CN110327134A - 可拆卸式专用模具及制备多分支通道复杂器官前体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生命、医学领域带多分支通道复杂组织器官的人工制造技术，特别涉及到一种可拆卸式组合模具及制备带多分支通道复杂器官前体的方法。其旨在现有技术的基础上，使用可拆卸式内模具及多级外模具成形具有不同细胞基质层的带有多分支通道的器官前体。包括底座、内模具及外模具；其中，底座为顶部敞开的容器状结构，外模具为底部敞开的壳体结构；所述内模具为用于模拟复杂器官前体两级分支通道的分支通道；所述外模具放置于底座上时，壳体结构与容器状结构间形成包围空间，内模具置于该包围空间内且一端伸出包围空间外；所述外模具上设置有加料口。
Description
技术领域
本发明属于生命、医学领域带多分支通道复杂组织器官的人工制造技术，特别涉及到一种可拆卸式组合模具及制备带多分支通道复杂器官前体的方法。
背景技术
由于人体组织缺损、衰竭或损伤等情况的发生往往会导致器官功能障碍并严重危及患者的正常生活甚至生命安全。药物治疗、替代性疗法可以暂时挽救病人的生命，但不能长久的保持病人的健康及正常生活，器官移植可以用于治疗这类疾病，但供体器官严重短缺，移植后器官深受患者自身免疫排斥反应的影响，为抑制免疫排斥反应需长期使用免疫抑制药物，这些缺点都严重制约着器官移植这一技术的应用。为了解决终末期器官损伤类疾病对人们的影响，组织工程应运而生。组织工程（Tissue engineering），在1987年由美国国家科学基金会正式确立，是一门以细胞生物学和材料科学相结合，进行体外或体内构建组织或器官的新兴学科。在组织工程的研究领域，可以实现利用患者自体细胞进行体外培养，最终研制出符合患者自身需求的人工器官，这既可以减少因供体器官不足而导致的患者错失治疗时机的现象，又可以避免器官移植后的免疫排斥反应，为众多的组织缺损、器官功能衰竭病人的治疗带来了曙光。
在过去的几十年间，组织工程一直处于波浪式前进过程中。由于受组织工程学家背景技术的限制，现阶段组织工程的成果主要集中在结构相对简单的骨组织及皮肤产品的制备，而对复杂器官的研究迟迟难以取得突破。以肝脏制造为例，肝脏中存在有大量丰富的血管、胆管等管状网络，它们为组成肝脏的各部分组织细胞提供氧气和营养的同时将代谢废物排出体外，保证各种生理功能正常运行。如果不能很好地实现这些管状网络的构建，那么制造出的肝脏产品中会有相当大的死核区域，既不能保证肝脏功能的实现，又不能维持肝脏正常的组织结构，因此对于血管等管状网络的构建才是复杂器官制造的关键。研究表明，细胞离毛细血管的距离必须足够近（100-200μm）才能从毛细血管中获得氧气和营养，并将代谢废物交换给毛细血管。（Bertassoni LE, Cecconi M, Manoharan V, et al.Hydrogel bioprinted microchannel networks for vascularization of tissueengineering constructs. Lab Chip. 2014;14(13):2202–2211. doi:10.1039/c4lc00030g）缺乏足够精细的血管网络将很难实现厚组织的构建。在组织工程中，常用的构建血管的方法主要有使用相应的生长因子缓慢促进血管不同组织层形成，多细胞联合培养形成血管结构，利用生物反应器和微流体通道等技术形成血管以及基于先进成型技术的血管化组织直接构建等。目前，血管、神经等分支管道的构建已成为器官制造领域的主要研究热点。
发明专利（申请号为201110448154.3）《基于一种组合模具的复杂器官前体的制备方法》中提供了一种多分支及多层结构的复杂组织器官前体的制备方法，即利用组合模具分层灌注来成型含有多分支结构的复杂器官组织前体。该发明的缺点在于采用直接拆模的方式，一方面对模具内部形状及粗糙度要求较高，另一方面在于脱模时，实心多分支内模具由于其形状不规则在脱出时会破坏已经成型的细胞基质层。
发明专利（申请号为201210324600.4）《利用旋转组合模具制备纺锤状复杂器官前体的方法》中提出了一种利用旋转组合模具制备纺锤状复杂器官前体的方法，理论上可以成形带多分支管状通路的纺锤体状复杂器官，但缺点在于对于模具的旋转速度没有定量的限制，旋转速度不同，纺锤体成型高度不同，难以确定纺锤体的具体成型形状。且这一模具只能用于含一组分支通道的纺锤体状器官前体成形，过程复杂、结构单一、精确度低。在内模具拔模时易造成含细胞基质材料结构破坏。
发明专利（申请号为201510419730.X）《一种制备带多分支通道的组织器官前体的方法及专用模具》中提出了一种制备带多分支通道的组织器官前体的方法及专用模具，其缺点在于中间步骤太多，大小管道间易错位。若加入的水凝胶溶液有一定的粘稠度，则很难充满整个内腔，一体型分支内模具从细胞基质层中取出时会对已成形的细胞基质层造成破坏。
发明内容
本发明就是针对现有技术存在的缺陷，提供一种可拆卸式专用模具及制备多分支通道复杂器官前体的方法，其旨在现有技术的基础上，使用可拆卸式内模具及多级外模具成形具有不同细胞基质层的带有多分支通道的器官前体，以克服现有技术难以实现含多分支通道复杂器官前体的多种形状精确构建。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案，可拆卸式专用模具，包括底座、内模具及外模具；其中，底座为顶部敞开的容器状结构，外模具为底部敞开的壳体结构；所述内模具为用于模拟复杂器官前体两级分支通道的分支通道；（该复杂器官前体可以是血管、胆管、神经或气管。）。
所述外模具放置于底座上时，壳体结构与容器状结构间形成包围空间，内模具置于该包围空间内且一端伸出包围空间外；所述外模具上设置有加料口。
作为本发明的一种优选方案，所述底座的内腔为单内腔或为宽度从下至上逐级递增的阶梯式内腔。
所述内模具至少为一组，每组内模具均由用于模拟一级分支通道的上模具和用于模拟二级分支通道的下模具组成，两者可拆卸式相连。
所述外模具至少一个，外模具为一个时，对应单内腔底座，外模具的内腔的形状与所需器官前体形状一致；外模具为两个或两个以上时，对应阶梯式内腔底座，且外模具的个数与阶梯式内腔的阶梯数相同。
多个外模具可由小到大逐一嵌套在一起并放置于阶梯式内腔底座中；其中，最内层外模具对应阶梯式内腔宽度最窄的阶梯空间，最外层外模具对应阶梯式内腔宽度最宽的阶梯空间；且外模具底部与其对应的阶梯空间无缝贴合，相邻两嵌套的外模具中：外层外模具的内腔与其嵌套的内层外模具在嵌套部分无缝贴合，且每层外模具的内腔的形状均与所需器官前体形状一致。
作为本发明的另一种优选方案，所述上模具为圆柱形，该圆柱形的下表面设置有五个圆形凹槽：其中一凹槽位于下表面的圆心，其余四个凹槽以该圆心为中心沿下表面的外缘等间距分布；所述下模具包括一个起定位作用的定位下模具和四个普通下模具；定位下模具与普通下模具均为圆棒状；且定位下模具与位于下表面圆心的凹槽紧配合，四个普通下模具各与其余四个凹槽中的一凹槽紧配合，使上模具与下模具成为一个整体。
所述底座的底面为平面、凹面或凸面，且分布有定位槽，定位槽的个数与内模具的组数相等；使用时，内模具的上模具的顶部伸出包围空间外，该内模具的定位下模具位于底座的定位槽中。
作为本发明的另一种优选方案，当多个外模具由小到大逐一嵌套在一起并放置于阶梯式内腔底座中，各外模具的加料口尺寸相同且中心线位于同一条直线上。（由于只有定位下模具对内模具起固定作用，故内模具可以在包围空间中绕各自下模具自由转动，在加料时可以使料体混合均匀，尽可能的减小了由于模具内腔过渡不光滑造成的空腔等现象。）。
作为本发明的另一种优选方案，所述外模具采用合成高分子材料。
作为本发明的另一种优选方案，所述内模具的材质为合成纤维、聚乙烯、聚氯乙烯或光敏树脂中的任意一种。
一种制备多分支通道复杂器官前体的方法，包括以下步骤。
步骤1、制备质量体积浓度为1％～30％的水凝胶溶液作为基质溶液，提取或购买动物细胞制成细胞悬浮液，细胞密度为1×103～5×107个/ml，将基质溶液与细胞悬浮液按体积比1:9～9：1混合制成含细胞的基质溶液，重复上述步骤制作含有多种（如三种）不同细胞的基质溶液。
步骤2、制备质量百分浓度为1％～30％的合成高分子溶液，合成高分子材料采用聚氨酯、聚己内酯、聚碳酸酯、聚乳酸、聚乙二醇、聚乳酸、聚酯、聚羟基酸酯和乳酸与乙醇酸共聚物中的一种或几种材料的复合物，用于溶解合成高分子材料的有机溶剂采用四乙二醇、乙二醇、异丙醇或 1，4-二氧六环。
步骤3、使用3D打印技术，将无细胞毒性的材料打印制成专用模具的各个组成部分；将定位下模具安装到上模具中心凹槽内，再将四个普通下模具安装到上模具其他凹槽内，构建成一组内模具；将一组内模具中的定位下模具安装到底座的定位槽内，完成对内模具的定位；对于多组内模具，再将其他组内模具安装到底座的其他定位槽内。
将多个外模具中尺寸最小的外模具，作为内环外模具放置到底座的阶梯式内腔宽度最窄的阶梯空间内，各内模具的上模具（由通孔）穿出内环外模具外，将第一种含有细胞的基质溶液通过加料口加入到包围空间中，随后边旋转内模具边加样，使基质溶液充分填满整个包围空间；使用物理、化学交联或聚合方法制成第一层细胞基质层。
步骤4、去除内环外模具，将次大外模具作为中环外模具放置于底座的相应阶梯空间上，各内模具的上模具（由通孔）穿出中环外模具外，通过加料口向中环内模具与已形成的细胞基质层之间的空腔中加入含有第二种细胞的基质溶液，并进行交联，制成第二层细胞基质层。
步骤5、去除中环外模具，以此类推，直至安装到最外层外模具，作为外环外模具放置到底座的相应阶梯空间上，重复步骤3的加料步骤制备出多层细胞基质层。
步骤6、将外环外模具去除，取出已形成的细胞基质层，沿着上模具和下模具的安装方向逆向拆除上模具和下模具，这样可以减少对已形成的细胞基质层的破坏，最终获得相对较完整的多通道复杂器官前体。
作为本发明的另一种优选方案，水凝胶溶液可取用明胶、海藻酸钠、胶原蛋白、纤维蛋白、琼脂糖、透明质酸、纤维蛋白原、凝血酶、壳聚糖、丝素蛋白、普朗尼克、聚乙二醇中的一种或者几种。（以多种材料相互混合得到的水凝胶溶液效果较佳。）。
作为本发明的另一种优选方案，可成型多层含有不同细胞的细胞基质层，完成多种细胞组织的组装。
作为本发明的另一种优选方案，多分支通道结构在器官前体成型后，可以加入内皮细胞生长因子、细胞转移因子或肝细胞生长因子中的一种或几种，以及肝素、紫杉醇或硫酸化壳聚糖中的一种或几种，诱导通道表层细胞分化形成血管的、胆管的、气管的、神经的管状网络或树枝状网络。
作为本发明的另一种优选方案，灌注细胞前多组内模具互不连接，互不干扰，每个管状通道表面细胞基质层有一定的厚度。
与现有技术相比本发明有益效果。
本发明相对于现有技术，采用可拆分式组合模具制备带多分支内部通道的复杂器官前体。分层灌注得到不同的细胞基质层，不同的细胞基质层之间的分支通路相互贯通。模具拆装简便，可以在腔内混匀含细胞的基质溶液，脱模时尽可能减少对已成型细胞基质层的破坏，各模具及底座的尺寸、形状等可以根据待成形的器官前体进行调整。使用灌注的方法使特定器官前体的制造简便易行。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步说明。本发明保护范围不仅局限于以下内容的表述。
图1是专用模具的整体剖面图。
图2专用模具剖面拆分图。
图3a是底座的俯视图。
图3b是底座图3a的A-A剖面图。
图4a是内模具的前视图。
图4b是内模具的结构示意图。
图5是带多分支通道的复杂器官前体成型图（以三种不同细胞基质层的器官前体为例）。
图6是专用模具整体示意图（虚线为不可见部分）。
图中，101-上模具；102-普通下模具；103-定位下模具；201-内环外模具；202-中环外模具；203-外环外模具；301-底座；501-加料口；401-第一层细胞基质层；402-第二层细胞基质层；403-第三层细胞基质层；404-中空管道。
具体实施方式
图1是本发明提供的专用模具的整体剖面图，图2是该专用模具的剖面拆分图，图3a是底座的俯视图，图3b是底座在A-A位置上的剖面图；图4a和图4b是内模具的结构图；图6是专用模具整体示意图。
模具包括底座301，至少一组内模具和至少一组外模具组成。其中，内模具由模拟二级通道分支的普通下模具102嵌入模拟一级通道分支的上模具101相应的凹槽中，来达到固定的目的。随后将起定位作用的定位下模具103嵌入底座301的相应凹槽中来固定。上模具形状为圆柱体，其一端有五个（或多个）圆形凹槽，这些凹槽直径与下模具的直径一致，使得下模具嵌入上模具中后两者连接的缝隙极小。（具体地，上模具也可为中空管道，用于血管、胆管、气管、乳管、尿道、神经等管状或树枝状网络构建。）。
下模具由一个定位下模具与四个（或多个）普通下模具组成，普通下模具形状与定位下模具略有不同，（其斜插于上模具凹槽内，用于模拟人体血管。）下模具与一个上模具相嵌构成一组内模具。底座为由下而上逐级扩大的阶梯状，阶梯数与外模具数量相同，底座底面可以为平面、凹面或者凸面，且分布有定位槽，定位槽数量与内模具组数相一致，定位槽尺寸与起定位作用的定位下模具尺寸完全一致。多个定位槽距底座中心距离不可过近，防止内模具无法装配上。每级外模具下端外部尺寸均与底座相应级数阶梯的外部表面所围成的面尺寸相同，（以三层为例）从内而外依次为内环外模具、中环外模具、外环外模具，可以使用更多级数的外模具，但要求与底座阶梯级数始终一致。相邻两模具，下一级外模具的内腔与上一级外模具的外轮廓之间尺寸一致，且最内层外模具的内腔的轮廓设计为与所需器官前体形状一致。
每级外模具上部留有加料口，且不同级数的外模具虽上端外表面尺寸逐级增大，但加料口尺寸始终一致且其中心线位于同一直线。由于只有定位下模具对内模具其固定作用，故内模具可以在内腔中自由旋转，在加料时可以使料体混合均匀，尽可能的减小了由于模具内腔过渡不光滑造成的空腔等现象。制造模具时要使用无生物毒性的硬质材料，如合成纤维、聚乙烯、聚氯乙烯或光敏树脂等。
图5是组织成型示意图，制备多分支通道复杂器官前体具体包括以下步骤。
1）制备质量体积浓度为1％～30％的水凝胶溶液作为基质溶液，提取或购买动物细胞制成细胞悬浮液，细胞密度为1×103～5×107个/ml，将基质溶液与细胞悬浮液按体积比9：1混合制成含细胞的基质溶液，重复上述步骤制作三种含有不同细胞的基质溶液。水凝胶溶液一般可取用明胶、海藻酸钠、胶原蛋白、纤维蛋白、琼脂糖、透明质酸、纤维蛋白原、凝血酶、壳聚糖、丝素蛋白、普朗尼克、聚乙二醇等材料中的一种或者几种，以多种材料相互混合得到的水凝胶溶液效果较佳。
2）制备质量百分浓度为1％～30％的合成高分子溶液，合成高分子材料采用聚氨酯、聚己内酯、聚碳酸酯、聚乳酸、聚乙二醇、聚乳酸、聚酯、聚羟基酸酯和乳酸与乙醇酸共聚物中的一种或几种材料的复合物，用于溶解合成高分子材料的有机溶剂采用四乙二醇、乙二醇、异丙醇或 1，4-二氧六环。
3）使用3D打印技术，将无细胞毒性的材料打印制成专用模具的各个组成部分。将定位下模具安装到上模具中心凹槽内，再将四个普通下模具安装到上模具其他凹槽内，这样构建成一组内模具。将一组内模具中的定位下模具安装到底座的定位槽内，这样完成了对内模具的定位。再将其他两组内模具安装到底座的另两个定位槽内。将内环外模具201安装到底座的内侧阶梯上，将第一种含有细胞的基质溶液通过加料口加入到模具内腔中，随后边旋转内模具边加样使内腔中的基质溶液充分填满整个内腔。灌注细胞前保证三组内模具互不连接，互不干扰，保证每个管状通道表面细胞基质层有一定的厚度，随后使用物理、化学交联或聚合等方法制成第一层细胞基质层401。
4）去除内环外模具，将较大的中环外模具202安装到底座的相应阶梯上，通过加料口向中环内模具与已形成的细胞基质层之间的空腔中加入含有第二种细胞的基质溶液，并进行交联，制成第二层细胞基质层402。
5）去除中环外模具，安装外环外模具203到底座相应阶梯上，重复步骤3）的加料步骤制备出第三层细胞基质层403。
6）将外环外模具去除，取出已形成的细胞基质层，沿着上模具和下模具的安装方向逆向拆除上模具和下模具，这样可以减少对已形成的细胞基质层的破坏，最终获得相对较完整的多通道复杂器官前体。多分支通道结构在器官前体成型前或后，可以加入内皮细胞生长因子、细胞转移因子或肝细胞生长因子中的一种或几种，以及肝素、紫杉醇或硫酸化壳聚糖中的一种或几种，诱导通道表层细胞分化形成血管、胆管、气管、神经等管状或树枝状网络。
本发明的优选方案是选用明胶、海藻酸钠、胶原蛋白、纤维蛋白、琼脂糖、透明质酸、纤维蛋白原、凝血酶、壳聚糖、丝素蛋白、普朗尼克、聚乙二醇等材料中的一种或者几种，将它们溶于生理盐水、PBS溶液、pH＝6～8的0.09M 氯化钠、3－羟甲基氨基甲烷盐酸溶液或细胞培养液作为细胞基质溶液；合成高分子材料采用聚氨酯、聚己内酯、聚碳酸酯、聚乳酸、聚乙二醇、聚乳酸、聚酯、聚羟基酸酯和乳酸与乙醇酸共聚物中的一种或几种材料的复合物，用于溶解合成高分子材料的有机溶剂采用四乙二醇、乙二醇、异丙醇或 1，4-二氧六环；在含细胞的基质溶液和合成高分子溶液中加入内皮细胞生长因子、细胞转移因子或肝细胞生长因子中的一种或多种，以及肝素、紫杉醇或硫酸化壳聚糖等抗凝血因子中的一种或多种。
本发明所制成的带多分支通道的复杂器官前体，所述通道可诱导为血管、胆管、神经、尿道、气管等多种通道。将所述通道诱导为血管的具体方法为，成形前先在内模具表面涂敷含内皮细胞的基质溶液，采用物理或化学交联或聚合方法，对含内皮细胞或干细胞/内皮细胞生长因子的基质溶液进行交联形成含内皮细胞或干细胞/内皮细胞生长因子基质层601，随后依次灌注器官实质细胞悬浮液构成实质细胞层或干细胞/实质细胞生长因子和合成高分子溶液，萃取后在内模具表面形成含内皮细胞或干细胞/内皮细胞生长因子基质层-内皮细胞或干细胞/内皮细胞生长因子层-合成高分子层三层结构（图6所示），成形完成细胞基质层小心拔出内模具，将该三层结构留在通道四周；将所述通道诱导为神经的具体方法为，直接将含血旺细胞或干细胞/神经细胞生长因子的基质溶液灌注进通道，经体内或体外培养形成。
实施例1：制备带多分支血管、胆管的肝脏前体。
1）使用3D打印技术，将无细胞毒性的材料打印制成专用模具的各个组成部分，包括3个上模具，3个定位下模具，12个普通下模具，1个三级底座，以及不同级数的外模具各一个。将定位下模具安装到上模具中心凹槽内，再将四个普通下模具安装到上模具其他凹槽内，这样构建成一组内模具。
2）将5%明胶、2%海藻酸钠共混溶于PBS溶液中作为基质溶液，购买脂肪干细胞/内皮细胞生长因子、胆管上皮细胞、肝星状细胞、肝窦内皮细胞和肝细胞制成细胞悬浮液，细胞密度为1×107个/ml,将基质溶液与细胞悬浮液分别按1：1体积比混合制成含细胞的基质溶液，配备浓度为 10%（w/v）的PLGA/四乙二醇(Tetraglycol)溶液作为合成高分子溶液，并加入1%（w/v）的肝素。
3）对两组内模具进行血管化处理制成血管内模具，具体方法是在内模具表面涂敷一层脂肪干细胞/内皮细胞生长因子，并用2%氯化钙溶液进行交联，对第三组内模具表面涂敷一层含胆管上皮细胞的基质溶液，并用2%氯化钙溶液进行交联，即形成胆管结构。
4）将每组内模具中的定位下模具插入到底座的定位槽内，三组内模具保持一定距离，随后将内环外模具插入到底座的第一级阶梯上。 将含有肝细胞的细胞基质溶液通过加料口灌注入模具内腔中，轻微旋转三组内模具使细胞基质溶液充满整个待成型的内腔底部的缝隙，加入氯化钙使其交联，形成一层稳定的细胞基质层，其中含有两组血管通道及一组胆管通道。
5）去除内环外模具，将中环外模具安装到底座的第二级阶梯上，通过加料口灌注含有肝细胞和肝星状细胞的基质溶液，旋转中环外模具使基质溶液充满整个内腔，随后通过氯化钙溶液进行交联，形成另一层稳定的细胞基质层。
6）去除中环外模具，将外环外模具安装到底座的第三级阶梯上，通过加料口灌注含有肝细胞和肝窦内皮细胞的基质溶液，旋转外环外模具使基质溶液充满整个内腔，随后通过氯化钙溶液进行交联，形成另一层稳定的细胞基质层。
7）将合成高分子溶液喷洒到所成形的多细胞基质层表面，经萃取后形成合成高分子材料层，去除底座模具。
8）将内模具沿各组成模具的轴向缓慢抽出，在尽可能少的破坏细胞基质层的情况下可以获得较为完整的具有多层不同细胞基质层的肝脏前体。
实施例2：制备带多分支血管、神经的心脏前体。
1）使用3D打印技术，将无细胞毒性的材料打印制成专用模具的各个组成部分，包括3个上模具，3个定位下模具，12个普通下模具，1个三级底座，以及不同级数的外模具各一个。将定位下模具安装到上模具中心凹槽内，再将四个普通下模具安装到上模具其他凹槽内，这样构建成一组内模具。
2）配制5%纤维蛋白原溶液作为基质溶液，10IU/mL凝血酶溶液，购买内皮细胞、血旺细胞和心肌细胞制成细胞悬浮液，内皮细胞悬浮液、血旺细胞悬浮液的细胞密度均为为2×107个/ml,心肌细胞悬浮液的细胞密度为1×105个/ml，将基质溶液与细胞悬浮液分别按1：1体积比混合制成含细胞的基质溶液，配备浓度为 30%（w/v）的30%聚酯/四异二醇溶液作为合成高分子溶液，并加入3%（w/v）的紫杉醇。
3）对两组内模具进行血管化处理制成血管内模具，具体方法是在两组内模具表面涂敷一层含内皮细胞的基质溶液，并用凝血酶溶液交联，随后喷洒内皮细胞悬浮液形成内皮细胞层，接着在内皮细胞层表面喷洒合成高分子溶液并萃取，至此在内模具表面形成含内皮细胞的基质层-内皮细胞层-合成高分子层三层结构，其余内模具不做处理作为神经内模具。
4）将每组内模具中的定位下模具插入到底座的定位槽内，三组内模具保持一定距离，随后将内环外模具插入到底座的第一级阶梯上。 将含有心肌细胞的细胞基质溶液通过加料口灌注入模具内腔中，轻微旋转三组内模具使细胞基质溶液充满整个待成型的内腔底部的缝隙，加入凝血酶溶液使其交联，形成第一层稳定的细胞基质层，其中含有两组血管通道及一组神经管状通道。
5）去除内环外模具，依次装入中环外模具和外环外模具并使用凝血酶进行交联。将合成高分子溶液喷洒到所成形的细胞基质层表面，经萃取后形成合成高分子材料层，去除底座模具。
6）将内模具沿各组成模具的轴向缓慢抽出，尽可能少的破坏细胞基质层。
7）将含血旺细胞的基质溶液灌注进神经通道，使其成型形成神经管状通路，从而制得较为完整的带多分支血管、神经的心脏前体。
实施例3：制备带多分支血管、神经和尿道的膀胱前体。
1）使用3D打印技术，将无细胞毒性的材料打印制成专用模具的各个组成部分，包括3个上模具，3个定位下模具，12个普通下模具，1个三级底座，以及不同级数的外模具各一个。将定位下模具安装到上模具中心凹槽内，再将四个普通下模具安装到上模具其他凹槽内，这样构建成一组内模具。
2）配制含5%纤维蛋白原和4%海藻酸钠的混合溶液作为基质溶液，10IU/mL凝血酶溶液和2%氯化钙溶液；购买内皮细胞、血旺细胞、尿道上皮细胞和膀胱细胞制成细胞悬浮液，细胞密度均为1×106个/ml；将基质溶液与细胞悬浮液分别按2：3体积比混合制成含细胞的基质溶液；配备30%聚氨酯/四乙二醇溶液作为合成高分子溶液，并加入5%的紫杉醇。
3）对一组内模具进行血管化处理制成血管内模具，具体方法是在两组内模具表面涂敷一层含内皮细胞的基质溶液，并用凝血酶溶液交联，随后喷洒内皮细胞悬浮液形成内皮细胞层，接着在内皮细胞层表面喷洒合成高分子溶液并萃取，至此在内模具表面形成含内皮细胞的基质层-内皮细胞层-合成高分子层三层结构。
4）对第二组内模具进行处理使其作为尿道内模具，具体方法是在内模具表面涂敷一层含尿道上皮细胞的基质溶液，并用凝血酶溶液进行交联，即形成尿道结构。
5）将每组内模具中的定位下模具插入到底座的定位槽内，三组内模具保持一定距离，随后将内环外模具插入到底座的第一级阶梯上。 将含有膀胱细胞的细胞基质溶液通过加料口灌注入模具内腔中，轻微旋转三组内模具使细胞基质溶液充满整个待成型的内腔底部的缝隙，加入凝血酶溶液使其交联，形成第一层稳定的细胞基质层，其中含有一组血管通道，一组尿道及一组神经管状通道。
6）直接将中环外模具安装到底座上，通过加料口向内腔中灌注含有膀胱细胞的基质溶液，轻微旋转三组内模具使细胞基质溶液充满整个待成型的内腔底部的缝隙，加入凝血酶溶液使其交联，制得含有膀胱细胞的细胞基质层
7）去除中环外模具，将合成高分子溶液喷洒到所成形的细胞基质层表面，经萃取后形成合成高分子材料层，去除底座模具。将内模具沿各组成模具的轴向缓慢抽出，尽可能少的破坏细胞基质层。
8）将含血旺细胞的基质溶液灌注进神经通道，使其成型形成神经管状通路，从而制得较为完整的带多分支血管、尿道、神经的膀胱前体。
实施例4：制备带多分支血管、神经和气管的肺前体。
1）使用3D打印技术，将无细胞毒性的材料打印制成专用模具的各个组成部分，包括3个上模具，3个定位下模具，12个普通下模具，1个三级底座，以及不同级数的外模具各一个。将定位下模具安装到上模具中心凹槽内，再将四个普通下模具安装到上模具其他凹槽内，这样构建成一组内模具。
2）将0.5g胶原溶于10mL 生理盐水制成胶原溶液作为基质溶液；配制质量体积浓度为1%的转谷氨酰胺酶溶液；购买内皮细胞、血旺细胞和肺细胞制成细胞悬浮液，细胞密度都为5×10个/ml；将基质溶液与细胞悬浮液分别按1：5体积比混合制成含细胞的基质溶液；配备5%的聚氨酯/乙二醇溶液作为合成高分子溶液，并加入5%的紫杉醇。
3）对一组内模具进行血管化处理制成血管内模具，具体方法是在两组内模具表面涂敷一层含内皮细胞的基质溶液，并用1%的转谷氨酰胺酶溶液交联，随后喷洒内皮细胞悬浮液形成内皮细胞层，接着在内皮细胞层表面喷洒合成高分子溶液并萃取，至此在内模具表面形成含内皮细胞的基质层-内皮细胞层-合成高分子层三层结构。其余两组内模具作为神经管状通路及气管，暂不进行处理。
4）将每组内模具中的定位下模具插入到底座的定位槽内，三组内模具保持一定距离，随后将内环外模具插入到底座的第一级阶梯上。 将含有肺细胞的细胞基质溶液通过加料口灌注入模具内腔中，轻微旋转三组内模具使细胞基质溶液充满整个待成型的内腔底部的缝隙，加入戊二醛溶液使其交联，形成第一层稳定的细胞基质层，其中含有一组血管通道，一组神经管状通道以及一组血管通道。
5）去除内环外模具，安装中环内模具，加入细胞基质溶液，并使用转谷氨酰胺酶溶液交联。
6）去除中环外模具，将合成高分子溶液喷洒到所成形的细胞基质层表面，经萃取后形成合成高分子材料层，去除底座模具。将内模具沿各组成模具的轴向缓慢抽出，尽可能少的破坏细胞基质层。
7）将含血旺细胞的基质溶液灌注进神经通道，使其成型形成神经管状通路，从而制得较为完整的带多分支血管、气管、神经的膀胱前体。
实施例5：制备带多分支血管、神经的肾前体。
1）使用3D打印技术，将无细胞毒性的材料打印制成专用模具的各个组成部分，包括3个上模具，3个定位下模具，12个普通下模具，1个三级底座，以及不同级数的外模具各一个。将定位下模具安装到上模具中心凹槽内，再将四个普通下模具安装到上模具其他凹槽内，这样构建成一组内模具。
2）将1g明胶溶于10mL 生理盐水制成胶原溶液作为基质溶液；配制质量体积浓度为1%的转谷氨酰胺酶溶液；购买内皮细胞、血旺细胞和肾细胞制成细胞悬浮液，细胞密度都为1×103个/ml；将基质溶液与细胞悬浮液分别按1：2体积比混合制成含细胞的基质溶液；配备1%的聚氨酯/乙二醇溶液作为合成合成高分子溶液，并加入1%的紫杉醇。
3）对一组内模具进行血管化处理制成血管内模具，具体方法是在两组内模具表面涂敷一层含内皮细胞的基质溶液，并用转谷氨酰胺酶溶液交联，至此在内模具表面形成含内皮细胞的基质层。
4）将每组内模具中的定位下模具插入到底座的定位槽内，三组内模具保持一定距离，随后将内环外模具插入到底座的第一级阶梯上。 将含有肾细胞的细胞基质溶液通过加料口灌注入模具内腔中，轻微旋转三组内模具使细胞基质溶液充满整个待成型的内腔底部的缝隙，加入转谷氨酰胺酶溶液使其交联，形成第一层稳定的细胞基质层，其中含有一组血管通道，一组神经管状通道以及一组肾小管通道。
5）去除内环外模具，安装中环内模具，加入细胞基质溶液，并使用转谷氨酰胺酶交联。
6）去除中环外模具，将合成高分子溶液喷洒到所成形的细胞基质层表面，经萃取后形成合成高分子材料层，去除底座。将内模具沿各组成模具的轴向缓慢抽出，尽可能少的破坏细胞基质层。
7）将含血旺细胞的基质溶液灌注进神经通道，使其成型形成神经管状通路，从而制得较为完整的带多分支血管、肾小管、神经的肾脏前体。
实施例6：制备带多分支血管、神经、乳管的乳房前体。
1）使用3D打印技术，将无细胞毒性的材料打印制成专用模具的各个组成部分，包括3个上模具，3个定位下模具，12个普通下模具，1个三级底座，以及不同级数的外模具各一个。将定位下模具安装到上模具中心凹槽内，再将四个普通下模具安装到上模具其他凹槽内，这样构建成一组内模具。
2）将5%明胶、2%海藻酸钠共混溶于PBS溶液中作为基质溶液，分离内皮细胞、脂肪干细胞、血旺氏细胞，并制成细胞悬浮液，细胞密度为1×107个/ml,将基质溶液与细胞悬浮液分别按1：9体积比混合制成含细胞的基质溶液，配备浓度为 10%（w/v）的PLGA/四乙二醇(Tetraglycol)溶液作为合成高分子溶液，并加入1%（w/v）的肝素。
3）对两组内模具进行血管化处理制成血管内模具，具体方法是在内模具表面涂敷一层含内皮细胞的基质溶液，并用2%氯化钙溶液进行交联，至此在两组内模具表面形成含内皮细胞的基质层-合成高分子层双层结构，对第三组内模具表面涂敷一层血旺氏细胞的基质溶液，并用2%氯化钙溶液进行交联，即形成神经网络。
4）将每组内模具中的定位下模具插入到底座的定位槽内，三组内模具保持一定距离，随后将内环外模具插入到底座的第一级阶梯上。 将含有脂肪干细胞/内皮细胞生长因子的细胞基质溶液通过加料口灌注入模具内腔中，轻微旋转三组内模具使细胞基质溶液充满整个待成型的内腔底部的缝隙，加入氯化钙使其交联，形成第一层稳定的细胞基质层，其中含有两组血管通道及一组神经网络。
5）去除内环外模具，将中环外模具安装到底座的第二级阶梯上，通过加料口灌注含有脂肪干细胞/脂肪细胞生长因子的基质溶液，旋转中环外模具使基质溶液充满整个内腔，随后通过氯化钙溶液进行交联，形成第二层稳定的细胞基质层。
6）将合成高分子溶液喷洒到步骤5）所成形的细胞基质层表面，经萃取后形成合成高分子材料层，去除底座模具。
7）将内模具沿各组成模具的轴向缓慢抽出，在尽可能少的破坏细胞基质层的情况下可以获得较为完整的具有三层不同细胞基质层的乳房前体。
实施例7：制备带多分支血管、神经的大脑前体。
1）使用3D打印技术，将无细胞毒性的材料打印制成专用模具的各个组成部分，包括3个上模具，3个定位下模具，12个普通下模具，1个三级底座，以及不同级数的外模具各一个。将定位下模具安装到上模具中心凹槽内，再将四个普通下模具安装到上模具其他凹槽内，这样构建成一组内模具。
2）将1%明胶、1%海藻酸钠共混溶于PBS溶液中作为基质溶液，分离病人自体脂肪干细胞细胞、大脑胶质细胞、神经细胞制成细胞悬浮液，细胞密度为1×105个/ml,将基质溶液与细胞悬浮液分别按9：1体积比混合制成含细胞的基质溶液，配备浓度为 10%（w/v）的PLGA/四乙二醇(Tetraglycol)溶液作为合成高分子溶液，并加入1%（w/v）的肝素。
3）对两组内模具进行血管化处理制成血管内模具，具体方法是在内模具表面涂敷一层含脂肪干细胞/内皮细胞生长因子的基质溶液，并用2%氯化钙溶液进行交联，形成内皮细胞层。对另一组内模具进行神经化处理，具体方法是在第三组模具表面涂敷一层含脂肪干细胞/神经细胞生长因子的基质溶液，并用2%氯化钙溶液进行交联，形成神经细胞层。在内皮或神经细胞层外围喷洒合成高分子溶液并萃取，至此在内模具表面形成内皮细胞层或神经层-合成高分子双层结构。
4）将上述制备的含内皮细胞层或神经层-合成高分子双层结构的内模具组合，每组内模具中的定位下模具插入到底座的定位槽内，三组内模具保持一定距离，随后将内环外模具插入到底座的第一级阶梯上。 将含有大脑胶质的细胞基质溶液通过加料口灌注入模具内腔中，轻微旋转三组内模具使细胞基质溶液充满整个待成型的内腔底部的缝隙，加入氯化钙使其交联，形成稳定的大脑胶质细胞基质层，其中含有两组血管通道及一组神经通道。
5）将合成高分子溶液喷洒到步骤4）所成形的细胞基质层表面，经萃取后形成合成高分子材料层，去除底座。
6）将内模具沿各组成模具的轴向缓慢抽出，在尽可能少的破坏细胞基质层的情况下可以获得较为完整的具有多层不同细胞基质层的大脑前体。
可以理解的是，以上关于本发明的具体描述，仅用于说明本发明而并非受限于本发明实施例所描述的技术方案，本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换，以达到相同的技术效果；只要满足使用需要，都在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.可拆卸式专用模具，包括底座、内模具及外模具；其特征在于，其中，底座为顶部敞开的容器状结构，外模具为底部敞开的壳体结构；所述内模具为用于模拟复杂器官前体两级分支通道的分支通道；
所述外模具放置于底座上时，壳体结构与容器状结构间形成包围空间，内模具置于该包围空间内且一端伸出包围空间外；所述外模具上设置有加料口。
2.根据权利要求1所述的可拆卸式专用模具，其特征在于：所述底座的内腔为单内腔或为宽度从下至上逐级递增的阶梯式内腔；
所述内模具至少为一组，每组内模具均由用于模拟一级分支通道的上模具和用于模拟二级分支通道的下模具组成，两者可拆卸式相连；
所述外模具至少一个，外模具为一个时，对应单内腔底座，外模具的内腔的形状与所需器官前体形状一致；外模具为两个或两个以上时，对应阶梯式内腔底座，且外模具的个数与阶梯式内腔的阶梯数相同；
多个外模具可由小到大逐一嵌套在一起并放置于阶梯式内腔底座中；其中，最内层外模具对应阶梯式内腔宽度最窄的阶梯空间，最外层外模具对应阶梯式内腔宽度最宽的阶梯空间；且外模具底部与其对应的阶梯空间无缝贴合，相邻两嵌套的外模具中：外层外模具的内腔与其嵌套的内层外模具在嵌套部分无缝贴合，且每层外模具的内腔的形状均与所需器官前体形状一致。
3.根据权利要求2所述的可拆卸式专用模具，其特征在于：所述上模具为圆柱形，该圆柱形的下表面设置有五个圆形凹槽：其中一凹槽位于下表面的圆心，其余四个凹槽以该圆心为中心沿下表面的外缘等间距分布；所述下模具包括一个起定位作用的定位下模具和四个普通下模具；定位下模具与普通下模具均为圆棒状；且定位下模具与位于下表面圆心的凹槽紧配合，四个普通下模具各与其余四个凹槽中的一凹槽紧配合，使上模具与下模具成为一个整体；
所述底座的底面为平面、凹面或凸面，且分布有定位槽，定位槽的个数与内模具的组数相等；使用时，内模具的上模具的顶部伸出包围空间外，该内模具的定位下模具位于底座的定位槽中。
4.根据权利要求1所述的可拆卸式专用模具，其特征在于：当多个外模具由小到大逐一嵌套在一起并放置于阶梯式内腔底座中，各外模具的加料口尺寸相同且中心线位于同一条直线上。
5.根据权利要求1所述的可拆卸式专用模具，其特征在于：所述外模具采用合成高分子材料。
6.根据权利要求1所述的可拆卸式专用模具，其特征在于：所述内模具的材质为合成纤维、聚乙烯、聚氯乙烯或光敏树脂中的任意一种。
7.一种制备多分支通道复杂器官前体的方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1、制备质量体积浓度为1％～30％的水凝胶溶液作为基质溶液，提取或购买动物细胞制成细胞悬浮液，细胞密度为1×103～5×107个/ml，将基质溶液与细胞悬浮液按体积比1:9～9：1混合制成含细胞的基质溶液，重复上述步骤制作含有多种不同细胞的基质溶液；
步骤2、制备质量百分浓度为1％～30％的合成高分子溶液，合成高分子材料采用聚氨酯、聚己内酯、聚碳酸酯、聚乳酸、聚乙二醇、聚乳酸、聚酯、聚羟基酸酯和乳酸与乙醇酸共聚物中的一种或几种材料的复合物，用于溶解合成高分子材料的有机溶剂采用四乙二醇、乙二醇、异丙醇或 1，4-二氧六环；
步骤3、使用3D打印技术，将无细胞毒性的材料打印制成专用模具的各个组成部分；将定位下模具安装到上模具中心凹槽内，再将四个普通下模具安装到上模具其他凹槽内，构建成一组内模具；将一组内模具中的定位下模具安装到底座的定位槽内，完成对内模具的定位；对于多组内模具，再将其他组内模具安装到底座的其他定位槽内；
将多个外模具中尺寸最小的外模具，作为内环外模具放置到底座的阶梯式内腔宽度最窄的阶梯空间内，各内模具的上模具穿出内环外模具外，将第一种含有细胞的基质溶液通过加料口加入到包围空间中，随后边旋转内模具边加样，使基质溶液充分填满整个包围空间；使用物理、化学交联或聚合方法制成第一层细胞基质层；
步骤4、去除内环外模具，将次大外模具作为中环外模具放置于底座的相应阶梯空间上，各内模具的上模具穿出中环外模具外，通过加料口向中环内模具与已形成的细胞基质层之间的空腔中加入含有第二种细胞的基质溶液，并进行交联，制成第二层细胞基质层；
步骤5、去除中环外模具，以此类推，直至安装到最外层外模具，作为外环外模具放置到底座的相应阶梯空间上，重复步骤3的加料步骤制备出多层细胞基质层；
步骤6、将外环外模具去除，取出已形成的细胞基质层，沿着上模具和下模具的安装方向逆向拆除上模具和下模具，这样可以减少对已形成的细胞基质层的破坏，最终获得相对较完整的多通道复杂器官前体。
8.根据权利要求7所述的制备多分支通道复杂器官前体的方法，其特征在于：水凝胶溶液可取用明胶、海藻酸钠、胶原蛋白、纤维蛋白、琼脂糖、透明质酸、纤维蛋白原、凝血酶、壳聚糖、丝素蛋白、普朗尼克、聚乙二醇中的一种或者几种。
9.根据权利要求7所述的制备多分支通道复杂器官前体的方法，其特征在于：可成型多层含有不同细胞的细胞基质层，完成多种细胞组织的组装。
10.根据权利要求7所述的制备多分支通道复杂器官前体的方法，其特征在于：多分支通道结构在器官前体成型后，可以加入内皮细胞生长因子、细胞转移因子或肝细胞生长因子中的一种或几种，以及肝素、紫杉醇或硫酸化壳聚糖中的一种或几种，诱导通道表层细胞分化形成血管的、胆管的、气管的、神经的管状网络或树枝状网络；灌注细胞前多组内模具互不连接，互不干扰，每个管状通道表面细胞基质层有一定的厚度。
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