JP5581499B2 - 心臓リエントリーモデルチップおよび心臓リエントリーモデルチップによる薬剤の評価装置および方法 - Google Patents

Description

本発明は、心臓リエントリーモデルチップおよび心臓リエントリーモデルチップによる薬剤の評価装置および方法に関する。

細胞の状態の変化や、細胞の薬物等に対する応答を観察するのに多用されているのはバイオアッセイである。従来のバイオアッセイでは、一般的に培養細胞を用いることが多い。この系では複数の細胞を用いてアッセイを行うので、細胞集団の値の平均値をあたかも１細胞の特性であるかの様に観察してきた。

しかし、実際には細胞は集団の中で細胞周期が同調しているものはまれであり、各々の細胞が異なった周期でタンパク質を発現している。このため、刺激に対する応答の結果を解析するときにゆらぎの問題が常に付きまとう。

すなわち、細胞の反応機構自体が普遍的に持つ応答のゆらぎが存在するために、常に、平均的なレスポンスしか得ることができない。これらの問題を解決するために、同調培養等の手法が開発されているが、常に同じステージにある細胞群を使用することは、常にそのような細胞を供給し続けなければならないということで、バイオアッセイを広く一般に広める障害となっている。

また、細胞に対する刺激（シグナル）は、細胞周辺の溶液に含まれるシグナル物質、栄養、溶存気体の量によって与えられるものと、他の細胞との物理的接触・細胞間インタラクションによるものの２種類があることからも、ゆらぎについての判断が難しいのが実情であった。

細胞の物理的接触・細胞間インタラクションの問題は、バイオアッセイを組織断片のような細胞塊で行うことである程度解決できる。しかし、この場合、培養細胞と異なり、常に均一な素性の細胞塊を得ることができない。そのため、得られるデータがばらついたり、集団の中に情報が埋もれてしまったりする問題がある。

細胞群の細胞の１つ１つを最小構成単位とする情報処理モデルの計測のために、本願の発明者らは特開２００６‐９４７０３（特許文献１）に示すように、細胞を特定の空間配置の中に閉じ込めておくための複数の細胞培養区画を構成し、隣接する区画間は細胞の通り抜けることができない溝またはトンネルでお互いを連結するとともに、必要に応じて、溝またはトンネルあるいは細胞培養区画に、細胞の電位変化を計測するための複数の電極パターンを持つ構造の集合細胞マイクロアレー（バイオアッセイチップ）を提案した。
特開２００６‐９４７０３号公報

従来のバイオアッセイでは、細胞を組織断片として扱うか、培養細胞のように１細胞として扱うかのいずれかであった。細胞の数が多すぎると上記従来技術の項で述べたように、得られる情報が平均的なものになってしまい、薬剤などに対するレスポンスが正確に得られない問題がある。細胞を１細胞ずつ用いる場合は、本来、多細胞組織の細胞として機能している細胞を、引き離された独立した状態の細胞として使用するために、細胞同士のインタラクションの影響が現れなくなることとなり、やはり正確な薬剤レスポンスすなわちバイオアッセイデータを得る上で問題がある。

心臓の拍動の基本となる心筋細胞および線維芽細胞の動作を検証するためには、隣接する心筋細胞あるいは線維芽細胞からの拍動の伝播が、１細胞単位で細胞電位、細胞形態が正確に計測できるとともに、心筋細胞と線維芽細胞とを適当に分散させて配置した閉ループを構成して心臓モデルを構成し薬物による影響が評価できるチップを開発することが重要である。

本発明は、以下の心臓リエントリーモデルチップ、該心臓リエントリーモデルチップによる薬剤の評価装置、および該心臓リエントリーモデルチップによる薬剤の評価方法を提供する。

（１）基板、
該基板上に設けた所定の大きさと厚さのゲル層、
該ゲル層に形成され、細胞を収納するための複数の開口、
該複数の開口のそれぞれの開口間を連絡する複数の溝を有し、前記複数の開口と前記複数の溝により形成された閉ループ、
前記ゲル層の周辺に細胞培養液を満たすための壁、
前記基板上の前記開口位置に設けられ、前記開口に収納される細胞を載置する微小電極、
前記壁で囲われた領域内に設けられた比較電極、および
前記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と前記比較電極に接続された引き出し線を有することを特徴とする心臓リエントリーモデルチップ。
（２）前記溝は、前記細胞が通り抜けることの出来ない間隙である上記（１）記載の心臓リエントリーモデルチップ。
（３）基板、
該基板上に設けた所定の大きさと厚さのゲル層、
該ゲル層に形成され、細胞を収納するための複数の開口、
該複数の開口のそれぞれの開口間を連絡する複数の溝を有し、前記複数の開口と前記複数の溝により形成された閉ループ、
前記ゲル層の周辺に細胞培養液を満たすための壁、
前記基板上の前記開口位置に設けられ、前記開口に収納される細胞を載置する微小電極、
前記壁で囲われた領域内に設けられた比較電極、
前記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と前記比較電極に接続された引き出し線
前記細胞培養液を前記壁で囲われた領域内に供給し、および、排出する培養液供給、排出手段、
前記細胞に作用する薬剤を前記細胞培養液に加える手段、および
前記引き出し線を用いて前記微小電極に載置されている細胞電位を計測し記録する手段を有することを特徴とする心臓リエントリーモデルチップによる薬剤の評価装置。
（４）基板、
該基板上に設けた所定の大きさと厚さのゲル層、
該ゲル層に形成され、細胞を収納するための複数の開口、
該複数の開口のそれぞれの開口間を連絡する複数の溝を有し、前記複数の開口と前記複数の溝により形成された閉ループ、
前記ゲル層の周辺に細胞培養液を満たすための壁、
前記基板上の前記開口位置に設けられ、前記開口に収納される細胞を載置する微小電極、
前記壁で囲われた領域内に設けられた比較電極、
前記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と前記比較電極に接続された引き出し線
前記細胞培養液を前記壁で囲われた領域内に供給し、および、排出する培養液供給、排出手段、
前記細胞に作用する薬剤を前記細胞培養液に加える手段、および
前記引き出し線を用いて前記微小電極に載置されている細胞電位を計測し記録する手段を備える心臓リエントリーモデルチップを用いて、前記細胞に作用する薬剤を前記細胞培養液に加える手段から前記細胞培養液に加えることを特徴とする心臓リエントリーモデルチップによる薬剤の評価方法。
（５）前記基板上に設けられたゲル層が細胞非接着性のゲルである上記（１）記載の心臓リエントリーモデルチップ。
（６）前記基板上に設けられたゲル層が細胞非接着性のゲルである上記（３）記載の心臓リエントリーモデルチップによる薬剤の評価装置。
（７）前記基板上に設けられたゲル層が細胞非接着性のゲルである上記（３）記載の心臓リエントリーモデルチップによる薬剤の評価方法。
（８）基板、
該基板上に設けられた所定の大きさと厚さのゲル層、
該ゲル層に形成された、細胞を収納するための複数の開口、
該複数の開口のそれぞれを互いに連絡し、前記複数の開口とともに流体連絡可能な流路の閉ループを形成する該ゲル層に形成された溝、
前記基板表面と、該基板上の前記ゲル層の周囲に形成された壁とによって規定される細胞培養液を満たすための領域、
前記基板上の前記開口内に設けられ、前記開口に収納される細胞を載置する微小電極、
前記基板上の前記細胞培養液を満たすための領域内に設けられた比較電極、および
前記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と前記比較電極に接続された引き出し線を備える、心臓リエントリーモデルチップ。
（９）前記溝の幅は、前記細胞が通り抜けることができない大きさである、上記（８）記載の心臓リエントリーモデルチップ。
（１０）上記（８）または（９）記載の心臓リエントリーモデルチップを使用して薬剤評価を行うための薬剤評価装置であって、
前記チップを載置するためのステージ、
前記細胞培養液を前記細胞培養液を満たすための領域内に供給し、および、排出する培養液供給・排出手段、
前記細胞に作用する薬剤を前記細胞培養液に加えるための薬剤供給手段、ならびに
前記引き出し線を用いて前記微小電極に載置されている細胞電位を計測し記録する手段を備える、心臓リエントリーモデルチップによる薬剤の評価装置。
（１１）上記（１０）記載の心臓リエントリーモデルチップによる薬剤の評価装置を用いて薬剤評価を行うための方法であって、
前記細胞に作用する薬剤を前記薬剤供給手段から前記細胞培養液に加えることを含む、心臓リエントリーモデルチップによる薬剤の評価方法。

（１２）基板、
該基板上に設けた所定の大きさと厚さのゲル層、
該ゲル層に形成された、細胞を収納するための複数の開口、
該複数の開口のそれぞれを互いに連絡し、上記複数の開口とともに流体連絡可能な流路の閉ループを形成する該ゲル層に形成された溝、 上記基板表面と、該基板上の上記ゲル層の周囲に形成された壁とによって規定される細胞培養液を満たすための領域、

上記基板上の上記開口内に設けられ、上記開口に収納される細胞を載置する微小電極、
上記基板上の上記細胞培養液を満たすための領域内に設けられた比較電極、および
上記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と上記比較電極に接続された引き出し線を備え、
上記微小電極、上記複数の開口および上記複数の開口間を連絡する溝が複数の細胞を保持できるものである、心臓リエントリーモデルチップ。
（１３）上記（１２）記載の心臓リエントリーモデルチップを使用して薬剤評価を行うための薬剤評価装置であって、
上記チップを載置するためのステージ、
上記細胞培養液を上記細胞培養液を満たすための領域内に供給し、および、排出する培養液供給、排出手段、
上記細胞に作用する薬剤を上記細胞培養液に加えるための薬剤供給手段、ならびに
上記引き出し線を用いて上記微小電極に載置されている細胞電位を計測し記録する手段を備える、心臓リエントリーモデルチップによる薬剤の評価装置。
（１４）さらに、すべての微小電極から得られる細胞電位の加算値を導出する手段を備える、上記（１３）記載の心臓リエントリーモデルチップによる薬剤の評価装置。
（１５）上記（１３）または（１４）記載の心臓リエントリーモデルチップによる薬剤の評価装置を用いて薬剤評価を行うための方法であって、
上記細胞に作用する薬剤を上記薬剤供給手段から上記細胞培養液に加えることを含む、心臓リエントリーモデルチップによる薬剤の評価方法。

本発明は、１細胞を特定の空間配置の中に閉じ込めておく構成を利用して、透明基板上に設けた透明電極の上に配置された心筋細胞と線維芽細胞とよりなる閉ループの任意の心筋細胞あるいは特定の心筋細胞の拍動をループの両側に伝播させ、閉ループ上の細胞の拍動の状況を電気的に検出し、In vitroでの心臓リエントリーモデルチップを作成する。この心臓リエントリーモデルチップに薬物を作用させ、個々の細胞の細胞電位を計測して心筋細胞に対する薬物の有用性あるいは毒性を評価する。

心筋細胞および線維芽細胞の混在したIn vitroでのリエントリーモデルチップを構成することが出来、これを利用して心筋細胞に対する薬物の有用性あるいは毒性が評価できる。本発明のモデルチップによれば、in vitroでありながら、in vivoの状態に限りなく近い条件での薬物試験が可能であり、薬物の有用性および／または毒性について信頼性の高い評価ができるという格別顕著な効果が得られる。

本発明の一実施形態に係る心臓リエントリーモデルチップの構造の１例を模式的に示した斜視図である。 図１に示す心臓リエントリーモデルチップの細胞収納部ＣＨの構成の１例を模式的に示す斜視図である。 （ａ）は、開口４に保持された細胞が溝５を介して物理的接触・細胞間インタラクションを持つことによる細胞の拍動の伝播の様子の一例を概念的に説明する図であり、（ｂ）は細胞の拍動の伝播を電極２に得られる電気信号の一例を説明する図である。 すべての細胞収納部ＣＨに保持されている細胞が、いわゆる、正常なパルス電位で拍動している期間Ｔ_１、細胞収納部ＣＨ_４およびＣＨ_６に保持されている細胞が、正常なパルス電位の後に不整脈に対応する異常なパルス電位を伴って拍動している期間Ｔ_２の切り替わるときのパルス電位を時間軸を拡大して占めた図である。 （Ａ）−（Ｃ）は第２の実施形態のモデルチップ１００のアガロースゲル層３と微小電極２に着目した構成（必要に応じて、チャンバーと呼ぶ）を示す図である。（Ａ）はアガロースゲル層３により構成される心筋細胞と線維芽細胞とよりなる閉ループ単位の顕微鏡写真である。（Ｂ）は、（Ａ）のスケッチである。（Ｃ）は、アガロースゲル層３の上に心筋細胞と線維芽細胞の混在した細胞を振りまいて、６日間細胞培養を行い、７日目に撮った顕微鏡写真である。 本発明の第２の実施形態における心臓リエントリーモデルチップの細胞収納部ＣＨの構成の１例を模式的に示す斜視図である。 （Ａ）および（Ｂ）は、図５（Ｃ）に示すように細胞が培養された状態のリエントリーモデルチップの各チャンネルの微小電極２に得られる電位波形および各チャンネルのピーク時間をプロットした一つの例を示す図である。 （Ａ）は、図７（Ａ）に示す信号が心臓の活動としては正常なものに対応するものであることを意味していることを、より簡便に評価する波形図を示す。（Ｂ）は、ヒトの心電図の正常範囲にある心電図の例を示す図である。（Ｃ）は、心臓の活動としては正常なものに対応している状態のリエントリーモデルチップを構成している細胞の拍動の伝播状況を推定した図である。 （Ａ）および（Ｂ）は、図５（Ｃ）に示すように細胞が培養された状態のリエントリーモデルチップの各チャンネルの微小電極２に得られる電位波形および各チャンネルのピーク時間をプロットした他の例を示す図である。 （Ａ）は、図９（Ａ）に示す信号が心臓の活動としては正常なものに対応するものではないことを意味していることを、より簡便に評価する波形図を示す。（Ｂ）は、ヒトの心電図が不整脈を多く含み正常範囲を超えた心電図の例を示す図である。（Ｃ）は、図９（Ａ）、（Ｂ）に波形図、ピーク時間を示す状態のリエントリーモデルチップを構成している細胞の拍動の伝播状況を推定した図である。

符号の説明

１…透明基板、２…微小電極、２ｃ…比較電極、２’…微小電極２の引き出し線、３…アガロースゲルの層、４…開口、５…溝、７…周辺を取り巻く壁、８_１，８_２，８_３…パイプ、ＰＣ…パソコン、Ｍｓ…パソコンの操作信号、１０…心筋細胞あるいは線維芽細胞、ＣＨ…細胞保持部。

図１は本発明の一実施形態に係る心臓リエントリーモデルチップの構造の１例を模式的に示した斜視図である。図２は、図１に示す心臓リエントリーモデルチップの細胞収納部ＣＨの構成の１例を模式的に示す斜視図である。

１００はリエントリーモデルチップであり、透明基板１の上に構築されている部品を主体として構成される。透明基板１は光学的に透明な材料、たとえば、ガラス基板あるいはシリコン基板である。２は微小電極であり、たとえば、ＩＴＯによる透明電極とされ、透明基板１上に配置される。２’は微小電極２の引き出し線であり、これもＩＴＯによる透明電極とされる。３はアガロースゲル層である。アガロースゲル層３には心筋細胞あるいは線維芽細胞を収納すべき位置にアガロースゲル層３の表面から透明基板１の表面にまで達する開口４が所定の周期で形成され、細胞収納部ＣＨを構成する。さらに、隣接する開口４間にはアガロースゲル層３の表面から透明基板１の表面にまで達する溝５が形成される。細胞収納部ＣＨを構成する開口４の透明基板１上には、必要により、微小電極２が配置される。図１では、すべての細胞収納部を構成する開口４に微小電極２を配置するものとした。微小電極２の有無に係らず、細胞収納部ＣＨを構成する開口４に一つの心筋細胞または線維芽細胞１０が収納される。図２では、細胞収納部ＣＨを構成する開口４の位置で溝５より手前側でアガロースゲル層３を除去して透明基板１上の微小電極２、微小電極２の上に載置されている心筋細胞または線維芽細胞１０、微小電極２に接続されて引き出されている引き出し線２’の様子を示す。微小電極２の細胞載置面および微小電極２を設けないで透明基板１に、直接、細胞を載置する場合の細胞載置面にはコラーゲン等の細胞が接着するのを助ける素材を塗っておくのがよい。アガロースゲル層で取り囲まれている細胞収納部ＣＨを構成する開口４内の細胞は、アガロースゲルが細胞にとっては非接着性であるため、アガロースゲル層３の壁の高さを細胞と同程度としても、壁を乗り越えて細胞１０が移動することはない。また、両側がアガロースゲル層３の溝５に幅は細胞の大きさより小さいものとされるから、この溝５をすり抜けて細胞１０が隣接する細胞収納部ＣＨを構成する開口４に移動することはない。ここで、アガロースゲル層３は、細胞を保持するμｍオーダーの開口が形成でき、開口間をμｍオーダーの溝で連絡できるゲル材料であれば任意のものが使用できる。

図１において、細胞収納部ＣＨを構成する開口４は直線状で８個が所定の間隔で配置され、これが２列平行して設けられている。各列の細胞収納部ＣＨを構成する開口４は、それぞれ溝５で接続されるとともに、各列の両端の細胞収納部ＣＨを構成する開口４もそれぞれ溝５で接続される。すなわち、１６個の細胞収納部ＣＨを構成する開口４が閉ループを構成している。各細胞収納部ＣＨを構成する開口４はそれぞれ一つの心筋細胞あるいは線維芽細胞１０を保持するとともに、図２に示すように、それぞれ、微小電極２を備えていて、各微小電極２からは引き出し線２’が引き出されている。これら１６個の直列配列された心筋細胞および／または線維芽細胞の配分は、ランダムでよい。また、すべてを心筋細胞あるいは線維芽細胞としないことが好適である。心臓リエントリーモデルとしては、これらの細胞が適当に混在していることが最も好適である。さらに、１６個の細胞収納部ＣＨを構成する開口４に細胞を配分する際、１６個の細胞収納部ＣＨを構成する開口４のそれぞれに配分されるべき細胞の数よりも十分に多い数の細胞をアガロースゲル層３の上面に振りかける形で配分するものとしてもよい。このようにすると、開口４に細胞が配分される他に、溝５の上にも細胞が載るケース、アガロースゲル層３の周辺部に細胞が分散する形となるが、これらの細胞はそのままにしておいても支障は無い。隣接した細胞収納部ＣＨを構成する開口４に保持された細胞は溝５を介して物理的接触・細胞間インタラクションが可能である。アガロースゲル層３の端部の下部に比較電極２_Ｃが設けられ、引き出し線２’_Ｃが引き出されている。

７は周辺を取り巻く壁であり、アガロースゲル層３および比較電極２_Ｃを取り巻いている。８_１および８_２は壁７の内部の領域に、細胞の培養液を供給し、および、壁７の内部の領域から、細胞の培養液を排出するためのパイプである。図１の例では、基板１の底面近くまで延伸されたパイプ８_１から培養液が供給され、基板１の底面近くまで延伸されたパイプ８_２から培養液が排出される。培養液を供給するパイプ８_１の培養液の出口の近くにパイプ８_３が結合され、このパイプ８_３を介して細胞に作用させたい薬剤が供給される。したがって、細胞１０はパイプ８_１により壁７の内部の領域に供給される細胞の培養液に曝されながら、微小電極２の上に安定して保持される。細胞を培養液に曝す必要がなくなったときは、パイプ８_２により壁７の内部の領域から培養液を排出すればよい。また、培養液を新しいもの交換するときは、培養液を排出した後、あるいは、排出しながら、培養液を供給すればよい。一方、細胞に薬剤を作用させたいときは、パイプ８_２により培養液を排出しながら、パイプ８_３を介して細胞に作用させたい薬剤を培養液に加えて、パイプ８_１により培養液とともに供給すればよい。なお、パイプ８_１、パイプ８_２およびパイプ８_３の構成、配置は計測の仕方により任意に変更してよい。例えば、パイプ８_１およびパイプ８_３は分離されたものとしてもよいし、パイプ８_２は省略して、パイプ８_１を供給、排出の両方に使用するものとしてもよい。

ＰＣはパソコンであり、細胞収納部ＣＨを構成する開口４の微小電極２の引き出し線２’と比較電極２_Ｃの引き出し線２’_Ｃとの間で細胞電位を計測し記録する。なお、図１では、図が煩雑になるので、上段の細胞収納部ＣＨを構成する開口４の微小電極２の引き出し線２’の引き出し線がパソコンＰＣに信号を与える線の表示は省略された。また、パソコン９には操作者の操作信号Ｍｓが加えられる。

図１に示すリエントリーモデルチップ１００の構造の主要なサイズの例を示すと以下のようである。これは、細胞の大きさを１０μｍφとした例である。透明基板１の大きさは１００ｍｍ×１５０ｍｍ、微小電極２は８μｍ×８μｍの大きさ、アガロースゲル層３の大きさは４．５ｍｍ×２ｍｍ×１０μｍ（高さ）、細胞収納部となる開口４は１２μｍφの円柱状、開口４間の距離は５０μｍ、開口４間の溝５の幅５μｍ、周辺に形成される壁７の外形は５ｍｍ×５ｍｍとし高さは５ｍｍである。尚、ここでは、微小電極２は８μｍ×８μｍの正方形としたが、細胞収納部ＣＨを構成する開口４の１２μｍφと同じ円状の電極としてもよい。

以下、本発明のリエントリーモデルチップ１００を用いた具体的な計測例を説明する。

図３（ａ）は、開口４に保持された細胞が溝５を介して物理的接触・細胞間インタラクションを持つことによる細胞の拍動の伝播の様子の一例を概念的に説明する図であり、図３（ｂ）は細胞の拍動の伝播を電極２に得られる電気信号の一例を説明する図である。

図３（ａ）に黒く塗りつぶして示すのが開口４を有する細胞収納部ＣＨに対応し、それぞれに、説明の便宜上ＣＨ_１，ＣＨ_２，---，ＣＨ_１６の参照符号を付した。図３（ａ）では、細胞収納部ＣＨ_６から時計方向（ＣＷ）および反時計方向（ＣＣＷ）に拍動が伝播され、細胞収納部ＣＨ_６から等距離にある細胞収納部ＣＨ_１４で両方向からの拍動が衝突して消滅することを模式的に示す。もっとも、線維芽細胞は、それ自体では、拍動しないし、電気信号も発生しないが、伝えられた拍動および電気信号を伝える機能は有する。

図１に示す実施形態の心臓リエントリーモデルの細胞収納部ＣＨに心筋細胞および線維芽細胞を適当に配分し、所定の培養液、所定の培養条件で培養する。数日間培養を続けると、図３（ａ）に例示したような拍動および電気信号の伝達が行われるようになる。

図３（ｂ）は、培養開始後の５日目に細胞収納部ＣＨの電極２の電位をパソコンＰＣに取り込んで計測した結果の例を、細胞収納部ＣＨ_４、ＣＨ_６、ＣＨ_１１およびＣＨ_１５に保持されている細胞について示す図である。ここで、Ｔ_１はすべての細胞収納部ＣＨに保持されている細胞が、いわゆる、正常なパルス電位で拍動している期間であり、Ｔ_２は細胞収納部ＣＨ_４およびＣＨ_６に保持されている細胞が、正常なパルス電位の後に不整脈に対応する異常なパルス電位を伴って拍動している期間である。図の右下にスケールバーを参照して分かるように、パルス電位は１回／１秒程度で発生している。また、この例では、正常なパルス電位で拍動している期間Ｔ_１はほぼ５分、不整脈に対応する異常なパルス電位を伴って拍動している期間Ｔ_２はほぼ３０秒であった。

この計測では、期間Ｔ_１のパルス電位を時間軸で比較してみると、細胞収納部ＣＨ_６に保持されている細胞が最も早いタイミングでパルス電位を発生しているから、これがペースメーカーとなっていることが分かる。細胞収納部ＣＨ_６に保持されている細胞が発生したパルス電位が反時計方向（ＣＣＷ）に伝播されて、細胞収納部ＣＨ_４に保持されている細胞がパルス電位を発生し、時計方向（ＣＷ）に伝播されて、細胞収納部ＣＨ_１１およびＣＨ_１５に保持されている細胞がパルス電位を発生していることが分かる。

この状態が、期間Ｔ_１継続した後、突然、細胞収納部ＣＨ_４およびＣＨ_６に保持されている細胞が、正常なパルス電位の後に不整脈に対応する異常なパルス電位を伴って拍動し始め、これが期間Ｔ_２継続した後、突然、ふたたび、正常なパルス電位の拍動の状態となり、期間Ｔ_１継続する。ここで、細胞収納部ＣＨ_４およびＣＨ_６に保持されている細胞の不整脈に対応する異常なパルス電位についてみると、細胞収納部ＣＨ_４に保持されている細胞の異常なパルス電位の方が細胞収納部ＣＨ_６に保持されている細胞の異常なパルス電位よりも早い時点で発生していることが観測された。すなわち、異常なパルス電位は細胞収納部ＣＨ_４に保持されている細胞がペースメーカーとなって時計方向に伝播されているようである。この期間Ｔ_１、期間Ｔ_２の繰り返しの状態は、正常なパルス電位での拍動、異常なパルス電位を伴っての拍動の繰り返しとなることは確認されたが、期間Ｔ_１、期間Ｔ_２は一定ではなく、計測のたびにそれぞれ変動するものであった。

図４は、期間Ｔ_１から期間Ｔ_２の切り替わるときのパルス電位を時間軸を拡大して示した図である。上段にペースメーカーとなっている細胞収納部ＣＨ_６に保持されている細胞のパルス電位を基準として時計方向（ＣＷ）への伝播を細胞収納部ＣＨ_１０、ＣＨ_１５、ＣＨ_２に保持されている細胞パルス電位を示す。下段には、ペースメーカーとなっている細胞収納部ＣＨ_６に保持されている細胞のパルス電位を基準として反時計方向（ＣＣＷ）への伝播を細胞収納部ＣＨ_４、ＣＨ_３、ＣＨ_２に保持されている細胞パルス電位を示す。

時計方向（ＣＷ）への伝播についてみると、細胞収納部ＣＨ_６の細胞のパルス電位が細胞収納部ＣＨ_１０、ＣＨ_１５と順次伝播しているが、ＣＨ_２に保持されている細胞がパルス電位を発生したとき、これが細胞収納部ＣＨ_６の細胞に伝播されたとき、この細胞が不整脈に対応する異常なパルス電位を生ずるように思われる。一方、反時計方向（ＣＣＷ）への伝播についてみると、細胞収納部ＣＨ_６の細胞のパルス電位が細胞収納部ＣＨ_４へ伝播しているが、ＣＨ_３に到達後途絶してしまっている。この結果、上述したように、時計方向（ＣＷ）の伝播によるパルス電位が、細胞収納部ＣＨ_６の細胞に伝播されることになり、不整脈に対応する異常なパルス電位を生ずるように思われる。

なお、図３、図４で表示されていない細胞収納部ＣＨの細胞のパルス電位は、細胞が線維芽細胞であると認められ、パルス電位が得られない場合、あるいは、説明に必要ないので表示しなかったものである。

上述の第１の実施形態では、心筋細胞と線維芽細胞とよりなる閉ループの特定の空間に１細胞を閉じ込める構成を利用するものとした。以下に説明する第２の実施形態では、より操作を簡便にするとともに、微小電極から電気信号を得やすくすることを目的として、心筋細胞と線維芽細胞とよりなる閉ループに所定の周期で配置された透明電極を大きくするとともに、細胞を閉じ込めておく空間（開口）も大きくし、空間（開口）との空間（開口）とを結ぶ溝も幅を広くした。以下、図面を参照しながら説明する。

図５（Ａ）−（Ｃ）は第２の実施形態のモデルチップ１００のアガロースゲル層３と微小電極２に着目した構成（必要に応じて、チャンバーと呼ぶ）を示す図である。モデルチップ１００の構成およびシステムの全体構成の考え方自体は図１で説明したものと同じである。図５（Ａ）はアガロースゲル層３により構成される心筋細胞と線維芽細胞とよりなる閉ループ単位の顕微鏡写真である。図５（Ｂ）は、図５（Ａ）のスケッチである。図５（Ｃ）は、アガロースゲル層３の上に心筋細胞と線維芽細胞の混在した細胞を振りまいて、６日間細胞培養を行い、７日目に撮った顕微鏡写真である。

図５（Ａ）−（Ｃ）の参照符号（全部には付けていない）は、図１のそれと同じであり、２は微小電極、２’は微小電極２の引き出し線、３はアガロースゲル層、４は心筋細胞および線維芽細胞を保持するとともに微小電極２が配置された空間（開口）であるが、チャンバーの上下の両端では、４つの微小電極を一つの空間（開口）に配置した構成とした（参照符号を４’として、他の空間（開口）と区別した）。５は空間（開口）間を結ぶ溝である。これらは透明基板１の表面上に形成される。図５（Ａ）には、心筋細胞と線維芽細胞とよりなる閉ループの微小電極２に関係の無い微小電極２の引き出し線２’が見えているが、これは、便宜上、透明基板１の表面上に複数の心筋細胞と線維芽細胞とよりなる閉ループを形成できるように構成したためであり、心筋細胞と線維芽細胞とよりなる閉ループの１単位としては、図５（Ｂ）に示すスケッチの構成である。図５（Ｃ）の左側（Ｌｅｆｔ）、右側の（Ｒｉｇｈｔ）のそれぞれにある８個の微小電極２の脇に付した１〜８の数字は、各微小電極２に付したチャンネル番号であり、後述の説明で使用する。

ここで、図５（Ａ）−（Ｃ）に示すチャンバーの主要なサイズと構成の例を説明する。ここでも、細胞の大きさは１０μｍφとする。微小電極２は５０μｍ×５０μｍの大きさ、微小電極２間の距離は４５０μｍ、アガロースゲル層３の厚さ（高さ）は１０μｍ、空間（開口）４は６０μｍφとした。空間（開口）４間の溝５の幅は２０μｍ〜６０μｍとするがここでは５０μｍとした。空間（開口）４間の距離は４５０μｍ、チャンバーの上下の両端の空間（開口）４’は５００μｍ×５００μｍの大きさとした。尚、ここでは、アガロースゲル層３の大きさ、透明基板１の大きさ、周辺に形成される壁７の外形および高さには言及しない。これらは、上述したサイズを考慮して決めればよい。

このサイズの例からも分かるように、第２の実施形態では、空間（開口）４も溝５も細胞のサイズに対して十分に大きいから、アガロースゲル層３の上面から心筋細胞と線維芽細胞の混在した細胞を振りまくと、微小電極２、空間（開口）４、４’および溝５、に適宜分布することになる。図６はこの状態を模式的に示す図である。空間（開口）４の位置にある微小電極２には細胞１０が５個載っていて、その両側の溝５の中にも細胞１０があり、アガロース層３の上面にも細胞１０が載っている。ここでは微小電極２には細胞１０が５個載っている例を示したが、１個から１０個程度の細胞が載ると推定される。図６と図２とを対比してよく分かるように、第２の実施形態では、閉ループが複数の細胞１０を載置した微小電極２と複数の微小電極２間の、細胞１０を載置した溝５とにより構成されるものとなっていることが分かる。心筋細胞と線維芽細胞とが混在した細胞群をアガロース層３の上面に振りまくだけでよいからリエントリーモデルチップを簡単に構成できる。この場合、心筋細胞と線維芽細胞との混合の比率を管理する必要は無い。また、微小電極２には細胞１０が複数個載ることが期待され、これらがすべて線維芽細胞であるとは考えられないので、第１の実施形態のように電位信号が得られない微小電極２はなくなり、すべての微小電極２から電位信号が得られることが期待される。

図７（Ａ）および（Ｂ）は、図５（Ｃ）に示すように細胞が培養された状態のリエントリーモデルチップの各チャンネルの微小電極２に得られる電位波形および各チャンネルのピーク時間をプロットした一つの例を示す図である。リエントリーモデルチップの左右両側のｔ＝０を基点として観測したものである。図７（Ａ）から分かるように、リエントリーモデルチップの左右両側の各チャンネルの微小電極２に得られる電位は、すべてのチャンネルで安定した周期の波形となっている。図７（Ｂ）は、図７（Ａ）の電位波形を解析するために各チャンネルのピーク時間をプロットした図であり、図７（Ａ）のリエントリーモデルチップの左右両側の電位波形の対応する時間帯のものを同一時間軸に重ねて表示した。この処理は、図１に示すパソコンＰＣにより簡単に行うことができる。図７（Ａ）と図７（Ｂ）との間を結ぶ矢印の根元の位置の電位波形信号から矢印の先端の位置のピーク時間が導出されたものであることを示す。実線の矢印がリエントリーモデルチップの左側の微小電極２の信号に対応し、破線の矢印がリエントリーモデルチップの右側の微小電極２の信号に対応する。図７（Ｂ）では、リエントリーモデルチップの左側の微小電極２の信号に対応するピーク時間を×印、リエントリーモデルチップの右側の微小電極２の信号に対応するピーク時間を○で表示した。図７（Ｂ）から容易に分かるように、この例では、第１チャンネルから第８チャンネルまでほぼ同じ速度で拍動が伝播していて、第１チャンネルから発した拍動が約１００ｍｓで第８チャンネルまで伝播して消滅している。

すなわち、図７（Ａ）に示す信号は、心臓の活動としては正常なものに対応しているものであることを意味している。そこで、図７（Ｂ）に示す解析結果に、正常と言う意味で「Ｎ」と言う表示を付した。

図８（Ａ）は、図７（Ａ）に示す信号が心臓の活動としては正常なものに対応するものであることを意味していることを、より簡便に評価する波形図を示す。図８（Ａ）の波形図は、図７（Ａ）に示す第１チャンネルから第８チャンネルまでの信号波形をすべて加算したものである。この処理は、図１に示すパソコンＰＣにより簡単に行うことができる。図８（Ａ）の波形図は、安定したピーク波形を持つ信号が所定の周期で安定して表れている。このことは、図８（Ａ）の波形図と図７（Ａ）の波形図との対応、あるいは図８（Ａ）の波形図と図７（Ｂ）のピーク時間との対応から容易に推定できることである。この図８（Ａ）の波形図は、したがって、心臓の活動として正常な状態のものであることを意味しているという意味で「Ｎ」と言う表示を付した。

図８（Ｂ）は、ヒトの心電図の正常範囲にある心電図の例を示す図である。図８（Ａ）に示す信号波形を図８（Ｂ）に示す波形と比較して分かるように、安定したピーク波形、安定した周期から、リエントリーモデルチップを構成している細胞の活動が正常な心臓の活動と類似な正常なものに対応するものであることが理解できる。

図８（Ｃ）は、心臓の活動としては正常なものに対応している状態のリエントリーモデルチップを構成している細胞の拍動の伝播状況を推定した図である。左右両側の第１チャンネルの微小電極の近辺にある細胞がペースメーカー（ＰＭ）となり、この拍動が、矢印で示すように、左右両側のチャンネルを順次伝播して行き、第７チャンネルあるいは第８チャンネルの微小電極の近傍で衝突して消滅している。これが、所定の周期で繰り返されていると推定される。

図９（Ａ）および（Ｂ）は、図５（Ｃ）に示すように細胞が培養された状態のリエントリーモデルチップの各チャンネルの微小電極２に得られる電位波形および各チャンネルのピーク時間をプロットした他の例を示す図である。図７（Ａ）と同様、リエントリーモデルチップの左右両側のｔ＝０を基点として観測したものである。図９（Ａ）から分かるように、リエントリーモデルチップの左右両側の各チャンネルの微小電極２に得られる電位は、図７（Ａ）のそれと比較して、不安定な周期の波形となっている。図９（Ｂ）は、図９（Ａ）の電位波形を解析するために各チャンネルのピーク時間をプロットした図であり、図９（Ａ）のリエントリーモデルチップの左右両側の電位波形の対応する時間帯のものを同一時間軸に重ねて表示した。この処理は、図１に示すパソコンＰＣにより簡単に行うことができる。図９（Ａ）と図９（Ｂ）との間を結ぶ矢印の根元の位置の電位波形信号から矢印の先端の位置のピーク時間が導出されたものであることを示す。実線の矢印がリエントリーモデルチップの左側の微小電極２の信号に対応し、破線の矢印がリエントリーモデルチップの右側の微小電極２の信号に対応する。図９（Ｂ）では、リエントリーモデルチップの左側の微小電極２の信号に対応するピーク時間を×印、リエントリーモデルチップの右側の微小電極２の信号に対応するピーク時間を○で表示した。

図９（Ａ）、（Ｂ）では、図７（Ａ）、（Ｂ）と比較して複雑な動きをしている。この例では、図９（Ｂ）に示すように、ｔ=０の直後に第１チャンネルから第８チャンネルまでほぼ同じ速度で拍動が伝播していて、第１チャンネルから発した拍動が約１００ｍｓで第８チャンネルまで伝播して消滅している正常な拍動の伝播（Ｎ_１）が計測された後、リエントリーモデルチップの左側の微小電極２の第３チャンネルから第７チャンネルまでの拍動の伝播（Ｅ_１）が計測され、その後、リエントリーモデルチップの右側の微小電極２の第３チャンネルから第８チャンネルまでの拍動の伝播後、これが折り返して、リエントリーモデルチップの左側の微小電極２の第８チャンネルから第３チャンネルまでの拍動の部分的な循環型の伝播（Ｕ）が計測されている。その後しばらくして、第１チャンネルから第８チャンネルまでほぼ同じ速度で拍動が伝播していて、第１チャンネルから発した拍動が約１００ｍｓで第８チャンネルまで伝播して消滅している正常な拍動の伝播（Ｎ_２）が計測された後、リエントリーモデルチップの左側の微小電極２の第３チャンネルから第７チャンネルまでの拍動の伝播（Ｅ_２）が計測され、その後、リエントリーモデルチップの右側の微小電極２の第１チャンネルから第８チャンネルまでの拍動の伝播後、これが折り返して、リエントリーモデルチップの左側の微小電極２の第８チャンネルから第１チャンネルまでの拍動の伝播（Ｒ_１）後、これが折り返して、リエントリーモデルチップの左側の微小電極２の第１チャンネルから第８チャンネルまでの拍動の伝播後、これが折り返して、リエントリーモデルチップの左側の微小電極２の第８チャンネルから第１チャンネルまでの拍動の伝播（Ｒ_２）後、これが、さらに折り返して、リエントリーモデルチップの右側の微小電極２の第１チャンネルから第６チャンネルまでの拍動の伝播（Ｒ_３）後、消滅している。

すなわち、図９（Ａ）に示す信号は、正常な拍動の伝播Ｎ_１、Ｎ_２は起きていても、部分的な伝播Ｅ_１、Ｅ_２、部分的な伝播Ｕ、および、２回半の循環型の伝播を伴うリエントリーＲ_１、Ｒ_２、Ｒ_３を起こしている。これは心臓の活動としては正常なものとは言えない。

図１０（Ａ）は、図９（Ａ）に示す信号が心臓の活動としては正常なものに対応するものではないことを意味していることを、より簡便に評価する波形図を示す。図１０（Ａ）の波形図は、図９（Ａ）に示す第１チャンネルから第８チャンネルまでの信号波形をすべて加算したものである。この処理は、図１に示すパソコンＰＣにより簡単に行うことができる。図１０（Ａ）の波形図に、図９（Ｂ）のピーク時間の解析で示した伝播の状況Ｎ_１，Ｎ_２，Ｅ_１，Ｅ_２，Ｕ，Ｒ_１，Ｒ_２およびＲ_３を示したように、図１０（Ａ）の波形図と図９（Ｂ）のピーク時間の解析とはよく対応する。この図１０（Ａ）の波形図は、したがって、心臓の活動として正常な状態のものではないことを意味している。

図１０（Ｂ）は、ヒトの心電図が不整脈を多く含み正常範囲を超えた心電図の例を示す図である。図１０（Ａ）に示す信号波形を図１０（Ｂ）に示す波形と比較して分かるように、図１０（Ａ）に示す信号波形を示すリエントリーモデルチップを構成している細胞の活動は正常な心臓の活動を超えた心電図を示す場合のヒトの心臓の活動と類似な異常なものに対応するものであることが理解できる。

図１０（Ｃ）は、図９（Ａ）、（Ｂ）に波形図、ピーク時間を示す状態のリエントリーモデルチップを構成している細胞の拍動の伝播状況を推定した図である。Ｎ_１，Ｎ_２は図８（Ｃ）で説明した左右両側の第１チャンネルの微小電極の近辺にある細胞がペースメーカー（ＰＭ）となり、この拍動が、矢印で示すように、左右両側のチャンネルを順次伝播して行き、第７チャンネルあるいは第８チャンネルの微小電極の近傍で衝突して消滅している例と同じである。Ｅ_１，Ｅ_２は左側の第３チャンネルの微小電極の近辺にある細胞がペースメーカー（ＰＭ）となり、この拍動が、矢印で示すように、左側のチャンネルのみを順次伝播して行き、第７チャンネルあるいは第８チャンネルの微小電極の近傍で消滅している例である。Ｕは右側の第３チャンネルの微小電極の近辺にある細胞がペースメーカー（ＰＭ）となり、この拍動が、矢印で示すように、右側のチャンネルのみを順次伝播して行き、第７チャンネルあるいは第８チャンネルの微小電極の近傍で左側の第８チャンネルに伝播し、左側の第８チャンネルから順次第４チャンネルまで伝播した後、左側の第３チャンネルの微小電極の近辺にある細胞から発生した拍動と衝突して消滅している例である。Ｒ_１は右側の第１チャンネルの微小電極の近辺にある細胞がペースメーカー（ＰＭ）となり、この拍動が、矢印で示すように、右両側のチャンネルを順次伝播して行き、第７チャンネルあるいは第８チャンネルの微小電極の近傍で左側の第８チャンネルに伝播し、左側の第８チャンネルから順次第１チャンネルまで伝播した状態に達した後、さらにＲ_２に示すように、再び、左側のチャンネルの微小電極の近辺にある細胞を介して伝播した拍動となって巡回するのみならず、さらに、Ｒ_３に示すように、再び、右側のチャンネルの微小電極の近辺にある細胞を介して伝播した拍動となって第７チャンネルまで伝播した後消滅している例である。

第２の実施形態によれば、図８（Ａ）および図１０（Ａ）に示すように、全部の電極の電圧信号を合計した信号波形をみることにより、リエントリーモデルチップを形成している細胞群が正常状態の動作をしているか、不整脈を含む正常領域を超えた動作をしているかが一目瞭然でわかる。この信号波形の集計と評価はパソコンに適当なソフトを備えることで容易に実現できる。もちろん、集計はパソコンで行い、評価は医者によるものとしてもよい。

したがって、例えば、図８（Ａ）の信号波形を出力しているリエントリーモデルチップに対して、第１の実施形態で説明したように、薬剤を作用させた結果をみれば、薬剤が有害か否かが評価できる。すなわち、薬剤を作用させた結果図８（Ａ）の出力波形が図１０（Ａ）のようになるようであれば、この薬剤は有害であるし、大きな変化を与えないようであれば、有害なものではないと言える。同じように、図１０（Ａ）の信号波形を出力しているリエントリーモデルチップに対して、第１の実施形態で説明したように、薬剤を作用させた結果をみれば、薬剤が有用か否かが評価できる。すなわち、薬剤を作用させた結果図１０（Ａ）の出力波形が図８（Ａ）のようになるようであれば、この薬剤は心臓疾患に対して有用な薬になる可能性があるし、大きな変化を与えないようであれば、有用な薬になる可能性があるものではないと言える。

このように、本発明によれば、心筋細胞および線維芽細胞の混在したIn vitroでの心臓リエントリーモデルチップを構成することが出来る。したがって、パイプ８_３を介して細胞に作用させたい薬剤を供給して、図３（ｂ）に示すパルス電位の変化を検出して評価すれば、心筋細胞に対する薬剤の有用性あるいは毒性が評価できる。すなわち、不整脈に対応する異常なパルス電位が大きくなり、あるいは発生する継続期間が長くなるようであれば、薬剤としては不適当であること、逆に、不整脈に対応する異常なパルス電位が小さくなり、あるいは発生する継続期間が短くなるようであれば、薬剤としては適当であることが分かる。

なお、上記実施形態では、基板１および電極２を光学的に透明な材料で構成することにしたから、具体的に説明はしなかったが、細胞の拍動の状態を光学顕微鏡で観察することを併用することが出来る。そうすれば、パルス電位で評価するだけよりも、薬剤の影響を多面的に評価できる。逆に、光学顕微鏡で観察しない場合には、基板１および電極２を光学的に透明な材料で構成する必要は無い。

本発明によれば、隣接する心筋細胞あるいは線維芽細胞からの拍動の伝播が、１細胞単位で細胞電位、細胞形態が正確に計測できるとともに、心筋細胞と線維芽細胞とを適当に分散させて配置した閉ループを構成して心臓モデルを構成し薬物による影響が評価できるチップを提供することができる。

Claims (8)

1. 基板、
   前記基板上に設けられた複数の細胞収納部（ＣＨ）であって、該細胞収納部の各々が細胞を収納しており、該細胞が心筋細胞または線維芽細胞である、細胞収納部、
   隣接する細胞収納部を互いに連絡し、流路の閉ループを形成する溝、
   前記基板上に設けられた前記複数の細胞収納部（CH）の周囲を囲む壁と、前記基板表面とによって規定される細胞培養液を満たすための領域、
   前記基板上に設けられた微小電極であって、前記微小電極の各々が前記細胞収納部内に配置されており、前記細胞の拍動状態が電気的に検出されるように前記細胞収納部に収納された前記細胞が載置されている、微小電極、
   前記基板上の前記細胞培養液を満たすための領域内に設けられた比較電極、および
   前記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と前記比較電極に接続された引き出し線を備える、心臓リエントリーモデルチップ。
2. 前記基板上に形成された所定の大きさと厚さのゲル層をさらに備え、
   前記複数の細胞収納部が、前記ゲル層内に形成された複数の開口から形成されており、前記開口の各々が前記細胞を収納しており、前記溝が前記ゲル層上に形成されている、請求項１記載の心臓リエントリーモデルチップ。
3. 前記溝の幅は、前記細胞が通り抜けることができない大きさである、請求項１または２記載の心臓リエントリーモデルチップ。
4. 前記基板上に設けられたゲル層が細胞非接着性のゲルである請求項１〜３のいずれか記載の心臓リエントリーモデルチップ。
5. 前記微小電極、前記複数の開口、および前記複数の開口を連絡する溝が、複数の細胞を保持する、請求項１〜４のいずれか記載の心臓リエントリーモデルチップ。
6. 請求項１〜５のいずれか記載の心臓リエントリーモデルチップを使用して薬剤評価を行うための薬剤評価装置であって、
   請求項１〜５のいずれか記載の心臓リエントリーモデルチップ、
   前記チップを載置するためのステージ、
   細胞培養液を前記細胞培養液を満たすための領域内に供給し、および、排出する培養液供給・排出手段、
   前記細胞に作用する薬剤を前記細胞培養液に加えるための薬剤供給手段、ならびに
   前記引き出し線を用いて前記微小電極に載置されて
   いる細胞の電位を計測し記録する手段を備える、心臓リエントリーモデルチップによる薬剤の評価装置。
7. さらに、すべての微小電極から得られる細胞電位の加算値を導出する手段を備える、請求項６記載の心臓リエントリーモデルチップによる薬剤の評価装置。
8. 請求項６または７記載の心臓リエントリーモデルチップによる薬剤の評価装置を用いて薬剤評価を行うための方法であって、
   前記細胞に作用する薬剤を前記薬剤供給手段から前記細胞培養液に加える工程、および
   前記細胞の電位を計測し記録する工程
   を含む、心臓リエントリーモデルチップによる薬剤の評価方法。