CN104186311A - 一种组织培养装置及光皮桦微型扦插快繁方法 - Google Patents

Abstract

一种组织培养装置，属于生物技术领域。该组织培养装置包括培养容器主体和盖子，其特征在于：所述培养容器主体下部装有半固体培养基，半固体培养基的上表面设有固定片，所述固定片上设有开孔，用于插入植物外植体。结合该装置本发明还提供了一种光皮桦微型扦插快繁方法，该方法步骤简单，生长速度快，减少了变异的发生。通过该方法，可以实现在体外进行无菌培养，在一个很小的范围以及有限的培养时间内，用较少的外植体材料繁殖出大量的植株。

Description

一种组织培养装置及光皮桦微型扦插快繁方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种组织培养装置以及采用该培养装置用于光皮桦微型扦插快繁。 

背景技术

微型扦插技术指离体培养带一个芽的茎段，使顶芽或腋芽发育成苗。它与传统的扦插极为类似，但是微型扦插一般不需要添加外源激素来打破顶端优势，有时也可加入少量生长素，不仅促使腋芽萌发，同时也会产生较好的生根效果。微型扦插技术的最大优点是通过体外无菌培养，在一个很小的范围以及有限的培养时间内，用尽可能少的外植体材料繁殖出尽可能多的植株。近年来微型扦插技术在茶树（Camellia sinensis）、北美海棠（Malus micromalus cv. "American"）、木薯（Manihot esculenta）等木本植物育种中应用，而关于光皮桦（Betula luminifera）的微型扦插技术目前尚未报道。然而，传统的微型扦插培养基均为固体培养基，若培养过程中需更换培养基，同时需保持植株的完整性，采用固体培养基不能实现，尤其针对那些须根性植物，从固体培养基中取出植株，不能完整保持植株的根系，甚至会导致植株的死亡。 

发明内容

鉴于现有技术中存在的上述问题，本发明的目的之一在于提供一种组织培养装置，通过在该装置中加入适合特定植物外植体培养的营养元素，制成半固体培养基，当培养一段时间后，培养基中的营养不再满足或不适合该外植体的生长时，吸出培养基而不用将组培苗从培养装置中拔出，保持了根系的完整性，避免了固体培养基更换造成根系破坏对植株生长带来的负面影响。本发明的目的之二是利用该培养装置并结合特定培养基和培养方法进行光皮桦微型扦插快繁。 

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下： 

一种组织培养装置，包括培养容器主体和盖子，其特征在于：所述培养容器主体下部装有半固体培养基，半固体培养基的上表面设有固定片，所述固定片上设有开孔，用于插入植物外植体。

所述的一种组织培养装置，其特征在于：所述培养容器主体位于固定片（3）下方的容器壁上设有向外延伸的小管，小管的端口设有管帽或塞子。 

所述的一种组织培养装置，其特征在于：所述固定片为滤纸。 

光皮桦微型扦插快繁方法，其特征在于其采用上述的组织培养装置进行培养。 

光皮桦微型扦插快繁方法，其特征在于包括如下步骤： 

1）制备半固体培养基，倒入培养容器中，高压灭菌后培养基自然冷却成半凝固状态；

2）在无菌操作台上，将经过高温灭菌的滤纸放置在培养容器中的半固体培养基表面；

3）选择长势一致的光皮桦同一无性系无菌苗，在无菌操作台上，剪取第3-4和5-6节茎段，每个外植体上顶端留半个叶片；

4）将外植体的形态学下端穿过滤纸孔插入半固体培养基中，扶正，拧紧培养容器的盖子，置于培养架上；

5）放入培养室内光照培养，温度保持在23-27℃，光/暗周期16h/8h,光照强度1000-1500Lx；

6）培养30天后，取下小管的塞子或盖子，从小管口吸出半固体培养基，并注入新的培养基让幼苗继续生长；或者当幼苗生长到一定高度后，取下盖子，用吸取装置穿过固定片的边缘吸出半固体培养基，并注入新的培养基让幼苗继续生长。

所述的光皮桦微型扦插快繁方法，其特征在于所述的半固体培养基为MSB5，配方如下： 

半固体培养基（1L）：MS大量母液（20×）50ml，MS微量母液（20×）50 ml；MS铁盐母液（20×）50 ml；B5有机母液（100×）10 ml，蔗糖30 g，琼脂粉 2.8 g，PH调至5.9；

其中MS大量母液（20×）配方为： NH₄NO₃ 33g、KNO₃ 38g、KH₂PO₄ 3.4g、KH₂PO₄ 3.4g、MgSO₄·7H₂O 7.4g，用去离子水定容到1L；

MS微量母液（20×）配方为：KI 0.166g 、H₃BO₃1.24g、MnSO₄·4H₂O 4.46g、ZnSO₄·7H₂O 1.72g、Na₂MoO₄·2H₂O 0.05g、CuSO₄·5H₂O 0.005g、CoCl₂·6H₂O 0.005g，用去离子水定容到1L；

MS铁盐母液（20×）配方为：FeSO₄·7H₂O 5.56g、 Na₂EDTA·2H₂O 7.46g，用去离子水定容到1L；

B5有机母液（100×）配方为：肌醇10g、烟酸0.1g、VB₆ 0.1g、VB₁ 0.1g，用去离子水定容到1L。

本发明提供的一种组织培养装置，可以用于不同植物的半固体培养，尤其适用于须根系植物，如光皮桦，采用该装置与采用液体培养基相比，克服了水分胁迫等原因造成外植体生长发育不良，或因液体培养基的流动性导致其难以生根。与固体培养基相比，避免了培养基更换对根系造成的破坏，此外，相对固体培养基而言，采用半固体培养基其生根数量更多，根的长度更长，极大程度地缩短了生长周期。 

光皮桦(Betula luminifera) 是一种须根系植物，为我国特有树种，因其速生、材质优良，已成为我国南方山地造林的首选树种。本发明提供的光皮桦微型扦插快繁方法可为光皮桦优良单株的扩繁推广提供前期的组培苗，采用该方法与传统的组培而言，一是采用半固体培养基，避免了用固体培养基培养时，更换培养基时将植株取出造成根系不完整和植株死亡；二是通过特定的配方，制成培养基后能实现生根和发芽同时进行，而不需要先在诱导培养基培养，然后转移至生根培养基中，简化了培养步骤；三是采用第3-4和5-6节茎段，每个外植体上顶端留半个叶片，并在特定的光照条件下，生长速度快，发芽和生根情况良好，长势相对一致，四是本方法可以不使用激素，减少了变异的发生。通过该方法，可以实现在体外进行无菌培养，在一个很小的范围以及有限的培养时间内，用较少的外植体材料繁殖出大量的植株。 

附图说明

图1和图2为组织培养装置的结构示意图； 

图3为固定片的结构示意图；

其中：1-培养容器主体；2-半固体培养基；3-固定片；4-外植体；5-盖子；6-小管；7-开孔。

具体实施方式

现结合本发明的实施例对本发明作进一步说明。 

实施例1：

图1为本发明提供的组织培养装置的结构示意图，包括培养容器主体1和盖子5，培养容器主体1和盖子5为现有技术，在此不做赘述。与现有技术不同的是，本发明在容器主体1内设有固定片3，培养容器主体1下部为半固体培养基2，固定片3即位于半固体培养基2的上表面，固定片3上设有开孔7，用于插入植物外植体2，外植体即固定在固定片上。固定片3可以用滤纸通过打孔器打孔制成，也可以采用其它材料，固定片需要满足如下要求：一方面能固定外植体，另一方面不会限制植株生长。采用该装置进行培养，在需要更换培养基时，可以用注射器外接一根长吸管，长吸管从固定片3的边缘插入，先将原来的半固体培养基2吸出，再用干净的注射器和吸管向培养容器主体1中注入处理所用的培养基。

为了更为方便地更换培养基，本发明对培养容器主体1进行改进，即在培养容器主体1位于固定片3下方的容器壁上设置一个向外延伸的小管5，小管6与培养容器主体1一体成型，小管6的端口设有管帽或塞子，在更换培养基时将塞子或者盖子取下，通过吸取装置如注射器、吸管等工具从小管6处将培养基吸出或注入，见图2。 

实施例2：

采用实施例1中的装置进行光皮桦微型扦插快繁时，操作步骤如下：

1）制备半固体培养基，倒入培养容器中，高压灭菌后培养基自然冷却成半凝固状态；

2）在无菌操作台上，将经过高温灭菌的滤纸放置在培养容器中的半固体培养基表面；

3）选择长势一致的光皮桦同一无性系无菌苗，在无菌操作台上，剪取第3-4和5-6节茎段，每个外植体上顶端留半个叶片；

4）将外植体的形态学下端穿过滤纸孔插入半固体培养基中，扶正，拧紧培养容器的盖子，置于培养架上；

5）放入培养室内光照培养，温度保持在23-27℃，光/暗周期16h/8h,光照强度1000-1500Lx；

6）当幼苗生长到一定高度后，当采用图1所示的装置时，取下盖子5，用吸取装置穿过固定片3的边缘吸出半固体培养基，并注入新的培养基。当采用图2所示的装置时，取下小管6的塞子或盖子，从小管口吸出半固体培养基，并注入新的培养基让幼苗继续生长。

实施例3：光皮桦半固体培养基配方

采用MSB5半固体培养基，具体配方如下：

MSB5半固体培养基（1L）

MS大量母液（20×） 50ml

MS微量母液（20×） 50 ml

MS铁盐母液（20×） 50 ml

B5有机母液（100×） 10 ml

蔗糖 30 g

琼脂粉 2.8 g

PH调至5.9

具体母液配方如下：

MS大量母液（20×）（1L）

NH4NO3	33g
		KNO3	38g
KH2PO4	3.4g
		CaCl2·2H2O	8.8g
MgSO4·7H2O	7.4g

MS铁盐母液（20×）（1L）

FeSO4·7H2O	5.56g
		Na2EDTA·2H2O	7.46g

MS微量母液（20×）（1L）

KI	0.166g
		H3BO3	1.24g
MnSO4·4H2O	4.46g
		ZnSO4·7H2O	1.72g
Na2MoO4·2H2O	0.05g
		CuSO4·5H2O	0.005g
CoCl2·6H2O	0.005g

B5有机母液（100×）（1L）

肌醇	10g
		烟酸	0.1g
VB6	0.1g
		VB1	0.1g

实施例4：光皮桦微扦插快繁技术研究

1实验材料与方法

试验材料均为光皮桦子代测定林中优良单株，嫁接定植于浙江农林大学平山苗圃，所用外植体均为优良单株嫁接苗的幼芽培育的无菌苗，保存于组培室。

选取4种基本培养，分别为1/2 MS、MS 、B₅、MS·B₅，其中MS·B₅培养基为改良培养基，其无机盐成分采用MS的配方，有机成分采用B₅的配方。 

在无菌操作台上，剪取光皮桦不同无性系（优3，优30，G49-3和G50-1）的茎段（长约1.5cm，保留一个腋芽、半片叶片为宜），扦插于4种基本培养基中，每瓶接5个外植体，每组10瓶，放入培养室内光照培养。培养室温度控制在25±2℃，光/暗周期16h/8h, 光照强度1,000-1,5000Lx，一个月后，对其株高、根数、根长、叶长、叶宽性状进行测定。 

2实验结果 

2.1微扦插基本培养基的筛选

光皮桦微型扦插一个月后观测结果经统计分析表明（表1），株高生长在不同培养基间存在极显著差异，而在各无性系间无显著差异；生根数在不同培养基和不同无性系中均存在极显著差异；根长在不同培养基中存在显著差异，而各无性系间差异不显著；叶长和叶宽在不同培养基和无性系间均无显著差异（表2）。经株高、根数和根长性状的多重比较表明，株高生长表现最好的最佳培养基为MS·B₅，各无性系在MS·B₅培养基中的株高均达4.00cm以上，其次为B₅培养基，为3.00cm以上，显著优于1/2MS和MS培养基；根数性状表现最好的培养基为MS·B₅，各无性系均达4根以上；根长生长的最佳培养基为B₅，各无性系根长均可达9.03cm（表1）。

表1不同无性系茎段在不同培养基的生根与植株生长 

表2 不同无性系在不同培养基生长的方差分析表

F_0.05（3,9）=3.83；F_0.01（3,9）=6.99。

2.2不同部位茎段的扦插比较 

以不同部位的茎段为外植体，4个无性系在MSB₅培养基中微扦插，一个月对其株高、根数、根长、叶长和叶宽性状进行测量，结果如表3。

表3 不同茎段部位外植体在MSB₅中的生根与植株生长 

表4 不同无性系的不同茎段部位为外植体生长的方差分析表

F_0.05（2,6）=5.14；F_0.01（2,6）=10.90；F_0.05（3,6）=4.76；F_0.01（3,6）=9.78。

方差分析表明，其株高和根数性状存在极显著差异，叶宽生长存在显著差异，而根长和叶长无显著差异；株高和叶宽性状在不同无性系间存在极显著差异，而根数、根长和叶长无显著差异（表4）。为筛选最佳的茎段部位为外植体，多重比较后表明，以株高生长为选择指标，光皮桦微扦插的最佳外植体为中下部茎段，如优3无性系中下部茎段为外植体，株高可达4.40cm，而上部茎段仅3.40cm；以根数为选择指标，中上部茎段作为外植体优于下部茎段，表现为4种无性系以下部茎段为外植体时生根数仅有2~3根，而中上部茎段的生根数可达5~6根。 

培养基的成分对微型扦插植株的生长有重要的影响，在培养过程中连续添加外源激素容易促使植株变异，本研究所用培养基均未添加任何激素。本研究所用4种培养基的配方完全不同，植株的生长差异较大，因此推测培养基成分对光皮桦株高、根系生长萌发起到关键作用。MS·B₅与MS的差别主要在于有机成分以及肌醇用量的不同，MS中含有甘氨酸，并且肌醇的用量偏多，而MS·B₅培养基不含甘氨酸，且肌醇用量降低一半，反而长势较好。 

Claims (7)

1.一种组织培养装置，包括培养容器主体（1）和盖子（5），其特征在于：所述培养容器主体（1）下部装有半固体培养基（2），半固体培养基（2）的上表面设有固定片（3），所述固定片（3）上设有开孔（7），用于插入植物外植体。

2.根据权利要求1所述的一种组织培养装置，其特征在于：所述培养容器主体（1）位于固定片（3）下方的容器壁上设有向外延伸的小管（6），小管（6）的端口设有管帽或塞子。

3.根据权利要求1或2所述的一种组织培养装置，其特征在于：所述固定片（3）为滤纸。

4.光皮桦微型扦插快繁方法，其特征在于其采用权利要求1-3中任何一项所述的组织培养装置进行培养。

5.光皮桦微型扦插快繁方法，其特征在于包括如下步骤：

1）制备半固体培养基，倒入培养容器中，高压灭菌后培养基自然冷却成半凝固状态；

2）在无菌操作台上，将经过高温灭菌的滤纸放置在培养容器中的半固体培养基（2）表面；

3）选择长势一致的光皮桦同一无性系无菌苗，在无菌操作台上，剪取第3-4和5-6节茎段，每个外植体上顶端留半个叶片；

4）将外植体的形态学下端穿过滤纸孔插入半固体培养基（2）中，扶正，拧紧培养容器的盖子（5），置于培养架上；

5）放入培养室内光照培养，温度保持在23-27℃，光/暗周期16h/8h,光照强度1000-1500Lx；

6）当幼苗生长到一定高度后，取下小管（6）的塞子或盖子，从小管口吸出半固体培养基（2），并注入新的培养基让幼苗继续生长。

6.根据权利要求5所述的光皮桦微型扦插快繁方法，其特征在于所述的半固体培养基（2）为MS·B5，配方如下：

半固体培养基（1L）：MS大量母液（20×）50ml，MS微量母液（20×）50 ml；MS铁盐母液（20×）50 ml；B5有机母液（100×）10 ml，蔗糖30 g，琼脂粉 2.8 g，PH调至5.9；

其中MS大量母液（20×）配方为： NH₄NO₃ 33g、KNO₃ 38g、KH₂PO₄ 3.4g、KH₂PO₄ 3.4g、MgSO₄·7H₂O 7.4g，用去离子水定容到1L；

MS微量母液（20×）配方为：KI 0.166g 、H₃BO₃1.24g、MnSO₄·4H₂O 4.46g、ZnSO₄·7H₂O 1.72g、Na₂MoO₄·2H₂O 0.05g、CuSO₄·5H₂O 0.005g、CoCl₂·6H₂O 0.005g，用去离子水定容到1L；

MS铁盐母液（20×）配方为：FeSO₄·7H₂O 5.56g、 Na₂EDTA·2H₂O 7.46g，用去离子水定容到1L；

B5有机母液（100×）配方为：肌醇10g、烟酸0.1g、VB₆ 0.1g、VB₁ 0.1g，用去离子水定容到1L。

7.根据权利要求5所述的光皮桦微型扦插快繁方法，其特征在于步骤6）为：当幼苗生长到一定高度后，取下盖子（5），用吸取装置穿过固定片（3）的边缘吸出半固体培养基（2），并注入新的培养基让幼苗继续生长。