CN108467835B - 用于心肌细胞三维功能性培养的微流控芯片及制备方法及力学电学特性检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于心肌细胞三维功能性培养的微流控芯片及制备方法及力学电学特性检测方法，包括沟槽腔室结构和电极底板，进行心肌组织的三维培养和力学电学特性的检测；槽内加入心肌细胞悬浮培养液，通过槽内结构引导心肌细胞攀附立柱并沿着槽内通道生长并达到生理上的成熟，形成条带状心肌组织；通过对心肌组织搏动收缩造成的立柱弯曲程度的力学分析以达成检测心肌细胞的生理特性或病理缺陷等目的；通过将电极底板倒置使得心肌组织与电极底板的电极相接触可对心肌组织进行动作电位的监测，从电学上分析心肌组织的电生理特性或病理缺陷。本发明的微流控芯片使用透明的无生物毒性的材料加工而成，可在显微镜下进行实时监测、分析组织的动态生长成熟的过程，研究心肌细胞的生理、病理特征。

Description

用于心肌细胞三维功能性培养的微流控芯片及制备方法及力 学电学特性检测方法

技术领域

本发明涉及微流控技术及动物组织培养分析领域，尤其涉及一种用于心肌细胞三维功能性培养的微流控芯片及制备方法及力学电学特性检测方法。

背景技术

微流控技术是指操控微小体积的流体完成将生物、化学等多交叉学科的实验手段。在生物实验领域，能够将生物组织培养缩小到对单个细胞操作和分析的精度水平。同时，通过各个操作单元间建立的微通道网络内流体的流动形成互相联系的系统，从而能从整体上实现特定功能。微流控技术既能做到微型化，即实现对生物细胞的单独操控，又能做到集成化，即实现多个生物操作的集合，体现了其灵活多变的特点。

微流控芯片中通过微结构可以实现对生物细胞、组织的捕获、分选、培养等操作，从而使得微流控芯片在生物领域有着广泛的利用价值。在芯片的微结构内获得细胞后，通过施加能够模拟的符合细胞生存的类体内生理环境条件，在抗菌环境、温度适宜且营养充足的条件下，使细胞生长、分裂、分化并形成结构，表达功能。微流控芯片依托于微加工技术，能够构建不同尺度且相对独立的的三维结构，从而实现对各个功能单元如微沟道、微泵、微阀和微反应器在局部的集成。此外利用微加工技术可将电学测量引入生物学研究中，通过对生物细胞或组织进行电阻抗频谱分析，可以作为生物电学分析依据，辅助细胞或组织的特性检测。生物电学测量具有对生物体几乎没有影响、稳定可靠、分析简单、方法成熟等优势，在特性检测、生物传感方面有着广阔的前景。

动物组织培养是指将动物的细胞取出，放置于模拟的符合细胞生存的类体内生理环境条件中，在抗菌环境、温度适宜且营养充足的条件下，使细胞生长、分裂、分化并形成结构，表达功能。组织培养技术使用与真实细胞生长环境相类似的培养环境，有助于研究者分析细胞各项生理功能和现象的表达机制。同时，动物组织培养还为器官组织培养工程、胚胎干细胞工程、克隆技术、动物细胞产品大规模制作、基于细胞的体外试药等生物学以及医学领域提供了技术操作基础，具有极大的实际应用价值。动物组织培养是现代动物细胞工程的基础。

动物心肌组织培养作为组织培养的分支，用于研究心脏组织在特定环境下实现功能表达的情况，是对心脏器官研究的途径之一，对于生物体的器官、疾病的研究有很大意义。心脏细胞供给源可以是幼鼠具有高度分化能力的心脏细胞，也可以是诱导型多功能干细胞分化心肌细胞，即iPS细胞。其一般做法是通过医学方法取得哺乳动物血细胞，通过生物方法使其退分化成诱导型多能干细胞后，再利用心脏成纤维细胞培养条件和特定的处理方法诱导使其分化成心肌细胞。通过对诱导分化成的心肌细胞进行体外组织培养，使其分裂并成熟，就可成为适用于研究心脏生理和病理的新式的体外细胞模型。成熟的心肌细胞不仅可以作为体外试药的新载体，若使用人类血细胞作为供给源，还可以通过其功能表达、肌动蛋白的合成来检验细胞供给源是否存在或潜在心脏疾病，为医学诊断提供了新型的体外诊断方式。

心肌细胞工程一般使用的是传统的二维培养环境，即在传统的培养皿上进行细胞的诱导分化、细胞培养等操作。但是此种非生理性的培养环境以及培养器件可会影响心肌细胞的功能表达和细胞成熟。同时，二维的培养环境仅能通过细胞的基因表达和蛋白质的合成来判断细胞的状态和功能，这不仅增加了检测难度，增加了分泌产物的精度误差，增加了对细胞的伤害的可能性，也无法做到对组织的动态成长过程的实时监测，更无法在第一时间内知道心肌细胞对于药物的反映情况。

随着微流控技术在生物学以及医学领域的应用发展，越来越多的传统的动物组织培养操作被微流控芯片所取代。微流控芯片使用微型的通道和腔室和无生物毒性的材料，可以实现动物组织的三维培养和观察，可实现心脏组织的某些功能特性的表达，并可同时进行某些特性的测量。

发明内容

发明目的：针对以上问题，本发明提出一种用于心肌细胞三维功能性培养的微流控芯片及制备方法及力学电学特性检测方法。

技术方案：为实现本发明的目的，本发明所采用的技术方案是：一种用于心肌细胞三维功能性培养的微流控芯片，包括圆形腔室结构，立于腔室底面的立柱结构，与腔室等深连通的长方形连通通道和分离式电学性能测量电极；所述圆形腔室结构包括上侧圆形无顶腔室，左侧圆形无顶腔室和右侧圆形无顶腔室；所述三个圆形无顶腔室的圆心分别位于正三角形的三个顶点处，且腔室等深等直径；所述立柱结构包括上侧圆柱体立柱，左侧圆柱体立柱，右侧圆柱体立柱；所述各立柱截面与各圆形无顶腔室的圆心对准，高度与槽深相等或略低于槽深；所述长方形连通通道包括左侧连通通道，下侧连通通道和右侧连通通道；所述各连通通道分别与各圆形无顶腔室连通对准，各连通通道均为长方形无顶深槽结构，槽深与圆形腔室等深；所述分离式电学性能测量电极包括上侧电极，左侧电极，右侧电极，电极底板基座和用于连接外部信号处理电路的导线；所述测量电极分别与所述圆柱体立柱相对齐。

进一步地，所述长方形连通通道内连通通道的宽度均小于个圆形无顶腔室的直径。

进一步地，所述圆形腔室结构，立柱结构和长方形连通通道引导心肌细胞沿着上侧圆柱体立柱、左侧圆柱体立柱、右侧圆柱体立柱及左侧连通通道、下侧连通通道、右侧连通通道生长成熟并形成具有一定生理功能的心肌组织。

进一步地，所述立柱结构为可弹性弯曲结构，可受心肌组织收缩牵拉而弯曲，通过计算立柱顶部弯曲时的水平位移可获得心肌细胞在肌纤维搏动能力的测定。

进一步地，所述分离式电学性能测量电极通过结构倒置与心肌组织相接触，并通过导线向上侧电极施加输入信号，通过导线获得左侧电极和右侧电极的接收信号，并传送至外部信号处理电路中分析处理，获得心肌组织电学特性。

一种用于心肌细胞三维功能性培养的微流控芯片制备方法，包括步骤：

(1)3D打印与芯片相同结构的一次模具，用去离子水清洗并用氮气枪吹干，放置于紫外灯下数天得到固化的一次模具；

(2)利用软光刻工艺倒模制作二次模具结构层；

(3)对二次模具结构层和衬底层分别用去离子水清洗并用氮气枪吹干，置于氧等离子体清洗机中进行表面改性处理后，进行永久性键合形成二次模具；

(4)将二次模具利用硅烷蒸气在表面形成疏水层后，再次利用软光刻工艺制作具有圆形腔室结构，立柱结构和长方形连通通道的微流控芯片；

(5)在硅圆晶片上利用软光刻工艺倒模制作双层通道结构，并分别插入金属线从预留孔穿出，制作上侧电极，左侧电极，右侧电极和用于连接外部信号处理电路的导线。

进一步地，所述衬底层为洁净的方形玻璃。

进一步地，所述分离式电学性能测量电极可用在玻璃表面上利用剥离工艺制作的共面微电极图案替代上侧电极，左侧电极，右侧电极和用于连接外部信号处理电路的导线。

一种利用微流控芯片的力学电学特性检测方法，包括步骤：

(1)将心肌细胞悬浮液加至微流控芯片的圆形腔室和长方形连通通道中，并将芯片放入培养箱中，设定适宜的培养环境至心肌细胞达到生理成熟，能攀附圆形腔室中的立柱结构并通过连通通道两两相连，形成条带状心肌组织；

(2)从培养箱中取出芯片，置于显微镜下观察，圆柱体立柱受到心肌组织的收缩力牵拉而一同向中心弯曲；此时可使用显微镜的摄像镜头记录各圆柱体立柱顶端的圆面在心肌组织的收缩力的作用下发生的移动；

(3)进行数据采集和计算，可得立柱顶部圆截面的水平方向位移，并通过综合立柱建模分析和测得的实际水平位移得到一组心肌组织收缩力的数值表征；

(4)将电极底板放在芯片上压紧后倒置，使得各电极分别与各立柱上的心肌组织接触，通过导线对上侧电极施加动作电位，在左侧电极和右侧电极接受电信号并通过导线连接至外部电路；通过外部电路对检测到的信号进行处理，可对心肌细胞电信号传导能力进行判定。

有益效果：本发明具有以下优点：

(1)该微流控芯片采用微型腔室和立柱结构实现人类心脏组织的三维立体培养，能够更直观的观察到肌细胞的功能表达；

(2)该微流控芯片通过测量组织收缩拉动立柱的位移，可以计算比较得细胞功能表达强弱以及细胞活性等指标；

(3)该微流控芯片可测量心肌组织在生物电学性能传导上的功能表达，可用于研究生物电学性能传导并作为心肌组织功能强弱的辅助性判断；

(4)该微流控芯片采用微型腔室以及通道，使用少量细胞就可实现组织功能；

(5)该微流控芯片采用3D打印技术与微加工工艺相结合的手段制作芯片，操作方便，具有高度可重复性和灵活度；

(6)该微流控芯片使用透明的加工材料，不具有生物毒性，同时可以在显微镜头下进行实时监测和数据分析，用以研究组织的力学参数。

附图说明

图1是本发明的微流控芯片的平面结构示意图；

图2是本发明的微流控芯片的腔室A-A向剖面结构示意图；

图3是本发明的微流控芯片的两个腔室以及通道的B-B向剖面结构示意图；

图4是本发明的微流控芯片的弹性电极盖板三维结构示意图；

图5是本发明的微流控芯片加上电极盖板后的三维结构示意图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。

如图1-4所示，本发明所述的用于心肌细胞三维功能性培养的微流控芯片，微流控芯片的基本结构包括圆形腔室结构，设在立于腔室底面的立柱结构和与腔室等深连通的长方形连通通道，以及分离式电学性能测量电极。

如图1-3所示，圆形腔室结构的基本结构包括上侧圆形无顶腔室101、左侧圆形无顶腔室102和右侧圆形无顶腔室103；三个圆形无顶腔室深槽结构的圆心分别位于正三角形的三个顶点处，且腔室的深以及直径相同。

立柱结构包括上侧圆柱体立柱201，左侧圆柱体立柱202和右侧圆柱体立柱203。上侧立柱201、左侧立柱202和右侧立柱203分别位于上侧腔室101、左侧腔室102和右侧腔室103中心，立于槽内底部，各立柱截面与各圆形腔室圆心对准，高度与槽深相等或略低于槽深。用于成熟的成纤维心肌细胞在此攀附形成心肌组织，心肌组织具有搏动的能力，便可通过搏动收缩拉动三端立柱向中间收缩。

长方形连通通道包括左侧连通通道301，右侧连通通道302和下侧连通通道303。长方形连通通道30内长条形无顶通道301、302、303宽度小于圆型腔室的直径，长方形两宽分别与圆形腔室101和102、102和103、103和101相贯通，且短轴中轴线分别穿过各自两侧圆形腔室的圆心。各连通通道均为长方形无顶深槽结构，槽深与圆形腔室等深。腔室和通道皆为敞口结构，用于施加细胞悬浮培养液。

如图4所示，电学性能测量电极包括上侧电极401，左侧电极402，右侧电极403和电极底板基座404，电极立于底板基座，并分别由布于底板上的导线405连接至外部检测电路。在电学性能测量模式中，测量电极401、402、403分别与圆形立柱结构201、202、203相对齐。通过倒置并倒扣于位置一一对应的电极盖板，可对心肌组织在搏动收缩过程中电信号的传导时间、效率等进行检测和处理。

本发明的芯片结构可改成以下造型：(1)三叉状的带有立柱的沟槽结构，即位于正三角形顶点的三个腔室通过长方形连通通道连至正中心的圆形腔室中，四个立柱的截面圆心分别与各腔室的圆心重合，生长成熟的心肌组织可搏动牵拉三顶点处的立柱向中心弯曲；(2)带有数个立柱的正多边形凹槽结构，在凹槽中有多个立柱将凹槽内结构分解成若干正三角形；使用多种结构有助于心肌组织形成稳定的组织块，牵拉立柱时受力更加均匀可靠。

本发明的用于心肌细胞三维功能性培养的微流控芯片的制备方法，结合3D打印技术与微加工、软光刻工艺，具体包括以下步骤：

(1)3D打印出具有和最终芯片具有相同结构的一次模具，用去离子水清洗并用氮气枪吹干，放置于紫外灯下数天得到固化完成后的3D打印一次模具；

(2)在3D打印一次模具上利用基于环氧树脂的负性光刻胶的软光刻工艺倒模制作二次模具PDMS结构层；

(3)对二次模具结构层和衬底层分别用去离子水清洗并用氮气枪吹干，然后置于氧等离子体清洗机中进行表面改性处理后进行永久性键合形成二次模具；其中，衬底层为洁净的方形玻璃；

(4)将二次模具利用硅烷蒸气在表面形成疏水层后，再次利用基于环氧树脂的负性光刻胶的软光刻工艺制作具有圆形无顶腔室结构，圆柱体立柱结构和长方形连通通道的微流控芯片；

(5)在硅圆晶片上利用基于环氧树脂的负性光刻胶的软光刻工艺倒模制作双层PDMS通道结构，并分别插入金属线从预留孔穿出，制作成上侧激发电极，左侧测量电极，右侧测量电极和用于连接外部信号处理电路的导线；

(6)电极盖板可用在玻璃表面上利用剥离工艺制作的共面微电极图案替代上侧激发电极，左侧测量电极，右侧测量电极和用于连接外部信号处理电路的导线。

使用本发明微流控芯片进行心肌组织培养及力学电学特性检测，将通过生物手段获得的心肌细胞放于微流控芯片的微型沟槽中，通过添加培养液并提供相应的培养环境使其在特定的微结构上达到生理成熟，形成特定的具有收缩搏动能力的成纤维组织。在连续观察和检测中，通过对成纤维组织的收缩能力的观察和力学测定，可以对心肌细胞是否具有生理活性或病理缺陷进行判定，从而可以进行下一步的体外试药、细胞供给源疾病判定等医学行为。同时，利用芯片特定结构测量心肌组织电学性能传导能力，用以对心肌组织的活性及功能进行辅助判定。具体包括以下步骤：

步骤1，将微流控芯片高温高压灭菌后，放置于超净工作台上。将未成熟的心肌细胞置于普通心肌细胞培养液中制成心肌细胞悬浮液，并使用移液枪施加适量悬浮液至芯片的圆形腔室10中，保证液面比立柱顶稍低。将芯片放入细胞培养箱中，设定适宜的培养环境，培养2-3天。待心肌细胞沿沟槽的立柱周生长成熟，初步形成条状组织后将芯片从培养箱内取出，使用移液器将培养液吸出，更换为高糖心肌细胞培养液，然后将芯片放回培养箱中继续培养5天。

步骤2，将芯片培养5天后从培养箱中取出，并放置于显微镜下观察。此时的心肌组织已沿着上侧立柱201、左侧立柱202和右侧立柱203生长，并两两之间通过连通通道30相连接；由于成熟的心肌组织302在高糖培养环境下会自行发生收缩搏动，因而立柱201、202和203会受到心肌组织的收缩力的牵拉而一同向中心弯曲。此时可使用显微镜的摄像镜头记录下上侧立柱201、左侧立柱202和右侧立柱203顶端的圆面在心肌组织的收缩力的作用下发生的移动。

步骤3，使用视频分析软件进行数据采集和计算，可得到立柱顶部圆截面的水平方向位移，并通过综合立柱建模分析和测得的实际水平位移可得到一组心肌组织收缩力的数值表征；通过心肌组织收缩力的数值表征即可对心肌组织的收缩能力给出判定。

步骤4，如图5所示，将电极底板40倒置放在芯片上，压紧后将系统倒置，使得电极401、402、403分别与腔室10中，立柱201、202、203上的心肌组织接触。通过导线405对上侧电极401施加动作电位，在另外两极402、403接受电信号并通过埋于底座的导线405连接至外部电路。通过外部电路对于输入、输出电信号的检测，可以对心肌细胞电信号传导能力进行判定，并用此信息可对心肌组织功能表达进行辅助判定。

心肌细胞供给源可以是任意哺乳动物的心脏组织上取下后分散的心肌细胞，例如大鼠、小鼠、猴等，也可以是人类诱导型多功能干细胞分化形成的心肌细胞。

若将微流控芯片的高糖培养液培养基更换为带有心脏药物的高糖培养液，或将心肌细胞供给源更换为人类心脏疾病患者，即可通过上述得出的心肌组织的收缩力数字表征和电信号传递速度等信息的综合判定得到相应的病理学研究，使得芯片具有更多的实际医学应用价值。

Claims (7)

1.一种用于心肌细胞三维功能性培养的微流控芯片，其特征在于：包括圆形腔室结构，立于腔室底面的立柱结构，与腔室等深连通的长方形连通通道和分离式电学性能测量电极；

所述圆形腔室结构包括上侧圆形无顶腔室（101），左侧圆形无顶腔室（102）和右侧圆形无顶腔室（103）；所述三个圆形无顶腔室的圆心分别位于正三角形的三个顶点处，且腔室等深等直径；

所述立柱结构包括上侧圆柱体立柱（201），左侧圆柱体立柱（202），右侧圆柱体立柱（203）；所述各立柱截面与各圆形无顶腔室的圆心对准，高度与槽深相等或略低于槽深，使得所述圆形腔室两两连通；

所述长方形连通通道包括左侧连通通道（301），下侧连通通道（302）和右侧连通通道（303）；所述各连通通道分别与各圆形无顶腔室连通对准，各连通通道均为长方形无顶深槽结构，槽深与圆形腔室等深；

所述分离式电学性能测量电极包括上侧电极（401），左侧电极（402），右侧电极（403），电极底板基座（404）和用于连接外部信号处理电路的导线（405）；所述测量电极分别与所述圆柱体立柱相对齐；

所述立柱结构为可弹性弯曲结构，可受心肌组织收缩牵拉而弯曲，通过计算立柱顶部弯曲时的水平位移获得心肌细胞在肌纤维搏动能力的测定；

所述分离式电学性能测量电极通过结构倒置与心肌组织相接触并通过导线（405）向上侧电极（401）施加输入信号，通过导线（405）获得左侧电极（402）和右侧电极（403）的接收信号，并传送至外部信号处理电路中分析处理，获得心肌组织电学特性。

2.根据权利要求1所述的用于心肌细胞三维功能性培养的微流控芯片，其特征在于：所述长方形连通通道内连通通道的宽度均小于圆形无顶腔室的直径。

3.根据权利要求1所述的用于心肌细胞三维功能性培养的微流控芯片，其特征在于：所述圆形腔室结构，立柱结构和长方形连通通道引导心肌细胞沿着上侧圆柱体立柱（201）、左侧圆柱体立柱（202）、右侧圆柱体立柱（203）及左侧连通通道（301）、下侧连通通道（302）、右侧连通通道（303）生长成熟并形成具有生理功能的心肌组织。

4.一种如权利要求1-3任意一项所述用于心肌细胞三维功能性培养的微流控芯片的制备方法，其特征在于：包括步骤：

（1）3D打印与芯片相同结构的一次模具，用去离子水清洗并用氮气枪吹干，放置于紫外灯下数天得到固化的一次模具；

（2）利用软光刻工艺倒模制作二次模具结构层；

（3）对二次模具结构层和衬底层分别用去离子水清洗并用氮气枪吹干，置于氧等离子体清洗机中进行表面改性处理后，进行永久性键合形成二次模具；

（4）将二次模具利用硅烷蒸气在表面形成疏水层后，再次利用软光刻工艺制作具有圆形腔室结构，立柱结构和长方形连通通道的微流控芯片；

（5）在硅圆晶片上利用软光刻工艺倒模制作双层通道结构，并分别插入金属线从预留孔穿出，制作上侧电极，左侧电极，右侧电极和用于连接外部信号处理电路的导线。

5.根据权利要求4所述的用于心肌细胞三维功能性培养的微流控芯片的制备方法，其特征在于：所述衬底层为洁净的方形玻璃。

6.根据权利要求 4 所述的用于心肌细胞三维功能性培养的微流控芯片的制备方法，其特征在于：分离式电学性能测量电极用在玻璃表面上利用剥离工艺制作的共面微电极图案替代上侧电极（401），左侧电极（402），右侧电极（403）和用于连接外部信号处理电路的导线（405）。

7.一种利用微流控芯片的力学电学特性检测方法，其特征在于：利用权利要求 1-3任意一项所述的微流控芯片，包括步骤：

（1）将心肌细胞悬浮液加至微流控芯片的圆形腔室和长方形连通通道中，并将芯片放入培养箱中，设定适宜的培养环境至心肌细胞达到生理成熟，能攀附圆形腔室中的立柱结构并通过连通通道两两相连，形成条带状心肌组织；

（2）从培养箱中取出芯片，置于显微镜下观察，圆柱体立柱受到心肌组织的收缩力牵拉而一同向中心弯曲；此时使用显微镜的摄像镜头记录各圆柱体立柱顶端的圆面在心肌组织的收缩力的作用下发生的移动；

（3）进行数据采集和计算，得立柱顶部圆截面的水平方向位移，并通过综合立柱建模分析和测得的实际水平位移得到一组心肌组织收缩力的数值表征；

（4）将电极底板放在芯片上压紧后倒置，使得各电极分别与各立柱上的心肌组织接触，通过导线对上侧电极施加动作电位，在左侧电极和右侧电极接受电信号并通过导线连接至外部电路；通过外部电路对检测到的信号进行处理，对心肌细胞电信号传导能力进行判定。

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