KR20180042220A - 연속적으로 바이오프린트된 다층 조직 구조물 - Google Patents

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KR20180042220A
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테이머 모하메드
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샘 워즈워스
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애스펙트 바이오시스템즈 리미티드
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Abstract

3D 프린터로부터 고화된 형태로 침착된 다수의 섬유층을 포함하는 합성 생체 조직 구조물이, 이와 관련된 키트(kit) 및 사용 방법과 함께 본원에 제공된다. 섬유는 고화된 생체적합성 매트릭스 내에 배치된 다수의 포유동물 세포를 포함한다. 섬유의 구조적 통합성은 어떠한 추가의 가교결합없이 침착 전 및 후에 유지된다. 섬유는 적어도 2개의 층의 구조물을 통해 바이오프린트된다. 일 국면에서, 합성 근육 조직 구조물은 용이하게 분석가능한 수축 기능성을 나타낸다.

Description

연속적으로 바이오프린트된 다층 조직 구조물
관련 출원의 교차-참조
본 출원은 2015년 6월 16일자로 출원된 미국 가특허원 일련 번호 제62/180,174호, 및 또한 2016년 3월 8일자로 출원된 미국 가특허원 일련 번호 제62/180,174호의 이익을 청구하며, 이들 둘 다는 이들의 전문이 본원에 참고로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 상이한 자극에 대한 반응 시 근육 수축 및 이완을 시험할 목적으로 근육 세포를 포함하는 생물가공된 조직(bioengineered tissue)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 조직을 제작하기 위한 바이오프린팅 방법(bioprinting method)에 관한 것이다.
골격근 시스템은 신체의 기본 구조 및 기능성의 근본적인 부분을 나타내지만, 평활근은 혈관계, 호흡계, 림프계, 및 위장계와 같은 많은 생물학적 시스템에서 중요한 역활을 담당하며, 피부, 눈, 방광 및 수개의 다른 기관에서도 발견된다. 조직의 유형 둘 다는 이들 시스템과 관련된 많은 질환에서 중요한 역활을 담당한다. 그와 같이, 학계 및 약제 산업으로부터의 연구자들이 다양한 화합물 또는 다른 자극에 대한 골격근 및 평활근의 반응을 시험함으로써 질병 경로 및 기본적인 생리학의 보다 나은 이해를 얻기 위해 생리학적으로 관련된 조직에 접근하는 것이 중요하다.
이러한 모델을 창조하는데 있어서의 앞선 시도가 이루어졌으며 전형적으로 매트릭스 속에 현탁되거나 주형을 사용하여 응집체, 특수한 형태로 형성된 몰딩 세포(moulding cell), 또는 이미 형성된 스캐폴드(scaffold)의 외부로의 씨딩 세포(seeding cell)를 포함한다. 대부분의 진전된 모델은 수축과 같은, 평활근 조직의 특정 기능을 재현할 수 있지만, 이들의 제작은 수동 집약적이어서, 재현성에 있어 도전으로 이끈다. 다른 모델에서, 상기 제작은 거의 복잡하지는 않지만 조직의 수축 능력이 손실된다.
보다 최근에, 적층 가공(additive manufacturing: AM)의 형태인, 3D 프린팅(3D printing)이 디지털 파일로부터 직접 3차원 대상체를 창조하는데 적용되어 왔으며, 여기서 대상체는 층별로(layer-by-layer) 쌓아올려져서 바람직한 3차원 구조물을 달성한다. 3D 바이오프린팅으로 명명된, 세포 구조물 및 조직의 창조에 대한 3D 프린팅 기술을 채택하기 위한 초기 노력은 또한 상기 관례와 일치하는, 세포 물질의 직접적인 씨딩(seeding) 또는 후속적인 프린팅과는 독립적인 스캐폴드 물질(scaffold material)에 집중되었다. 예를 들면, 미국 특허 제6,139,574호; 제7,051,654호; 제8,691,274호; 제9,005,972호 및 제9,301,925로를 참고한다. 그러나, 불행하게도, 선행 기술의 스캐폴드를 형성하는데 전형적으로 사용된 중합체는, 일반적으로 생체적합성인 것으로 고려되었지만, 생리학적으로 혼화성(compatibility)이 아니다. 그와 같이, 세포 생존능은 필수적인 스캐폴드의 기계적 안정성에 우선하는 당해 시도에 의해 희생된다.
대안적 3D 바이오프린팅 기술은 또한 정반대 사실을 강조하기 위해 기술되어 왔으며, 여기서 기계적 구조 및 형태 충실도는 세포 생존능에 우선하여 희생된다. 이들 바이오프링팅 시스템은 생체적합형 매트릭스내에 세포 물질을 분배함으로써 합성 조직을 창조하며, 이는, 이후 가교결합하거나 기타의 경우에 침착(deposition) 후 고화되어서 고체 또는 반-고체 조직 구조물을 창조한다. 예를 들면, 미국 특허 제9,227,339호; 제9,149,952호; 제8,931,880호 및 제9,315,043호; 미국 특허 공개 공보 제2012/0089238호; 제2013/0345794호; 제 2013/0164339호 및 제2014/0287960호를 참고한다. 그러나, 이들 시스템 모두의 사용시, 침착 단계와 가교결합 단계 사이의 일시적인 지연은 인쇄된 구조물의 기하학적 구조, 및 또한 구조물의 세포 및 매트릭스 조성에 대한 조절의 결핍을 초래한다. 더욱이, 세포 생존능은 흔히 후속적인 가교결합 또는 고화 현상에 의해 어떠한 상황에서도 여전히 절충된다.
그러나, 이러한 문제의 한가지 예로서, 마르크슈테트(Markstedt) 등은 콜라겐, 하이알루론산, 키토산 및 알기네이트와 같은 하이드로겔을 3D 바이오프린팅용 바이오-잉크로서, 나노피브릴화된 셀룰로즈(nanofibrillated cellulose)와 같은 비-생리학적 보강 섬유 물질과 함께 사용하였다[BioMacromolecules 16:1489-96 (2015)]. 당해 바이오-잉크는 물질의 2D 층으로서 적층되며, 이는 2가 양이온 욕(CaCl2) 속에 잠겨서 10분 동안 가교결합하여 상부에 다른 층이 침착하기 전에 제1 층을 고화시킨다. 살아있는 세포는 이들의 바이오-잉크 내로 성공적으로 혼입되었지만, 세포 생존능 분석은 세포 생존능이 가교결합 공정의 결과로서 포매(embedding) 전 ~95.3%로부터 포매 및 가교결합 후 ~69.9%까지 유의적으로 감소하였음을 입증하였다. 더욱이, 인쇄되지 않은 대조군과의 비교는 세포 생존능에 있어서의 감소가 실제의 3D 프링팅 공정보다는, 바이오-잉크 자체의 제조 및 혼합에 기인하는 경향이 있음을 나타내었다.
따라서, 존재하는 3D 바이오프린팅 기술 및 물질은 한편으로는 구조적 통합성과 형태 충실도 사이에 기술적 충돌, 및 다른 한편으로는 생리학적 혼화성 및 세포 생존능을 만족스럽게 해결하는데 실패하였다. 본 발명은 이들 및 다른 충족되지 않은 요구에 촛점을 맞추고 있다.
선행 기술
문헌
* Cyrille Norotte, Francois S. Marga, Laura E. Niklason, and Gabor Forgacs, "Scaffold-free vascular tissue engineering using bioprinting", Biomaterials, Vol. 30, 2009, pp. 5910-5917.
* Jin-yau Lai, Cheol Yong Yoon, James J. Yoo, Tina Wulf, and Anthony Atala, "Phenotypic and functional characteristics of in vivo tissue engineered smooth muscle from normal and pathological bladders", Journal of Urology, Vol. 168, 2002, pp. 1853-1858.
* Byung-Soon Kim, and David J. Mooney "Scaffolds for engineering smooth muscle under cyclic mechanical strain conditions", J. Biomech Eng, Vol. 122(3_, 2000, pp. 210-215.
특허
* US20140287960
* US20130345794
* US20140377232
* US7368279
본 발명은 개선된 세포 생존 및 생리학적 기능성을 지니고, 가교결합 또는 다른 후속적인 고화 단계에 대한 필요성없이, 고화된 형태로 침착된 합성의 생체 조직 구조물을 제공하여, 구조적 통합성과 세포 생존능 사이에서 3D 바이오프린팅 분야에 앞서 모순되는 문제를 성공적으로 해결한다. 본 발명의 국면은 고화된 생체적합성 매트릭스내의 바이오프린터로부터 분배된 다수의 포유동물 세포를 포함하는 합성 조직 섬유를 포함하는 합성의 생체 조직 구조물을 포함하며, 여기서 상기 섬유의 구조적 통합성은 침착 시 및 후에, 및 어떠한 추가의 가교결합 단계(들) 없이 유지된다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 연속된 합성 조직 섬유의 오버래핑 층(overlapping layer)을 포함하는 합성 생체 조직 구조물을 제공하며, 여기서 상기 오버래핑 층은 구조적으로 별개일 수 있다. 구체적인 구현예에서, 고화된 생체적합성 매트릭스내에 바이오프린터로부터 분배된 다수의 포유동물 균육 세포를 포함하는 연속된 합성 조직 섬유의 2개 이상의 층을 포함하는 합성 근육 조직 구조물이 제공된다.
일 국면에서, 본 발명은 바이오프린터로부터 분배된 합성 조직 섬유를 포함하는 합성 생체 조직 구조물을 제공하며, 상기 섬유는 고화된 생체적합성 매트릭스 내에 바이오프린터로부터 분배된 다수의 포유동물 세포를 포함하고, 여기서 상기 섬유의 구조적 통합성은 프린트헤드(printhead)로부터 분배된 후 유지되며, 침착 표면에 접촉한 후 매트릭스를 가교결합할 필요가 없다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 바이오프린터로부터 분배되어 생체적합성 매트릭스내에 분배된 포유동물 세포의 연속된 오버랩핑 섬유를 포함하는 합성 생체 조직 구조물을 제공하며, 여기서 상기 섬유는 구조물의 적어도 2개 이상의 층을 통해, 보다 바람직하게는 적어도 3개 또는 4개의 층을 통해, 여전히 보다 바람직하게는 조직 구조물의 적어도 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상의 층을 통해 연속적으로 바이오프린트된다. 포유동물 세포는 바람직하게는 섬유의 오버랩핑 분절들 사이에 육안 경계구역(visual border)이 존재하도록, 섬유의 구조적 통합성과 형태 충실도를 유지할 수 있는 고화된 생체적합성 매트릭스 내에 포함된다.
고화된 생체적합성 매트릭스는 예를 들면, 알기네이트, 라미닌, 피브린, 하이알루론산, 폴리(에틸렌)글리콜계 겔, 젤라틴, 키토산, 아가로즈, 또는 이의 조합물을 포함하는, 살아있는 세포의 다양성을 뒷받침하는 광범위하게 다양한 천연 또는 합성 중합체 중 어느 것도 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 고화된 생체적합성 매트릭스는 프린트헤드로부터 분배되면서 순간적으로 고화될 수 있는 알기네이트, 또는 다른 적합한 생체적합성 중합체를 포함한다.
특히 바람직한 구현예에서, 고화된 생체적합성 매트릭스는 생리학적으로 혼화성인데, 즉, 세포 성장, 분화 및 전달에 도움이 된다. 일부 이러한 구현예에서, 생리학적으로 혼화성인 매트릭스는 콜라겐, 피브로넥틴, 트롬보스폰딘, 글리코스아미노글리칸(GAG), 데옥시리보핵산(DNA), 부착 당단백질, 엘라스틴, 및 이의 조합 중 하나 이상과 함께 알기네이트를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 콜라겐은 콜라겐 I, 콜라겐 II, 콜라겐 III, 콜라겐 IV, 콜라겐 V, 콜라겐 VI, 또는 콜라겐 XVIII로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 구체적인 구현예에서, GAG는 하이알루론산, 콘드로이틴-6-설페이트, 더마탄 설페이트, 콘드로이틴-4-설페이트, 또는 케라틴 설페이트로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
본원에 예시된 바람직한 구현예에서, 포유동물 세포는 근육 세포, 예를 들면, 평활근 세포, 골격근 세포 및/또는 심장근 세포를 포함한다. 대안적 구현예에서, 조직 또는 조직 구조물은 적어도 하나의 추가의 세포형, 예를 들면, 섬유아세포, 내피 세포 및/또는 상피 세포, 줄기 세포 등을 추가로 포함한다. 하나의 이러한 구현예에서, 적어도 하나의 추가의 세포형은 상기 섬유내에 분산된다. 또 다른 이러한 구현예에서, 적어도 하나의 추가의 세포형은 외부/제2 층으로서 상기 섬유의 외부 주변에 동심원으로 배치된다. 특히 바람직한 구현예에서, 포유동물 세포는 사람 세포이다. 유리하게는, 이들 합성 생체 조직 구조물 내의 세포 생존능은 프린팅 전 세포 생존능과 비교하여, 바이오프린팅 후 약 70% 내지 약 100%, 예를 들면, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 98%, 약 99%, 약 99.5%, 또는 약 99.9%이다.
일 구현예에서, 상기 구조물은 실린더/튜브를 포함하며 상기 섬유는 실린더의 각각의 층을 통해 실질적으로 연속된다. 대안적 구현예에서, 상기 구조물은 평면 시이트를 포함하며, 상기 섬유는 평면 시이트 전체에서 실질적으로 연속적이다. 특히 바람직한 구현예에서, 합성 근육 구조물은 수축 기능성을 나타내며, 이러한 수축 기능성은 상기 구조물의 직경 및/또는 원주에 있어서의 변화로 측정될 수 있다.
또 다른 국면에서, 적절한 포장 및/또는 사용을 위한 지시사항과 함께, 대상체 합성 조직 및 조직 구조물을 포함하는 키트(kit)가 제공된다.
또 다른 국면에서, a) 대상체 합성 생체 조직 구조물을 시험 제제 및/또는 조건과 접촉시키는 단계; 및 b) 예를 들면, 차원 변화(예를 들면, 상기 구조물의 면적, 직경 및/또는 길이와 같은)를 측정함으로써 근육 기능을 평가하고/하거나 세포 생존능, 증식, 분극화(polarization), 및/또는 예를 들면, 평활근 액틴, 칼포닌 또는 칼데스몬의 발현을 포함하는 유전자 발현, 항-평활근 세포 항체(ASMA)의 결합 등과 같은 메트릭스(metrics)를 분석함으로써 포유동물 근육 세포에서 제제 및/또는 조건의 효과를 측정하는 단계를 포함하여, 포유동물 근육 세포의 수축 기능에 대한 시험 제제 및/또는 조건의 효과를 평가하는 방법이 제공된다. 바람직한 구현예에서, 상기 구조물은 실린더/튜브를 포함하고, 상기 측정 단계는 실린더의 직경 및/또는 원주에 있어서의 변화를 측정하는 것을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 바이오프린터는 다수의 포유동물 세포를 포함하는 고화된 생체적합성 매트릭스를 단일의 오리피스(orifice)를 통해 분배한다. 특히 바람직한 구현예에서, 단일의 오리피스는 이의 개시내용이 본원에 이의 전문을 참고로 포함되어 있는 제WO 2014/197999호에 기술되고 청구된 바와 같은 프린트 헤드 내에 포함된다.
도 1은 층별 겔 필라멘트 침착 공정의 개략적인 묘사를 나타낸다.
도 2는 수축 전 및 후의 평활근 환의 2개의 하향식 영상을 나타낸다.
도 3은 겔 필라멘트 내의 평활근 세포 성장을 나타내는 하향식 투광 현미경사진(transmission light micrograph)이다.
도 4는 평활근 세포 및 또 다른 세포형을 포함하는 공동축으로 배열된 튜브의 개략적인 묘사이다.
도 5는 평활근 세포 및 또 다른 세포형의 공동축 배열을 갖는 겔 필라멘트로 구성된 튜브의 개략적인 묘사이다.
본 발명의 국면은 고화된 생체적합성 매트릭스 내의 바이오프린터로부터 분배된 다수의 포유동물 세포를 포함하는 합성 조직 섬유를 포함하는 합성 조직 구조물을 포함하며, 여기서 상기 섬유의 구조적 통합성 및 형태 충실도는 침전 시 및 후에 어떠한 추가의 가교결합 단계(들) 없이 유지된다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 연속된 합성 조직 섬유의 오버래핑 층을 포함하는 합성 생체 조직 구조물을 제공하며, 여기서 상기 오버래핑 층은 구조적으로 별개일 수 있다. 본 발명의 추가의 국면은 약물 스크리닝 및 근육 기능의 평가시 사용하기 위한, 고화된 생체적합성 매트릭스 내의 바이오프린터로부터 분배된 다수의 포유동물 근육 세포를 포함하는 연속된 합성 조직 섬유의 2개 이상의 층을 포함하는 합성 근육 조직 구조물을 포함한다.
도 1에 제공된 바와 같이, 다수의 포유동물 세포, 예를 들어, 사람 평활근, 골격근 또는 심장근 세포를 포함하는 고화된 생체적합성 매트릭스는 침착 표면에 합성 조직 섬유를 형성하는 바이오프린터로부터 분배된다. 그와 같이, 후속적인 가교 결합 또는 다른 고화 단계는 프린트헤드로부터 이미-고화된 매트릭스를 분배한 후에는 필수적이지 않다. 이러한 방식으로, 합성 조직 섬유의 제2 및 후속적인 층이 제1 층의 상부에 연속적으로 침착되어 각각의 층의 구조적 통합성 및 형태 충실도를 유지하면서, 다층 구조물을 생성할 수 있다. 이러한 공정은 바람직한 높이의 구조물이 생성될 때까지 규정된 기간 동안 지속된다.
고화된 생체적합성 매트릭스는 프린트헤드로부터 분배되면서 순간적으로 고화될 수 있는 알기네이트, 또는 어떠한 다른 적합한 생체적합성 중합체도 유리하게 포함할 수 있다. 본원에 사용된 것으로서, 용어 "고화된"은 침착시 이의 형태 충실도 및 구조적 통합성을 유지하는 물질의 고체 또는 반-고체 상태를 말한다. 본원에 사용된 것으로서, 용어 "형태 충실도"는 이의 3차원 형태를 유지하는 물질의 능력을 의미한다. 일부 구현예에서, 고화된 물질은 약 30초 이상, 예를 들면, 1, 10 또는 30분 이상, 예를 들면, 1, 10, 24, 또는 48시간 이상의 기간 동안 이의 3차원 형태를 유지하는 능력을 지닌 것이다. 본원에 사용된 것으로서, 용어 "구조적 통합성"은 파괴, 굽힘 또는 붕괴를 견디면서, 이의 자체 중량을 포함하여, 하중 하에 함께 유지하는 물질의 능력을 의미한다.
일부 구현예에서, 고화된 생체적합성 매트릭스는 탄성 모듈러스가 약 15, 20 또는 25킬로파스칼(kPa) 이상, 보다 바람직하게는 약 30, 40, 50, 60, 70, 80 또는 90kPa 이상, 여전히 보다 바람직하게는 약 100, 110, 120 또는 130kPa 이상인 것이다. 대상체 바이오프린트된 합성 조직 섬유에 대한 바람직한 탄성 모듈러스 범위는 약 15, 25 또는 50kPa 내지 약 80, 100, 120 또는 140kPa을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 알기네이트계 매트릭스는 프린트헤드로부터 분배 전 또는 분배 시에 2가 양이온 가교결합 용액(예를 들면, CaCl2 용액)을 접촉함으로써 인쇄되고 인쇄시 동시에 가교결합된다. 특히 바람직한 구현예에서, 알기네이트계 생체적합성 매트릭스는 본원에 보다 상세히 기술한 바와 같이 하나 이상의 생리학적 물질을 추가로 포함한다. 추가의 바람직한 구현예에서, 고화된 생체적합성 매트릭스는 각각의 합성 조직 섬유의 방사형 단면적 전체에 걸쳐서 알기네이트의 균질한 조성을 포함한다.
본 발명의 주요 이점들 중 하나는 이것이 섬유계 3D 바이오프린팅 접근법을 사용하여 제작됨으로써, 조직이 이의 높이 및 너비가 프로그램식으로 변형될 수 있는 환 형태로 용이하게 제작되도록 하는 것이다. 반복된 구조적 통합성 및 형태 충실도를 달성하는 수단 또한 제공된다. 수개의 조직이 층 두께, 층의 수, 층 기하학, 세포 밀도, 물질 조성, 및 세포형을 포함하는, 동일한 매개변수의 세트를 사용하여 인쇄되는 경우, 이들은 실질적으로 모두 유사할 것이다. 본 발명의 유의적인 이점은 근육 세포가 프린팅된 후 수축하는 이들의 능력을 보유하거나, 재-발달하여, 근육 수축 및 후속적인 이완에 있어서 상이한 자극에 대한 효과의 정량화를 가능하도록 한다는 것이다. 이론에 얽메이지 않고, 본원에 기술된 다층의 연속 섬유는 섬유의 개개 층 내에서 구속 정도(degree of confinement)를 생성함으로써, 섬유를 가로지르기보다는 섬유의 방향을 따라 실질적으로 세포 증식을 촉진시킬 수 있으며, 이는 궁극적으로 세포가 천연에서 일어날 수 있는 바와 같이, 통일된 방향으로 수축하도록 한다. 본 발명자의 가장 우수한 이해를 위해서, 이것은 연속된 층별 침착 공정을 사용하여 제작된 근육 조직의 수축을 첫번째 증명이다.
일 구현예에서, 근육 조직의 다층 튜브가 본원에 기술되어 있다. 튜브는 이에 의해 근육 세포가 고화된 생체적합성 매트릭스 내에 분배되어 연속 섬유 속에 바이오프린트되는 층별 침착 공정을 사용하여 생성된다. 일 구현예에서, 섬유는 환-유사 양식으로 침착되어 층을 형성한다. 이들 층은 적재되어 튜브를 형성하고, 이의 높이는 층의 수를 변화시킴에 의해 조절된 방식으로 변할 수 있다. 바람직하게는, 매트릭스 조성물은 근육 세포가 수축성 표현형으로 완전히 분화하도록 생리학적으로 혼화성이다. 바이오프린팅시, 튜브는 수축성이 아니다. 수축성을 달성하기 위하여, 튜브는 일반적으로 형성 후 세포 배양 배지 속에 침지되고, 전형적으로 수일 동안 세포 배양 항온처리기 속에서 배양되며, 이 이상의 시간에 세포는 이들의 수축 능력을 다시 획득한다. 수축시, 튜브는 근유 수축 또는 이완에 대한 상이한 자극의 반응을 시험하기 위해 사용될 수 있으며, 이는 이것이 수축하거나 이완함에 따라서 튜브 직경 및/또는 원주에 있어서 변화를 측정함으로써 수행된다.
바이오프린팅용 근육 세포를 관 구조로 제조하기 위해서, 세포를 우선 분리하고 충분한 양으로 배양하여 바이오프린트된 구조물을 형성하여야만 한다. 세포 밀도는 측정가능한 수축을 제공하도록 충분히 높아야만 하며 전형적으로 겔 물질 mL당 1백만개 내지 10억개의 세포의　범위이다. 근육 세포는 기증된 사람 기관 또는 조직, 분화된 배아 또는 유도된 다능성 줄기 세포, 불멸화된 세포주, 또는 동물 조직으로부터 분리되거나 유도된 세포를 포함하는 많은 상이한 잠재적인 공급원으로부터 분리될 수 있다. 이후에, 분리된 세포는 고화되지 않은 형태로 현탁되어 바이오프린터 내로 로딩된다. 당해 공정을 통해 세포는 이들의 수축성 표현형을 상실한다.
바이오프린팅 후, 근육 구조물은 세포 배양 배지 속에 침지시키고 세포 배양 항온처리기 속에 온도 및 이산화탄소 수준을 조절하면서 두어야만 한다. 세포 배양물 속에서 일부 시간, 전형적으로 수일 후, 세포는 이들의 수축성 표현형을 되찾을 것이며 수축 및 이완하는 능력을 획득할 것이다. 도 2는 14일 동안 배양된 근육 튜브의 하향식 도면을 나타내며, 여기서 수축이 자극된다. 수축은 40분의 기간에 걸쳐 점진적으로 일어난다. 백색 점선은 이완된 상태의 튜브의 직경을 나타낸다. 수축된 상태에서 튜브는 보다 작은 직경을 가지며, 이러한 변화는 측정가능하다. 당해 실시예에서는 히스타민을 사용하여 수축을 개시하였지만, 많은 화합물 또는 다른 자극이 또한 수축을 개시할 수 있다. 일부 예는: 염화칼륨, 아세틸콜린, 히스타민, 및 전기적 전하를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 수축 및 이완은 튜브의 직경에 있어서의 변화를 육안으로 관찰하여 측정한다. 이는 저배율에서 현미경 대물 렌즈를 통해 튜브를 관찰하고 현미경에 장착된 디지탈 카메라를 사용하여 비디오를 기록함으로써 달성할 수 있다. 또한, 하향식 관점으로부터 튜브의 비디오 장면이 기록되도록 적절한 수준의 배율을 사용한 카메라를 평활근 튜브 위에 위치시킬 수 있었다. 소프트웨어를 사용하여 가장자리 검출 알고리즘을 사용하거나, 가장자리를 손으로 정의함으로써 비디오 장면에서 근육 튜브 구조물을 분리할 수 있다. 근육 튜브의 면적, 반경, 직경 또는 원주에 있어서의 변화를 정량화할 수 있다. 이러한 작용을 용이하게 달성하기 위해 이용가능한 많은 소프트웨어 도구들이 존재하며, Mathworks Matlab은 하나의 예이다.
도 3은 14일 후 필라멘트내에 배양된 평활근 세포의 투광 현미경 사진을 나타낸다. 여기에 나타낸 바와 같이, 평활근 세포는 섬유를 가로지르기보다는 섬유의 길이를 따라 성장하는 경향이 있으며, 이는 조화된 수축성 반응을 가능하도록 하거나 향상시킬 수 있다. 이론에 얽메이지 않고, 근육 세포가 모든 방향에서 균일하게 성장하는 경우 수축 반응은 가능하지 않을 수 있거나, 유의적이지 않을 수 있다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 합성 근육 조직 섬유는 각각의 성공적인 층 사이에 물질의 최소한의 통합성이 존재하도록, 바이오프린팅 공정 후 이의 구조적 통합성 및 형태 충실도를 유지한다. 바람직하게는, 층들은 도 3에 가시적으로 나타낸 바와 같이 서로 구조적으로 별개일 것이다. 가장 바람직하게는, 생리학적으로 혼화성이고 섬유 층의 프린팅 표면 위로의 침착 시 또는 침착된 후 가교결합에 대한 필요성이 없는 생체적합성 매트릭스 물질이 사용된다.
생체적합성 매트릭스 물질:
고화된 생체적합성 매트릭스는 예를 들면, 알기네이트, 라미닌, 피브린, 하이알루론산, 폴리(에틸렌)글리콜계 겔, 젤라틴, 키토산, 아가로즈, 또는 이의 조합물을 포함하는, 살아있는 세포의 다양성을 뒷받침하는 매우 다양한 천연 또는 합성 중합체 중의 어느 것도 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 고화된 생체적합성 매트릭스는 프린트헤드로부터 분배시 알기네이트, 또는 다른 적합한 생체적합성 중합체를 포함한다. 추가의 바람직한 구현예에서, 고화된 생체적합성 매트릭스는 각각의 합성 조직 섬유의 방사상 횡단면 전반에 걸쳐서 알기네이트의 균질한 조성을 포함한다.
특히 바람직한 구현예에서, 고화된 생체적합성 매트릭스는 생리학적으로 혼화성인데, 즉, 세포 성장, 분화 및 전달에 도움이 된다. "생리학적 매트릭스 물질"은 천연의 포유동물 조직에서 발견된 생물학적 물질을 의미한다. 이러한 생리학적 매트릭스 물질의 비-제한적 예는: 피브로넥틴, 트롬보스폰딘, 글리코스아미노글리칸(GAG)(예를 들면, 하이알루론산, 콘드로이틴-6-설페이트, 더마탄 설페이트, 콘드로이틴-4-설페이트, 또는 케라틴 설페이트), 데옥시리보핵산(DNA), 부착 당단백질, 및 콜라겐(예를 들면, 콜라겐 I, 콜라겐 II, 콜라겐 III, 콜라겐 IV, 콜라겐 V, 콜라겐 VI, 또는 콜라겐 XVIII)을 포함한다.
생체적합성 매트릭스는 살아있는 세포의 성장 및 생존능을 뒷받침하는 매우 다양한 천연 또는 합성 중합체로 구성될 수 있다. 이러한 물질의 예는 콜라겐, 알기네이트, 라미닌, 엘라스틴, 피브린, 하이알루론산, 폴리(에틸렌)글리콜계 겔, 젤라틴, 키토산, 아가로즈, 펩타이드, 또는 이의 조합물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 근육 튜브의 직경은 바이오프린터에 의해 정의되며 조절된 방식으로 변할 수 있으나, 바람직한 구현예는 다중-웰 세포 배양 플레이트의 내부에 조직을 위치시킬 목적의 경우 2mm 내지 30mm의 범위 내에 있다. 필라멘트 직경은 전형적으로 10μm 내지 300μm의 범위일 것이다.
포유동물 세포형 :
대상체 반월 이식체(subject meniscus implant)에 사용될 수 있는 포유동물 세포형의 비-제한적 예는 평활근 세포, 골격근 세포, 심장근 세포, 상피 세포, 내피 세포, 근아세포, 섬유모세포, 배아 줄기 세포, 간엽 줄기 세포, 유도된 다능성 줄기 세포, 분화된 줄기 세포, 조직-기원한 세포, 및 이의 어떠한 조합을 포함한다. 세포는 공여체(동종이계)로부터 또는 수용체(자가)로부터 수득될 수 있다. 세포는 또한 확립된 세포 배양주로부터 기원할 수 있거나 표현형의 바람직한 유전형을 달성하기 위한 유전 가공 및/또는 조작을 겪은 세포일 수 있다.
하나의 바람직한 구현예에서, 합성 조직 섬유는 사람 근육 세포, 예를 들면, 평활근 세포, 골격근 세포 및/또는 심장근 세포, 및/또는 이의 근아세포를 포함한다. 일 구현예에서, 합성 조직 구조물은 예를 들면, 섬유모세포, 내피 세포, 상피 세포, 줄기 세포 등을 포함하는, 근육 조직 섬유 내에 분산되거나 이의 주변에 배치된, 적어도 하나의 추가의 세포형을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 세포는 적합한 공여체, 사람 또는 동물로부터, 또는 세포가 이식되어야 하는 대상체로부터 수득될 수 있다. 포유동물 종은 사람, 원숭이, 개, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 고양이, 마우스, 토끼, 랫트를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일 구현예에서, 세포는 사람 세포이다. 다른 구현예에서, 세포는 개, 고양이, 말, 원숭이, 또는 다른 포유동물과 같은 동물로부터 기원할 수 있다.
포유동물 세포용으로 적절한 성장 조건은 당해 분야에 잘 공지되어 있다(Freshney, R. I. (2000) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique. Hoboken N.J., John Wiley & Sons; Lanza et al. Principles of Tissue Engineering, Academic Press; 2nd edition May 15, 2000; and Lanza & Atala, Methods of Tissue Engineering Academic Press; 1st edition October 2001). 세포 배양 배지는 일반적으로 필수 영양소 및, 임의로 배양되는 세포형(들)에 따라 선택될 수 있는, 성장 인자, 염, 광물, 비타민 등과 같은 추가의 성분을 포함한다. 세포 성장, 분화, 특수단백질의 분비 등을 향상시키기 위한 특수한 성분이 선택될 수 있다. 일반적으로, 표준 성장 배지는 10 내지 20% 태아 소 혈청(FBS) 또는 송아지 혈청 및 100U/ml의 페니실린이 보충된, 110mg/L의 피루베이트 및 글루타민이 들어있는, 둘베코 변형된 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium), 저 글루코즈(DMEM)가 당해 분야의 숙련가에게 잘 공지된 다양한 다른 표준 배지와 같이 적절하다. 성장 조건은 목적한 사용 및 조직에 있어 포유동물 세포의 유형에 따라 변할 것이다.
사람 세포의 추가의 공급원은 간엽줄기 세포(MSC)를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. MSC는 환자로부터 분리될 수 있고 지가이식 조직 대체물로서 사용하기 위해 용이하게 확장될 수 있으므로 재생 의약 목적으로 매력적이다. 공여체 동종 이식편과 달리, 수용체-기원한 MSC 자가이식편은 개인간 전염 또는 면역-매개된 조직 거부의 위험성이 없다. MSC의 추가의 이점은 MSC의 골격근 세포로의 정착 및 후속적인 분화를 위한 중요한 인자가 확인되어 있다는 점이다(Torihashi et al., J. Biol. Chem. 290:22771-81 (2015)).
일 구현예에서, 근육 튜브는 필라멘트 내에 위치하거나 필라멘트의 외부에 부착된, 섬유모세포, 내피 세포 또는 상피 세포와 같은 하나 이상의 세포형을 포함할 것이다.
다른 구현예에서, 하나 이상의 세포형은 튜브가 도 4에 나타낸 바와 같이 동축이도록, 근육 튜브의 외부 및/또는 내부 측면에 위치하며, 여기서 세포형 1, 세포형 2, 또는 세포형 3 중의 어느 것도 수축성 근육 세포이다.
여전히 다른 구현예에서, 하나 이상의 세포형은 근육 세포의 위 또는 아래에 위치하여, 샌드위치형 구조물(나타내지 않음)을 형성한다.
여전히 또 다른 구현예에서, 하나 이상의 세포형은 하나의 세포형이 도 5에 나타낸 바와 같이, 동축 정렬로 다른 세포형을 둘러싸도록 필라멘트 내에 정렬되며, 여기서 세포형 1 또는 세포형 2는 수축성 평활근 세포이다.
일부 구현예에서, 바이오브린팅을 수행하여 수득되는 근육 튜브를 수시간 이상 동안 세포 배양물 속에 둔 후, 필라멘트를 용해하거나 기타의 경우에는 제거하여, "스캐폴드가 없는(scaffold free)" 것으로 때때로 언급되는, 비-세포 물질이 실질적으로 없는 튜브를 수득한다. 세포는 상호연결된 네트워크를 형성하므로, 근육 튜브의 전체 구조는 필라멘트의 제거 후에도 유지된다.
스크리닝 방법
본 발명의 국면은 a) 대상체 합성 생체 조직 구조물을 시험 제제 및/또는 조건과 접촉시키는 단계; 및 b) 예를 들면, 차원 변화(예를 들면, 상기 구조물의 면적, 직경 및/또는 길이와 같은)를 측정함으로써 근육 기능을 평가하고/하거나 세포 생존능, 증식, 분극화(polarization), 및/또는 예를 들면, 평활근 액틴, 칼포닌 또는 칼데스몬의 발현을 포함하는 유전자 발현, 항-평활근 세포 항체(ASMA)의 결합 등과 같은 메트릭스를 분석함으로써 포유동물 근육 세포에서 제제 및/또는 조건의 효과를 측정하는 단계를 포함하여, 포유동물 근육 세포의 수축 기능에 있어서 시험 제제 및/또는 조건의 효과를 평가하는 방법을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 구조물은 실린더/튜브를 포함하고, 상기 측정 단계는 실린더의 직경 및/또는 원주에 있어서의 변화를 측정하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 근육 튜브는 효능 또는 독성에 대해 약물 화합물을 시험하기 위한 방법으로서 사용된다.
일부 구현예에서, 근육 튜브의 수축은 힘 변환기에 의해 측정된다.
일부 구현예에서, 세포 생존능, 증식, 분극화, 및/또는 예를 들면, 평활근 액틴, 칼포닌 또는 칼데스몬의 발현을 포함하는 유전자 발현과 같은 추가의 매트릭스가 평가되거나, 항-평활근 세포 항체(AMSA), 또는 다른 단백질의 결합이 측정된다.
근육 결함을 회복시키는 방법
본 발명의 국면은 대상체에서 근육의 적어도 일부를 회복시키고/시키거나 교체하는 방법을 포함한다. 본원에 기술된 합성 근육 섬유 조직 및 튜브 중 어느 것도 근육 회복 및/또는 재생을 달성하기 위하여 이를 필요로 하는 대상체 내로 이식될 수 있다. 따라서, 대상체에서 근육 결함을 회복하거나 근육 재생을 촉진시키는 방법이 또한 본원에 제공된다. 일 구현예에서, 당해 방법은 본원에 기술된 바와 같은 합성 근육 조직 구조물을 근육 회복 또는 재생이 필요한 결함 부위 내로 이식시킴을 포함한다.
용어 "대상체"는 사람, 침팬지 및 다른 영장류 및 원숭이 종과 같은 비사람 영장류; 소, 양, 돼지, 염소 및 말과 같은 농장 동물; 개 및 고양이와 같은 애완 동물; 마우스, 랫트 및 기니아 피그와 같은 설치류를 포함하는 실험 동물 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 용어는 특수한 연령 또는 성별을 나타내지 않는다. 따라서, 성체 및 신생 대상체, 및 또한 태아가, 수컷 또는 암컷에 상관없이 포함된다. 일 구현예에서, 대상체는 포유동물이다. 일 구현예에서, 대상체는 사람 대상체이다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 결함 부위에서 근육 이식체, 또는 이의 일부를 확보하고/하거나 대상체내 적어도 하나의 해부학적 구조물에 근육 이식체의 하나 이상의 부위를 확보하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 방법은 대상체로부터 결함이 있는 근육의 적어도 일부를 제거하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본원에 언급된 모든 특허 및 특허 공보는 본원에 참고로 포함된다.
특정한 변형 및 개선은 상기한 설명을 판독하는 경우 당해 분야의 숙련가에게 일어날 것이다. 이러한 변형 및 개질은 간결성과 판독가능성을 위해 본원에서 삭제하였지만 하기한 청구범위 영역 내에 적절하게 존재함을 이해하여야 한다.

Claims (18)

  1. 합성 생체 조직 구조물로서,
    침착시 포유동물 세포의 섬유의 구조적 통합성 및 형태 충실도를 유지할 수 있는 고화된 생체적합성 매트릭스 내에 바이오프린터로부터 분배된 포유동물 세포의 오버래핑(overlapping) 섬유를 포함하고,
    상기 고화된 생체적합성 매트릭스는 방사상 횡단면에서 균질하고; 그리고 상기 섬유는 합성 생체 조직 구조물의 적어도 2개의 층을 통해 연속적으로 바이오프린트(bioprint)되는, 합성 생체 조직 구조물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 섬유가 상기 구조물의 적어도 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상의 층을 통해 연속적으로 바이오프린트되는, 합성 생체 조직 구조물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 섬유의 오버래핑 층이 바이오프린팅 후 구조적으로 별개인, 합성 생체 조직 구조물.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 생체적합성 매트릭스가 생리학적으로 혼화성인, 합성 생체 조직 구조물.
  5. 청구항 2에 있어서, 상기 구조물이 실린더/튜브를 포함하고, 상기 필라멘트(filament)가 상기 실린더의 각각의 층을 통해 실질적으로 연속성인 합성 생체 조직 구조물.
  6. 청구항 2에 있어서, 상기 구조물이 평면 시이트(planar sheet)를 포함하고, 상기 필라멘트는 상기 평면 시이트를 통해 실질적으로 연속성인, 합성 생체 조직 구조물.
  7. 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물 세포가 근육 세포인, 조직 구조물.
  8. 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 근육 세포가 평활근 세포인, 조직 구조물.
  9. 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 근육 세포가 골격근 세포인, 조직 구조물.
  10. 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 근육 세포가 심장근 세포인, 조직 구조물.
  11. 청구항 7 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 있어서, 상기 구조물이 수축 기능을 포함하고, 그리고 상기 수축 기능성이 상기 구조물의 직경 및/또는 원주에 있어서의 변화에 의해 측정될 수 있는, 조직 구조물.
  12. 청구항 7 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 추가의 세포형을 추가로 포함하는, 조직 구조물.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 적어도 하나의 추가의 세포형이 상기 필라멘트 내에 분산되는, 조직 구조물.
  14. 청구항 12에 있어서, 상기 적어도 하나의 추가의 세포형이 외부/제2 층으로서 상기 필라멘트의 외부 주변에 배치되는, 조직 구조물.
  15. 청구항 1 내지 청구항 14 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물 세포가 사람 세포인, 조직 구조물.
  16. 청구항 1 내지 청구항 15 중 어느 한 항에 따른 조직 구조물을 포함하는, 키트(kit).
  17. 포유동물 근육 세포의 수축 기능에 대한 시험 제제 및/또는 조건의 효과를 평가하는 방법으로서,
    a) 청구항 7 내지 청구항 10 중 어느 한 항의 합성 생체 조직 구조물을 상기 시험 제제 및/또는 조건과 접촉시키는 단계; 및
    b) 상기 구조물 내 차원 변화를 측정함으로써 상기 포유동물 근육 세포에서 상기 제제 및/또는 조건의 효과를 측정하는 단계를 포함하는, 방법.
  18. 청구항 15에 있어서, 상기 구조물이 실린더/튜브를 포함하고, 그리고 상기 측정 단계가 상기 실린더의 면적, 직경 및/또는 원주에 있어서의 차원 변화를 측정하는 것을 포함하는, 방법.
KR1020187001242A 2015-06-16 2016-06-16 연속적으로 바이오프린트된 다층 조직 구조물 KR20180042220A (ko)

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US201562180174P 2015-06-16 2015-06-16
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