的宏观图像：该墨水被生物打印在共打印的NovoGelTM控制窗口中，并层叠HAEC，但在顶部没有NovoGelTM网格(例如，网)的第三层。
图5为生物打印的细胞片和暂时的或可移除的生物打印的限制网格结构的非限制性实例；还描绘了制造它的示例性步骤。
图6为描绘了工程化肝组织的非限制性实例的宏观图像，在这种情况下，是使用由包封在水溶性挤出化合物(例如，PF-127)中的多个肝脏细胞类型组成的生物墨水、并利用连续沉积机理生物打印的多层肝组织。(A)显示了单个功能单元的示意图，突出了通过图案化生物墨水和负空间(negative space)构建的平面几何图形；(B)棋盘格状(tessellated)生物打印的功能单元；(C)和(D)显示了在施加培养基和溶出挤出化合物之后的构建体；记录该平面几何图形随着时间的保持度。
图7是H&E染色的图6的棋盘格状构建体的显微照片，描绘了在棋盘格状构建体中的示例性"轮辐(spoke)"。
图8为具有层状几何形状的生物打印的新组织的非限制性示意图(A)、宏观图片(B)和系列显微照片(C-E)。
图9为一系列显微照片(A-D)，描绘了在生物打印的组织中的细胞图案化和层化。
图10为具有层状几何形状的生物打印的人体肺部组织构建体的非限制性示意图，描绘了制造步骤(A-D)。
图11为描绘了生物打印的人肺部组织的表征的系列显微照片(A-H)。
图12为两张宏观照片，描绘了在生物打印之后立即的(A)和在培养基中孵育24小时之后的(B)生物打印的血管壁节段。
图13为一系列显微照片(A-F)，描绘了在静态和流动条件下对生物打印在多孔细胞培养插入物上的、具有层状几何形状的多层血管壁节段进行的分析。
图14为描绘了生物打印在多孔板(A)中或多孔细胞培养插入物(B)内的组织的两张非限制性宏观照片。
图15为描绘了用TGF-β1刺激生物打印的多层血管壁节段的两张非限制性显微照片。
图16为描绘了用TGF-β1刺激含有肝星形细胞的生物打印的肝组织的系列显微照片(A-H)。
图17为描绘了共成型的功能肝组织微观结构的两张宏观照片，该微观结构是通过连续沉积生物打印图案化的PF-127的6-层六边形、将细胞浆料生物打印到每个三角形内(A)、之后溶出PF-127边界(B)而形成的。
图18为平面(A-C)和层状(D-E)几何形状的系列非限制性实例，包括与本文中描述的构建方法相匹配的它们的组合(F)，并且再现天然组织结构和生物学的结构或空间元素。
发明详述
本发明涉及再生医学和组织和/或器官工程的领域。更具体地说，本发明涉及工程化哺乳动物组织的阵列、工程化血管壁节段、其阵列及其制造方法。
在某些实施方案中，本文中公开了活的三维组织构建体，该三维组织构建体包含：至少一种粘附细胞类型，该至少一种粘附细胞类型凝聚并融合以形成活的三维组织构建体，该三维组织构建体具有不是血管的多层结构，该组织构建体用于体外使用，条件是该组织构建体的至少一个部分是生物打印的。
在某些实施方案中，本文中还公开了活的三维组织构建体的阵列，每个组织构建体包含：至少一种粘附细胞类型，该至少一种粘附细胞类型凝聚并融合以形成活的三维组织构建体，每个组织构建体具有多层结构，每个组织构建体用于体外使用，条件是每个组织构建体的至少一个部分是生物打印的。
在某些实施方案中，本文中还公开了活的三维组织构建体，该三维组织构建体包含：一个或多个层，其中每个层含有一种或多种细胞类型，该一个或多个层凝聚以形成活的三维组织构建体，该组织构建体的特征在于具有如下的至少一种：至少一个包含多种细胞类型的层，该细胞类型相对于彼此空间排列，以构建平面几何形状；和多个层，至少一个层在组成上或结构上与至少一个其它层不同，以构建层状几何形状。
在某些实施方案中，本文中还公开了用于构建活的三维组织构建体的方法，该方法包括如下步骤：将包含至少一种粘附细胞类型的生物墨水生物打印到形式中或形式上；以及将生物墨水融合成活的三维组织构建体；条件是该组织构建体用于体外使用，并且不是血管。
在某些实施方案中，本文中还公开了用于构建活的三维组织构建体的方法，该方法包括如下步骤：制备一个或多个包含哺乳动物细胞的凝聚的多细胞聚集体；将所述一个或多个凝聚的多细胞聚集体放置在载体上，以形成如下的至少一种：至少一个包含多种细胞类型的层，该细胞类型相对于彼此空间排列，以构建平面几何形状；和多个层，至少一个层在组成上或结构上与至少一个其它层不同，以构建层状几何形状；并孵育所述一个或多个多细胞聚集体，以使所述多细胞聚集体凝聚，并形成活的三维组织构建体。
在某些实施方案中，本文中还公开了用于构建活的三维组织构建体的阵列的方法，该方法包括如下步骤：制备包含哺乳动物细胞的凝聚的多细胞聚集体；将所述凝聚的多细胞聚集体放置在生物相容性载体上；其中所述集合体以适合于组织阵列的形式空间排列；并孵育所述多细胞聚集体，以使所述多细胞聚集体凝聚，并形成活的三维组织构建体的阵列。
某些定义
除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。
如在本说明书和所附权利要求书中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数的指示物，除非上下文另有明确规定。因此，例如，提及“一种核酸”包括一种或多种核酸，和/或本领域技术人员在阅读本公开内容等之后将会明白的、本文所述的类型的组合物。本文中任何提及的“或”意在包括“和/或”，除非另有说明。
如本文中使用的，“阵列”是指科学工具，包括多个空间排列的元件的关联(association)，以允许在一个样品上进行多个试验、在多个样品上进行一个或多个试验或两者。
如本文中使用的，“分析(assay)”是指：测试或测量物质(例如化学品、分子、生物化学品、蛋白质、激素或药物等)在有机或生物样品(例如细胞聚集体、组织、器官、有机体等)中的存在或活性的程序。
如本文中使用的，“生物相容性的(biocompatible)”是指对细胞造成伤害或毒性的风险有限。如在说明书和权利要求书中所呈现的，“生物相容性多孔容器”和“生物相容性膜”对哺乳动物细胞造成伤害或毒性的风险有限，但该定义并未延伸到隐含了这些生物相容性元件可以被植入到哺乳动物体内。
如本文中使用的，“生物打印”是指：经由与自动的或半自动的、计算机辅助的三维原型装置(例如生物打印机)相匹配的方法，利用细胞(例如细胞溶液、含细胞的凝胶、细胞悬浮液、细胞浓缩物、多细胞聚集体、多细胞体等)的三维精确沉积。
如本文中使用的，“血管”意指具有包含平滑肌细胞的壁和内衬于管腔的内皮细胞的单个简单或分支的管状结构，并具有大于100μm的内径，且不作为三维组织构建体(其包括非血管组织)的一个部分存在。
如本文中使用的，“凝聚(cohere)”、“凝聚的(cohered)”和“凝聚(cohesion)”指将细胞、细胞聚集体、多细胞聚集体、多细胞体和/或它们的层结合起来的细胞-细胞粘附性质。该术语可以与“融合(fuse)”、“融合的(fused)”和“融合(fusion)”互换使用。
如本文中使用的，“层状”是指多层的、生物打印的组织，其中两个或多个平面层组合起来以增加该组织在z平面的总厚度。在一些实施方案中，每个平面层在结构和/或组成上基本类似。在其它实施方案中，每个平面层在结构和/或组成上是基本上独特的。例如参见图18A-F。
如本文中使用的，“多层的”是指由两个或多个组织层组成，其中每个组织层是一个或多个细胞层的厚度。在一些实施方案中，组织层一次沉积一个。在其它实施方案中，同时沉积多个层。任选地，每个层是由多种细胞类型组成的。进一步地，在每个层中的多种细胞类型任选地在x-y平面(即：水平平面)上以空间限定的结构相对于彼此排列。此外，在某些情况下，在z-平面(即：垂直平面)上的层增加导致细胞在层内相对于彼此的受控空间定位，使得空间限定的结构在z-平面上继续。
如本文中使用的，“平面的”是指生物打印的多细胞组织的层，其中在该组织层的x-y平面内，多个生物墨水组合物和/或空隙空间相对于彼此空间布置成设定的图案。例如参见图18A-F。
如本文中使用的，“支架”是指：合成的支架，例如聚合物支架和多孔水凝胶；非合成的支架，例如预形成的细胞外基质层、死细胞层和脱细胞的组织，以及任何其它类型的预形成支架，它对于工程化组织和/或器官的物理结构而言是必要的，并且不能在不损坏/破坏所述组织和/或器官的情况下从该组织和/或器官除去。在进一步的实施方案中，脱细胞的组织支架包括脱细胞的天然组织或以任意方式由培养的细胞产生的脱细胞的细胞材料；例如，使之死亡或者脱细胞的细胞层，留下它们在活着时产生的ECM。因此，术语“无支架(scaffoldless)”意在隐含了：在使用时，支架不是工程化组织的必要部分，或者已经被除去或者保留作为工程化组织的惰性部分。“无支架(Scaffoldless)”可以与“不含支架(scaffold-free)”和“不含预形成的支架”互换使用。
如本文中使用的，“受试者”是指为人、非人的动物、任意哺乳动物或任意脊椎动物的任意个体。该术语可以与“患者”、“受体”和“供体”互换。
如本文中使用的，“组织”是指细胞的聚集体。组织的实例包括但不限于：结缔组织(例如，网形结缔组织、致密结缔组织、弹性组织、网状结缔组织和脂肪组织)、肌肉组织(例如，骨骼肌、平滑肌和心肌)、泌尿生殖组织、胃肠组织、肺组织、骨组织、神经组织和上皮组织(例如，单层上皮和复层上皮)、内胚层来源的组织、中胚层来源的组织和外胚层来源的组织。
组织工程
组织工程是跨学科的领域，其应用并结合了工程学和生命科学的原理，指向生物替代品的发展，该生物替代品通过器官或组织的增大(augmentation)、修复或更换来恢复、保持或改善组织功能。经典组织工程学的基本方法是将活细胞接种到生物相容且最终可生物降解的环境中(例如支架)，随后在生物反应器中培养该构建体，以便初始细胞群进一步扩充和成熟，以在植入后生成目标组织。采用模拟该生物细胞外基质(ECM)的适当支架，发育中的组织在一些情况下在体外和体内成熟之后采取了所需器官的形态和功能。然而，由于控制细胞在整个支架上的分布和空间布置的能力有限，达到足够高的细胞密度并具有类似于天然组织的结构是具有挑战性的。这些限制经常导致组织或器官具有较差的机械性能和/或不足的功能。在支架的生物降解性、残留聚合物的夹杂和制造工艺的工业规模化方面，存在额外的挑战。已经尝试了无支架的方法。目前的无支架方法受到一些限制：
·复杂的平面和/或层状几何形状，例如多层结构，其中一个或多个层在组成上或结构上与其它层不同，或者其中一个或多个层在相对于彼此空间限定的位置中包含多种细胞类型，通常需要将细胞类型在特定的结构中进行明确的高分辨率的放置，以再现性地获得类似天然组织的结果。
·规模和/或几何形状受到扩散和/或营养供给需要功能血管网络的限制。
·在一些情况下，组织的存活力受到限制材料的损害，该限制材料限制了扩散并限制细胞获得营养物。
在某些实施方案中，本文中公开了工程化的哺乳动物组织、工程化的血管壁节段、其阵列以及制造方法。本文中公开的组织工程方法具有以下优点：
·它们能够产生包含细胞的组织和/或器官。
·通过重新产生类似于天然组织的细胞间相互作用，它们模拟在天然组织的发育、稳态和/或发病中发现的环境条件。
·它们任选地获得活的三维组织和复合组织，其具有宽范围的复杂拓扑结构和几何形状(例如多层结构、节段、片、管、囊等)。
·它们与自动或半自动制造手段相匹配，并且是可规模化的。
生物打印使得生成微小规模组织类似物的改善方法成为可能，包括对体外分析有用的那些(参见下文)。
生物打印
在一些实施方案中，工程化组织(包括血管壁节段)及其阵列的至少一个部分是生物打印的。在进一步的实施方案中，生物打印的构建体是采用使用了快速原型技术的方法得到的，该快速原型技术是基于通过三维递送装置(例如生物打印机)将细胞和任选的限制材料向(例如由水凝胶和/或多孔膜组成的)生物相容性表面上进行三维、自动化、计算机辅助的沉积，该细胞包括细胞溶液、细胞悬浮液、包含细胞的凝胶或浆料、细胞浓缩物、多细胞体(例如圆柱体、球形体、带形体等)。如本文中使用的，在一些实施方案中，在用于指代组织和/或器官时，术语“工程化的”是指：根据计算机脚本，通过计算机辅助的装置(例如生物打印机)，将细胞、细胞溶液、细胞悬浮液、包含细胞的凝胶或浆料、细胞浓缩物、多细胞聚集体和它们的层放置以形成三维结构。在进一步的实施方案中，计算机脚本例如是一个或多个计算机程序、计算机应用或计算机模块。在更进一步的实施方案，通过细胞或多细胞体的打印后融合来形成三维组织结构，在一些情况下，这类似于早期形态发生中的自组装现象。
尽管有许多方法可以用来将细胞、多细胞聚集体和/或它们的层布置在生物相容性表面上以产生三维结构，包括手动放置，但通过自动化的、计算机辅助的机器(例如生物打印机)来放置是有利的。采用这种技术递送细胞或多细胞体的优点包括：快速、精确和可再现地放置细胞或多细胞体以产生构建体，该构建体表现出具有各种组成的细胞、多细胞聚集体和/或它们的层的计划的或预先确定的取向或图案。优点还包括确定的高细胞密度，同时使细胞破坏减至最小。
在一些实施方案中，生物打印方法是连续的和/或基本连续的。连续生物打印方法的非限制性实例是：经由连接到生物墨水储存器的分配末端(例如，注射器、毛细管等)从生物打印机分配生物墨水(例如细胞，与赋形剂或挤出化合物组合的细胞，或细胞的聚集体)。在进一步的非限制性实施方案中，连续生物打印方法是按功能单元的重复图案(pattern)分配生物墨水。在各个实施方案中，重复功能单元具有任何适宜的几何形状，包括例如：圆形、正方形、矩形、三角形、多边形和不规则的几何形状，从而产生具有通过独特生物墨水和/或间隙空间的空间图案化而获得的平面几何形状的一个或多个组织层。在进一步的实施方案中，生物打印的功能单元的一个重复图案包括一个层，相邻地生物打印(例如堆叠)多个层以形成具有层状几何形状的工程化组织或器官。在各个实施方案中，相邻地生物打印(例如堆叠)了2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个层，以形成工程化组织或器官。在进一步的实施方案中，具有层状几何形状的组织的一个或多个层也具有平面几何形状。
在一些实施方案中，生物打印的功能单元以棋盘格状图案重复。“棋盘格状图案”是没有向该平面填充重叠和空隙的图形平面。图6A显示任选地重复以产生图6B-D和图7所示的棋盘格状图案的功能单元的实例。作为非限制性的实例，连续和/或棋盘格状生物打印的优点包括提高的生物打印组织的生产率。另一个非限制性的示例性优点是不需要将生物打印机与先前沉积的生物墨水元件对准。在一些实施方案中，连续生物打印有利于从大型生物墨水储存器打印较大的组织，该打印过程中任选地使用注射器机构。连续的生物打印也是利用挤出化合物、水凝胶、聚合物、生物墨水或能够在打印后保持其形状的任何可打印材料，共打印空间限定的边界的适宜方式；其中创建的边界任选地通过生物打印一种或多种生物墨水填充，从而创建具有空间限定的平面几何形状的镶嵌组织，例如参见图17中说明的实施方案。
在一些实施方案中，连续生物打印中的方法包括：独立地或相对于彼此优化和/或平衡诸如打印高度、泵速、机扑速度或其组合的参数。在一个实例中，用于沉积的生物打印机头速度为3mm/s，第一层的分配高度为0.5mm，而后面每个层的分配高度增加0.4mm。在一些实施方案中，该分配高度与生物打印机分配末端的直径基本相等。不受限制地，适宜的和/或最佳的分配距离不会导致材料变平或附着到分配针上。在各个实施方案中，生物打印机分配末端具有约20、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000μm或更大的内径，包括其中的增量。在各个实施方案中，生物打印机的生物墨水储存器具有约0.05、0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100立方厘米或更大的容积，包括其中的增量。在一些情况下，当系统中的残余压力积累较低时，该泵速是适宜的或最佳的。在一些情况下，有利的泵速取决于储存器的横截面积与分配针之间的比例，该比例越大，则需要越低的泵速。在一些实施方案中，适宜的和/或最佳的打印速度使得能够沉积均匀的线，而不影响材料的机械完整性。
本文中公开的发明包括商业方法。在一些实施方案中，本文中公开的技术和方法的速度和可放大性用来设计、构建和操作用于生产供植入使用的工程化组织和/或器官或者用于生成基于细胞的工具(用于研究和开发，例如体外分析)的工业和/或商业设施。在进一步的实施方案中，工程化组织和/或器官及其阵列被生产、储存、分发、上市、宣传并销售，例如作为用于生物分析和高通量药物筛选的细胞阵列(例如微阵列或芯片)、组织阵列(例如微阵列或芯片)以及试剂盒。在其它实施方案中，工程化组织和/或器官及其阵列被制造并用来进行作为服务的生物分析和/或药物筛选。
工程化组织
在一些实施方案中，本文中公开了活的三维组织构建体，该三维组织构建体包含至少一种粘附细胞类型，其中该至少一种粘附细胞类型被凝聚和融合，以形成具有多层结构的组织构建体。在进一步的实施方案中，该组织构建体的至少一个部分是生物打印的。在一些实施方案中，该组织为血管壁节段(例如，参见实施例16和图12和13)。因此，在一些实施方案中，本文中公开了工程化的血管壁节段，该血管壁节段包含：平滑肌细胞；和任选的成纤维细胞和/或内皮细胞；其中这些细胞彼此凝聚；其中该血管壁节段是生物打印的，并且是非管状的。在其它的实施方案中，该组织是气道类似物(例如，参见实施例15和图10和图11)。在一些实施方案中，该气道类似物包含：肺成纤维细胞和任选的平滑肌细胞和/或内皮细胞，其中该组织的至少一个表面层叠有小的气道上皮细胞。在其它实施方案中，该组织是肝类似物(例如，参见实施例13和19以及图6A-D、图7和图17A-B)。在进一步的实施方案中，该肝组织类似物包含：肝细胞或类似肝细胞的细胞，和任选的胆管上皮细胞，和任选的非实质细胞类型，包括但不限于：星形细胞、内皮细胞、枯否细胞、免疫细胞或肌成纤维细胞。
在某些实施方案中，本文中还公开了工程化组织，该组织包含凝聚的哺乳动物细胞，并进一步包含一层或多层哺乳动物细胞，其中该组织的至少一个部分是生物打印的。在某些实施方案中，一个或多个该组织层的特征在于平面几何图形，其中多种细胞类型或生物墨水类型和/或空隙空间存在于x-y平面中的空间限定的位置中。在一些实施方案中，该组织是多层的，其中至少一个层在结构或组成上与其它层不同，赋予该组织特定的层状几何形状。在进一步的实施方案中，该层在z平面中具有相似的厚度。在更进一步的实施方案中，该层在z平面中具有可变的厚度。在进一步的实施方案中，任意的单层为一个细胞层的厚度。在一些实施方案中，该组织为血管壁节段。因此，在某些实施方案中，本文还公开了工程化的血管壁节段，该血管壁节段包含凝聚的平滑肌细胞和在一个或多个表面上的内皮细胞层、在一个或多个表面上的成纤维细胞层，或者两者均具备，其中所述血管壁节段的至少一个部分是生物打印的；并且，其中所述血管壁节段是非管状的。在其它的实施方案中，该组织为气道类似物。在一些实施方案中，该气道类似物包含：肺成纤维细胞和任选的平滑肌细胞和/或内皮细胞，其中该组织的至少一个表面层叠有小的气道上皮细胞。在其它的实施方案中，该组织为肝类似物。在进一步的实施方案中，该肝组织类似物包含：肝细胞或类似肝细胞的细胞，和任选的胆管上皮细胞，和任选的非实质细胞类型，包括但不限于：星形细胞、内皮细胞、枯否细胞、免疫细胞或肌成纤维细胞。
在一些实施方案中，工程化组织(包括血管壁节段)是生物打印的，本文中描述的方法。在进一步的实施方案中，该工程化组织的至少一个部分是生物打印的。在进一步的实施方案中，该生物打印的部分包含凝聚的平滑肌细胞。在更进一步的实施方案中，该组织的另外的部分是生物打印的。在进一步的实施方案中，另外的生物打印层包含成纤维细胞和/或内皮细胞。在进一步的实施方案中，如在本文中进一步描述的，在制造或者使用时，该组织不含任何预形成的支架。在一些实施方案中，作为通过组织工程技术(包括生物打印)制造的结果，作为机体的部分，本发明的组织进一步区别于在体内发育的组织。在一些实施方案中，单层的工程化组织由间质组织组成，包含多种细胞类型，例如成纤维细胞、平滑肌细胞、肌成纤维细胞、周细胞和内皮细胞。在进一步的实施方案中，该间质组织被层叠在包含普通的或组织-特殊的内皮或上皮细胞的第二组织类型的一个或多个表面上。在更进一步的实施方案中，第二组织层是连续的，并作为分子到支撑的间质组织层的通道的阻碍。
在一些实施方案中，工程化组织(包括血管壁节段)包括任何类型的哺乳动物细胞。在各个进一步的实施方案中，该组织(包括血管壁节段)包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多种细胞类型。在一些实施方案中，该组织仅包括平滑肌细胞。在一些实施方案中，该组织包括平滑肌细胞和内皮细胞。实施例3表明由人类主动脉的平滑肌细胞和人类主动脉的内皮细胞组成的多型圆柱形生物墨水的制造，而实施例4表明该圆柱体的生物打印和融合，以形成血管壁节段(例如，参见图1、图2a和图2b)。实施例7表明：由从人类脂肪抽提物的基质血管组分培养的平滑肌细胞和内皮细胞组成的多型圆柱形生物墨水的制造，而实施例8表明该圆柱体的生物打印和融合，以形成血管壁节段。在其它实施方案中，该组织包括平滑肌细胞和成纤维细胞。在另外的其它实施方案中，该组织包括平滑肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞。实施例5表明由人类主动脉平滑肌细胞、人类皮肤成纤维细胞和人类主动脉内皮细胞组成的多型圆柱形生物墨水的制造，而实施例6表明该圆柱体的生物打印和融合，以形成血管壁节段。在一些实施方案中，工程化组织(包括血管壁节段)的细胞被“凝聚”或彼此“粘附”。在进一步的实施方案中，“凝聚”和“粘附”指将细胞、多细胞聚集体、多细胞体和/或它们的层结合的细胞-细胞粘附性质。
在一些实施方案中，工程化组织(包括血管壁节段)包括在一个或多个表面上的一个或多个细胞层。在进一步的实施方案中，一个或多个细胞层位于该凝聚的平滑肌细胞的一个或多个表面上。在进一步的各个实施方案中，在该凝聚的平滑肌细胞的一个或多个表面上，存在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个细胞层。在更进一步的各个实施方案中，在凝聚的平滑肌细胞的1、2、3、4或更多个表面上，存在至少一个细胞层，从而构建在该工程化组织中的层状几何形状。在进一步的实施方案中，一个或多个该层的特征在于具有平面几何形状。在更进一步的实施方案中，该工程化组织的多个层具有平面几何形状；其中该平面几何形状在层间是可变的，或者是相同的。在更进一步的实施方案中，在制造过程中将单层中的平面几何形状(x-y平面)定位，以便在该复合组织的z-平面中创建另外的几何形状(例如，参见图18D-F代表的实施方案)。
在一些实施方案中，组织层包含单细胞层。在进一步的实施方案中，该单层是汇合的(confluent)。在其它实施方案中，该单层不是汇合的。在一些实施方案中，细胞层包含一个或多个细胞片。在各个实施方案中，细胞片为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多个细胞厚(包括其中的增量)。在其它各个实施方案中，细胞片为约3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500μm厚或更厚(包括其中的增量)。在一些实施方案中，组织层包含融合的细胞聚集体。在进一步的实施方案中，在融合之前，作为非限制性的实例，该细胞聚集体具有限定的形状和/或结构，为基本上球形的、细长的、基本上圆柱形的和类似带的形状。在各个实施方案中，融合的细胞聚集体形成大约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500μm厚或更厚(包括其中的增量)的层。
在一些实施方案中，该一个或多个层包括任何种类的哺乳动物细胞。在各个进一步的实施方案中，每个层包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多种细胞类型。在一些实施方案中，该工程化组织(包括血管壁片段)包括在一个或多个表面上的一个或多个内皮细胞层。实施例9表明血管壁节段的构建，包括：生物打印包含圆柱形平滑肌细胞生物墨水的血管中膜组织层，之后在上表面施加第二层内皮细胞，并通过直接在SMC构建体上生物打印细胞浓缩物以形成层状几何形状而获得，其重现了该血管壁的中膜和内膜。实施例10表明血管壁节段的构建，包括：生物打印包含人类主动脉平滑肌细胞的圆柱形生物墨水，之后在上表面施加内皮细胞层，通过特定定位的内皮细胞液滴在SMC构建体上沉积而获得。在一些实施方案中，该工程化组织(包括血管壁节段)包括在一个或多个表面上的一个或多个成纤维细胞层。
在一些实施方案中，工程化组织(包括血管壁片段)包括在一个或多个表面上的一个或多个内皮细胞层和在一个或多个表面上的一个或多个成纤维细胞层。在进一步的实施方案中，该一个或多个内皮细胞层与一个或多个成纤维细胞层位于相同的表面上。在其它实施方案中，该一个或多个内皮细胞层与一个或多个成纤维细胞层位于不同的表面上。在进一步的实施方案中，该多层结构中的一个或多个层的特征进一步在于具有平面几何形状。
实施例11表明血管壁节段的构建，包括：将包含人类主动脉平滑肌细胞的圆柱形生物墨水直接生物打印到第一层成纤维细胞上，之后在上表面施加包含内皮细胞的第三层，从而创建三层的层状几何形状，其中每个层在组成上是不同的，并且具有可变的厚度和结构(例如参见图12)。通过将内皮细胞悬浮液的特定定位液滴沉积在该构建体上，来施加该内皮细胞层。实施例11的方法导致形成三层的组织，其包含凝聚的平滑肌细胞、在该平滑肌细胞一个表面上的成纤维细胞层和在该平滑肌细胞相对的表面上的成纤维细胞层。每个层中的细胞彼此凝聚，并且位于层间界面的细胞也凝聚，从而通过细胞相互作用将各个层粘合在一起(例如，参见图4a和4b)。
在各个实施方案中，该工程化组织(包括血管壁节段)为任意合适的尺寸。在一些实施方案中，生物打印的组织(包括血管壁节段)的尺寸随时间而改变。在进一步的实施方案中，由于例如细胞迁移、细胞死亡、细胞间的相互作用、压缩或其它形式的收缩，导致在生物打印后生物打印的组织收缩或缩小。在其它实施方案中，在生物打印后，由于例如细胞迁移、细胞生长和繁殖、天然组织的细胞外基质或其它产生细胞的部分的产生、细胞/组织的成熟或其它形式的扩展，导致在生物打印后生物打印的组织成长或扩展。
在一些实施方案中，该工程化组织(包括血管壁节段)的物理尺寸受到营养物质(包括氧)扩散到该构建体内部的能力的限制。在各个实施方案中，在生物打印时，该工程化组织(包括血管壁节段)在其最小维度上为至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000μm。在各个实施方案中，在生物打印时，该工程化组织(包括血管壁节段)在其最小维度上为至少约0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75、2.0、2.25、2.5、2.75、3.0、3.25、3.5、3.75、4.0、4.25、4.5、4.75或5.0mm。在进一步的实施方案中，在生物打印时，该工程化组织(包括血管壁节段)在其最小维度上为约25μm至约500μm。在其它实施方案中，在制造时，该工程化组织(包括血管壁节段)在其最大维度上小于3cm。
在各个实施方案中，该工程化组织(包括血管壁节段)为任意合适的形状。在一些实施方案中，选择形状以模拟特定的天然组织或器官。在进一步的实施方案中，选择形状以模拟特定的病理、病状或疾病状态。在一些实施方案中，该工程化组织(包括血管壁节段)具有基本上为平面的形状。在进一步的实施方案中，平面的组织具有任何适宜的平面几何形状，作为非限制性的示例，包括正方形、矩形、多边形、圆形、椭圆形或不规则形状。在一些实施方案中，在工程化组织中，通过特定细胞或生物墨水部分和/或空隙空间在x-y平面中相对于彼此的定位，来形成平面的几何形状。在一些实施方案中，该工程化组织(包括血管壁节段)具有基本上为片状或圆盘的形状。在一些实施方案中，该工程化血管壁节段具有非管状的形状，为血管壁节段、补片或片，而不是血管。
在一些实施方案中，通过适于在空间中相对于容纳容器固定该组织的位置的方式将该工程化组织(包括血管壁节段)固定在该容纳容器中。在进一步的实施方案中，该工程化组织被固定在表面上。在进一步的实施方案中，该工程化组织被固定在生物相容性表面上。在更进一步的实施方案中，如本文中描述的，通过固定在表面上和空间排布，将多个组织关联以形成阵列。在一些实施方案中，工程化组织(包括血管壁节段)在一个或多个侧面上经受由流体流动引起的剪切力(例如，参见图13)。在进一步的实施方案中，施加的剪切力用来促进组织的成熟和发育和/或促进细胞外基质的迁移、分化、增殖、沉积；或者促进蛋白质或分子进入组织内的细胞或从组织内的细胞流出的转运。
组织几何形状
天然组织的特征在于：存在由组织的细胞和细胞外(即：空隙空间、细胞外基质、蛋白质物质等)组分驱动的空间和组成图案。部署合成支架以获得三维形状的组织工程化策略的固有挑战是：不能既复制天然组织的几何形状又复制生物属性。迄今为止，在支架结构内构建类似于天然组织的层状或平面几何形状、同时也允许在模拟天然组织的密度下引入细胞的尝试，被技术局限所妨碍。通过由细胞组成的生物墨水的空间限定沉积，根据在图18A-F中说明的实例，生物打印克服了这两个固有挑战(平面/层状几何形状和细胞密度)。在一些实施方案中，平面几何形状是从多生物墨水制剂创建的，从而根据在图18A-C中阐明的实例，以将每个组织部分/细胞群/生物墨水制剂在x、y和/或z平面内相对于彼此受限的位置中放置的方法，来制造两个或更多个组织部分(即：间质的、上皮的、血管的、骨骼、软骨、实质的、皮层的、骨髓的、乳头的、小叶的(lobular)等等)。在一些实施方案中，通过生物打印来形成该平面几何形状。在一些实施方案中，该平面几何形状重现了腺组织、癌组织、组织界面(骨：例如软骨)、血管化组织、椎体组织、带状组织或分叶状组织中的至少一个空间元件。在一些实施方案中，该平面几何形状引入空隙空间。在进一步的实施方案中，在平面几何形状中的空隙空间容纳模拟体液的至少一个部分的流体，例如血液、淋巴、胆汁、尿、分泌物等。在进一步的实施方案中，该空隙空间任选地含有非粘附细胞类型或体液衍生的部分(例如，血细胞、骨髓细胞、淋巴细胞、免疫细胞、癌细胞、血小板、蛋白质等等)。在更进一步的实施方案中，体液衍生部分的非粘附细胞类型任选地作为非空隙空间部分存在，该非空隙空间部分在制造之前、期间或之后已经被引入到该平面几何形状的包含细胞的部分中。在更进一步的实施方案中，非粘附细胞部分或体液衍生部分从空隙空间补充进入平面几何形状中包含细胞的空间中，作为细胞间相互作用或对分泌因素反应的结果。
在一些实施方案中，任选地通过在几何形状内部的空隙空间来启动流体流动或灌注。在一些实施方案中，平面几何形状允许产生组织-组织或组织-液体界面，如在图18B中突出的。在进一步的实施方案中，在容器中制造该组织，该容器是光学透明的，以允许实时观察在按几何形状创建的界面处的细胞。
在一些实施方案中，组织包含多个层，其中这些层中的至少一个在结构或组成上与该构建体中的其它层不同，从而在z-平面中创建层状结构。层状结构的实例包括屏障组织，其拥有到底层间质组织的内皮或上皮屏障，如由在图18D-F中所示的实例中所描绘的。在一些实施方案中，层状组织表示管腔或管状结构(例如，肠、血管、淋巴管、肾小管、输尿管、膀胱、气管、食管、气道、输卵管、尿道、导管结构等等)。在其它实施方案中，层状组织表示组织(例如，粘膜组织、皮肤组织、肾组织、心肌组织等等)的多个带或层(例如，参见图8-11)。在进一步的实施方案中，组织的一个或多个层合并了血管或微血管部分。在更进一步的实施方案中，血管或微血管部分的合并导致在该工程化组织的一个或多个部分中形成了微血管或假血管网。在一些实施方案中，具有层状几何形状的该组织的一个或多个部分是生物打印的。在一些实施方案中，彼此邻近地制造具有层状几何形状的一个或多个组织，从而产生组织界面，例如在图18E中绘制的粘膜皮肤连接。
在一些实施方案中，根据在图18F中阐明的非限制性实例，具有层状几何形状的多层工程化组织的一个或多个层也包括平面的几何形状。在一些实施方案中，在每个层中延续同样的平面几何形状，导致形成在x、y和z平面中具有连续结构的三维组织。在一些实施方案中，根据在图18F中说明的肾小管的非限制性实例，一个或多个层状层的组成或平面几何形状是变化的，使得所产生的三维组织在x、y和z平面中均具有复杂的结构。
细胞
在一些实施方案中，本文中公开了包含一种或多种哺乳动物细胞类型的工程化组织。在一些实施方案中，本文中还公开了工程化的血管壁节段，该血管壁节段包含平滑肌细胞和任选的成纤维细胞和/或内皮细胞。在其它实施方案中，该组织为气道类似物。在一些实施方案中，该气道类似物包含：肺成纤维细胞和任选的平滑肌细胞和/或内皮细胞，其中该组织的至少一个表面层叠有小气道上皮细胞。在其它实施方案中，该组织为肝类似物。在进一步的实施方案中，该肝组织类似物包含：肝细胞或类似肝细胞的细胞，和任选的胆管上皮细胞，和任选的非实质细胞类型，包括但不限于：星形细胞、内皮细胞、枯否细胞、免疫细胞或肌成纤维细胞。
在一些实施方案中，任何哺乳动物细胞适合于包括在该工程化组织及其阵列中。在进一步的实施方案中，该工程化组织的至少一个部分是粘附细胞类型。在进一步的实施方案中，作为非限制性的实例，该哺乳动物细胞是：收缩或肌肉细胞(例如，骨骼肌细胞、心肌细胞、平滑肌细胞和成肌细胞)、结缔组织细胞(例如，骨细胞、软骨细胞、成纤维细胞以及分化为成骨细胞、软骨细胞或淋巴组织的细胞)、骨髓细胞、内皮细胞、皮肤细胞、上皮细胞、乳腺细胞、血管细胞、血细胞、淋巴细胞、神经细胞、许旺细胞、胃肠细胞、肝细胞、胰细胞、肺细胞、气管细胞、角膜细胞、泌尿生殖细胞、肾细胞、生殖细胞、脂肪细胞、实质细胞、周细胞、间皮细胞、基质细胞、未分化的细胞(如胚细胞、干细胞和祖细胞)、内胚层来源的细胞、中胚层来源的细胞、外胚层来源的细胞、癌来源的细胞和它们的组合。
在一个实施方案中，该细胞是平滑肌细胞。在另一个实施方案中，该细胞为平滑肌细胞和成纤维细胞。在又一个实施方案中，该细胞为平滑肌细胞和内皮细胞。在再一个实施方案中，该细胞是平滑肌细胞、成纤维细胞和内皮细胞。在包括超过一种细胞类型的实施方案中，所述细胞类型以多种合适的比例存在，其实例如本文所述。
在一些实施方案中，该细胞是成体的、分化的细胞。在进一步的实施方案中，“分化的细胞”是在分离时具有与例如平滑肌细胞、成纤维细胞或内皮细胞一致的组织特异性表型的细胞，其中从分离时到使用时都保持着组织特异性表型(或显示该表型的潜能)。在其它实施方案中，该细胞是成体的、未分化的细胞。在进一步的实施方案中，“未分化的细胞”是不具有或已经丧失例如平滑肌细胞、成纤维细胞或内皮细胞的明确组织特异性性状的细胞。在一些实施方案中，未分化的细胞包括干细胞。在进一步的实施方案中，“干细胞”是表现出潜能和自我更新的细胞。干细胞包括但不限于：全能干细胞、多能干细胞、多潜能细胞、寡能细胞、单能细胞和祖细胞。在各个实施方案中，干细胞是胚胎干细胞、成体干细胞、羊膜干细胞和诱导性多能干细胞。在另外其它的实施方案中，该细胞是成体的分化细胞与成体的未分化细胞的混合物。
在一些实施方案中，该平滑肌细胞是人类平滑肌细胞。在一些实施方案中，作为非限制性的实例，合适的平滑肌细胞来源于包括以下组织的组织：血管、淋巴管、消化道的组织、泌尿生殖道的组织、脂肪组织、呼吸道的组织、生殖系统的组织、骨髓和脐带组织。在一些实施方案中，该内皮细胞为人类内皮细胞。在一些实施方案中，作为非限制性的实例，适宜的内皮细胞来源于包括以下的组织：血液、血管、淋巴管、消化道的组织、泌尿生殖道的组织、脂肪组织、呼吸道的组织、生殖系统的组织、骨髓和脐带组织。在一些实施方案中，该成纤维细胞为人类成纤维细胞。在一些实施方案中，适宜的成纤维细胞为非血管的成纤维细胞。在其它实施方案中，适宜的成纤维细胞来源于血管外膜。在一些实施方案中，一些或所有的细胞来源于哺乳动物脂肪抽吸物。在进一步的实施方案中，一些或所有的细胞是由哺乳动物脂肪抽吸物的基质血管组分培养的。参见实施例1。
在各个实施方案中，基于特定的研究目的或目标来选择、配置、处理或调整细胞的细胞类型和/或来源。在一些实施方案中，选择、配置、处理或调整一种或多种特定的细胞类型，以促进对特定疾病或状况的研究。在一些实施方案中，选择、配置、处理或调整一种或多种特定的细胞类型，以促进对特定受试者的疾病或状况的研究。在一些实施方案中，一种或多种特定的细胞类型来源于两个或更多个不同的人类供体。在一些实施方案中，一种或多种特定的细胞类型来源于特定的脊椎动物受试者。在进一步的实施方案中，一种或多种特定的细胞类型来源于特定的哺乳动物受试者。在更进一步的实施方案中，一种或多种特定的细胞类型来源于特定的人类受试者。在进一步的实施方案中，一种或多种特定的细胞类型来源于具有与疾病或组织功能有关的特定表型的特定受试者。在更进一步的实施方案中，受试者特异性的细胞通过活检或组织采样的方式，从所关注的目标组织中分离出来。在进一步的实施方案中，受试者特异性的细胞在分离之后立即用来制造组织。在其它实施方案中，在用于制造三维组织之前，将受试者特异性的细胞在体外操作；其中该操作包括如下的一种或多种：扩充、分化、定向分化、增殖、暴露于蛋白质或核酸、引入遗传载体、引入遗传或非遗传的细胞示踪部分、去分化(即：生成诱导多能干细胞或等效物)、冷冻保存。在一些实施方案中，从不同于目标组织的组织来分离受试者特异性的细胞。在进一步的实施方案中，该受试者特异性的细胞需要在目标组织内部分化成所关注的细胞类型。在更进一步的实施方案中，需要分化的受试者特异性的细胞在制造成三维结构之前、期间或之后分化。
培养细胞的方法
在本发明的工程化组织中使用的细胞类型以本领域已知的任何方式适当地培养。细胞和组织培养方法是本领域已知的，并且例如描述在Freshney,R.,Culture of Animal Cells:A Manual of BasicTechniques,Wiley(1987)中，为了这些信息通过引用将其内容并入本文。在Doyle,A.,Griffiths,J.B.,Newell,D.G.,(编)Cell and TissueCulture:Laboratory Procedures,Wiley(1998)中也描述了适合与本发明一起使用的普通哺乳动物细胞培养技术、细胞系和细胞培养系统，为了这些信息通过引用将其内容并入本文。
适合于培养中的哺乳动物细胞的生长条件是本领域公知的。例如参见实施例1。细胞培养基通常包括必需营养物和任选的附加成分，例如生长因子、盐、矿物质、维生素、富含血小板的血浆等，它们是任选地根据所培养的细胞类型而选择的。在一些实施方案中，选择特定的成分来加强细胞生长、分化和特异性蛋白质的分泌等。通常，标准的生长培养基包括Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)或低葡萄糖及110mg/L丙酮酸盐和谷氨酰胺，补充1-20％的胎牛血清(FBS)、牛血清或人血清、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素是适当的，如同本领域技术人员公知的各种其它标准培养基。优选地，细胞在无菌条件下、在1-21％O2和优选3-5％CO2的气氛中、在接近或达到细胞来源动物体温的温度下培养。例如，人类细胞优选在约37℃下培养。
细胞任选地与细胞分化剂一起培养，以诱导细胞沿着期望的路线分化。例如，细胞任选地与生长因子、细胞因子等一起培养。在一些实施方案中，术语“生长因子”指蛋白质、多肽或多肽的复合物，包括细胞因子，它们是由细胞产生的，并且影响其自身和/或多种相邻的或远处的其它细胞。一般而言，生长因子或者发育性地或者响应于众多生理学或环境刺激影响特定类型的细胞的生长和/或分化。一些但不是全部生长因子是激素。示例性的生长因子是胰岛素、胰岛素样生长因子(IGF)、神经生长因子(NGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、角质形成细胞生长因子(KGF)、成纤维细胞生长因子(FGFs，包括碱性FGF(bFGF))、血小板衍生生长因子(PDGFs，包括PDGF-AA和PDGF-AB)、肝细胞生长因子(HGF)、转化生长因子α(TGF-α)、转化生长因子β(TGF-β，包括TGFβ1和TGFβ3)、表皮生长因子(EGF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、白细胞介素-6(IL-6)、IL-8等。除了其它地方外，在Molecular Cell Biology,Scientific American Books,Darnell等人编,1986；Principles of Tissue Engineering,第二版,Lanza等人编,Academic Press,2000中讨论了生长因子。本领域技术人员将会理解：在本文描述的条件培养基中的任何及所有培养物衍生的生长因子都在本发明的范围内。
生物墨水和多细胞聚集体
在某些实施方案中，本文中公开了包含生物打印的细胞的三维活组织(包括血管壁节段)、其阵列和方法。在一些实施方案中，通过从生物打印机沉积或挤出生物墨水来生物打印细胞。在一些实施方案中，“生物墨水”包括包含多个细胞的液体、半固体或固体组合物。在一些实施方案中，生物墨水包含液体或半固体的细胞溶液、细胞悬浮液或细胞浓缩物。在进一步的实施方案中，细胞溶液、悬浮液或浓缩物包含液体或半固体(例如粘性的)载体和多个细胞。在更进一步的实施方案中，该载体是合适的细胞营养培养基，例如本文中描述的那些。在一些实施方案中，在生物打印之前，生物墨水包含多个细胞，这些细胞任选地凝聚成多细胞聚集体。在进一步的实施方案中，生物墨水包含多个细胞，并被生物打印以产生特定的平面和/或层状几何形状；其中在生物打印之前、期间和/或之后，生物墨水中的个体细胞发生凝聚。在一些实施方案中，该生物墨水是通过如下方法产生的：1)在固定的体积中收集多个细胞；其中细胞组分占总体积的至少约30％且至多100％。在一些实施方案中，生物墨水包含半固体或固体的多细胞聚集体或多细胞体。在进一步的实施方案中，通过如下步骤产生生物墨水：1)以预先确定的比例，将多个细胞或细胞聚集体与生物相容性液体或凝胶混合，以形成生物墨水；和2)使该生物墨水致密化，以产生具有期望的细胞密度和粘度的生物墨水。在一些实施方案中，通过离心作用、切向流过滤(“TFF”)或其组合来实现生物墨水的致密化。在一些实施方案中，生物墨水的致密化产生了可挤出的组合物，从而允许形成多细胞聚集体或多细胞体。在一些实施方案中，“可挤出的”是指能够通过被迫(例如在压力下)穿过喷嘴或孔口(例如，一个或多个洞或管)而成形。在一些实施方案中，生物墨水的致密化是由细胞生长到合适的密度而引起的。该生物墨水所需的细胞密度会随着所使用的细胞和要产生的组织或器官而改变。在一些实施方案中，该生物墨水的细胞是凝聚和/或粘附的。在一些实施方案中，“凝聚(cohere)”、“凝聚的(cohered)”和“凝聚(cohesion)”指将细胞、多细胞聚集体、多细胞体和/或它们的层结合起来的细胞-细胞粘附性质。在一些实施方案中，该术语可以与“融合(fuse)”、“融合的(fused)”和“融合(fusion)”互换使用。在一些实施方案中，该生物墨水另外包含支持材料、细胞培养基(或其补充物)、细胞外基质(或其组分)、细胞粘着剂、细胞死亡抑制剂、抗凋亡剂、抗氧化剂、挤出化合物和它们的组合。
在各个实施方案中，该细胞是任何合适的细胞。在进一步的各个实施方案中，该细胞是脊椎动物细胞、哺乳动物细胞、人类细胞或它们的组合。在一些实施方案中，在本文公开的方法中使用的细胞类型取决于要产生的构建体或组织的类型。在一些实施方案中，该生物墨水包含一种类型的细胞(也被称为“均质”或“单型”生物墨水)。在一些实施方案中，该生物墨水包含超过一种类型的细胞(也被称为“异质”或“多型”生物墨水)。
细胞培养基
在一些实施方案中，该生物墨水包含细胞培养基。该细胞培养基是任何合适的培养基。在各个实施方案中，作为非限制性的实例，合适的细胞培养基包括：Dulbecco磷酸盐缓冲盐水、Earle平衡盐、Hanks平衡盐、Tyrode盐、Alsever溶液、Gey平衡盐溶液、Kreb's-Henseleit改良缓冲系、Kreb's-Ringer碳酸氢盐缓冲系、Puck盐水、Dulbecco改良Eagle培养基、Dulbecco改良Eagle培养基/营养F-12Ham、营养混合物F-10Ham(Ham's F-10)、培养基199、基本必需培养基Eagle、RPMI-1640培养基、Ames培养基、BGJb培养基(Fitton-Jackson改良)、Click培养基、CMRL-1066培养基、Fischer培养基、Glascow基本必需培养基(GMEM)、Iscove改良Dulbecco培养基(IMDM)、L-15培养基(Leibovitz)、McCoy5A改良培养基、NCTC培养基、Swim S-77培养基、Waymouth培养基、William培养基E或它们的组合。在一些实施方案中，该细胞培养基得到改良或补充。在一些实施方案中，该细胞培养基进一步包含白蛋白、硒、转铁蛋白、胎球蛋白、糖、氨基酸、维生素、生长因子、细胞因子、激素、抗生素、脂质、脂质载体、环糊精、富血小板血浆或它们的组合。
细胞外基质
在一些实施方案中，该生物墨水进一步包含细胞外基质或其衍生物的一种或多种组分。在一些实施方案中，“细胞外基质”包括由细胞产生并从细胞中转运到细胞外隙内的蛋白质，在细胞外隙中它们作为支持物将组织保持在一起、提供拉伸强度和/或促进细胞信号传导。细胞外基质组分的实例包括但不限于：胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、透明质酸盐、弹性蛋白和蛋白聚糖。例如，在一些实施方案中，该多细胞聚集体含有多种ECM蛋白质(例如，明胶、纤维蛋白原、纤维蛋白、胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白和蛋白聚糖)。任选地将ECM组分或ECM组分的衍生物加入到用于形成多细胞聚集体的细胞浆料中。加入到细胞浆料中的ECM组分或ECM组分的衍生物任选地从人类或动物源纯化，或者通过本领域已知的重组方法产生。或者，该ECM组分或ECM组分的衍生物是由细长细胞体内的细胞自然分泌的，或者用于形成该细长细胞体的细胞任选地通过任何本领域已知的合适方法进行遗传操作，以改变一种或多种ECM组分或ECM组分的衍生物和/或一种或多种细胞粘附分子或细胞-基底粘附分子(例如，选择素、整合素、免疫球蛋白和粘附素)的表达水平。在一些实施方案中，ECM组分或ECM组分的衍生物促进细胞在多细胞聚集体中的凝聚。例如，将明胶和/或纤维蛋白原适当地加入到细胞浆料中，该浆料用于形成多细胞聚集体。通过加入凝血酶将纤维蛋白原转变为纤维蛋白。
在一些实施方案中，该生物墨水进一步包含促进细胞粘附的试剂。
在一些实施方案中，该生物墨水进一步包含抑制细胞死亡(例如，坏死、凋亡或自体吞噬)的试剂。在一些实施方案中，该生物墨水进一步包含抗凋亡剂。抑制细胞死亡的试剂包括但不限于：小分子、抗体、肽、肽体或它们的组合。在一些实施方案中，抑制细胞死亡的试剂选自：抗-TNF试剂、抑制白细胞介素活性的试剂、抑制干扰素活性的试剂、抑制GCSF(粒细胞集落刺激因子)活性的试剂、抑制巨噬细胞炎性蛋白活性的试剂、抑制TGF-B(转化生长因子B)活性的试剂(例如，参见图15和16)、抑制MMP(基质金属蛋白酶)活性的试剂、抑制胱天蛋白酶活性的试剂、抑制MAPK/JNK信号级联活性的试剂、抑制Src激酶活性的试剂、抑制JAK(Janus激酶)活性的试剂或它们的组合。在一些实施方案中，该生物墨水包含抗氧化剂。在一些实施方案中，该生物墨水包含氧携带者或其它的细胞特异性营养物。
挤出化合物
在一些实施方案中，该生物墨水进一步包含挤出化合物(即，改变生物墨水的挤出性质的化合物)。挤出化合物的实例包括但不限于：凝胶、水凝胶、肽水凝胶、基于氨基酸的凝胶、表面活性剂多元醇(例如Pluronic F-127或PF-127)、热响应性聚合物、透明质酸盐、藻酸盐、细胞外基质组分(及其衍生物)、胶原、其它生物相容性天然或合成聚合物、纳米纤维和自组装的纳米纤维。在一些实施方案中，在生物打印之后，通过物理、化学或酶的方式将挤出化合物除去。
已经以各种方式定义了凝胶，有时被称作胶状物。例如，《美国药典》将凝胶定义为由小无机粒子组成的悬浮液或被液体互相渗透的大有机分子组成的半固体体系。凝胶包括单相或两相体系。单相凝胶由均匀分布在整个液体中的有机大分子组成，其分布方式使得在分散的大分子和液体之间不存在明显的边界。某些单相凝胶是由合成大分子(例如卡波姆)或由天然树胶(例如西黄蓍胶)制备的。在一些实施方案中，单相凝胶通常是水性的，但是也可以利用醇和油来制备。两相凝胶由小离散微粒的网络组成。
在某些情况下，凝胶被分类为亲水的或疏水的。在某些实施方案中，疏水凝胶的基质由液体石蜡与聚乙烯，或用胶态二氧化硅，或铝或锌皂胶凝的脂肪油组成。相反，亲水凝胶的基质一般由用合适的胶凝剂(例如，西黄蓍胶、淀粉、纤维素衍生物、羧乙烯基聚合物和硅酸镁铝)胶凝的水、甘油或丙二醇组成。在某些实施方案中，本文中公开的组合物或装置的流变学是假塑性、塑性、触变性或膨胀性的。
适宜的水凝胶包括衍生自胶原、透明质酸盐、纤维蛋白、藻酸盐、琼脂糖、壳聚糖及其组合的水凝胶。在其它实施方案中，适宜的水凝胶是合成聚合物。在进一步的实施方案中，适宜的水凝胶包括衍生自聚(丙烯酸)或其衍生物、聚(环氧乙烷)及其共聚物、聚(乙烯醇)、聚磷腈及其组合的水凝胶。在各个具体实施方案中，限制材料选自：水凝胶、NovoGelTM、琼脂糖、藻酸盐、明胶、MatrigelTM、透明质酸、泊洛沙姆、肽水凝胶、聚(异丙基正聚丙烯酰胺)、聚乙二醇二丙烯酸酯(PEG-DA)、甲基丙烯酸羟乙酯、聚二甲基硅氧烷、聚丙烯酰胺、聚(乳酸)、硅、丝或它们的组合。
在一些实施方案中，基于水凝胶的挤出化合物是热可逆凝胶(也称为热响应性凝胶或热凝胶)。在一些实施方案中，合适的热可逆水凝胶在室温下不是液体。在具体实施方案中，合适的水凝胶的胶凝温度(Tgel)为约10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃，包括其中的增量。在某些实施方案中，合适的水凝胶的Tgel为约10℃至约40℃。在进一步的实施方案中，合适的水凝胶的Tgel为约20℃至约30℃。在一些实施方案中，本文所述的生物墨水(例如，包含水凝胶、一种或多种细胞类型和其它添加剂等)在室温下不是液体。在一些实施方案中，合适的热可逆水凝胶在哺乳动物的体温下不是液体。在具体的实施方案中，合适的水凝胶的胶凝温度(Tgel)为约22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、41℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃，包括其中的增量。在某些实施方案中，合适的水凝胶的Tgel为约22℃至约52℃。在进一步的实施方案中，合适的水凝胶的Tgel为约32℃至约42℃。在一些实施方案中，本文所述的生物墨水(例如，包含水凝胶、一种或多种细胞类型和其它添加剂等)在哺乳动物的体温下不是液体。在具体的实施方案中，本文所述的生物墨水的胶凝温度(Tgel)为约10℃、约15℃、约20℃、约25℃、约30℃、约35℃、约40℃、约45℃、约50℃、约55℃，包括其中的增量。在具体实施方案中，本文所述的生物墨水的Tgel是约10℃至约15℃。在另一具体实施方案中，本文所述的生物墨水的Tgel是约15℃至约20℃。在另一具体实施方案中，本文所述的生物墨水的Tgel是约20℃至约25℃。在另一具体实施方案中，本文所述的生物墨水的Tgel是约25℃至约30℃。在另一具体实施方案中，本文所述的生物墨水的Tgel是约30℃至约35℃。在另一具体实施方案中，本文所述的生物墨水的Tgel是约35℃至约40℃。在另一具体实施方案中，本文所述的生物墨水的Tgel是约40℃至约45℃。在另一具体实施方案中，本文所述的生物墨水的Tgel是约45℃至约50℃。
当并入水溶液中时，由聚氧化丙烯和聚氧化乙烯组成的聚合物形成热可逆的凝胶。在生物打印机装置中可以保持的温度下，这些聚合物具有从液态变为凝胶态的能力。该液态至凝胶态的相变取决于聚合物的浓度和溶液中的成分。
泊洛沙姆407(Pluronic F-127或PF-127)是由聚氧化乙烯-聚氧化丙烯共聚物组成的非离子表面活性剂。其它泊洛沙姆包括188(F-68级)、237(F-87级)、338(F-108级)。泊洛沙姆的水溶液在酸、碱和金属离子的存在下是稳定的。PF-127是通式E106P70E106的可商购的聚氧化乙烯-聚氧化丙烯三嵌段共聚物，具有13000的平均摩尔质量。该聚合物任选地采用增强聚合物的胶凝性质的合适的方法进一步纯化。它含有大约70％的氧化乙烯，这解释了它的亲水性。它是泊洛沙姆ABA嵌段共聚物系列中的一种。PF-127具有良好的增溶能力、低毒性，因此被认为是合适的挤出化合物。
在一些实施方案中，通过任何所述的手段来测量本文中提出的水凝胶和生物墨水的粘度。例如，在一些实施方案中，采用LVDV-II+CP Cone Plate粘度计和Cone Spindle CPE-40来计算水凝胶和生物墨水的粘度。在其它实施方案中，采用Brookfield(轴和杯)粘度计来计算水凝胶和生物墨水的粘度。在一些实施方案中，本文中中提及的粘度范围是在室温下测量的。在其它实施方案中，本文中提及的粘度范围是在体温下(例如，在健康人的平均体温下)测量的。
在进一步的实施方案中，该水凝胶和/或生物墨水的特征在于具有约500至1,000,000厘泊、约750至1,000,000厘泊、约1000至1,000,000厘泊、约1000至400,000厘泊、约2000至100,000厘泊、约3000至50,000厘泊、约4000至25,000厘泊、约5000至20,000厘泊或约6000至15,000厘泊的粘度。
在一些实施方案中，该生物墨水包含细胞和适合于连续生物打印的挤出化合物。在具体实施方案中，该生物墨水具有约1500mPa·s的粘度。在一些实施方案中，Pluronic F-127和细胞材料的混合物适合于连续生物打印。这样的生物墨水适当地通过以下步骤制备：通过在冷(4℃)磷酸盐缓冲盐水(PBS)中连续混合48小时溶解PluronicF-127粉末至30％(w/v)。Pluronic F-127也适当地溶解在水中。在一些实施方案中，采用标准无菌细胞培养技术将细胞培养和扩充。在进一步的实施方案中，例如将该细胞在200g下沉淀，并重悬浮在30％Pluronic F-127中，并抽吸到附着在生物打印机上的储存器中，在一些实施方案中，这使之在约10℃至约25℃的胶凝温度下固化。在生物打印之前生物墨水的胶凝是任选的。生物墨水，包括包含PluronicF-127的生物墨水，任选地作为液体分配。
在各个实施方案中，Pluronic F-127的浓度是具有合适的粘度和/或细胞毒性的任意值。在一些实施方案中，Pluronic F-127的合适的浓度能够在生物打印时支撑重量同时保持其形状。在一些实施方案中，Pluronic F-127的浓度为约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％或约50％。在一些实施方案中，Pluronic F-127的浓度为约30％至约40％，或者约30％至约35％。
在一些实施方案中，在使用之前除去生物墨水的非细胞组分(例如，挤出化合物等)。在进一步的实施方案中，非细胞组分例如是：水凝胶、肽水凝胶、基于氨基酸的凝胶、表面活性剂多元醇、热响应性聚合物、透明质酸盐、藻酸盐、胶原或其它生物相容性天然或合成聚合物。在更进一步的实施方案中，通过物理、化学或酶手段除去非细胞组分。在一些实施方案中，在使用时，一部分非细胞组分仍与细胞组分相关联。
在一些实施方案中，预处理细胞，以增加细胞相互作用。例如，为了在生物墨水成形之前增强细胞-细胞相互作用，适当地在离心之后在离心管内培养细胞。
示例性的细胞比例
在一些实施方案中，生物墨水包含多细胞体，该多细胞体进一步包含平滑肌细胞和内皮细胞。在进一步的实施方案中，平滑肌细胞与内皮细胞的比例为任何合适的比例。在更进一步的实施方案中，平滑肌细胞与内皮细胞的比例为约90:10至约60:40。在具体的实施方案中，该多细胞体包含平滑肌细胞和内皮细胞，并且平滑肌细胞与内皮细胞的比例为约85:15。在另一具体实施方案中，该多细胞体包含平滑肌细胞和内皮细胞，并且平滑肌细胞与内皮细胞的比例为约70:30。
在一些实施方案中，生物墨水包含多细胞体，该多细胞体进一步包含平滑肌细胞和成纤维细胞。在进一步的实施方案中，平滑肌细胞与成纤维细胞的比例为任何合适的比例。在更进一步的实施方案中，平滑肌细胞与成纤维细胞的比例为约90:10至约60:40。
在一些实施方案中，生物墨水包含多细胞体，该多细胞体进一步包含平滑肌细胞、成纤维细胞和内皮细胞。在进一步的实施方案中，平滑肌细胞、成纤维细胞和内皮细胞的比例为任何合适的比例。在更进一步的实施方案中，平滑肌细胞与成纤维细胞和内皮细胞的比例为约70:25:5。
细胞的自分选(self-sorting)
在一些实施方案中，用于形成构建体或组织的多细胞聚集体包含将要包括在工程化组织中的所有细胞类型(例如，内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞等)；在这样的实例中，每个细胞类型迁移到合适的位置(例如，在成熟期间)，以形成工程化组织，如血管壁节段。在其它实施方案中，用于形成结构的多细胞聚集体包括比将要包括在工程化组织中的所有细胞类型要少的细胞类型。在一些实施方案中，每个类型的细胞均匀分布在多细胞聚集体中，或组织的区域或层中。在其它实施方案中，每个类型的细胞定位在多细胞聚集体内的特定区域或组织的区域或层中。
例如，在以合适的比例(例如，85:15、70:30等)包含平滑肌细胞和内皮细胞的工程化血管壁节段(例如血管组织片)的情况下，相邻的、生物打印的凝聚多型圆柱形生物墨水单元融合在一起。在成熟期间，内皮细胞在某种程度上定位在构建体的外围，并形成胶原。例如，参见图1、3和4a。进一步举例来说，在以合适的比例(例如，70:25:5等)包含平滑肌细胞、成纤维细胞和内皮细胞的生物打印的血管壁节段的情况下，生物打印的多型圆柱形生物墨水单元融合在一起，并且内皮细胞在某种程度上定位在构建体的外围。在一些实施方案中，细胞类型在构建体内的定位模拟了体内或离体哺乳动物组织的分层结构。在进一步的实施方案中，例如在工程化的血管壁节段中，细胞类型在构建体中的定位形成了假定的内膜、中膜和外膜。
在一些实施方案中，通过应用一个或多个细胞层加速、增强或增加了细胞的分选或自分选。例如，在一些实施方案中，用包含平滑肌细胞和内皮细胞的多细胞聚集体生物打印的构建体，进一步在该构建体的一个或多个表面上施加一层内皮细胞。在进一步的实施方案中，结果是增加了由内皮细胞向该构建体外围的定位所产生的层。
预形成的支架
在一些实施方案中，本文公开了工程化的可植入组织和器官，其不含或基本不含任何预形成的支架。在进一步的实施方案中，“支架”是指合成的支架，例如聚合物支架和多孔水凝胶；非合成的支架，例如预形成的细胞外基质层、死细胞层和脱细胞的组织；以及任何其它类型的预形成支架，它对于工程化组织和/或器官的物理结构而言是必要的，并且不从该组织和/或器官除去。在进一步的实施方案中，脱细胞的组织支架包括脱细胞的天然组织或以任意方式由培养的细胞产生的脱细胞的细胞材料；例如，使之死亡或者脱细胞的细胞层，留下它们在活着时产生的ECM。
在一些实施方案中，该工程化的组织(包括血管壁节段)及其阵列，不利用任何预形成的支架，例如，来形成该组织、该组织的任何层或者形成该组织的形状。作为非限制性的实例，在制造时或使用时，本发明的工程化组织不利用任何预形成的合成支架(例如聚合支架)、预形成的细胞外基质层或任何其它类型的预形成支架。在一些实施方案中，该工程化的组织基本不含任何预形成的支架。在进一步的实施方案中，该组织的细胞组分含有可检测到的但是痕量或微量的支架，例如，小于总组合物的2.0％、小于1.0％或小于0.5％。在更进一步的实施方案中，痕量或微量的支架不足以影响该组织或其阵列的长期行为或者妨碍其主要生物功能。在另外的实施方案中，在打印之后，通过物理、化学或酶方法除去支架组分，从而产生不含或基本不含支架组分的工程化组织。
在一些实施方案中，本文公开的不含或基本不含预形成支架的工程化组织，与用某些其它组织工程方法开发的那些形成鲜明对比，后者中首先形成支架材料，然后将细胞接种到支架上，随后细胞增殖，以填充并呈现支架的形状。在一个方面，本文中描述的生物打印方法允许产生活的且有用的组织，其不含或基本不含预形成的支架。在另一方面，在一些实施方案中，利用限制材料将本发明的细胞保持在期望的三维形状中。该限制材料至少在以下事实上与支架是不同的：限制材料是暂时的和/或可以从细胞和/或组织除去。
阵列
在一些实施方案中，本文中公开了工程化组织的阵列，包括血管壁节段。在一些实施方案中，“阵列”意指包括多个元件的关联的科学工具，其中多个元件被空间布置以允许在一个样品上进行多个试验、在多个样品上进行一个或多个试验或两者。在一些实施方案中，该阵列适于筛选方法和装置，或者与筛选方法和装置(包括与中或高通量筛选有关的那些)相匹配。在进一步的实施方案中，阵列允许同时进行多个试验。在进一步的实施方案中，阵列允许同时测试多个样品。在一些实施方案中，该阵列为细胞的微阵列。在进一步的实施方案中，细胞的微阵列为允许对固体载体表面上的活细胞多路讯问的实验室工具。在其它的实施方案中，该阵列为组织微阵列。在进一步的实施方案中，组织微阵列包括组装成一个阵列的多个分离的组织或组织样品，以允许进行多个生物化学的、代谢的、分子的或组织学的分析。
在一些实施方案中，该工程化组织(包括血管壁节段)各自存在于生物相容性多孔容器的孔中(例如，参见图14)。在一些实施方案中，每个组织被放入孔中。在其它的实施方案中，每个组织被生物打印入孔中。在进一步的实施方案中，该孔被包被。在各个进一步的实施方案中，该孔用如下物质中的一种或多种包被：生物相容性水凝胶、一种或多种蛋白质、一种或多种化学品、一种或多种肽、一种或多种抗体和一种或多种生长因子，包括它们的组合。在一些实施方案中，该孔用NovoGelTM包被。在其它的实施方案中，该孔用琼脂糖包被。在一些实施方案中，每个组织存在于生物相容性多孔容器的孔内的多孔生物相容性膜上。在一些实施方案中，多孔容器的每个孔含有两个或更多个组织。
在一些实施方案中，工程化组织(包括血管壁节段)被固定在生物相容性表面的一个或多个侧面上。许多方法适于将组织固定到生物相容性表面。在各个实施方案中，组织被适当地固定在生物相容性表面，例如，沿着一个或多个整体侧面、只在一个或多个侧面的边缘或只在一个或多个侧面的中心。在各个进一步的实施方案中，将组织适当地固定在具有(整合到表面中的或者与表面相关联的)支持物或载体的生物相容性表面。在各个进一步的实施方案中，将组织适当地固定在具有(整合到表面中的或者与表面相关联的)一个或多个夹持夹或塑料补片的生物相容性表面。在一些实施方案中，通过细胞到多孔膜的附着，将组织适当地固定在生物相容性表面。在一些实施方案中，通过固定在生物相容性表面的一个或多个侧面上，将工程化组织(包括血管壁节段)保持在阵列结构中。在进一步的实施方案中，该组织在1、2、3、4或更多个侧面上被附着到生物相容性表面。在一些实施方案中，该生物相容性表面为任何对该组织或与该组织接触的有机体不产生显著伤害或毒性风险的表面。在进一步的实施方案中，该生物相容性表面为任何适合于传统组织培养方法的表面。作为非限制性的实例，合适的生物相容性表面包括：已处理的塑料、膜、多孔膜、涂覆的膜、涂覆的塑料、金属、涂覆的金属、玻璃、已处理的玻璃和涂覆的玻璃，其中合适的涂层包括水凝胶、ECM成分、化学品、蛋白质等，并且涂覆或处理提供了刺激或防止细胞和组织粘附到该生物相容性表面的手段。
在一些实施方案中，将工程化组织固定到生物相容性表面的一个或多个侧面上，有利于使该组织经受由流体流动引起的剪切力。在进一步的实施方案中，该工程化组织(包括血管壁节段)经受由流体流动引起的剪切力。在各个实施方案中，该工程化组织在1、2、3、4或更多个侧面上经受剪切力(例如，参见图13)。
在一些实施方案中，工程化组织(包括血管壁节段)的阵列包括两种或多种元件的结合。在各个实施方案中，该阵列包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475或500种元件(包括其中的增量)的结合。在进一步的实施方案中，每个元件包括一个或多个细胞、多细胞聚集体、组织、器官或它们的组合。
在一些实施方案中，工程化组织(包括血管壁节段)的阵列包括以预先确定的图案空间布置的多个元件。在进一步的实施方案中，该图案为元件的任何合适的空间布置。在各个实施方案中，作为非限制性的实例，布置的图案包括二维网格、三维网格、一个或多个线、弧或圆、一系列的行或列等等。在进一步的实施方案中，选择该图案，以与高通量生物学分析或筛选方法或装置具有相容性。
在各个实施方案中，基于特定的研究目的或目标，选择用于制造在阵列中的一个或多个组织的细胞的细胞类型和/或来源。在进一步的各个实施方案中，基于特定的研究目的或目标，选择阵列中的特定组织。在一些实施方案中，在阵列中包括一种或多种特定的工程化组织，以促进特定疾病或状况的研究。在一些实施方案中，在阵列中包括一种或多种特定的工程化组织，以促进对特定受试者的疾病或状况的研究。在进一步的实施方案中，用来源于两个或更多个不同人类供体的一种或多种细胞类型来产生该阵列中的一种或多种特定的工程化组织。在一些实施方案中，阵列中的每个组织在细胞类型、细胞来源、细胞层、细胞比例、构建方法、尺寸、形状等方面是基本相似的。在其它的实施方案中，阵列中的一种或多种组织在细胞类型、细胞来源、细胞层、细胞比例、构建方法、尺寸、形状等方面是独特的。在各个实施方案中，阵列中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300或更多个(包括其中的增量)组织是独特的。在其它各个实施方案中，阵列中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(包括其中的增量)的组织是独特的。
在一些实施方案中，阵列中的一个或多个组织代表在人体内的一个或多个特定的组织。在进一步的实施方案中，作为非限制性的实例，阵列中的一个或多个个体组织代表包括如下的人体组织：血或淋巴管、肌肉、子宫、神经、粘膜、间皮、网膜、角膜、皮肤、肝、肾、心脏、气管、肺、骨、骨髓、脂肪、结缔组织、膀胱、乳腺、胰腺、脾、脑、食管、胃、肠、结肠、直肠、卵巢、前列腺、瘤、内胚层、中胚层和外胚层。在一个实施方案中，选择阵列中的组织，以代表受试者中的所有重要的组织类型。
在一些实施方案中，阵列中的每个组织被独立地培养维持。在进一步的实施方案中，阵列中每个组织的培养条件为使得它们与其它组织分离，并且不能交换培养基或溶解于培养基中的因子。在其它实施方案中，该阵列中的两个或更多个个体组织交换可溶性因子。在进一步的实施方案中，阵列中的两个或更多个个体组织的培养条件为使得它们与其它组织交换培养基或溶解于培养基中的因子。在各个实施方案中，阵列中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300或更多个(包括其中的增量)组织，交换培养基和/或可溶性因子。在其它各个实施方案中，阵列中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(包括其中的增量)的组织，交换培养基和/或可溶性因子。
体外分析
在一些实施方案中，本文中公开的工程化组织(包括血管壁节段)和及阵列用于体外分析。在一些实施方案中，“分析”是指测试或测量物质(例如化学品、分子、生物化学品、药物等)在有机或生物样品(例如细胞聚集体、组织、器官、有机体等)中的存在或活性的过程。在进一步的实施方案中，分析包括定性分析和定量分析。在更进一步的实施方案中，定量分析测量样品中物质的量。
在各个实施方案中，作为非限制性的实例，该工程化组织(包括血管壁节段)和阵列用于基于图像的分析、分泌的蛋白质的测量、标记物的表达和蛋白质的生产。在各个进一步的实施方案中，该工程化组织(包括血管壁节段)和阵列用于分析以检测或测量如下的一种或多种：分子结合(包括放射性配体结合)、分子吸收、活性(例如，酶活性和受体活性等)、基因表达、蛋白质表达、受体激动作用、受体拮抗、细胞信号传导、细胞凋亡、化学敏感性、转染、细胞迁移、趋化性、细胞活力、细胞增殖、安全性、有效性、代谢、毒性和滥用倾向。
在一些实施方案中，工程化组织(包括血管壁节段)和阵列用于免疫测定中。在进一步的实施方案中，免疫测定是竞争性的免疫测定或非竞争性的免疫测定。在竞争性的免疫测定中，例如样品中的抗原与和抗体结合的标记抗原竞争，随后测量结合到抗体位点的标记抗原的数量。在非竞争性的免疫测定(也称作"夹心法分析")中，例如将样品中的抗原结合到抗体位点；接着，将标记抗体结合到该抗原，并且随后测量在该位点上的标记抗体的数量。
在一些实施方案中，工程化组织(包括血管壁节段)和阵列用于酶联免疫吸附测定(ELISA)中。在进一步的实施方案中，ELISA是用于检测抗体或抗原在样品中的存在的生物化学技术。在ELISA中，例如，使用了至少一种对特定抗原具有特异性的抗体。进一步举例来说，将具有未知量的抗原的样品非特异性地(通过吸附到表面)或特异性地(在“夹心”ELISA中，通过对同样抗原具有特异性的另外的抗体进行捕获)固定在固体载体(例如，聚苯乙烯微孔板)上。再进一步举例来说，在抗原固定之后，加入检测抗体，形成与抗原的复合物。该检测抗体例如被共价连接到酶，或者通过经生物偶联连接到酶的第二抗体进行自身检测。
例如，在一些实施方案中，细胞、多细胞聚集体或组织的阵列、微阵列或芯片用于药物筛选或药物发现。在进一步的实施方案中，组织的阵列、微阵列或芯片用作用于药物筛选或药物发现的试剂盒的一部分。在一些实施方案中，每个血管壁节段存在于生物相容性多孔容器的孔中，其中容器适合于一个或多个自动药物筛选程序和/或装置。在进一步的实施方案中，自动药物筛选程序和/或装置包括计算机或自动机械辅助的任何合适的步骤或装置。
在进一步的实施方案中，用于药物筛选分析或药物发现分析的阵列用于研究或开发潜在可用于任何治疗领域的药物的药物。在更进一步的实施方案中，作为非限制性的实例，合适的治疗领域包括：传染病、血液病、肿瘤、儿科、心脏病、中枢神经系统疾病、神经病、肠胃病、肝脏病、泌尿科、不育症、眼科、肾脏、矫形外科、疼痛控制、精神病、肺、疫苗、伤口愈合、生理学、药理学、皮肤病、基因治疗、毒作用和免疫。
方法
在一些实施方案中，本文中公开了用于构建活的、三维组织构建体的方法，该方法包括将包含至少一种粘附细胞类型的生物墨水生物打印到形式中或形式上，并将生物墨水融合成活的、三维组织构建体。在进一步的实施方案中，该组织构建体用于体外使用。在更进一步的实施方案中，该组织构建体不是血管。
在一些实施方案中，本文中还公开了用于构建组织(包括血管壁节段)的方法，该方法包括如下步骤：制备包含平滑肌细胞的凝聚的多细胞聚集体；将所述凝聚的多细胞聚集体放置在载体上；并孵育所述多细胞聚集体，以使所述多细胞聚集体凝聚并形成组织(例如血管壁节段)；其中所述孵育持续约2小时至约10天。在一些实施方案中，该方法使用生物打印。在进一步的实施方案中，该方法产生不含或基本上不含预形成的支架的工程化组织(包括血管壁节段)。
在一些实施方案中，本文中还公开了用于构建活的三维组织(包括血管壁节段)的方法，该方法包括如下步骤：制备一个或多个包含哺乳动物细胞的凝聚的多细胞聚集体；将所述一个或多个凝聚的多细胞聚集体放置在载体上；将如下的一种或多种施加到所述一个或多个凝聚的多细胞聚集体：在一个或多个外表面上的第一种哺乳动物细胞层；在一个或多个外表面上的第二种哺乳动物细胞层；以及孵育所述一个或多个多细胞聚集体，以使多细胞聚集体凝聚并形成组织；其中所述孵育持续约2小时至约10天。在一些实施方案中，该方法使用生物打印。在进一步的实施方案中，该方法产生不含或基本上不含预形成的支架的工程化组织(包括血管壁节段)。
在一些实施方案中，本文中还公开了用于构建活的三维组织构建体的方法，该方法包括如下步骤：制备一个或多个包含哺乳动物细胞的凝聚的多细胞聚集体；将所述一个或多个凝聚的多细胞聚集体放置在载体上，以形成如下的至少一种：至少一个包含多种细胞类型的层，该细胞类型相对于彼此空间排列，以构建平面几何形状，和多个层，至少一个层在组成上或结构上与至少一个其它层不同，以构建层状几何形状；以及孵育所述一个或多个多细胞聚集体，以使多细胞聚集体凝聚并形成活的三维组织构建体。
制备凝聚的多细胞聚集体
在一些实施方案中，该方法包括制备包含一种或多种类型的哺乳动物细胞的凝聚的多细胞聚集体。在一些实施方案中，该方法包括制备包含平滑肌细胞的凝聚的多细胞聚集体。在一些实施方案中，该方法包括制备进一步包含内皮细胞的凝聚的多细胞聚集体。例如，参见实施例3、4和7。在一些实施方案中，该方法包括制备进一步包含成纤维细胞的凝聚的多细胞聚集体。例如，参见实施例5和6。
存在多种制备具有本文所述特性的多细胞聚集体的方式。在一些实施方案中，从含有多个活细胞或具有所需细胞密度和粘性的细胞浆料制造多细胞聚集体。在进一步的实施方案中，将该细胞浆料成形为所需的形状和通过成熟(例如孵育)形成的多细胞体。在一些实施方案中，该多细胞聚集体基本上是圆柱形的。在一些实施方案中，该多细胞聚集体基本上是带形的。在一些实施方案中，该多细胞聚集体基本上是球形的。在其它实施方案中，该工程化组织是由具有一系列形状的多细胞聚集体构建的。在具体实施方案中，通过将包括多个活细胞的细胞浆料成形为细长形状(例如圆柱体、带状体等)来产生细长的多细胞体。在进一步的实施方案中，将细胞浆料在受控环境中孵育，以使细胞彼此粘附和/或凝聚，以形成细长的多细胞体。在另一个具体实施方案中，通过在将细胞保持为三维形状的装置中，将包括多个活细胞的细胞浆料成形来制备多细胞体。在进一步的实施方案中，将细胞浆料在受控环境中孵育，同时将其保持为三维形状充分的时间，以在平表面上产生具有足以支撑其自身的凝聚力的多细胞体。
在各个实施方案中，通过如下步骤来提供细胞浆料：1)收集(一种或多种细胞类型的)细胞或细胞聚集体与生物相容性凝胶或液体，例如细胞培养基(例如，以预先确定的比例)，以产生细胞悬浮液；和2)将该细胞悬浮液致密化，以产生具有所需细胞密度和粘度的细胞浆料。在各个实施方案中，通过多种方法来实现致密化，例如通过将由细胞培养获得的特定细胞悬浮液浓缩，以获得所需的细胞浓度(密度)、粘度和细胞浆料所需的稠度。在具体的实施方案中，将来自细胞培养的相对较稀的细胞悬浮液离心设定的时间，以获得在能够在模具中成形的沉淀物中的细胞浓度。切向流过滤(“TFF”)是细胞浓缩或致密化的另一个合适的方法。在一些实施方案中，将化合物与细胞悬浮液合并，以提供所需的挤出性质。作为非限制的实例，合适的化合物包括：表面活性剂多元醇、胶原、水凝胶、肽水凝胶、基于氨基酸的凝胶、MatrigelTM、纳米纤维、自组装纳米纤维、明胶、纤维蛋白原等。
在一些实施方案中，通过将多个活细胞与组织培养基混合并使活细胞致密化(例如通过离心)来产生细胞浆料。任选地通过如下步骤来包括一种或多种ECM组分(或ECM组分的衍生物)：将细胞沉淀物重悬浮在一种或多种含有ECM组分(或ECM组分的衍生物)的生理学可接受的缓冲液中，并将所得细胞悬浮液再次离心以形成细胞浆料。
在一些实施方案中，进一步加工所需的细胞浆料的细胞密度随着细胞类型而改变。在进一步的实施方案中，细胞之间的相互作用决定了细胞浆料的性质，并且不同的细胞类型在细胞密度与细胞-细胞相互作用之间将具有不同的关系。在更进一步的实施方案中，在细胞浆料成形之前预处理该细胞，以增加细胞相互作用。例如，在一些情况下，为了在细胞浆料成形之前增强细胞-细胞相互作用，在离心之后在离心管内培养细胞。在一些实施方案中，该细胞浆料伴随着生物打印而成形；其中在生物打印期间或之后，个体细胞彼此凝聚以形成生物墨水。
在各个实施方案中，采用多种方法来使细胞浆料成形。例如，在特定实施方案中，将细胞浆料手工模塑或压制(例如，在浓缩/致密化之后)，以获得所需的形状。进一步举例来说，将细胞浆料吸收(例如，抽吸)到仪器如微量吸液管(例如，毛细吸管)中，这使细胞浆料成形，以符合该仪器的内表面。微量吸液管(例如毛细吸管)的横截面形状备选地是圆形的、正方形的、矩形的、三角形的或其它非圆形的横截面形状。在一些实施方案中，通过沉积，使细胞浆料在预形成的模具如塑料模具、金属模具或凝胶模具中成形。在一些实施方案中，采用离心浇铸或连续浇铸来使细胞浆料成形。在一些实施方案中，该生物墨水的成形伴随着生物打印而发生，或者在生物打印之后发生。在进一步的实施方案中，作为共打印模具的结果发生生物墨水的成形；其中该模具任选地通过生物打印而沉积；其中该模具包含如下的一种或多种：凝胶、水凝胶、合成聚合物、碳水化合物、蛋白质或哺乳动物细胞。在更进一步的实施方案中，该共打印的模具的一个或多个部分在生物打印后被去除；其中去除方法选自如下的一种：物理手段，用水性介质增溶；化学处理；酶处理；调整温度。
在一些实施方案中，限定形状的多细胞聚集体也适于建造本文中所述的组织，包括血管壁节段。任选通过多种方法形成球形多细胞聚集体，该方法包括但不限于：细胞自组装、使用模具和悬滴法。在进一步的实施方案中，产生基本为球形的多细胞聚集体的方法包括以下步骤：1)提供具有所需细胞密度和粘度的、含有多个预先选择的细胞或细胞聚集体的细胞浆料；2)将该细胞浆料处理成圆柱形状；3)将圆柱体切割成相等的片段；4)任选地将该片段在旋转摇床上放置过夜；和5)通过成熟形成基本为球形的多细胞聚集体。在进一步的实施方案中，通过声波聚焦工艺来形成细胞聚集体。
在一些实施方案中，部分粘附和/或凝聚的细胞浆料用于生物打印；其中凝聚和生物墨水形成主要发生在打印后。在其它实施方案中，在生物打印之前的第一步骤中，使细胞浆料成形。在进一步的实施方案中，将细胞浆料从第一成形装置(例如，毛细吸管)转移到允许向细胞供应营养物和/或氧的第二成形装置(例如，模具)，同时它们在第二成形装置中保持额外的成熟时间。允许向细胞供应营养物和氧的合适的成形装置的一个例子是用于制造多个多细胞聚集体(例如，基本相同的多细胞聚集体)的模具。进一步举例来说，这样的模具包括由抵抗细胞向基质中的迁移或向内生长并且抵抗细胞对基质的粘着的材料制成的生物相容性基质。在各个实施方案中，该基质适当地由(PTFE)、不锈钢、NovoGelTM、琼脂糖、聚乙二醇、玻璃、金属、塑料或凝胶材料(例如琼脂糖或其它水凝胶)和类似的材料制成。在一些实施方案中，还适当地配置模具，以允许向细胞浆料供应组织培养基(例如通过将组织培养基分配到模具的顶部上)。
因此，在使用第二成形装置的实施方案中，将部分粘附和/或凝聚的细胞浆料从第一成形装置(例如，毛细吸管)转移到第二成形装置(例如，模具)。在进一步的实施方案中，将部分粘附和/或凝聚的细胞浆料由第一成形装置(例如，毛细吸管)转移到模具的凹槽中。在更进一步的实施方案中，在成熟期(其中模具与保留于其中的细胞浆料一起在受控环境中孵育，以使细胞浆料中的细胞进一步彼此粘附和/或凝聚，以形成多细胞聚集体)之后，细胞的凝聚力将足够强大，从而允许用工具(例如，毛细吸管)拾取所得的多细胞聚集体。在更进一步的实施方案中，该毛细吸管适宜地是生物打印机或类似装置的打印头的一部分，其可以操作，以自动地将多细胞聚集体放置在三维构建体中。
在一些实施方案中，多细胞聚集体的横截面形状和尺寸基本对应于第一成形装置和任选的用于制备该多细胞聚集体的第二成形装置的横截面形状和尺寸，并且本领域技术人员将能够选择具有适当横截面形状、横截面积、直径和长度的适当的成形装置，其适合于产生具有以上讨论的横截面形状、横截面积、直径和长度的多细胞聚集体。
将凝聚的多细胞聚集体放置在载体上
许多方法适合于将多细胞聚集体放置在载体上，以生产所需的三维结构。例如，在一些实施方案中，将该多细胞聚集体人工放置而使其彼此接触，通过从移液管、喷嘴或喷针挤出而沉积在适当的位置，或者通过自动的计算机辅助装置(例如生物打印机)来安置。
如本文所述，在各个实施方案中，多细胞聚集体具有许多合适的形状和尺寸。在一些实施方案中，多细胞聚集体是细长的，具有数种合适的横截面形状中的任一种，作为非限制性的实例，包括圆形、椭圆形、正方形、三角形、多边形和不规则形状。在进一步的实施方案中，多细胞聚集体是细长的，并且是圆柱体的形式。在一些实施方案中，细长的多细胞聚集体具有类似的长度和/或直径。在其它实施方案中，细长的多细胞聚集体具有不同的长度和/或直径。在一些实施方案中，多细胞聚集体基本上是球形的。在一些实施方案中，工程化的组织(例如，血管壁节段等)包括基本为球形的多细胞聚集体，其尺寸基本上是类似的。在其它实施方案中，工程化的组织(例如，血管壁节段等)包括基本为球形的多细胞聚集体，其具有不同的尺寸。在一些实施方案中，不同形状和尺寸的工程化组织(例如，血管壁节段等)是通过布置各种形状和尺寸的多细胞体而形成的。
在一些实施方案中，将凝聚的多细胞聚集体放置在载体上。在各个实施方案中，该载体是任何合适的生物相容性表面。在更进一步的实施方案中，作为非限制性的实例，合适的生物相容性表面包括聚合材料、多孔膜、塑料、玻璃、金属、水凝胶及其组合。在一些实施方案中，该载体用生物相容性物质涂覆，作为非限制性的实例，该生物相容性物质包括水凝胶、蛋白质、化学品、肽、抗体、生长因子或它们的组合。在一个实施方案中，该载体涂覆有NovoGelTM。在另一个实施方案中，该载体涂覆有琼脂糖。在一个实施方案中，该凝聚的多细胞聚集体被放置在生物相容性多孔容器的孔中。
在一些实施方案中，一旦完成对凝聚的多细胞聚集体的放置，就将组织培养基倒在该构建体的顶部。在进一步的实施方案中，组织培养基进入多细胞体之间的空间，以支持多细胞体中的细胞。
施加第一细胞类型的层和/或第二细胞类型的层
许多方法适合于将一个或多个细胞层施加到该凝聚的哺乳动物细胞结构的一个或多个外表面上。例如，在一些实施方案中，施加细胞层包括：用细胞的悬浮液、片、单层或融合的聚集体来涂覆所述凝聚的多细胞集合体的一个或多个表面。在各个实施方案中，涂覆该凝聚的哺乳动物细胞构建体的1、2、3、4或更多个表面。
在一些实施方案中，施加细胞层包括：生物打印融合的多细胞聚集体的附加层。在其它实施方案中，施加细胞层包括：生物打印、喷雾或墨水喷射细胞的溶液、悬浮液或液态浓缩物。在进一步的实施方案中，合适的细胞悬浮液包含约1x104至约1x106个细胞/μl。在更进一步的实施方案中，合适的细胞悬浮液包含约1x105至约1.5x105个细胞/μl。在进一步的实施方案中，施加细胞层包括：将细胞的悬浮液以空间分布小滴的形式直接分配到该凝聚的哺乳动物细胞结构的一个或多个表面上。在更进一步的实施方案中，施加细胞层包括：将细胞的悬浮液以喷雾的形式直接分配到该凝聚的哺乳动物细胞结构的一个或多个表面上。在各个实施方案中，在构建过程中的任何合适的时间施加细胞层。在一些实施方案中，在生物打印之后立即(例如，最多10分钟)将一个或多个细胞层施加到凝聚的哺乳动物细胞构建体的一个或多个外表面上。在其它实施方案中，在生物打印之后(例如，10分钟之后)，施加一个或多个层。在另外的其它实施方案中，在该结构成熟期间，施加一个或多个层。
任何类型的细胞适合于用作以生物墨水形式生物打印的层。此外，任何类型的细胞适合以通过悬浮液、溶液或浓缩物的小滴沉积的形式或者以悬浮液、溶液或浓缩物形式喷雾的形式来施加层。在一些实施方案中，成纤维细胞被用作该凝聚的哺乳动物细胞构建体的一个或多个外表面上的一个或多个层。在其它的实施方案中，内皮细胞被用作该凝聚的哺乳动物细胞构建体的一个或多个外表面上的一个或多个层。在更进一步的实施方案中，将内皮细胞层施加到该凝聚的哺乳动物细胞构建体的一个或多个外表面，并将成纤维细胞层施加到该构建体的一个或多个不同的表面。
实施例9显示了用凝聚的平滑肌细胞聚集体生物打印的血管壁构建体，其进一步涂覆有内皮细胞浓缩物(例如，1-1.5x105个细胞/μl)。实施例9的技术导致形成了由SMC和EC覆盖层(例如，假定的中膜和内膜)组成的血管壁构建体。例如，参见图3、图4B。
实施例10显示了用凝聚的人类主动脉的平滑肌细胞聚集体生物打印的血管壁构建体。进一步地，在平滑肌圆柱形生物墨水顶端，以2.5μL小滴的形式，从生物打印机分配悬浮液中的人类主动脉内皮细胞。
在一些实施方案中，该方法进一步包括在载体上培养细胞层的步骤。在这样的实施方案中，在某些情况下，施加细胞层包括：将凝聚的平滑肌细胞构建体的一个或多个表面放置为与制备的细胞培养基直接接触。在进一步的实施方案中，该构建体被直接生物打印在细胞的培养层上或细胞单层上。在生物相容性载体上的任何类型的培养细胞层是合适的。在一些实施方案中，将多细胞聚集体生物打印到内皮细胞层上。在其它的实施方案中，将多细胞聚集体生物打印到成纤维细胞层上。在进一步的实施方案中，细胞层与该生物打印构建体的多细胞聚集体粘附和/或凝聚。在一些实施方案中，多层结构的每个层都是生物打印的。在进一步的实施方案中，个体层包括可变形式的生物墨水，包括但不限于：凝聚的细胞聚集体、细胞浆料、与挤出化合物或其它添加剂组合的细胞浆料、细胞单层和细胞片。
实施例11显示了与实施例10的构建体相同的构建；然而，该构建体被生物打印到载体上，在载体上已经预先培养了汇合的单层人类皮肤成纤维细胞。实施例11的技术导致形成了由SMC与EC和Fb覆盖层(例如，假定的中膜、内膜和外膜)组成的血管壁构建体。例如，参见图4a和图4b。
孵育多细胞聚集体
在一些实施方案中，孵育多细胞聚集体。在进一步的实施方案中，孵育允许多细胞聚集体粘附和/或凝聚以形成组织，例如血管壁节段。在一些实施方案中，在细胞培养环境(例如，培养皿、细胞培养瓶、生物反应器等)中，多细胞聚集体凝聚以形成组织。在进一步的实施方案中，在具有适合于促进包括在多细胞聚集体中的细胞类型生长的条件的环境中，多细胞聚集体凝聚以形成组织。在一个实施方案中，在约37℃下，在含有约5％CO2的湿润气氛中，在含有促进粘附和/或凝聚的因子和/或离子的细胞培养基的存在下，孵育多细胞聚集体。在其它实施方案中，将该多细胞聚集体保持在含有0.1％至21％O2的环境中。
在各个实施方案中，孵育具有任何合适的持续时间。在进一步的各个实施方案中，孵育具有约20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180或更多分钟的持续时间，包括其中的增量。在进一步的各个实施方案中，孵育具有约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、36、48或更多小时的持续时间，包括其中的增量。在进一步的各个实施方案中，孵育具有约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多天的持续时间，包括其中的增量。有几种因素影响多细胞聚集体凝聚以形成组织所需的时间，作为非限制性的实例，包括细胞类型、细胞类型的比例、培养条件和添加剂如生长因子的存在。
用于增加工程化组织存活力的额外步骤
在一些实施方案中，该方法进一步包括增加工程化组织的存活力的步骤。在进一步的实施方案中，这些步骤包括：通过限制材料的暂时或半永久性的网格，提供该组织与营养培养基之间的直接接触。在一些实施方案中，该组织被束缚在多孔或间隙材料中。该工程化组织的至少一些细胞直接接近营养物增加了该工程化组织的存活力。
在进一步的实施方案中，用于增加工程化组织的存活力的额外和任选的步骤包括：1)任选地在放置凝聚的多细胞聚集体之前，分配限制材料的基底层；2)任选地分配限制材料的周界；3)在限定的几何形状内生物打印该组织的细胞；和4)分配限制材料的细长体(例如，圆柱体、带状体等)，按照图案覆盖初生组织，该图案在限制材料中引入间隙，例如网格、网孔或格子。例如，参见实施例12和图5。
许多限制材料适合用于本文描述的方法中。在一些实施方案中，水凝胶是示例性的限制材料，其具有一种或多种有利的性质，包括：非附着的、生物相容的、可挤出的、可生物打印的、非细胞的、具有合适的强度以及不溶于水性条件。在一些实施方案中，适宜的水凝胶是天然聚合物。在一个实施方案中，该限制材料由NovoGelTM组成。在进一步的实施方案中，合适的水凝胶包括衍生自表面活性剂多元醇的水凝胶如Pluronic F-127、胶原、透明质酸盐、纤维蛋白、藻酸盐、琼脂糖、壳聚糖和它们的衍生物或组合。在其它实施方案中，合适的水凝胶是合成聚合物。在进一步的实施方案中，合适的水凝胶包括衍生自聚(丙烯酸)或其衍生物、聚(环氧乙烷)及其共聚物、聚(乙烯醇)、聚磷腈及其组合的那些水凝胶。在各个具体实施方案中，该限制材料选自：水凝胶、NovoGelTM、琼脂糖、藻酸盐、明胶、MatrigelTM、透明质酸、泊洛沙姆、肽水凝胶、聚(异丙基正聚丙烯酰胺)、聚乙二醇二丙烯酸酯(PEG-DA)、甲基丙烯酸羟乙酯、聚二甲基硅氧烷、聚丙烯酰胺、聚(乳酸)、硅、丝和它们的组合。
在一些实施方案中，覆盖图案的间隙均匀地或基本均匀地围绕组织的表面分布。在其它实施方案中，该间隙不均匀地分布，从而使组织的细胞不均匀地暴露于营养物。在不均匀的实施方案中，任选地利用对营养物的差异获取来影响组织的一种或多种性质。例如，在某些情况下，理想的是在生物打印的组织的一个表面上的细胞比在该生物打印的组织的另一表面上的细胞增殖更快。在一些实施方案中，任选地在不同的时间改变该组织的各个部分对营养物的暴露，以影响该组织向期望的终点的发育。
在一些实施方案中，覆盖图案的间隙均匀地或基本均匀地围绕组织的表面分布。在其它实施方案中，该间隙不均匀地分布，从而使组织的细胞不均匀地暴露于营养物。在不均匀的实施方案中，利用对营养物的差异获取来影响组织的一种或多种性质。例如，在某些情况下，理想的是在生物打印的组织的一个表面上的细胞比在该生物打印的组织的另一表面上的细胞增殖更快。在一些实施方案中，任选地在不同的时间改变该组织的各个部分对营养物的暴露，以影响该组织向期望的终点的发育。
在一些实施方案中，该方法进一步包括使工程化组织(例如，血管壁节段等)在一个或多个侧面上经受由流体流动引起的剪切力的步骤。
具体的示例性实施方案
在某些实施方案中，本文中公开了活的三维组织，其中所述组织的至少一个部分是生物打印的；并且其中所述组织不是血管。在一些实施方案中，该组织基本上不含任何预形成的支架。在一些实施方案中，在生物打印时，该组织基本上不含任何预形成的支架。在一些实施方案中，在使用时，该组织基本上不含任何预形成的支架。在一些实施方案中，该组织的至少一个部分包括层状或平面几何形状。在一些实施方案中，该组织在一个或多个侧面上被固定到生物相容性表面。在进一步的实施方案中，该生物相容性表面为多孔膜。在更进一步的实施方案中，使该组织在一个或多个侧面上经受由流体流动引起的剪切力。在一些实施方案中，在生物打印时，该组织在其最小维度上为至少约25μm。在进一步的实施方案中，在生物打印时，该组织在其最小维度上为至少约100μm。在更进一步的实施方案中，在生物打印时，该组织在其最小维度上为至少约250μm。在更进一步的实施方案中，在生物打印时，该组织在其最小维度上为至少约500μm。在一些实施方案中，在生物打印时，该组织在其最大维度上为小于3.0cm。在一些实施方案中，该组织包含平滑肌细胞和内皮细胞，其中平滑肌细胞与内皮细胞的比例为约90:10至约60:40。在一些实施方案中，该组织包含平滑肌细胞和内皮细胞，其中平滑肌细胞与内皮细胞的比例为约85:15。在一些实施方案中，该组织包含平滑肌细胞和内皮细胞，其中平滑肌细胞与内皮细胞的比例为约70:30。在一些实施方案中，该组织包含平滑肌细胞和成纤维细胞，其中平滑肌细胞与成纤维细胞的比例为约90:10至约60:40。在一些实施方案中，该组织包含平滑肌细胞、成纤维细胞和内皮细胞，其中平滑肌细胞与成纤维细胞和内皮细胞的比例为约70:25:5。在一些实施方案中，该组织用于体外分析。在进一步的实施方案中，该组织用于药物测试。在更进一步的实施方案中，该组织用于心血管药物测试。在一些实施方案中，平滑肌细胞、成纤维细胞和内皮细胞为成熟的分化细胞。在一些实施方案中，平滑肌细胞、成纤维细胞和内皮细胞为成熟的未分化细胞。在一些实施方案中，该平滑肌细胞为人类平滑肌细胞。在进一步的实施方案中，该平滑肌细胞来源于选自下组的组织：血液、血管、淋巴管、消化道的组织、泌尿生殖道的组织、脂肪组织、呼吸道的组织、生殖系统的组织、中胚层来源的组织、骨髓和脐带组织。在一些实施方案中，该内皮细胞是人类内皮细胞。在进一步的实施方案中，该内皮细胞来源于选自下组的组织：血液、血管、淋巴管、消化道的组织、泌尿生殖道的组织、脂肪组织、呼吸道的组织、生殖系统的组织、中胚层来源的组织、骨髓和脐带组织。在一些实施方案中，该成纤维细胞为非血管的成纤维细胞。在其它的实施方案中，该成纤维细胞来源于血管外膜。在一些实施方案中，一种或多种所述细胞类型来源于特定的脊椎动物受试者。在进一步的实施方案中，该细胞来源于具有影响心血管系统的疾病或状况的脊椎动物受试者。在一些实施方案中，选择该细胞，以模拟特定的疾病状态。在一些实施方案中，该细胞配置为模拟特定的疾病状态。在一些实施方案中，以模拟特定的疾病状态的方式，处理或调整该细胞。
在某些实施方案中，本文中公开了活的三维组织的阵列，其中每个所述组织包含一种或多种类型的哺乳动物细胞；其中所述细胞彼此凝聚；其中每个所述组织的至少一个部分是生物打印的；并且其中每个所述组织被培养维持。在一些实施方案中，在使用时，该阵列中的每个组织不含任何预形成的支架。在一些实施方案中，该哺乳动物细胞选自：肝细胞、胃肠细胞、胰腺细胞、肾细胞、肺细胞、气管细胞、血管细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、皮肤细胞、平滑肌细胞、结缔组织细胞、角膜细胞、泌尿生殖细胞、生殖细胞、内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、神经细胞、施万细胞、脂肪细胞、骨细胞、骨髓细胞、软骨细胞、周细胞、间充质细胞、间皮细胞、间质细胞、干细胞、祖细胞、淋巴细胞、血细胞、肿瘤来源的细胞及其组合。在一些实施方案中，阵列中的每个组织基本相似。在其它的实施方案中，该阵列中的一个或多个组织是独特的。在一些实施方案中，该阵列中的个体组织代表在人体中的一种或多种特定组织。在进一步的实施方案中，该阵列中的一个或多个个体组织代表选自下组的人体组织：血或淋巴管、肌肉、子宫、神经、粘膜、间皮、网膜、角膜、皮肤、肝、肾、心脏、气管、肺、骨、骨髓、脂肪、结缔组织、膀胱、乳腺、胰腺、脾、脑、食管、胃、肠、结肠、直肠、卵巢和前列腺；其中每个组织任选地包括特定疾病状态(例如，纤维化、癌、炎症等等)的组成或结构特点。在一些实施方案中，每个组织存在于生物相容性多孔容器的孔中。在进一步的实施方案中，该孔用如下物质中的一种或多种包被：生物相容性水凝胶、蛋白质、化学品、肽、抗体或生长因子。在更进一步的实施方案中，该孔用琼脂糖包被。在一些实施方案中，将每个组织放在所述容器的所述孔内的多孔生物相容性膜上。在一些实施方案中，该容器与自动药物筛选相匹配。在一些实施方案中，每个组织在一个或多个侧面上被固定到生物相容性表面。在进一步的实施方案中，该生物相容性表面为多孔膜。在更进一步的实施方案中，使每个组织在一个或多个侧面经受由流体流动引起的剪切力。在一些实施方案中，采用来源于两个或更多个不同人类供体的一个或多个细胞类型来产生该阵列中的组织。在一些实施方案中，该阵列中的每个组织被独立地培养维持。在其它的实施方案中，该阵列中的两个或更多个个体组织交换可溶性因子。在一些实施方案中，该阵列用于体外分析。在进一步的实施方案中，该阵列用于药物测试。
在一些实施方案中，本文中公开了用于构建活的三维哺乳动物组织的阵列的方法，该方法包括如下步骤：制备包含哺乳动物细胞的凝聚的多细胞聚集体；将所述凝聚的多细胞聚集体放置在生物相容性载体上；其中所述集合体以适合于组织阵列的形式空间排列；并孵育所述多细胞聚集体，以使所述多细胞聚集体凝聚并形成三维组织的阵列；其中所述孵育具有约2小时至约10天的持续时间。在一些实施方案中，该阵列中每个组织的至少一个部分是生物打印的。在进一步的实施方案中，在使用时，该阵列中的每个组织基本上不含任何预形成的支架。在各个实施方案中，该阵列包含2至500个不同的组织。在进一步的实施方案中，该组织以限定的图案空间布置。在更进一步的实施方案中，该组织被布置在行和列的格子中。在一些实施方案中，该凝聚的多细胞聚集体包含一种细胞类型。在其它实施方案中，该凝聚的多细胞聚集体包含超过一种细胞类型。在一些实施方案中，该凝聚的多细胞聚集体基本上是球形的和/或基本上是圆柱形的。在一些实施方案中，该生物相容性载体由以下物质组成：聚合物材料、多孔膜、塑料、玻璃、金属或水凝胶。在一些实施方案中，在生物打印时，该阵列中的每个组织在其最小维度上为至少约25μm。在进一步的实施方案中，在生物打印时，每个组织在其最小维度上为至少约150μm。在更进一步的实施方案中，在生物打印时，每个组织在其最小维度上为至少约250μm。在更进一步的实施方案中，在生物打印时，每个组织在其最小维度上为至少约500μm。在一些实施方案中，该阵列中的每个组织被培养维持。在一些实施方案中，该方法进一步包括以下步骤：使每个所述组织在一个或多个侧面上经受由流体流动引起的剪切力。
在某些实施方案中，本文公开了活的三维血管壁节段，该三维血管壁节段包含：平滑肌细胞；和任选的，一种或多种选自成纤维细胞和内皮细胞的细胞类型；其中所述细胞彼此凝聚；其中所述血管壁节段的至少一个部分是生物打印的；并且，其中所述血管壁节段是非管状的。在一些实施方案中，该血管壁节段不含任何预形成的支架。在一些实施方案中，该血管壁节段基本上为平面。在一些实施方案中，该血管壁节段在一个或多个侧面上被固定到生物相容性表面。在进一步的实施方案中，该生物相容性表面为多孔膜。在更进一步的实施方案中，使该血管壁节段在一个或多个侧面上经受由流体流动引起的剪切力。在一些实施方案中，在生物打印时，该血管壁节段在其最小维度上为至少约25μm。在进一步的实施方案中，在生物打印时，该血管壁节段在其最小维度上为至少约150μm。在更进一步的实施方案中，在生物打印时，该血管壁节段在其最小维度上为至少约250μm。在更进一步的实施方案中，在生物打印时，该血管壁节段在其最小维度上为至少约500μm。在一些实施方案中，该血管壁节段包含平滑肌细胞和内皮细胞，其中平滑肌细胞与内皮细胞的比例为约90:10至约60:40。在进一步的实施方案中，该血管壁节段包含平滑肌细胞和内皮细胞、其中平滑肌细胞与内皮细胞的比例为约85:15。在其它的实施方案中，该血管壁节段包含平滑肌细胞和内皮细胞、其中平滑肌细胞与内皮细胞的比例为约70:30。在一些实施方案中，该血管壁节段包含平滑肌细胞和成纤维细胞，其中平滑肌细胞与成纤维细胞的比例为约90:10至约60:40。在一些实施方案中，该血管壁节段包含平滑肌细胞、成纤维细胞和内皮细胞，其中平滑肌细胞与成纤维细胞和内皮细胞的比例为约70:25:5。在一些实施方案中，该血管壁节段用于体外分析。在进一步的实施方案中，该血管壁节段用于药物测试。在更进一步的实施方案中，该血管壁节段用于心血管药物测试。在一些实施方案中，平滑肌细胞、成纤维细胞和内皮细胞为成熟的分化细胞。在其它实施方案中，平滑肌细胞、成纤维细胞和内皮细胞为成熟的未分化细胞。在一些实施方案中，该平滑肌细胞为人类平滑肌细胞。在进一步的实施方案中，该平滑肌细胞来源于选自下组的组织：血液、血管、淋巴管、消化道的组织、泌尿生殖道的组织、脂肪组织、呼吸道的组织、生殖系统的组织、骨髓和脐带组织。在一些实施方案中，该内皮细胞为人类内皮细胞。在进一步的实施方案中，该内皮细胞来源于选自下组的组织：血液、血管、淋巴管、消化道的组织、泌尿生殖道的组织、脂肪组织、呼吸道的组织、生殖系统的组织、骨髓和脐带组织。在一些实施方案中，该成纤维细胞为非血管的成纤维细胞。在一些实施方案中，该成纤维细胞来源于血管外膜。在一些实施方案中，该细胞来源于特定的脊椎动物受试者。在进一步的实施方案中，一种或多种细胞类型来源于具有影响心血管系统的疾病或状况的脊椎动物受试者。在一些实施方案中，选择该细胞，以模拟特定的疾病状态。在一些实施方案中，该细胞被配置为模拟特定的疾病状态。在一些实施方案中，以模拟特定的疾病状态的方式，处理或调整该细胞。
在某些实施方案中，本文中公开了活的三维血管壁节段的阵列，其中每个所述血管壁节段包含平滑肌细胞和任选的选自成纤维细胞和内皮细胞的一种或多种细胞类型；其中所述细胞彼此凝聚；其中每个所述血管壁节段被工程化。在一些实施方案中，该阵列中每个血管壁节段的至少一个部分是生物打印的。在进一步的实施方案中，在使用时，该阵列中的每个血管壁节段不含任何预形成的支架。在一些实施方案中，每个血管壁节段存在于生物相容性多孔容器的孔内。在进一步的实施方案中，该孔用如下物质中的一种或多种包被：生物相容性水凝胶、蛋白质、化学品、肽、抗体或生长因子。在更进一步的实施方案中，该孔用NovoGelTM包被。在其它的实施方案中，该孔用琼脂糖包被。在一些实施方案中，将每个血管壁节段放在所述容器的所述孔内的多孔生物相容性膜上。在进一步的实施方案中，该容器与自动药物筛选相匹配。在一些实施方案中，每个血管壁节段在一个或多个侧面上被固定到生物相容性表面。在进一步的实施方案中，该生物相容性表面为多孔膜。在更进一步的实施方案中，使每个血管壁节段在一个或多个侧面上经受由流体流动引起的剪切力。在一些实施方案中，阵列中的每个血管壁节段基本相似。在其它的实施方案中，阵列中的一个或多个血管壁节段是独特的。在一些实施方案中，该阵列中的血管壁节段代表人体中的一种或多种不同的血管组织。在一些实施方案中，采用来源于两个或更多个不同的人类供体的一种或多种细胞类型，来产生该阵列中的血管壁节段。在一些实施方案中，该阵列中的每个血管壁节段被独立地培养维持。在其它的实施方案中，该阵列中的两个或更多个个体血管壁节段交换可溶性因子。在一些实施方案中，该阵列用于体外分析。在进一步的实施方案中，该阵列用于药物测试。在更进一步的实施方案中，该阵列用于心血管药物测试。
在某些实施方案中，本文中公开了用于构建活的三维血管壁节段的方法，该方法包括如下步骤：制备包含平滑肌细胞的凝聚的多细胞聚集体；将所述凝聚的多细胞聚集体放置在载体上；并孵育所述多细胞聚集体，以使所述多细胞聚集体凝聚并形成血管壁节段；其中所述孵育具有约2小时至约10天的持续时间。在一些实施方案中，该血管壁节段的至少一个部分是生物打印的。在进一步的实施方案中，在使用时，该血管壁节段用于体外分析，并且不含任何预形成的支架。在一些实施方案中，该凝聚的多细胞聚集体进一步包含内皮细胞。在一些实施方案中，该凝聚的多细胞聚集体进一步包含成纤维细胞。在一些实施方案中，该凝聚的多细胞聚集体基本上是球形的和/或基本上是圆柱形的。在一些实施方案中，将该凝聚的多细胞聚集体放置在生物相容性表面上。在进一步的实施方案中，该生物相容性表面由以下物质组成：聚合物材料、多孔膜、塑料、玻璃、金属或水凝胶。在一些实施方案中，在生物打印时，该血管壁节段在其最小维度上为至少约50μm。在进一步的实施方案中，在生物打印时，该血管壁节段在其最小维度上为至少约150μm。在更进一步的实施方案中，在生物打印时，该血管壁节段在其最小维度上为至少约266μm。在其他实施方案中，在生物打印时，该血管壁节段在其最小维度上为至少约500μm。在一些实施方案中，该方法进一步包括：使所述血管壁节段在一个或多个侧面上经受由流体流动引起的剪切力。
在某些实施方案中，本文中公开了活的三维组织，该三维组织包含：平滑肌细胞和选自以下的一种或多种：在一个或多个表面上的内皮细胞层；在一个或多个表面上的成纤维细胞层。其中所述平滑肌细胞彼此凝聚；其中所述组织的至少一个部分是生物打印的；并且，其中所述组织是非管状的。在一些实施方案中，该组织基本上不含任何预形成的支架。在一些实施方案中，在生物打印的时候，该组织基本上不含任何预形成的支架。在一些实施方案中，在使用时，该组织基本上不含任何预形成的支架。在一些实施方案中，该组织基本上为平面。在一些实施方案中，该内皮细胞层包含内皮细胞的单层、一个或多个片或融合的聚集体。在一些实施方案中，该组织包含在所述组织的一个或多个表面上的内皮细胞层。在一些实施方案中，该成纤维细胞层包含成纤维细胞的单层、一个或多个片或融合的聚集体。在一些实施方案中，该组织包含在所述组织的一个或多个表面上的成纤维细胞层。在一些实施方案中，该组织包含内皮细胞层和成纤维细胞层；其中所述内皮细胞层在所述组织的一个或多个外表面上，并且所述成纤维细胞层在所述组织的一个或多个不同的表面上。在一些实施方案中，在生物打印时，该组织在其最小维度上为至少约50μm。在进一步的实施方案中，在生物打印时，该组织在其最小维度上为至少约150μm。在更进一步的实施方案中，在生物打印时，该组织在其最小维度上为至少约250μm。在更进一步的实施方案中，在生物打印时，该组织在其最小维度上为至少约500μm。在一些实施方案中，该组织在一个或多个侧面上被固定到生物相容性表面。在进一步的实施方案中，该生物相容性表面为多孔膜。在进一步的实施方案中，使该组织在一个或多个侧面上经受由流体流动引起的剪切力。在一些实施方案中，该组织用于体外分析。在进一步的实施方案中，该组织用于药物测试。在更进一步的实施方案中，该组织用于心血管药物测试。在一些实施方案中，平滑肌细胞、成纤维细胞和内皮细胞为成熟的分化细胞。在一些实施方案中，平滑肌细胞、成纤维细胞和内皮细胞为成熟的未分化细胞。在一些实施方案中，该平滑肌细胞为人类平滑肌细胞。在进一步的实施方案中，该平滑肌细胞来源于选自下组的组织：血液、血管组织、血管、淋巴管、消化道的组织、泌尿生殖道的组织、脂肪组织、呼吸道的组织、生殖系统的组织、骨髓、肌肉组织、结缔组织、中胚层来源的组织和脐带组织。在一些实施方案中，该内皮细胞为人类内皮细胞。在进一步的实施方案中，该内皮细胞来源于选自下组的组织：血管组织、血液、血管、淋巴管、消化道的组织、泌尿生殖道的组织、脂肪组织、呼吸道的组织、生殖系统的组织、中胚层来源的组织、骨髓和脐带组织。在一些实施方案中，该成纤维细胞为非血管的成纤维细胞。在其它的实施方案中，该成纤维细胞来源于血管外膜。在一些实施方案中，该细胞来源于特定的脊椎动物受试者。在进一步的实施方案中，该细胞来源于具有影响心血管系统的疾病或状况的脊椎动物受试者。在一些实施方案中，选择该细胞，以模拟特定的疾病状态。在一些实施方案中，该细胞被配置为模拟特定的疾病状态。在一些实施方案中，以模拟特定的疾病状态的方式，处理或调整该细胞。
在某些实施方案中，本文中公开了活的三维组织的阵列，其中每个所述组织包含哺乳动物细胞和选自以下的一种或多种：在一个或多个表面上的第一种哺乳动物细胞层；在一个或多个表面上的第二种哺乳动物细胞层。其中所述细胞彼此凝聚；其中每个所述组织的至少一个部分是生物打印的；其中每个所述组织被培养维持。在一些实施方案中，在使用时，该阵列中的每个组织不含任何预形成的支架。在一些实施方案中，该哺乳动物细胞包含来源于选自下组的组织的平滑肌细胞：血管组织、血液、血管、淋巴管、消化道的组织、泌尿生殖道的组织、脂肪组织、呼吸道的组织、生殖系统的组织、骨髓、肌肉组织、间叶组织、结缔组织、中胚层来源的组织和脐带组织。在一些实施方案中，该哺乳动物细胞包括来源于选自下组的组织的内皮细胞：血管组织、血液、血管、淋巴管、消化道的组织、泌尿生殖道的组织、脂肪组织、呼吸道的组织、生殖系统的组织、中胚层来源的组织、骨髓和脐带组织。在一些实施方案中，所述哺乳动物细胞包括非血管的成纤维细胞。在其它的实施方案中，该哺乳动物细胞包括血管的成纤维细胞。在进一步的实施方案中，该血管的成纤维细胞来源于血管外膜。在一些实施方案中，阵列中的每个组织基本相似。在其它的实施方案中，该阵列中的一个或多个组织是独特的。在一些实施方案中，该阵列中的个体组织代表在人体中的一种或多种特定的组织。在进一步的实施方案中，该阵列中的一个或多个个体组织代表选自下组的人体组织：血或淋巴管、肌肉、子宫、神经、粘膜、间皮、网膜、角膜、皮肤、肝、肾、心脏、气管、肺、骨、骨髓、脂肪、结缔组织、膀胱、乳腺、胰腺、脾、脑、食管、胃、肠、结肠、直肠、卵巢和前列腺。在一些实施方案中，每个组织存在于生物相容性多孔容器的孔中。在进一步的实施方案中，该孔用如下物质中的一种或多种包被：生物相容性水凝胶、蛋白质、化学品、肽、抗体或生长因子。在一些实施方案中，该孔用NovoGelTM包被。在更进一步的实施方案中，该孔用琼脂糖包被。在一些实施方案中，将每个组织放置在容器的孔内的多孔生物相容性膜上。在一些实施方案中，该容器与自动药物筛选相匹配。在一些实施方案中，该阵列中的每个组织在一个或多个侧面上被固定到生物相容性表面。在进一步的实施方案中，该生物相容性表面为多孔膜。在更进一步的实施方案中，使每个组织在一个或多个侧面经受由流体流动引起的剪切力。在一些实施方案中，采用来源于两个或更多个不同人类供体的细胞类型，来产生该阵列中的组织。在一些实施方案中，该阵列中的每个组织被独立地培养维持。在其它的实施方案中，该阵列中的两个或更多个个体组织交换可溶性因子。在一些实施方案中，该阵列用于体外分析。在进一步的实施方案中，该阵列用于药物测试。
在某些实施方案中，本文中公开了用于构建活的三维组织的方法，该方法包括如下步骤：制备一个或多个包含哺乳动物细胞的凝聚的多细胞聚集体；将所述一个或多个凝聚的多细胞聚集体放置在载体上；将如下的一种或多种施加到所述一个或多个凝聚的多细胞聚集体：在一个或多个外表面上的第一种哺乳动物细胞层；在一个或多个外表面上的第二种哺乳动物细胞层；以及孵育所述一个或多个多细胞聚集体，以使该多细胞聚集体凝聚并形成组织；其中所述孵育具有约2小时至约10天的持续时间。在一些实施方案中，所述组织的至少一个部分是生物打印的。在一些实施方案中，在制造时，该组织不含任何预形成的支架。在进一步的实施方案中，在制造时，该组织基本上不含任何预形成的支架。在其它的实施方案中，使用时，该组织基本上不含任何预形成的支架。在一些实施方案中，在生物打印时，该组织在其最小维度上为至少约50μm。在进一步的实施方案中，在生物打印时，该组织在其最小维度上为至少约150μm。在更进一步的实施方案中，在生物打印时，该组织在其最小维度上为至少约250μm。在其它的实施方案中，在生物打印时，该组织在其最小维度上为至少约500μm。在进一步的实施方案中，该组织在最小维度上具有约50μm至约600μm的长度、宽度或高度或厚度。在更进一步的实施方案中，该组织的长度、宽度、高度或厚度大于约1mm。在一些实施方案中，第一细胞类型的凝聚的多细胞聚集体包含间质细胞、结缔组织来源的细胞、中胚层来源的细胞。在进一步的实施方案中，该凝聚的多细胞聚集体另外包含第二细胞类型。在另外的实施方案中，第二细胞类型来源于上皮组织、内皮组织、间叶组织或外胚层组织。在一些实施方案中，施加哺乳动物细胞层包括：采用细胞的悬浮液、单层、一片或多片、多个层或融合的聚集体来涂覆该凝聚的多细胞集合体的至少一个表面。在进一步的实施方案中，该悬浮液包含约1x104至约1x106个细胞/μl。在更进一步的实施方案中，细胞悬浮液包含约1x105至约1.5x105个细胞/μl。在一些实施方案中，施加哺乳动物细胞层包括：将细胞悬浮液以空间分布小滴的形式直接分配到所述凝聚的多细胞聚集体的一个表面上。在一些实施方案中，施加哺乳动物细胞层包括：将细胞悬浮液以喷雾的形式直接分配到所述凝聚的多细胞聚集体的一个表面上。在一些实施方案中，施加哺乳动物细胞层包括：将所述凝聚的多细胞聚集体的一个或多个表面放置为与建立的细胞层直接接触。在进一步的实施方案中，该建立的细胞层包括细胞的单层、多层、一个或多个片或融合的聚集体。在一些实施方案中，将第一类型的细胞层施加到所述凝聚的多细胞聚集体的一个或多个表面上，并将第二类型的细胞层施加到所述凝聚的多细胞聚集体的一个或多个不同的表面上。在一些实施方案中，该孵育具有约2小时至约10天的持续时间。在一些实施方案中，在放置一种或多种凝聚的多细胞聚集体时进行施加以下的一种或多种的步骤：在一个或多个表面上的第一类型的细胞层；在一个或多个表面上的第二类型的细胞层。在其它实施方案中，在所述孵育过程中进行施加以下的一种或多种的步骤：在一个或多个外表面上的第一类型的细胞层；在一个或多个外表面上的第二类型的细胞层。在一些实施方案中，该方法进一步包括以下步骤：使该组织在一个或多个侧面上经受由流体流动引起的剪切力。
在某些实施方案中，本文中公开了活的三维血管壁节段，该三维血管壁节段包含：平滑肌细胞和选自以下的一种或多种：在一个或多个表面上的内皮细胞层；在一个或多个表面上的成纤维细胞层，其中所述平滑肌细胞彼此凝聚；其中所述血管壁节段的至少一个部分是生物打印的；并且，其中所述血管壁节段是非管状的。在一些实施方案中，在制造时，该血管壁节段基本上不含任何预形成的支架。在其它的实施方案中，在使用时，该血管壁节段基本上不含任何预形成的支架。在一些实施方案中，该血管壁节段基本上为平面。在一些实施方案中，该内皮细胞层包括内皮细胞的单层、一个或多个层、一个或多个片或融合的聚集体。在一些实施方案中，该血管壁节段包括在一个或多个表面上的内皮细胞层。在一些实施方案中，该成纤维细胞层包括成纤维细胞的单层、一个或多个层、一个或多个片或融合的聚集体。在一些实施方案中，该血管壁节段包括在所述血管壁节段的一个或多个表面上的成纤维细胞层。在一些实施方案中，该血管壁节段包括内皮细胞层和所述成纤维细胞层；其中所述内皮细胞层在所述血管壁节段的一个或多个外表面上，并且所述成纤维细胞层在所述血管壁节段的一个或多个不同的表面上。在一些实施方案中，在生物打印时，该血管壁节段在其最小维度上为至少约50μm。在进一步的实施方案中，在生物打印时，该血管壁节段在其最小维度上为至少约150μm。在更进一步的实施方案中，在生物打印时，该血管壁节段在其最小维度上为至少约250μm。在更进一步的实施方案中，在生物打印时，该血管壁节段在其最小维度上为至少约500μm。在一些实施方案中，该血管壁节段在一个或多个侧面上被固定到生物相容性表面。在进一步的实施方案中，该生物相容性表面为多孔膜。在更进一步的实施方案中，使该血管壁节段在一个或多个侧面上经受由流体流动引起的剪切力。在一些实施方案中，该血管壁节段用于体外分析。在进一步的实施方案中，该血管壁节段用于药物测试。在更进一步的实施方案中，该血管壁节段用于心血管药物测试。在一些实施方案中，平滑肌细胞、成纤维细胞和内皮细胞为成熟的分化细胞。在其它实施方案中，平滑肌细胞、成纤维细胞和内皮细胞为成熟的未分化细胞。在一些实施方案中，该平滑肌细胞为人类平滑肌细胞。在进一步的实施方案中，该平滑肌细胞来源于选自下组的组织：血管组织、血液、血管、淋巴管、消化道的组织、泌尿生殖道的组织、脂肪组织、呼吸道的组织、生殖系统的组织、骨髓、肌肉组织、结缔组织和脐带组织。在一些实施方案中，该内皮细胞为人类内皮细胞。在进一步的实施方案中，该内皮细胞来源于选自下组的组织：血管组织、血液、血管、淋巴管、消化道的组织、泌尿生殖道的组织、脂肪组织、呼吸道的组织、生殖系统的组织、骨髓和脐带组织。在一些实施方案中，该成纤维细胞为非血管的成纤维细胞。在其它的实施方案中，该成纤维细胞为血管的成纤维细胞。在进一步的实施方案中，该成纤维细胞来源于血管外膜。在一些实施方案中，一种或多种该细胞组分来源于特定的脊椎动物受试者。在进一步的实施方案中，一种或多种该细胞组分来源于具有影响心血管系统的疾病或状况的脊椎动物受试者。在一些实施方案中，选择和/或配置一种或多种该细胞组分，以模拟特定的疾病状态。在一些实施方案中，以模拟特定的疾病状态的方式，处理和/或调整一种或多种该细胞组分。
在某些实施方案中，本文中公开了活的三维血管壁节段的阵列，其中每个所述血管壁节段包含平滑肌细胞和选自以下的一种或多种：在一个或多个表面上的内皮细胞层；在一个或多个表面上的成纤维细胞层；其中所述平滑肌细胞彼此凝聚；其中每个所述血管壁节段被工程化；其中每个所述血管壁节段被培养维持。在一些实施方案中，该阵列中每个血管壁节段的至少一个部分是生物打印的。在进一步的实施方案中，在制造时，在该阵列中的每个血管壁节段基本上不含任何预形成的支架。在其它的实施方案中，在使用时，该阵列中的每个血管壁节段基本上不含任何预形成的支架。在一些实施方案中，每个血管壁节段存在于生物相容性多孔容器的孔内。在进一步的实施方案中，该孔用如下物质中的一种或多种包被：生物相容性水凝胶、蛋白质、化学品、肽、抗体或生长因子。在一些实施方案中，该用NovoGelTM包被。在其它实施方案中，该孔用琼脂糖包被。在一些实施方案中，将每个血管壁节段放在所述容器的所述孔内的多孔生物相容性膜上。在一些实施方案中，该容器与自动药物筛选相匹配。在一些实施方案中，该阵列中的每个血管壁节段在一个或多个侧面上被固定到生物相容性表面。在进一步的实施方案中，该生物相容性表面为多孔膜。在更进一步的实施方案中，使每个血管壁节段在一个或多个侧面上经受由流体流动引起的剪切力。在一些实施方案中，阵列中的每个血管壁节段基本相似。在其它的实施方案中，该阵列中的一个或多个血管壁节段是独特的。在一些实施方案中，该阵列中的血管壁节段代表人体中的一种或多种不同的血管组织。在一些实施方案中，采用来源于两个或更多个不同的人类供体的细胞类型，来产生该阵列中的血管壁节段。在一些实施方案中，该阵列中的每个血管壁节段被独立地培养维持。在其它的实施方案中，该阵列中的两个或更多个个体血管壁节段交换可溶性因子。在一些实施方案中，该阵列用于体外分析。在进一步的实施方案中，该阵列用于药物测试。在更进一步的实施方案中，该阵列用于心血管药物测试。
在某些实施方案中，本文中公开了用于构建活的三维血管壁节段的方法，该方法包括如下步骤：在生物相容性载体上，培养成纤维细胞层；制备一个或多个包含平滑肌细胞的凝聚的多细胞聚集体，其中所述聚集体基本上为球形或基本上为圆柱形；将一个或多个凝聚的多细胞聚集体放置在所述载体上；在一个或多个表面上，向所述一个或多个凝聚的多细胞聚集体施加内皮细胞层；并孵育所述多细胞聚集体，以使所述多细胞聚集体凝聚以形成组织。
在一些实施方案中，本文中公开了工程化的组织培养系统，其包含基于细胞的三维元件和暂时的或可移除的限制材料，其中该限制材料允许细胞与培养基之间直接接触。在一些实施方案中，该工程化的、基于细胞的三维元件是生物打印的。在进一步的实施方案中，该工程化的、基于细胞的三维元件不含任何预形成的支架。在一些实施方案中，该限制材料具有至少一个以下特征：基本上不粘附于细胞；是生物相容的；是可挤出的；是非细胞的；具有足够的强度，以提供对细胞的支持；和不溶于水性条件。在进一步的实施方案中，该限制材料不是塑料，不是玻璃，且不是陶瓷。在一些实施方案中，该限制材料是水凝胶。在进一步的实施方案中，该限制材料是NovoGelTM。在进一步的实施方案中，该限制材料包括如下的一种或多种：琼脂糖、聚乙二醇二丙烯酸酯(PEG-DA)、透明质酸、明胶、泊洛沙姆、甲基丙烯酸羟乙酯、肽水凝胶、MatrigelTM、聚二甲硅氧烷、硅、丝、聚丙烯酰胺、聚乳酸、表面活性剂多元醇和藻酸盐。在一些实施方案中，该细胞和/或限制材料的至少一种从生物打印机挤出。在进一步的实施方案中，在限制材料中存在间隙，并且其中营养培养基能够通过该间隙接触细胞。在更进一步的实施方案中，该间隙为约100μm至约30mm宽。在一些实施方案中，该间隙围绕该结构不均匀地分布，从而使该组织的细胞不均匀地暴露于营养物。在一些实施方案中，其中该组织至少约10％的表面积暴露于适合于与营养培养基接触的间隙。在一些实施方案中，该限制材料覆盖在细胞上，作为至少一个细长的元件。在进一步的实施方案中，限制材料的细长元件具有约100μm至约1mm的横截面厚度。在一些实施方案中，在限制材料的细长元件之间存在间隙。在一些实施方案中，当从生物打印机挤出该限制材料时，在细长元件之间留下间隙。在其它实施方案中，将至少一些限制材料从系统中除去，以提供间隙。在一些实施方案中，限制材料的细长材料是基本上平行的，并且该间隙是细长的。在一些实施方案中，限制材料的细长元件被布置在网格中。在一些实施方案中，限制材料的细长元件将该结构附着在支承面上。在一些实施方案中，该系统适合于运送。在一些实施方案中，生物打印的细胞包含以下中的至少一种：平滑肌细胞、内皮细胞、成纤维细胞和上皮细胞。在一些实施方案中，该营养培养基包含以下中的至少一种：氧(O2)、碳源、氮源、生长因子、盐、矿物质、维生素、血清、抗生素、化学品、蛋白质、核酸、药物化合物和抗体。
在某些实施方案中，本文中公开了工程化的活组织，其包含三维的包含细胞的元件，通过水凝胶固定在合适的位置，其中该水凝胶作为圆柱体或带状体被分配到所述包含细胞的元件上，在该圆柱体或带状体之间存在间隙，细胞通过该间隙接近营养物，并且其中该水凝胶可从该组织移除。
在某些实施方案中，本文中公开了用于增加工程化组织的存活力的方法，包括：通过暂时的或半永久性的网格，在该组织与营养培养基之间提供直接接触，其中该组织不含任何预形成的支架。在一些实施方案中，通过暂时的或半永久性的网格在该组织与培养基之间提供直接接触的步骤包括：将所述组织束缚在多孔或间隙材料中。在进一步的实施方案中，该孔或间隙为约100μm至约30mm宽。在进一步的实施方案中，该多孔或间隙材料是水凝胶。在更进一步的实施方案中，该多孔或间隙材料是琼脂糖。在一些实施方案中，工程化组织的存活力在体外增加。在一些实施方案中，构成工程化组织的至少部分细胞的存活力得到延长。在进一步的实施方案，该细胞的存活力延长1天或以上。在一些实施方案中，该至少一种营养物选自：碳源、氮源、生长因子、盐、矿物质、维生素、血清、抗生素、蛋白质、核酸、药物化合物和抗体。在一些实施方案中，至少一种营养物是氧(O2)。在进一步的实施方案中，该多孔或间隙水凝胶限制材料旨在提供在一个或多个表面上对营养物的暴露具有差异的生物打印的细胞。
在某些实施方案中，本文中公开了制备组织培养系统的方法，包括如下步骤：在生物相容性基质上建立包含细胞的三维元件；并分配限制材料以覆盖该包含细胞的三维元件，其中该覆盖的限制材料允许该细胞的至少一部分与生长培养基接触。
在某些实施方案中，本文中公开了制备组织培养系统的方法，包括如下步骤：在表面上分配限制材料的周界；在该周界内分配细胞；并分配限制材料以覆盖该细胞，其中该覆盖的限制材料允许该细胞的至少一部分与生长培养基接触。在一些实施方案中，限制材料的分配是通过生物打印完成的。在一些实施方案中，该方法包括或进一步包括将该系统在合适的培养基中培养，以使生物打印的细胞构建体成熟。
实施例
下述具体实施例应理解为仅是说明性的，而不以任何方式对公开内容的其他部分进行限制。
实施例1-细胞培养
平滑肌细胞
将原代人主动脉平滑肌细胞(HASMC；GIBCO/Invitrogen Corp.,Carlsbad，CA)在补充有10％胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素、0.1mg/mL链霉素、0.25μg/mL两性霉素B、0.01M HEPES(均来自Invitrogen Corp.,Carlsbad，CA)、50mg/L脯氨酸、50mg/L甘氨酸、20mg/L丙氨酸、50mg/L抗坏血酸和3μg/L CuSO4(全部来自Sigma，St.Louis,MO)的低葡萄糖Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM；Invitrogen Corp.,Carlsbad，CA)中，在37℃和5％CO2下维持并扩充。在所有的研究中使用传代4-8代的HASMC的铺满培养物。
内皮细胞
将原代人主动脉内皮细胞(HAEC；GIBCO/Invitrogen Corp.,Carlsbad，CA)在补充有10％FBS、1μg/mL氢化可的松、10ng/mL人表皮生长因子、3ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、10μg/mL肝素、100U/mL青霉素、0.1mg/mL链霉素和0.25μg/mL两性霉素B(均来自Invitrogen Corp.,Carlsbad，CA)的培养基199(Invitrogen Corp.,Carlsbad，CA)中维持并扩充。细胞在37℃和5％CO2下，在明胶(来自猪血清，Sigma,St.Louis,MO)包被的、组织培养物处理的烧瓶中生长。在所有的研究中使用传代4-8代的HAEC的铺满培养物。
成纤维细胞
将原代人皮肤成纤维细胞(HDF；GIBCO/Invitrogen Corp.,Carlsbad，CA)在补充有2％FBS、1μg/mL氢化可的松、10ng/mL人表皮生长因子、3ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、10μg/mL肝素、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素(均来自Invitrogen Corp.,Carlsbad，CA)的培养基106(Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)中，在37℃和5％CO2下维持并扩充。在所有的研究中使用传代4-8代的HDF的铺满培养物。
来自人脂肪抽吸物的SVF的SMC样细胞
从胶原酶消化脂肪抽提物后分离的细胞的附着部分产生SMC样细胞。此消化产生了被称作基质血管组分(SVF)的一群细胞。将SVF的细胞接种到标准组织培养塑料上，并用合适的培养条件进一步选择贴壁细胞。将来自脂肪组织抽吸物的SVF的SMC样细胞在补充有10％胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素、0.1mg/mL链霉素、0.25μg/mL两性霉素B、0.01M HEPES(均来自Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)、50mg/L脯氨酸、50mg/L甘氨酸、20mg/L丙氨酸、50mg/L抗坏血酸和3μg/L CuSO4(均来自Sigma,St.Louis,MO)的高葡萄糖Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM；Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)中，在37℃和5％CO2下维持并扩充。在所有的研究中使用传代3-8代的SVF-SMC的铺满培养物。
来自人脂肪抽吸物的SVF的EC
将来自基质血管组分(SVF)的内皮细胞在生长培养基中维持并扩充，该培养基通常用于生长真正(bona fide)内皮细胞(EC)的原代分离物。具体而言，将SVF-EC维持在补充有10％FBS、1μg/mL氢化可的松、10ng/mL人表皮生长因子、3ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、10μg/mL肝素、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素的M199中。使细胞在37℃和5％CO2下，在组织培养基处理的烧瓶中生长。在所有的研究中使用传代3-8代的SVF-EC的铺满培养物。
肺来源的细胞
正常人类肺成纤维细胞从LifeLine technologies或Lonza来获得，并根据制造商的说明书，利用来自各个供应商的培养基来增殖。小的气道上皮细胞购自Lonza，并根据制造商的说明书在供应商提供的培养基中生长。肺气道和肺血管平滑肌细胞从LifeLine Technologies获得，并根据制造商的说明书在供应商提供的培养基中进行培养。
实施例2-NovoGelTM溶液和模具
2％和4％(w/v)NovoGel TM 溶液的制备
将1g或2g(分别对应2％或4％)的NovoGelTM(Organovo,SanDiego,CA)溶于50mL Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(DPBS；InvitrogenCorp.,Carlsbad,CA)中。简言之，将DPBS和NovoGelTM在恒定搅拌下在加热板上加热到85℃，直至NovoGelTM完全溶解。通过蒸汽灭菌法将NovoGelTM溶液在125℃下灭菌25分钟。NovoGelTM溶液保持于液相，只要温度维持在65.5℃以上。低于这个温度会发生相变，NovoGelTM溶液的粘度增加，并且NovoGelTM形成固体凝胶。
NovoGel TM 模具的制备
采用适配10cm培养皿的模具，制造用于孵育圆柱形生物墨水的NovoGelTM模具。简言之，将模具使用70％乙醇溶液预灭菌，并使该模具经受45分钟紫外线照射。将灭菌的模具放在10cm培养皿(VWR International LLC,West Chester,PA)的上方，并牢固地附接。将这个组装体(模具+培养皿)垂直保持，并将45mL预加温的无菌2％NovoGelTM溶液倒入模具与培养皿之间的间隙。随后，将该组装体在室温下水平放置1小时，以使NovoGelTM完全胶凝。在胶凝以后，取出印制物，并用DPBS冲洗两次NovoGelTM模具。然后，向NovoGelTM模具加入17.5mL的HASMC培养基，用于孵育多型圆柱形生物墨水。
实施例3-HASMC-HAEC多型圆柱形生物墨水的制造
为了制备多型圆柱形生物墨水，单独收集HASMC和HAEC，随后以预先确定的比例混合。简言之，从铺满的培养瓶中除去培养基，并用DPBS(1ml/15cm2生长面积)冲洗细胞。通过在胰蛋白酶(1ml/15cm2生长面积；Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)存在下孵育10分钟，使细胞从培养瓶的表面上脱离。采用0.15％胰蛋白酶来分离HASMC，而采用0.1％胰蛋白酶来分离HAEC。在孵育后，将合适的培养基加入到培养瓶中(2X体积，相对于胰蛋白酶体积)。将细胞悬浮液在200g下离心6分钟，随后完全除去上清液。将细胞沉淀物重悬浮于各自的培养基中，并利用血细胞计数器计数。将适当体积的HASMC和HAEC合并，以产生含有15％HAEC和其余85％HASMC(基于总细胞群的％)的多型细胞悬浮液。将该多型细胞悬浮液在200g下离心5分钟，随后完全除去上清液。将多型细胞沉淀物重悬浮于6mL的HASMC培养基中，并转移到20mL玻璃小瓶(VWRInternational LLC,West Chester,PA)中，随后在定轨摇床上以150rpm在37℃和5％CO2下孵育60分钟。这使得细胞彼此聚集，并开始细胞-细胞粘附。在孵育后，将细胞悬浮液转移到15mL离心管中，并在200g下离心5分钟。在除去上清液培养基之后，将该细胞沉淀物重悬浮于400μl的HASMC培养基中，并用移液管上下吸取几次，以确保所有的细胞簇被打破。将细胞悬浮液转移到放置在15mL离心管中的0.5mL微量离心管(VWR International LLC,West Chester,PA)中，随后在2000g下离心4分钟，以形成高度致密并压紧的细胞沉淀物。将上清液培养基吸出，并通过抽吸将细胞转移到毛细管(OD1.5mm,ID0.5mm,L75mm；Drummond Scientific Co.,Broomall,PA)中，以产生50mm长的圆柱形生物墨水。在37℃和5％CO2下，将毛细管中的细胞浆料在HASMC培养基中孵育20分钟。随后，使用随毛细管提供的柱塞，将圆柱形生物墨水从毛细管中挤出到NovoGelTM模具(例如，参见实施例2)(覆盖有HASMC培养基)的凹槽中。将圆柱形生物墨水在37℃和5％CO2下孵育24小时。
实施例4-生物打印包含HASMC和HAEC多型圆柱形生物墨水的血管壁节段
使用NovoGen MMX BioprinterTM(Organovo,Inc.,San Diego,CA)，在NovoGelTM底板(100毫米培养皿尺寸)上、在NovoGelTM包被的孔内，或者直接向多孔板(例如6-孔板)中的 插入物上生物打印血管壁模拟节段。该过程包括以下三个阶段：
HASMC-HAEC多型生物墨水的制备
对人主动脉平滑肌细胞(HASMC)和人主动脉内皮细胞(HAEC)的培养物进行胰蛋白酶化、计数并以适当的量混合，以生产以85:15或70:30的比例包含HASMC：HAEC的生物墨水。将该多型细胞悬浮液在旋转震荡器上摇动60分钟，收集并离心。将细胞吸入266或500μm(ID)玻璃微细管中，然后挤出到培养基覆盖的NovoGelTM板内，并孵育最少6小时。
补片/三维细胞片的生物打印
在多孔板的孔内或NovoGelTM底板(100mm培养皿尺寸)上的NovoGelTM床上打印的情况下，生物打印第一层NovoGelTM圆柱体。然后，在NovoGelTM圆柱体的上方，利用NovoGelTM棒来生物打印箱盒(box)，使得内部空间为8mm长x1.25mm宽。将成熟的圆柱形生物墨水装载到生物打印机上，用于在该箱盒内打印。最后，将第三层NovoGelTM圆柱体打印在第二层的上方，其或者覆盖细胞的整个长度或者在顶部创建网格/网孔型结构。在该板的孔内的插入物上打印的情况下，去除前面描述的第一层NovoGelTM棒。随后，用合适的细胞培养基覆盖该生物打印的构建体，并孵育，在孵育期间，邻接生物墨水区段融合，以形成三维细胞补片。
生物打印的构建体的成熟
将包含HASMC-HAEC生物墨水的生物打印的构建体孵育1至7天，以使该构建体成熟，并给HAEC提供充足的时间来分选至该构建体的外围，从而模拟血管壁的一段。在一些实验中，使该三维细胞补片经受剪切力(即脉动流)，以有助于HAEC分选的过程。
实施例5-HASMC-HDF-HAEC多型圆柱形生物墨水的制造
为了制备多型圆柱形生物墨水，单独收集HASMC、HDF和HAEC，随后以预先确定的比例(例如，70:25:5的HASMC:HDF:HAEC比例)混合。简言之，从铺满的培养瓶中除去培养基，并用DPBS(1mL/10cm2生长面积)冲洗细胞。通过在胰蛋白酶(1mL/15cm2生长面积；Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)存在下孵育10分钟，使细胞从培养瓶的表面上脱离。采用0.15％胰蛋白酶来分离HASMC和HDF，而采用0.1％胰蛋白酶来分离HAEC。在孵育后，将合适的培养基加入到培养瓶(2X体积，相对于胰蛋白酶体积)中。将细胞悬浮液在200g下离心6分钟，随后完全除去上清液。将细胞沉淀物重悬浮于各自的培养基中，并利用血细胞计数器计数。将适当体积的HASMC、HDF和HAEC合并，以产生多型细胞悬浮液。将该多型细胞悬浮液在200g下离心5分钟，随后吸出上清液。将多型细胞沉淀物重悬浮于6mL的HASMC培养基中，并转移到20mL玻璃小管(VWR InternationalLLC,West Chester,PA)中，随后在定轨摇床上以150rpm在37℃和5％CO2下孵育60分钟。这使得细胞彼此聚集，并开始细胞-细胞粘附。在孵育后，将细胞悬浮液转移到15mL离心管中，并在200g下离心5分钟。在除去上清液培养基之后，将细胞沉淀物重悬浮于400μl的HASMC培养基中，并用移液管上下吸取几次，以确保所有的细胞簇被打破。将该细胞悬浮液转移到放置在15mL离心管中的0.5mL微量离心管(VWR International LLC,West Chester,PA)中，随后在2000g下离心4分钟，以形成高度致密并压紧的细胞沉淀物。将上清液培养基吸出，并通过抽吸将细胞转移到毛细管(OD1.5mm,ID0.266mm,L75mm；Drummond Scientific Co.,Broomall,PA)中，以产生50mm长的圆柱形生物墨水聚集体。在37℃和5％CO2下，将毛细管中的细胞浆料在HASMC培养基中孵育20分钟。随后，使用随毛细管提供的柱塞，将圆柱形生物墨水从毛细管中挤出到NovoGelTM模具(参见，例如，实施例2)(覆盖有HASMC培养基)的凹槽中。将圆柱形生物墨水在37℃和5％CO2下孵育6至24小时。
实施例6-生物打印包含多型HASMC、HAEC和HDFa生物墨水的血管壁节段
使用NovoGen MMX BioprinterTM(Organovo,Inc.,San Diego,CA)，在NovoGelTM底板(100毫米培养皿尺寸)上、在NovoGelTM包被的孔内，或者直接向多孔板(例如6-孔板)中的插入物上生物打印血管壁模拟节段。该过程包括以下三个阶段：
HASMC-HDFa-HAEC生物墨水的制备
对HASMC、HAEC和HDFa的培养物进行胰蛋白酶化、计数并以适当的量混合，以产生以70:15:15的比例包含HASMC：HDPa：HAEC的生物墨水。将该多型细胞悬浮液在旋转震荡器上摇动60分钟，收集并离心。将细胞吸入266或500μm(ID)玻璃微细管中，然后挤出到培养基覆盖的NovoGelTM板，并培养最少6小时。
补片/三维细胞片的生物打印
在多孔板的孔内或NovoGelTM底板(100mm培养皿尺寸)上的NovoGelTM床上打印的情况下，生物打印第一层NovoGelTM圆柱体。然后，在NovoGelTM圆柱体的上方，利用NovoGelTM棒来生物打印箱盒，使得内部空间为8mm长x1.25mm宽。将成熟的圆柱形生物墨水凝聚体装载到生物打印机上，用于在箱盒内打印。最后，将第三层NovoGelTM圆柱体打印在第二层的上方，其或者覆盖细胞的整个长度或者在顶部创建网格/网孔类型的结构。在该板的孔内的插入物上打印的情况下，去除前前描述的第一层NovoGelTM棒。随后，用合适的细胞培养基覆盖该生物打印的构建体，并孵育，在孵育期间，邻接的生物墨水区段融合，以形成三维细胞块。
生物打印的构建体的成熟
将包含多型HASMC-HDFa-HAEC生物墨水的生物打印的构建体孵育1至7天，以使该构建体成熟，并为HAEC提供充足的时间来分选至该构建体的外围，从而模拟血管壁的一段。在一些实验中，使该三维细胞补片经受剪切力(即脉动流)，以有助于HAEC分选的过程。
实施例7-SVF-SMC-SVF-EC多型圆柱形生物墨水的制造
为了制备多型圆柱形生物墨水，单独收集SVF-SMC和SVF-EC，随后以预先确定的比例混合。简言之，从铺满的培养瓶中除去培养基，并用DPBS(1mL/5cm2生长面积)冲洗细胞。通过在TrypLE(InvitrogenCorp.,Carlsbad,CA)存在下孵育5-10分钟，使细胞从培养瓶的表面上脱离。在孵育后，将合适的培养基加入到培养瓶中来猝灭酶活性。将细胞悬浮液在200g下离心6分钟，随后完全除去上清液。将细胞沉淀物重悬浮于各自的培养基中，并利用血细胞计数器计数。将适当体积的SVF-SMC和SVF-EC合并，以产生含有15％SVF-EC和其余85％SVF-SMC(基于总细胞群的％)的多型细胞悬浮液。将多型细胞悬浮液在200g下离心5分钟，随后完全除去上清液。将多型细胞沉淀物重悬浮于6mL的SVF-SMC培养基中，并转移到20mL玻璃小管(VWR International LLC,West Chester,PA)中，随后在定轨摇床上以150rpm在37℃和5％CO2下孵育60分钟。这使得细胞彼此聚集，并开始细胞-细胞粘附。在孵育后，将细胞悬浮液转移到15mL离心管中，并在200g下离心5分钟。在除去上清液培养基之后，将细胞沉淀物重悬浮于400μl的SVF-SMC培养基中，并用移液管上下吸取几次，以确保所有的细胞簇被打破。将细胞悬浮液转移到放置在15mL离心管中的0.5mL微量离心管(VWR International LLC,West Chester,PA)中，随后在2000g下离心4分钟，以形成高度致密并压紧的细胞沉淀物。将上清液培养基吸出，并通过抽吸将细胞转移到毛细管(OD1.25mm,ID0.266mm,L75mm；Drummond Scientific Co.,Broomall,PA)中，以产生50mm长的圆柱形生物墨水聚集体。在37℃和5％CO2下，将毛细管中的细胞浆料在SVF-SMC培养基中孵育20分钟。随后，使用随毛细管提供的柱塞，将圆柱形生物墨水从毛细管中挤出到NovoGelTM模具(参见，例如，实施例2)(覆盖有SVF-SMC培养基)的凹槽中。将圆柱形生物墨水在37℃和5％CO2下孵育6至12小时。实施例8-生物打印包含血管SMC和EC混合物的血管壁节段
利用NovoGen MMX BioprinterTM(Organovo,Inc.San Diego,CA)，将血管壁构建体生物打印到预先用1.5mL2％(w/v)NovoGelTM包被的6孔培养板的孔中。用人血管平滑肌细胞(SMC)和人内皮细胞(EC)的混合物(SMC:EC比例为85:15或70:30)制备圆柱形生物墨水。通过将细胞沉淀物(SMC:EC)吸至内径(ID)500μm或266μm的玻璃微毛细管中，来产生生物墨水。随后，将生物墨水圆柱体挤出到覆盖有合适培养基的NovoGelTM模具中。在生物打印之前，将生物墨水保持6至18小时。使用含有SMC和EC混合物的多型生物墨水。在这些实验中，将生物墨水内的EC分选到生物墨水聚集体的外围，导致形成由EC覆盖并含有富SMC构建体壁的构建体。该过程导致形成含有由SMC和EC覆盖物(例如，假定的中膜和内膜)组成的壁的血管壁构建体。使用生物打印方案将该构建体生物打印在培养孔的中心，并且向培养孔填充合适的培养基，并将构建体返回到培养箱中以供成熟和评价。生物打印后，用适量的培养基(例如，对于6孔板的1个孔是4mL)覆盖该构建体。总之，本实施例描述了血管SMC和EC用于在标准尺寸多孔组织培养板中生物打印血管壁节段或模拟物的用途。所得血管壁节段或模拟物的特征在于一个或多个EC外层和主要包含或仅包含SMC的内壁。
实施例9-生物打印包含人血管SMC与EC覆盖物的血管壁节段
利用NovoGen MMX BioprinterTM(Organovo,Inc.San Diego,CA)，将血管壁构建体生物打印到预先用1.5mL2％(w/v)NovoGelTM所覆盖的6孔培养板的孔中。用人血管平滑肌细胞(SMC)制备细胞生物墨水。通过将细胞沉淀物(SMC)吸至内径(ID)为500μm或266μm的玻璃微毛细管中来产生生物墨水。随后，将圆柱形生物墨水聚集体挤出到覆盖有合适培养基的NovoGelTM模具中。在生物打印之前，将该生物墨水保持6至18小时。将EC-浓缩物(1-1.5x105个细胞/μl)直接生物打印到之前生物打印的SMC结构的上方，以形成该构建体的第二层。该过程导致形成含有由SMC和EC覆盖物(例如，假定的中膜和内膜)组成的壁的血管壁构建体。使用生物打印方案将该构建体生物打印在培养孔的中心。生物打印后，用适量的培养基(例如，对于6孔板的1个孔是4mL)覆盖该构建体，并将其返回到培养箱中用于成熟和评价。总之，本实施例描述了血管SMC和EC用于在标准尺寸多孔组织培养板块中生物打印血管壁节段或模拟物的用途。所得血管壁节段或模拟物的特征在于EC的外层和主要包含或仅包含SMC的内壁。。
实施例10-利用NovoGelTM容纳生物打印包含层叠HAEC的HASMC的血管壁节段
使用NovoGen MMX BioprinterTM(Organovo,Inc.,San Diego,CA)，在NovoGelTM包被的孔内或者直接向多孔板(例如6孔板)的插入物上，生物打印血管壁模拟节段。该过程包括下面三个阶段：
HASMC生物墨水的制备
对人主动脉平滑肌细胞(HASMC)的培养物进行胰蛋白酶化，之后在旋转震荡器上摇动60分钟。在摇动之后，将细胞收集、离心并吸至266或500μm(ID)的玻璃微毛细管中。最后，将细胞挤出到培养基覆盖的NovoGelTM板内，并孵育至少6小时。
层叠HAEC的HASMC补片的生物打印
就在生物打印补片(例如，节段)之前，对人主动脉内皮细胞(HAEC)培养物进行胰蛋白酶化、计数，之后以1x106个细胞/10μL培养基的工作浓度重悬浮于HAEC培养基中。将HAEC悬浮液置于将要用于对生物打印的补片进行层化的生物打印机中。在打印到多孔板的孔内的NovoGelTM床上的情况下，生物打印第一层NovoGelTM圆柱体。然后，在它的上方，利用NovoGelTM棒来生物打印箱盒，使得内部空间为8mm长x1.25毫米宽。将成熟的圆柱形HASMC生物墨水装载到生物打印机上用于在该箱盒内打印。然后，通过生物打印机将悬浮液中的HAEC吸入干净的微毛细管中，并分配到打印的HASMC层的上方4次，接近所打印的补片的四个角。每滴的体积为2.5μL。在继续打印第三层之前，将该构建体孵育15-30分钟。最后，将第三层NovoGelTM圆柱体打印在第二层的上方，以在顶部创建网格/网孔型结构。在打印到培养板的孔内部的插入物上的情况下，除去前面描述的第一层NovoGelTM棒。随后，用合适的细胞培养基覆盖生物打印的构建体并进行孵育。
生物打印的构建体的成熟
将生物打印的构建体孵育1至7天，以使该构建体成熟，并为HAEC提供充足的时间，以在HASMC补片的上方形成均匀的薄单层。在某些实验中，使该三维细胞补片经受剪切力(即脉动流)。
实施例11-利用NovoGelTM容纳向HDFa单层上生物打印包含层叠HAEC的HASMC的血管壁节段
使用NovoGen MMX BioprinterTM(Organovo,Inc.,San Diego,CA)，直接向多孔板(例如6孔板)的插入物上生物打印血管壁模拟节段。该过程包括以下四个阶段：
HDFa’s向 膜上的培养
以20000个细胞/cm2的密度，将人成体皮肤成纤维细胞(HDFa)接种到膜上，并培养至少6天。这使细胞附着、生长并变成在膜上铺满的层。
HASMC生物墨水的制备
对人主动脉平滑肌细胞(HASMC)的培养物进行胰蛋白酶化，并在旋转震荡器上摇动60分钟。在摇动之后，将细胞收集、离心并吸到266或500μm(ID)玻璃微毛细管中。随后，将细胞挤出到培养基覆盖的NovoGelTM板中，并孵育至少6小时。
层叠HAEC的HASMC补片的生物打印
就在生物打印补片(例如，节段)之前，对人主动脉内皮细胞(HAEC)培养物进行胰蛋白酶化、计数，之后以1x106个细胞/10μL培养基的工作浓度重悬浮于HAEC培养基中。将HAEC悬浮液置于将要用于对生物打印的补片进行层化的生物打印机中。完全吸出具有生长在膜上的HDFa’s的多孔板中的培养基，并将该板转移到生物打印机上。直接在该膜上的HDFa’s的上方，利用NovoGelTM棒来生物打印箱盒，使得限定的空间为8mm长x1.25mm宽。将成熟的HASMC生物墨水圆柱体装载到生物打印机上用于在该箱盒内打印。然后，通过生物打印机将悬浮液中的HAEC吸到干净的微毛细管中，并分配到打印的HASMC层的上方4次，接近所打印的补片的四个角。每滴的体积为2.5μL。在继续打印顶部NovoGelTM棒层之前，将该构建体孵育15-30分钟。最后，打印NovoGelTM圆柱体的顶层，以创建网格/网孔型结构。随后，用合适的细胞培养基覆盖该生物打印的构建体并孵育。
生物打印的构建体的成熟
将生物打印的构建体孵育1至7天，以使该构建体成熟，并为HAEC提供充足的时间，以在HASMC补片的上方形成均匀的薄单层。实施例12-用于空间限制构建体同时允许与培养基直接接触的水凝胶网格
利用NovoGen MMX BioprinterTM(Organovo,Inc.,San Diego,CA)，穿过三维细胞片的顶面的一部分来生物打印圆柱形水凝胶元件。该网格向该片提供空间限制，并允许该片与周围培养基之间直接接触。首先，生物打印水凝胶基底层。其次，生物打印限定出8mm长x1.25mm宽的空间的水凝胶窗口。第三，在该水凝胶窗口内生物打印细胞生物墨水，以形成三维细胞片。并且，第四，生物打印水凝胶网格结构。在各个试验中，水凝胶元件的尺寸为直径约100μm至1mm，并且元件之间的间距为大约100μm至10mm。
在一些试验中，将水凝胶元件沿着一个方向打印，以在细胞片的上方创建长的开放通道。在其它实验中，将水凝胶元件在多个方向上打印，以在片的上方创建开放区域的网格状图案。水凝胶由NovoGelTM组成。任选地将该网格结构延长通过该结构，并延长到打印表面上，以允许施加额外的材料，从而将该结构附着到打印表面上。所得网格用来空间限制该构建体，但允许一些细胞构建体与周围的营养培养基直接接触。
实施例13-利用连续沉积和棋盘格状功能单元结构生物打印的肝组织
使用NovoGen MMX BioprinterTM(Organovo,Inc.,San Diego,CA)，利用连续沉积机理来生物打印工程化的肝组织。该肝组织的三维结构是基于重复功能单元，在这种情况下是六边形。该生物墨水由包封在挤出化合物(表面活性剂多元醇-PF-127)中的肝星形细胞和内皮细胞组成。
30％PF-127的制备
利用PBS制备30％PF-127溶液(w/w)。利用保持在4℃下的磁力搅拌板，将PF-127粉末与冷却的PBS混合。完全溶解发生在大约48小时内。
细胞制备和生物打印
将由82％肝星形细胞(SC)和18％人主动脉内皮细胞(HAEC)和人成体皮肤成纤维细胞(HDFa)组成的细胞悬浮液分到15mL管中，以便获得三个细胞浓度：50x106个细胞/ml、100x106个细胞/mL和200x106个细胞/ml，接着进行离心。将每个细胞沉淀物重悬浮于30％PF-127中，并抽吸到生物打印机使用的3cc储存器中。采用510μm分配末端，将包封的细胞生物打印到PDMS底板上成为单一六边形(参见图6A)或六边形棋盘格状结构(参见图6B)。每个构建体接纳大约200μL的培养基，并在室温下孵育20分钟，以评价构建体的完整性。
多层生物打印
对于六边形棋盘格状实验，生物打印高达(4个)连续层，结果形成具有更多细胞材料存在的更高结构。制作后，每个构建体最初接纳大约200μL的完全培养基，以评价构建体的完整性。将构建体在室温下孵育20分钟，之后浸入到20mL的完全培养基中。
结果
在含有10％胎牛血清的生长培养基(它溶解PF127)中培养18小时后，在生物打印的几何形状内含有的细胞彼此凝聚，足以产生组织的完整的组织邻接片，其保持了原始设计的几何图案(参见图6D)。图7中所示的是：在10％中性缓冲福尔马林中固定后，棋盘格状构建体的单个节段的H&E染色。发现细胞是活的、完整的，并且局限于它们原始打印的几何形状。
实施例14-强制层化
以圆柱形生物墨水或细胞悬浮液的形式在Pluronic F-127(Lutrol，BASF)中制备用于生物打印的细胞群(均质的或异质的)。简言之，对于生物墨水的制备，利用重组人类胰蛋白酶(75μg/mL，Roche)或0.05％胰蛋白酶(Invitrogen)，从标准的组织培养塑料中释放出细胞。在酶释放之后，将细胞清洗、收集、计数并以期望的比例(例如，50:50的肝星形细胞(hSC)：内皮细胞(EC))组合，并通过离心进行沉淀。然后，从细胞沉淀物中除去上清液，并将细胞混合物吸入至所需直径(内径一般为500μm或250μm)的玻璃微毛细管中。随后将这个圆柱形细胞制备物挤出至模具中，该模具由具有用于生物墨水成熟的孔道的非细胞粘着水凝胶材料形成。随后，将所得生物墨水圆柱体在完全细胞培养基中培养凭经验确定的时间，一般为2至24小时。
简言之，对于水凝胶细胞悬浮液的制备，利用本文中描述的任何一种酶介导的方案，将细胞从标准细胞培养容器中释放出来。随后，将释放的细胞用含有血清的培养基清洗、收集、计数并离心，以形成致密的细胞沉淀物。从所得细胞颗粒中除去上清液，随后以50至200x106个细胞/mL的浓度(10-300x106个细胞/mL的范围)，将细胞再悬浮于冷的PF-127(4℃)中。然后，使用NovoGen MMX BioprinterTM生物打印机(Organovo,Inc.,San Diego,CA)，将该细胞悬浮液吸入注射器中。
随后，利用生物打印机来完成具有强制的细胞图案化、层化或取向的组织构建体的制作。用圆柱形生物墨水、在水溶性凝胶中的细胞悬浮液或它们的组合，来进行三维组织构建体的生物打印。为了获得限定的细胞图案或层化，相关细胞群的组合被包含在生物墨水或细胞悬浮液制备中，然后以使负载细胞溶液的凝胶材料溶解的方式，来进行生物打印，在沉积的生物墨水周围产生限定的细胞层化(参见图8)。也可以通过利用和并入限定的、离散的细胞群(例如，hSC和EC)来获得细胞图案、组织或层化，这导致在生物打印的组织内形成细胞和细胞结构的可预测且可重复的组织(参见图9)。
在一些试验中，在成熟或培养期之后，观察在生物打印的新组织中最终的细胞组织结构。将构建体维持在标准实验室培养箱中(37℃，补充有5％CO2的加湿室)，并随着时间变化来评价。
结果
利用生物打印实现细胞图案化、层化或布置。通过含有异质的(即：多型的)细胞群的生物墨水的生物打印，或者通过将生物墨水(均质的或异质的细胞群)与高密度细胞凝胶或细胞悬浮液结合，观察不同的细胞组织结构。这些新组织构建体在加湿室(培养箱)中的成熟，导致进一步在这些生物打印的新组织中建立不同的细胞布置、结构和/或分离。
例如，装载了包括HepG2细胞的生物打印的生物墨水顶部的PF-127的EC:hSC生物打印，导致具有不同细胞群和离散组织形态的构建体的不同层的建立。在含有hSC和EC的生物墨水构建体的情况下，在完全培养基中成长超过3天的生物打印构建体，被发现在该构建体核心中的外围和组织微管网络含有不同的EC层。用包括血管平滑肌细胞的均质(即，单型的)群的生物墨水制造的生物打印构建体(高浓度EC溶液被生物打印在它上面)，被发现在该构建体外围含有不同的EC层。
实施例15-层化的非血管构建体(气道类似物)
用正常的人肺成纤维细胞(NHLF)、小气道上皮细胞(SAEC)和人主动脉内皮细胞(EC)制备圆柱形生物墨水。使细胞在标准实验室条件下增殖，并将细胞在以下培养基中培养：从与细胞相同的供应商处购买的培养基，或者包括在原始文献中一般发现的对那些特殊细胞类型的标准细胞培养实践有利的组分的培养基。简言之，通过采用无阳离子的磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗，将细胞从标准组织培养塑料制品中释放，然后将细胞暴露于0.1-0.05％的胰蛋白酶(Invitrogen)。然后，将释放的细胞用含有血清的培养基清洗、收集、计数并以合适的比例合并，通过离心进行沉淀。典型地，以NHLF:EC为90:10至50:50的比例将NHLF和EC混合。然后，除去上清液，并将细胞颗粒吸入玻璃微细管中，随后将其浸入完全培养基中大约15至20分钟。随后，将该圆柱形生物墨水结构挤压入非细胞粘着的水凝胶模具中(含有线性通道)，并保持2至18小时。
随后，在高浓度细胞悬浮液中制备SAEC。简言之，如本文中所述的将SAEC释放、收集、计数并通过离心进行沉淀。除去上清液，并将细胞沉淀物再悬浮于小体积的完全培养基中，生产1x105个细胞/μL的高浓度细胞团。随后，将该细胞悬浮液在4℃下储存，直至使用。
然后，将人肺部构建体生物打印到多孔板的孔中，或者生物打印到细胞培养孔插入物(Transwell,BD)的膜上。使用多细胞NHLF或NHLF:EC生物墨水来生物打印代表小气道壁的组织层。制造具有1.25mm x8mm x0.25mm(W x L x H)初始尺寸的人气道组织片段。用NHLF或NHLF:EC生物墨水生物打印该壁层后，接着将SAEC的浓缩细胞悬浮液生物打印在该壁的上表面，在假定的气道间隙顶部形成包括气道上皮的第二层。
然后，将人气道组织片段浸入含有血清的完全细胞培养基中，并放在补充有5％CO2的标准加湿室中成熟。然后，将该生物打印的人气道片段在静态条件下培养，或者通过添加细胞因子或生物力学信号(例如，流动、剪切应力等)来刺激。随后，将生物打印的人肺部组织构建体培养长达7天，并评价细胞结构、细胞外基质的产生、细胞活力和构建体完整性(参见图11)。
结果
具有包含NHLF壁(其含有EC-衬里的微管轮廓的组织化网络和包括小气道上皮细胞的顶部表面)的层化细胞结构的生物打印的人肺部组织构建体被成功制造，并培养维持。利用具有NHLF或NHLF:EC生物墨水圆柱体的多层途径和SAEC的生物打印层，来形成生物打印的构建体。一旦采用被认为在肺的疾病过程中很重要的细胞因子刺激后，观察包括组织增厚和NHLF活化的形态变化。
实施例16-层化的血管壁构建体
用血管平滑肌细胞(SMC)和(在一些试验中)皮肤成纤维细胞(Fb)来制备圆柱形生物墨水。简言之，通过采用无阳离子的磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗，将细胞从标准组织培养塑料制品中释放，然后暴露于0.05％的胰蛋白酶(Invitrogen)。然后，将释放的细胞用含有血清的培养基清洗、收集、计数并(对于包括Fb的实验)以合适的比例合并，以及通过离心进行沉淀。然后，除去上清液，并将细胞沉淀物吸入玻璃微细管中，随后将其浸入完全培养基中大约15至20分钟。随后，将该圆柱形生物墨水结构挤出入非细胞粘着的水凝胶模具中(含有线性通道)，并保持2至18小时。
随后，在高浓度细胞悬浮液中制备内皮细胞(EC)。简言之，如上所述，将EC释放、收集、计数并通过离心进行沉淀。除去上清液，并将细胞沉淀物再悬浮于小体积的完全培养基中，生产1x105个细胞/μL的高浓度细胞团。随后，将该细胞悬浮液在4℃下储存，直至使用。
然后，将血管壁构建体生物打印到多孔板的孔中，或者生物打印到细胞培养孔插入物(Transwell,BD)的膜上。使用圆柱形SMC或SMC:Fb生物墨水来生物打印血管壁节段的中膜。制造具有1.25mmx8mm x0.25mm(W x L x H)初始尺寸的血管壁节段。在采用SMC或SMC:Fb生物墨水生物打印假定的中膜(以形成组织的第一层)之后，接着将EC的浓缩细胞悬浮液生物打印在第一层的上表面，以形成血管内皮的第二层(作为假定的内膜)(参见图12)。
然后，将生物打印的血管壁节段浸入含有血清的完全细胞培养基中，并放在补充有5％CO2的标准加湿室中来成熟。然后，将该生物打印的血管壁节段在静态条件下培养，或者通过添加细胞因子或生物力学信号(例如，流动、剪切应力等)来刺激。将血管壁节段培养高达7天，并评价细胞结构、细胞外基质的产生、细胞活力和构建体完整性(参见图13)。
结果
具有包括富含SMC的培养基和EC衬里内膜的层化细胞结构的生物打印的血管壁节段被成功制造，并培养维持。利用具有SMC或SMC:Fb生物墨水圆柱体的多层途径和EC的生物打印层，来形成生物打印的构建体。
实施例17-多孔板
制备用于使用多种生物墨水形式的生物打印的细胞群(均质的或异质的)，包括圆柱形生物墨水聚集体、细胞聚集体的悬浮液或细胞悬浮液/浆料，任选含有挤出化合物。简言之，为制备圆柱形生物墨水，利用重组人胰蛋白酶(75μg/mL，Roche)或0.05％胰蛋白酶(Invitrogen)将细胞从标准组织培养塑料制品释放，在酶释放之后，接着将细胞清洗、收集、计数并以需要的比例(即：50:50的肝星形细胞(hSC)：内皮细胞(EC))结合，并通过离心进行沉淀。随后，从细胞沉淀物除去上清液，并将细胞混合物吸入所需直径(内径一般为500μm或250μm)的玻璃微细管中。随后将这个圆柱形细胞制备物挤入模具中，该模具由具有用于生物墨水成熟的孔道的非细胞粘着水凝胶材料形成。随后，将所得生物墨水圆柱体在完全细胞培养基中培养凭经验确定的时间，一般为2至24小时。
为了制备细胞聚集体的细胞悬浮液或细胞浆料，遵循了本文中描述的细胞细殖和释放方案。在产生细胞沉淀物时，从沉淀物除去上清液，并将沉淀物转移到常规的沉积注射器。然后，将这个注射器安装到用于将细胞聚集体溶液或浆料直接生物打印到多孔板中的生物打印机沉积头上。
然后，将复制组织构建体生物打印到多孔组织培养板(例如，6孔或24孔)的孔中或多孔细胞培养插入物(即：Transwell,BD)中，然后被放进合适的多孔板。在生物打印后，使三维构建体与相关的培养基成熟/老化(conditioned)一段时间，一般为3至14天。在成熟后，构建体被获得、固定并进行用于常规组织学和免疫组织化学的处理。
结果
在多孔培养板或多孔培养插入物(随后被插入到多孔板)中，成功制造了生物打印的组织。这个方法允许生成复制生物打印组织，其任选地被培养和处理，以形成相同或独特的培养条件。这个方法导致在生物打印过程的处理能力和样品形成中的显著增加(参见图14)。实施例18-生物打印的新组织的刺激
制备包括相关的异质(即，多型)细胞群的圆柱形生物墨水。以特定的比例将细胞生理上相关的群(例如，正常人肺成纤维细胞(NHLF)和小气道上皮细胞(SAEC)或血管平滑肌细胞(SMC)和血管内皮细胞(EC))结合，以产生恰当的生物墨水。在另外的实验中，将肝星形细胞(hSC)与EC结合，以形成肝组织。在另外的实验中，将肝星形细胞(hSC)与EC结合，以形成肝组织。将细胞在标准实验室条件下保持并细殖，并将细胞在以下培养基中培养：从与细胞相同的供应商处购买的培养基，或者包括在原始文献中一般发现的对那些特殊细胞类型的标准细胞培养实践有利的组分的培养基。用于生物墨水制备的细胞处理如下：简言之，通过无阳离子的磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗，将细胞从标准组织培养塑料制品中释放，然后将细胞暴露于0.1-0.05％的胰蛋白酶(Invitrogen)。然后，将释放的细胞用含有血清的培养基清洗、收集、计数并(对于刺激分析或正在进行的实验)以合适的比例合并，通过离心进行沉淀。然后，除去上清液，并将细胞沉淀物吸入玻璃微细管中，随后将其浸入完全培养基中大约15至20分钟。随后，将该圆柱形生物墨水结构挤入非细胞粘着的水凝胶模具中(含有线性通道)，并保持2至18小时。
对于需要均质(即，单型)细胞层的组织构建体，受限于上表面，利用含有相关细胞类型来进行第二细胞制备。典型地，在高浓度细胞悬浮液中，制备血管内皮细胞或小气道上皮细胞(分别对于血管壁和人肺组织模型)。简言之，如上所述，将细胞释放、收集、计数并通过离心进行沉淀。除去上清液，并将细胞沉淀物再悬浮于小体积的完全培养基中，生产1x105个细胞/μL的高浓度细胞团。随后，将该细胞悬浮液在4℃下储存，直至使用。
然后，将生物打印的组织构建体制造到多孔板的孔中，或者制造到细胞培养孔插入物(Transwell,BD)的膜上。产生多种细胞类型。采用多细胞的NHLF或NHLF:EC生物墨水来生物打印厚的间质组织，以概括(recapitulate)小气道的壁，接着与SAEC层化，以提供同源的上皮隔离层。采用血管的SMC或SMC：成纤维细胞生物墨水来生物打印厚的间质组织，以概括血管壁，接着与EC层化，以提供同源的内皮隔离层。将hSC生物墨水与EC一起生物打印成补片，该补片含有点缀的(interspersed)内皮网络或内皮层。制造具有1.25mm x8mm x0.25mm(W x L x H)初始尺寸的组织片段。在肺构建体或血管壁节段的生物打印之后，接着在之前分配的生物墨水层的顶部上生物打印浓缩的细胞悬浮液，从而在第一层的表面上形成额外的限定层。
然后，将生物打印的新组织浸入含有血清的完全细胞培养基中，并放在补充有5％CO2的标准加湿室中来成熟。随后，将该生物打印的新组织采用相关的细胞因子培养并刺激预定的时间，并进行福尔马林-固定、收获，以及进行用于常规组织性和免疫组织化学的处理。评价生物打印的组织的以下特征，例如但不限于：组织形态、细胞结构、细胞外基质的产生、细胞增殖、细胞活力和构建体完整性。
通过直接向培养基添加细胞因子，并采用添加的蛋白质培养生物打印的组织，来进行细胞因子刺激以提供细胞向合适刺激的直接且延长的通道。一般在0.1至100ng/mL的剂量下(取决于实验细胞因子的ED50)来进行剂量-反应实验。对于其中实施时间超过48小时的细胞因子刺激的实验，改变培养基，且每48小时加入新鲜的细胞因子。
结果
用先前已经说明的细胞因子成功刺激含有生理上相关的细胞群的生物打印的新组织，以在二维的体外系统中引起细胞反应。在生物打印的三维组织构建体中观察的反应，被观察到依赖于剂量，并且只有该生物打印的构建体内的细胞才有此现象(参见，例如，图11、15和16)。
实施例19-用连续沉积来生物打印共成型的功能性肝组织微观结构
30％PF-127的制备
利用PBS制备30％PF-127溶液(w/w)。利用维持在4℃的磁力搅拌板，将PF-127粉末与冷的PBS混合。完全溶解发生在大约48小时内。
细胞制备和模具的共打印及填充
利用生物打印机将PF-127溶液吸入3cc储存器中，采用510μm的分配末端，将30％的PF-127溶液生物打印到6孔的Transwell中，并形成单个六边形及依次层化6次。
在1000g下将由7.8x107个肝细胞(HepG2)组成的细胞悬浮液离心6分钟，以产生细胞浆料。通过510μm喷针，挤出5μL的细胞浆料，以填入每个三角形模具(参见图17A)。将六边形模具在室温下孵育15分钟。将3mL培养基(补充有10％FBS和1X青霉素、链霉素和两性霉素B的DMEM)与负载的Transwell加入到孔中，之后在37℃和5％CO2下孵育。在45分钟内，将PF-127模具溶解在培养基中，留下完整成型的肝生物墨水，以形成细胞和间隙的平面几何图形(参见图17B)。为从培养基中除去残留的PF-127，将Transwell转移到含有3mL培养基的新孔中，并孵育两个小时。对于总共9mL的培养基交换，用超过6小时将这个操作额外重复两次。
6小时后，将Transwell转移到没有培养基的新孔中，并以90％人主动脉内皮细胞和10％肝星形细胞的比例，将2x106个细胞的细胞悬浮液分配，以填入由FP-127模具溶解形成的空穴中。将肝的构建体在室温下孵育15分钟。在孵育15分钟后，4mL培养基含有85％比例的培养基(补充有10％FBS和1X青霉素、链霉素和两性霉素B的DMEM，以负载肝细胞和肝星形细胞；和15％补充有2％LSGS、10％FBS、HEPES和1X青霉素、链霉素和两性霉素B的M199，以负载人主动脉内皮细胞)。将该构建体在37℃和5％CO2下孵育48小时，以形成连续的构建体，该构建体具有包括插入包括内皮细胞的组织的肝实质的小叶片(三角形)结构的平面几何形状。
尽管本文中已经示出并描述了本发明的优选实施方案，但对本领域技术人员而言显而易见的是：这些实施方案仅仅是以示例的方式提供的。本领域技术人员在不偏离本发明下，现在将想到多种变化、改变和替代。应当理解，本文中描述的本发明实施方案的各种替代方案任选地用于实施本发明。

Claims (52)

1.一种活的三维组织构建体，其包含：至少一种粘附细胞类型，所述至少一种粘附细胞类型凝聚并融合以形成活的三维组织构建体，所述三维组织构建体具有不是血管的多层结构，所述组织构建体用于体外使用，条件是所述组织构建体的至少一个部分是生物打印的。
2.根据权利要求1所述的组织构建体，其中在生物打印时或者在使用时，所述组织构建体基本上不含任何预形成的支架。
3.根据权利要求1所述的组织构建体，其中所述组织构建体包含至少一个包含多种细胞类型的层，所述细胞类型相对于彼此空间排列，以构建平面几何形状。
4.根据权利要求1所述的组织构建体，其中所述组织构建体包含多个层，至少一个层在组成上或结构上与至少一个其它层不同，以构建层状几何形状。
5.根据权利要求1所述的组织构建体，进一步包含非粘附细胞类型。
6.根据权利要求1所述的组织构建体，其中所述组织构建体被固定到生物相容性表面。
7.根据权利要求6所述的组织构建体，其中所述生物相容性表面为多孔膜。
8.根据权利要求6所述的组织构建体，其中所述生物相容性表面涂覆有下列物质中的一种或多种：生物相容性水凝胶、蛋白质、化学品、肽、抗体或生长因子。
9.根据权利要求6所述的组织构建体，其中所述组织构建体在一个或多个侧面上经受由流体流动引起的剪切力。
10.根据权利要求1所述的组织构建体，其中在生物打印时，所述组织构建体在其最小维度上为至少约25μm。
11.根据权利要求10所述的组织构建体，其中在生物打印时，所述组织构建体在其最大维度上不大于约3cm。
12.根据权利要求1所述的组织构建体，其用于体外分析。
13.根据权利要求12所述的组织构建体，其用于药物测试。
14.根据权利要求1所述的组织构建体，其中所述粘附细胞为分化的细胞。
15.根据权利要求1所述的组织构建体，其中所述粘附细胞为未分化的细胞。
16.根据权利要求1所述的组织构建体，其中所述粘附细胞来源于选自下组的组织：肝脏、胃肠、胰腺、肾、肺、气管、血管、骨骼肌、心脏、皮肤、平滑肌、结缔组织、角膜、泌尿生殖系统、乳腺、生殖、内皮、上皮、成纤维细胞、神经、施万、脂肪、骨、骨髓、软骨、周细胞、间皮、内分泌、间质、淋巴、血液、内胚层、外胚层和中胚层。
17.根据权利要求1所述的组织构建体，其中所述组织构建体为血管壁节段。
18.一种活的三维组织构建体的阵列，每个组织构建体包含：至少一种粘附细胞类型，所述至少一种粘附细胞类型凝聚并融合以形成活的三维组织构建体，每个组织构建体具有多层结构，每个组织构建体用于体外使用，条件是每个组织构建体的至少一个部分是生物打印的。
19.根据权利要求18所述的阵列，其中在生物打印时或在使用时，每个组织构建体基本上不含任何预形成的支架。
20.根据权利要求18所述的阵列，其中所述粘附细胞选自：肝细胞、胃肠细胞、胰腺细胞、肾细胞、肺细胞、气管细胞、血管细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、皮肤细胞、平滑肌细胞、结缔组织细胞、角膜细胞、泌尿生殖细胞、乳腺细胞、生殖细胞、内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、神经细胞、施万细胞、脂肪细胞、骨细胞、骨髓细胞、软骨细胞、周细胞、间皮细胞、来源于内分泌组织的细胞、间质细胞、干细胞、祖细胞、淋巴细胞、血细胞、内胚层来源的细胞、外胚层来源的细胞、中胚层来源的细胞及其组合。
21.根据权利要求18所述的阵列，其中所述阵列中的每个组织构建体基本相似。
22.根据权利要求18所述的阵列，其中所述阵列中的一个或多个组织构建体是独特的。
23.根据权利要求18所述的阵列，其中所述阵列中的一个或多个个体组织代表选自下组的人体组织：血或淋巴管、肌肉、子宫、神经、粘膜、间皮、网膜、角膜、皮肤、肝、肾、心脏、气管、肺、骨、骨髓、脂肪、结缔组织、膀胱、乳腺、胰腺、脾、脑、食管、胃、肠、结肠、直肠、卵巢、前列腺、内分泌组织、内胚层、中胚层和外胚层。
24.根据权利要求18所述的阵列，其中每个组织构建体存在于生物相容性多孔容器的孔中。
25.根据权利要求24所述的阵列，其中所述孔用如下物质中的一种或多种包被：生物相容性水凝胶、蛋白质、化学品、肽、抗体或生长因子。
26.根据权利要求24所述的阵列，其中将每个组织构建体放置在所述容器的孔内的多孔生物相容性膜上。
27.根据权利要求24所述的阵列，其中所述容器与自动或半自动的药物筛选过程相匹配。
28.根据权利要求18所述的阵列，其中每个组织构建体被固定到生物相容性表面。
29.根据权利要求28所述的阵列，其中所述生物相容性表面为多孔膜。
30.根据权利要求28所述的阵列，其中所述生物相容性表面用如下物质中的一种或多种包被：生物相容性水凝胶、蛋白质、化学品、肽、抗体或生长因子。
31.根据权利要求28所述的阵列，其中每个组织构建体在一个或多个侧面经受由流体流动引起的剪切力。
32.根据权利要求18所述的阵列，其中所述阵列中的每个组织构建体被独立地培养维持。
33.根据权利要求18所述的阵列，其中所述阵列中的两个或更多个个体组织构建体交换可溶性因子。
34.根据权利要求18所述的阵列，其用于体外分析。
35.根据权利要求34所述的阵列，其用于药物测试。
36.根据权利要求18所述的阵列，其中所述阵列中的至少一个组织是血管壁节段。
37.一种活的三维组织构建体，其包含：一个或多个层，其中每个层含有一种或多种细胞类型，所述一个或多个层凝聚以形成活的三维组织构建体，所述组织构建体的特征在于具有如下的至少一种：
a.至少一个包含多种细胞类型的层，所述细胞类型相对于彼此空间排列，以构建平面几何形状；和
b.多个层，至少一个层在组成上或结构上与至少一个其它层不同，以构建层状几何形状。
38.根据权利要求37所述的组织构建体，其中所述组织构建体的至少一个部分是生物打印的。
39.根据权利要求38所述的组织构建体，其中在生物打印时或者在使用时，所述组织构建体基本上不含任何预形成的支架。
40.根据权利要求37所述的组织构建体，其用于体外分析。
41.根据权利要求40所述的组织构建体，其用于药物测试。
42.一种用于构建活的三维组织构建体的方法，包括如下步骤：
a.将包含至少一种粘附细胞类型的生物墨水生物打印到形式中或形式上；以及
b.将所述生物墨水融合成活的三维组织构建体；
条件是所述组织构建体用于体外使用，并且不是血管。
43.根据权利要求42所述的方法，其中在生物打印时或者在使用时，所述组织构建体不含任何预形成的支架。
44.根据权利要求42所述的方法，其中所述形式是生物打印的。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述形式与生物墨水基本上同时被生物打印。
46.根据权利要求42所述的方法，进一步包括溶解所述形式的步骤。
47.一种用于构建活的三维组织构建体的方法，包括如下步骤：
a.制备一个或多个包含哺乳动物细胞的凝聚的多细胞聚集体；
b.将所述一个或多个凝聚的多细胞聚集体放置在载体上，以形成如下的至少一种：
i.至少一个包含多种细胞类型的层，所述细胞类型相对于彼此空间排列，以构建平面几何形状；和
ii.多个层，至少一个层在组成上或结构上与至少一个其它层不同，以构建层状几何形状；
c.孵育所述一个或多个多细胞聚集体，以使其凝聚并形成活的三维组织构建体。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述组织构建体的至少一个部分是生物打印的。
49.根据权利要求48所述的方法，其中在生物打印时或者在使用时，所述组织构建体不含任何预形成的支架。
50.一种用于构建活的三维组织构建体的阵列的方法，包括如下步骤：
a.制备包含哺乳动物细胞的凝聚的多细胞聚集体；
b.将所述凝聚的多细胞聚集体放置在生物相容性载体上，其中所述聚集体以适合于组织阵列的形式空间排列；以及
c.孵育所述多细胞聚集体，以使其凝聚并形成活的三维组织构建体的阵列。
51.根据权利要求50所述的方法，其中每个组织构建体的至少一个部分是生物打印的。
52.根据权利要求51所述的方法，其中在生物打印时或者在使用时，每个组织构建体基本上不含任何预形成的支架。
CN201280055564.4A 2011-09-12 2012-09-12 用于体外研究用途的工程化组织、其阵列及其制备方法 Pending CN103946374A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810506160.1A CN108619572A (zh) 2011-09-12 2012-09-12 用于体外研究用途的工程化组织、其阵列及其制备方法

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161533757P 2011-09-12 2011-09-12
US201161533753P 2011-09-12 2011-09-12
US201161533761P 2011-09-12 2011-09-12
US61/533,757 2011-09-12
US61/533,753 2011-09-12
US61/533,761 2011-09-12
PCT/US2012/054923 WO2013040078A2 (en) 2011-09-12 2012-09-12 Engineered tissues for in vitro research uses, arrays thereof, and methods of making the same

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810506160.1A Division CN108619572A (zh) 2011-09-12 2012-09-12 用于体外研究用途的工程化组织、其阵列及其制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN103946374A true CN103946374A (zh) 2014-07-23

Family

ID=47883950

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810506160.1A Pending CN108619572A (zh) 2011-09-12 2012-09-12 用于体外研究用途的工程化组织、其阵列及其制备方法
CN201280055564.4A Pending CN103946374A (zh) 2011-09-12 2012-09-12 用于体外研究用途的工程化组织、其阵列及其制备方法

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810506160.1A Pending CN108619572A (zh) 2011-09-12 2012-09-12 用于体外研究用途的工程化组织、其阵列及其制备方法

Country Status (13)

Country Link
US (3) US20130190210A1 (zh)
EP (1) EP2756073B1 (zh)
JP (2) JP2014531204A (zh)
KR (1) KR20140072883A (zh)
CN (2) CN108619572A (zh)
AU (2) AU2012308715A1 (zh)
BR (1) BR112014005746A2 (zh)
CA (2) CA3157246A1 (zh)
DK (1) DK2756073T3 (zh)
HK (1) HK1200483A1 (zh)
IL (1) IL231449A0 (zh)
RU (1) RU2014113641A (zh)
WO (1) WO2013040078A2 (zh)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101611143B (zh) * 2006-11-10 2015-01-14 翁德克控股有限公司 将肽递送入胃粘膜的方法和装置
CN105209605A (zh) * 2013-03-15 2015-12-30 奥加诺沃公司 工程化肝组织、其阵列及其制备方法
CN107002033A (zh) * 2014-10-06 2017-08-01 奥加诺沃公司 工程化肾组织、其阵列及其制备方法
CN107406828A (zh) * 2015-03-26 2017-11-28 T&R 碧欧法博有限公司 用于心肌组织再生的三维结构及其制备方法
CN107982581A (zh) * 2015-04-07 2018-05-04 四川蓝光英诺生物科技股份有限公司 用于生物打印的生物砖及其用途
CN108026508A (zh) * 2015-06-16 2018-05-11 安斯百克特生物系统公司 连续生物打印的多层组织结构
US11439731B2 (en) 2016-09-14 2022-09-13 Revotek Co., Ltd. Artificial tissue progenitor and method for preparing the same

Families Citing this family (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005081970A2 (en) 2004-02-24 2005-09-09 The Curators Of The University Of Missouri Self-assembling cell aggregates and methods of making engineered tissue using the same
AU2009271223B2 (en) 2008-06-24 2013-05-16 The Curators Of The University Of Missouri Self-assembling multicellular bodies and methods of producing a three-dimensional biological structure using the same
CN105496601A (zh) 2010-10-21 2016-04-20 奥加诺沃公司 用于制造组织的装置、系统和方法
KR20140072883A (ko) * 2011-09-12 2014-06-13 오가노보, 인크. 시험관내 연구 용도를 위한 조작된 조직, 이의 어레이 및 이의 제조방법
WO2013075248A1 (en) 2011-11-23 2013-05-30 The Governing Council Of The University Of Toronto Devices and methods for producing planar polymeric materials using microfluidics
US9499779B2 (en) 2012-04-20 2016-11-22 Organovo, Inc. Devices, systems, and methods for the fabrication of tissue utilizing UV cross-linking
WO2014176697A1 (en) 2013-04-30 2014-11-06 Chen haotian Microfluidic devices and methods for the extrusion of tubular structures
US10119107B2 (en) * 2013-05-30 2018-11-06 The University Of Akron Automated cell and tissue bioprinter
CA2919734C (en) 2013-07-31 2023-04-25 Organovo, Inc. Automated devices, systems, and methods for the fabrication of tissue
US9910935B2 (en) 2013-10-11 2018-03-06 Advanced Solutions Life Sciences, Llc System and workstation for the design, fabrication and assembly of bio-material constructs
WO2015069619A1 (en) * 2013-11-05 2015-05-14 President And Fellows Of Harvard College Method of printing a tissue construct with embedded vasculature
AU2014355214A1 (en) * 2013-11-30 2016-07-07 Agency For Science, Technology And Research Self-assembling peptides, peptidomimetics and peptidic conjugates as building blocks for biofabrication and printing
WO2015129881A1 (ja) * 2014-02-28 2015-09-03 国立大学法人大阪大学 細胞の立体構造体の製造方法
EP3808838B1 (en) 2014-04-04 2024-04-10 Organovo, Inc. Engineered three-dimensional breast tissue, adipose tissue, and tumor disease model
GB201406716D0 (en) * 2014-04-15 2014-05-28 Insphero Ag Method of preparing cells for 3D tissue culture
WO2016022830A1 (en) * 2014-08-06 2016-02-11 Oregon Health & Science University Three-dimensional bioprinted pancreatic tumor model
EA028039B1 (ru) * 2014-09-05 2017-09-29 Частное Учреждение Лаборатория Биотехнологических Исследований "3Д Биопринтинг Солюшенс" Устройство и способы печати биологических тканей и органов
WO2016049345A1 (en) * 2014-09-24 2016-03-31 The Regents Of The University Of California Three-dimensional bioprinted artificial cornea
US20160122723A1 (en) 2014-11-05 2016-05-05 Organovo, Inc. Engineered three-dimensional skin tissues, arrays thereof, and methods of making the same
AU2014277667B2 (en) * 2014-12-15 2022-07-14 The University Of Queensland Differentiation of pluripotent stem cells to form renal organoids
WO2016161944A1 (en) 2015-04-07 2016-10-13 Sichuan Revotek Co., Ltd. Compositions for cell-based three dimensional printing
CN105056302B (zh) * 2015-08-26 2017-12-26 上海市肺科医院 一种生物性复合人工气管的制备方法及其应用
US11001811B2 (en) 2015-10-16 2021-05-11 Wake Forest University Health Sciences Multi-layer airway organoids and methods of making and using the same
JP6817619B2 (ja) * 2015-10-27 2021-01-20 学校法人慶應義塾 マイクロビーズの製造方法及び足場の製造方法
WO2017083402A1 (en) 2015-11-09 2017-05-18 Organovo, Inc. Improved methods for tissue fabrication
US10934538B2 (en) 2016-01-12 2021-03-02 Cleveland State University 3D-printed miniature biological constructs
WO2017197138A1 (en) 2016-05-11 2017-11-16 The Regents Of The University Of Michigan Hierarchically structured protein materials for three dimensional (3d) cellular support systems
US10738297B2 (en) 2016-05-13 2020-08-11 University Of Washington 3D printable hydrogel materials
DE102016109067B4 (de) * 2016-05-17 2018-07-19 Leibniz-Institut Für Polymerforschung Dresden E.V. Verfahren zur Bildung von Nierentubuli
US11254901B2 (en) 2016-07-12 2022-02-22 Deka Products Limited Partnership System and method for printing tissue
US10345208B2 (en) 2016-07-12 2019-07-09 Deka Products Limited Partnership System and method for applying force to a device
WO2018026172A1 (ko) * 2016-08-01 2018-02-08 포항공과대학교 산학협력단 통합형 3차원 세포 프린팅 기술을 이용한 세포 배양체 및 이의 제조방법
WO2018035138A1 (en) * 2016-08-15 2018-02-22 Organovo, Inc. Three dimensional bioprinted tumor models for drug testing
JP2019537729A (ja) * 2016-09-28 2019-12-26 オルガノボ インコーポレイテッド アッセイにおける人工腎臓組織の使用
US11299705B2 (en) 2016-11-07 2022-04-12 Deka Products Limited Partnership System and method for creating tissue
CN110191947A (zh) * 2016-11-10 2019-08-30 奥加诺沃公司 工程化肠组织和其用途
US11850330B2 (en) 2016-11-10 2023-12-26 Organovo, Inc. Bioprinted hair follicles and uses thereof
CN110087772B (zh) 2016-11-17 2022-07-19 克利夫兰州立大学 用于微阵列3d生物打印的芯片平台
US10570362B2 (en) 2017-07-12 2020-02-25 Deka Products Limited Partnership System and method for transferring tissue
US11262349B2 (en) 2017-10-11 2022-03-01 Cleveland State University Multiplexed immune cell assays on a micropillar/microwell chip platform
CN108355174A (zh) * 2018-05-06 2018-08-03 西北工业大学 一种多功能分层关节软骨支架的制备方法
WO2020256580A1 (ru) * 2019-06-19 2020-12-24 Общество с ограниченной ответственностью "Национальный БиоСервис" Матричный блок для изготовления тканевых микрочипов
CA3151222C (en) * 2019-09-22 2023-01-24 Sharon Fima Physical manipulation of cultured muscle tissue
US20240267751A1 (en) 2019-10-01 2024-08-08 Telefonaktiebolaget Lm Ericsson (Publ) Group Signalling Aspects for NR-NR Dual Connectivity (NR-DC) and Reconfiguration
KR102284592B1 (ko) * 2020-01-31 2021-08-02 성균관대학교산학협력단 생체 적합성 고분자를 이용한 배열된 구조체의 제조방법 및 이를 이용하여 제조된 배열된 구조체
KR20230004525A (ko) * 2020-03-22 2023-01-06 콜플랜트 리미티드 연조직 충전제 및/또는 임플란트로 사용할 수 있는 콜라겐 기반 제형
JP2023553883A (ja) * 2020-12-07 2023-12-26 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 組織オルガノイドバイオプリンティングおよびハイスループットスクリーニング法
US20240124845A1 (en) 2021-02-26 2024-04-18 University Of Rochester Skeletal stem cell isolation and uses thereof
EP4308679A1 (en) * 2021-03-14 2024-01-24 Copner Biotech Ltd Cell culture scaffold formed via 3d printing
WO2023159107A1 (en) 2022-02-18 2023-08-24 The Forsyth Institute Markers for skeletal stem cell and uses thereof
WO2023181859A1 (ja) 2022-03-24 2023-09-28 凸版印刷株式会社 バイオインク及び構造体の製造方法
US20230357710A1 (en) * 2022-05-06 2023-11-09 The Regents Of The University Of Michigan Engineered fibrillar extracellular matrix networks for three-dimensional (3d) cellular support systems
WO2024091824A1 (en) 2022-10-26 2024-05-02 Ada Forsyth Institute, Inc. Differentiation and reprogramming of chondrocyte

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040237822A1 (en) * 2003-05-30 2004-12-02 Clemson University Ink-jet printing of viable cells
US20080070304A1 (en) * 2004-02-24 2008-03-20 The Curators Of The Univeristy Of Missouri Self-Assembling Cell Aggregates and Methods of Making Engineered Tissue Using the Same

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU769637B2 (en) * 1998-11-19 2004-01-29 Organogenesis Inc. Bioengineered tissue constructs and methods for producing and using them
US6520997B1 (en) * 1999-12-08 2003-02-18 Baxter International Inc. Porous three dimensional structure
SI2310491T1 (en) * 2008-06-20 2018-07-31 Universiteit Maastricht Only composite tissue modules
AU2009271223B2 (en) * 2008-06-24 2013-05-16 The Curators Of The University Of Missouri Self-assembling multicellular bodies and methods of producing a three-dimensional biological structure using the same
JP2010057439A (ja) * 2008-09-05 2010-03-18 Konica Minolta Holdings Inc 細胞培養支持体とその製造方法並びに細胞培養方法
US8691974B2 (en) * 2009-09-28 2014-04-08 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Three-dimensional bioprinting of biosynthetic cellulose (BC) implants and scaffolds for tissue engineering
WO2011097330A2 (en) * 2010-02-02 2011-08-11 The Curators Of The University Of Missouri Engineered biological nerve graft fabrication and application thereof
CN101892285A (zh) * 2010-06-23 2010-11-24 西安交通大学 一种三维细胞芯片的制备方法
KR20140072883A (ko) * 2011-09-12 2014-06-13 오가노보, 인크. 시험관내 연구 용도를 위한 조작된 조직, 이의 어레이 및 이의 제조방법
US9442105B2 (en) * 2013-03-15 2016-09-13 Organovo, Inc. Engineered liver tissues, arrays thereof, and methods of making the same
EP3204488B1 (en) * 2014-10-06 2019-07-17 Organovo, Inc. Engineered renal tissues, arrays thereof, and methods of making the same

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040237822A1 (en) * 2003-05-30 2004-12-02 Clemson University Ink-jet printing of viable cells
US20080070304A1 (en) * 2004-02-24 2008-03-20 The Curators Of The Univeristy Of Missouri Self-Assembling Cell Aggregates and Methods of Making Engineered Tissue Using the Same

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JAKAB K ET AL: "Tissue engineering by self-assembly of cells printed into topologically defined structures", 《TISSUE ENGINEERING: PART A》, vol. 14, no. 3, 31 March 2008 (2008-03-31), XP055047480, DOI: doi:10.1089/tea.2007.0173 *
MIRONOV V ET AL: "Organ printing: tissue spheroids as building blocks", 《BIOMATERIALS》, vol. 30, no. 12, 26 January 2009 (2009-01-26) *

Cited By (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101611143B (zh) * 2006-11-10 2015-01-14 翁德克控股有限公司 将肽递送入胃粘膜的方法和装置
CN105209605B (zh) * 2013-03-15 2019-07-12 奥加诺沃公司 工程化肝组织、其阵列及其制备方法
CN105209605A (zh) * 2013-03-15 2015-12-30 奥加诺沃公司 工程化肝组织、其阵列及其制备方法
CN107002033A (zh) * 2014-10-06 2017-08-01 奥加诺沃公司 工程化肾组织、其阵列及其制备方法
CN107002033B (zh) * 2014-10-06 2021-08-10 奥加诺沃公司 工程化肾组织、其阵列及其制备方法
CN107406828A (zh) * 2015-03-26 2017-11-28 T&R 碧欧法博有限公司 用于心肌组织再生的三维结构及其制备方法
CN108096638A (zh) * 2015-04-07 2018-06-01 四川蓝光英诺生物科技股份有限公司 用于生物打印的生物砖及其用途
CN108126242A (zh) * 2015-04-07 2018-06-08 四川蓝光英诺生物科技股份有限公司 用于生物打印的生物砖及其用途
CN108273140A (zh) * 2015-04-07 2018-07-13 四川蓝光英诺生物科技股份有限公司 用于生物打印的生物砖及其用途
CN108126242B (zh) * 2015-04-07 2021-01-01 四川蓝光英诺生物科技股份有限公司 用于生物打印的生物砖及其用途
CN107982581B (zh) * 2015-04-07 2021-02-02 四川蓝光英诺生物科技股份有限公司 用于生物打印的生物砖及其用途
CN107982581A (zh) * 2015-04-07 2018-05-04 四川蓝光英诺生物科技股份有限公司 用于生物打印的生物砖及其用途
CN108026508A (zh) * 2015-06-16 2018-05-11 安斯百克特生物系统公司 连续生物打印的多层组织结构
US11439731B2 (en) 2016-09-14 2022-09-13 Revotek Co., Ltd. Artificial tissue progenitor and method for preparing the same

Also Published As

Publication number Publication date
CA2848043C (en) 2022-07-12
RU2014113641A (ru) 2015-10-20
DK2756073T3 (da) 2021-03-22
BR112014005746A2 (pt) 2017-03-28
WO2013040078A3 (en) 2013-05-10
EP2756073A2 (en) 2014-07-23
US20180313822A1 (en) 2018-11-01
AU2016203930A1 (en) 2016-09-08
US20210123906A1 (en) 2021-04-29
US20130190210A1 (en) 2013-07-25
JP2014531204A (ja) 2014-11-27
EP2756073A4 (en) 2015-05-06
KR20140072883A (ko) 2014-06-13
WO2013040078A2 (en) 2013-03-21
CA3157246A1 (en) 2013-03-21
AU2012308715A1 (en) 2014-04-24
HK1200483A1 (zh) 2015-08-07
CN108619572A (zh) 2018-10-09
CA2848043A1 (en) 2013-03-21
IL231449A0 (en) 2014-04-30
EP2756073B1 (en) 2020-12-30
JP2018171065A (ja) 2018-11-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103946374A (zh) 用于体外研究用途的工程化组织、其阵列及其制备方法
RU2623303C2 (ru) Платформа для инженерии имплантируемых тканей и органов и способы создания (биофабрикации) этих тканей и органов
US11124774B2 (en) Engineered liver tissues, arrays thereof, and methods of making the same
CN104717987A (zh) 工程化的三维结缔组织构建体及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1200483

Country of ref document: HK

RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20140723

REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: WD

Ref document number: 1200483

Country of ref document: HK