ES2273868T3 - Metodos de ensayo de canal ionico. - Google Patents
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Abstract
Un método de caracterización de la actividad biológica de un compuesto candidato que comprende: exponer una o más células a dicho compuesto; exponer repetidamente dichas una o más células a una pluralidad de impulsos de campo eléctrico bifásico en el que dichos impulsos tienen una amplitud máxima inferior a aproximadamente 90 V/cm, en el que dichos impulsos se aplican a una tasa de al menos aproximadamente 1 por segundo, y en el que la duración total de cada impulso es de al menos aproximadamente 1 milisegundo, de manera que realice un cambio controlado en el potencial transmembrana de dichas una o más células; y monitorizar, sin utilizar un patch clamp, los cambios en el potencial transmembrana de dichas una o más células
Description
Métodos de ensayo de canal iónico.
Esta solicitud reivindica prioridad para las
solicitudes provisionales de los EE.UU. con números de serie
60/
217.671, titulada INSTRUMENTATION AND METHODS FOR ELECTRICAL STIMULATION, presentada el 10 de julio de 2000, por Maher et al.; 60/217.666, titulada INSTRUMENTATION AND METHODS FOR ELECTRICAL STIMULATION, presentada el 10 de julio de 2000 por Mendlein; 60/217.221, titulada INSTRUMENTATION AND METHODS FOR ELECTRICAL STIMULATION, presentada el 10 de julio de 2000, por Maher et al.; 60/217.219, titulada INSTRUMENTATION AND METHODS FOR ELECTRICAL STIMULATION, presentada el 10 de julio de 2000, por Maher et al.; y las solicitudes de los EE.UU. con números de serie 09/804.457, titulada ION CHANNEL ASSAY METHODS, presentada el 12 de marzo de 2001, por Maher et al.; 09/804.480, titulada ION CHANNEL ASSAY METHODS, y presentada el 12 de marzo de 2001, por Maher et al.; 09/804.580, titulada HIGH THROUGHPUT METHOD AND SYSTEM FOR SCREENING CANDIDATE COMPOUNDS FOR ACTIVITY AGAINST TARGET ION CHANNELS, presentada el 12 de marzo de 2001, por Maher et al.; y 09/804.458, titulada MULTI-WELL PLATE AND ELECTRODE ASSEMBLIES FOR ION CHANNEL ASSAYS, presentada el 12 de marzo de 2001.
217.671, titulada INSTRUMENTATION AND METHODS FOR ELECTRICAL STIMULATION, presentada el 10 de julio de 2000, por Maher et al.; 60/217.666, titulada INSTRUMENTATION AND METHODS FOR ELECTRICAL STIMULATION, presentada el 10 de julio de 2000 por Mendlein; 60/217.221, titulada INSTRUMENTATION AND METHODS FOR ELECTRICAL STIMULATION, presentada el 10 de julio de 2000, por Maher et al.; 60/217.219, titulada INSTRUMENTATION AND METHODS FOR ELECTRICAL STIMULATION, presentada el 10 de julio de 2000, por Maher et al.; y las solicitudes de los EE.UU. con números de serie 09/804.457, titulada ION CHANNEL ASSAY METHODS, presentada el 12 de marzo de 2001, por Maher et al.; 09/804.480, titulada ION CHANNEL ASSAY METHODS, y presentada el 12 de marzo de 2001, por Maher et al.; 09/804.580, titulada HIGH THROUGHPUT METHOD AND SYSTEM FOR SCREENING CANDIDATE COMPOUNDS FOR ACTIVITY AGAINST TARGET ION CHANNELS, presentada el 12 de marzo de 2001, por Maher et al.; y 09/804.458, titulada MULTI-WELL PLATE AND ELECTRODE ASSEMBLIES FOR ION CHANNEL ASSAYS, presentada el 12 de marzo de 2001.
La presente invención se refiere generalmente a
los instrumentos y métodos para manipular potenciales de membrana de
células vivas mediante estimulación eléctrica.
Se conoce desde hace mucho tiempo que el
interior de las células animales y vegetales es eléctricamente
negativo con respecto al exterior. La magnitud de esta diferencia de
potencial es generalmente de entre 5 y 90 mV, desarrollándose la
mayor parte del potencial a través de la membrana celular. El
potencial transmembrana de una célula dada se establece mediante el
equilibrio de las actividades de los transportadores de iones que
crean y mantienen el gradiente electroquímico, y las actividades de
los canales iónicos, la difusión pasiva y otros factores, que
permiten que los iones fluyan a través de la membrana
plasmática.
Los canales iónicos participan en, y regulan,
procesos celulares tan diversos como la generación y sincronización
de los potenciales de acción, la producción de energía, la
transmisión sináptica, la secreción de hormonas y la contracción de
músculos, etc. Muchos fármacos ejercen sus efectos específicos
mediante la modulación de los canales iónicos. Ejemplos incluyen
compuestos antiepilépticos como fenitoína y lamotrigina, que
bloquean los canales de sodio dependientes de voltaje en el cerebro,
fármacos antihipertensores como nifedipina y diltiazem, que bloquean
los canales de calcio dependientes de voltaje en las células del
músculo liso, y estimuladores de la liberación de insulina como
glibenclamida y tolbutamida, que bloquean los canales de potasio
regulados por ATP en el páncreas.
Encontrar nuevos fármacos que tengan efectos
moduladores específicos sobre los canales iónicos requiere métodos
para medir y manipular el potencial de membrana de las células con
los canales iónicos presentes en la membrana. En la actualidad
existen varios métodos que pueden utilizarse para medir los
potenciales transmembrana de las células y para medir las
actividades de canales iónicos específicos. Probablemente, el
enfoque mejor conocido es el patch clamp ("pinzamiento zonal"),
desarrollado originalmente por Neher, Sakmann y Steinback. (The
Extracellular Patch Clamp, A Method For Resolving Currents Through
Individual Open Channels In Biological Membranes, Pfluegers Arch.
375; 219-278, 1978). Otros métodos incluyen
registros ópticos de colorantes sensibles al voltaje (Cohen et
al., Annual Reviews of Neuroscience 1: 171-82,
1978) y registros extracelulares de acontecimientos rápidos
utilizando metales (Thomas et al., Exp. Cell Res. 74:
61-66, 1972) o electrodos de transistores de efecto
campo (FET) (Fromherz et al., Science 252:
1290-1293, 1991).
La técnica de patch clamp permite la medición
del flujo de iones a través de las proteínas del canal iónico y el
análisis del efecto de los fármacos sobre la función de los canales
iónicos. En resumen, en la técnica de patch clamp convencional, se
calienta y se tira de una fina pipeta de vidrio hasta que se rompe,
formando una abertura muy fina (< 1 \mum de diámetro) en la
punta. La pipeta se llena con una solución salina que se aproxima a
la composición iónica intracelular de la célula. Se inserta un
electrodo de metal en el extremo largo de la pipeta y se conecta a
componentes electrónicos asociados. La punta de la pipeta de la
técnica de patch clamp se presiona contra la superficie de la
membrana celular. La punta de la pipeta se sella herméticamente a la
célula y aísla algunas proteínas del canal iónico en un diminuto
parche de la membrana. La actividad de estos canales puede medirse
eléctricamente (registro de canal único) o, alternativamente, el
parche puede romperse permitiendo mediciones de la actividad
combinada del canal de la totalidad de la membrana celular (registro
de célula completa).
Tanto durante el registro de canal único como
durante el registro de la célula completa, puede resolverse
adicionalmente la actividad de los subtipos de canal individuales
imponiendo una fijación de voltaje ("voltage clamp") a través
de la membrana. Mediante el uso de un bucle de realimentación
("feedback loop"), la fijación de voltaje impone una diferencia
de potencial especificada por el usuario a través de la membrana,
permitiendo la medición de las dependencias del voltaje, de los
iones y del tiempo de varias corrientes de canales iónicos. Estos
métodos permiten la resolución de subtipos diferenciados de canales
iónicos.
Una limitación principal de la técnica de patch
clamp como método general en la selección farmacológica es su bajo
rendimiento. Normalmente, un único operario, altamente cualificado,
puede probar menos de diez compuestos por día utilizando la técnica
de patch clamp. Además, la técnica no es fácilmente abordable para
la automatización y produce resultados complejos que requieren un
amplio análisis por parte de electrofisiólogos expertos. En
comparación, el uso de sistemas de detección óptica proporciona un
rendimiento significativamente mayor para las aplicaciones de
selección (en la actualidad, hasta 100.000 compuestos por día),
mientras que al mismo tiempo proporciona análisis sumamente
sensibles de potencial transmembrana. Los métodos para la detección
óptica del potencial de membrana normalmente se basan en
translocación, redistribución, cambios de orientación, o
desplazamientos en los espectros de colorantes fluorescentes,
luminescentes, o de absorción en respuesta al potencial de la
membrana celular (véase generalmente González, et al., Drug
Discovery Today 4: 431-439, 1999).
Un método óptico preferido de análisis se ha
descrito anteriormente (González y Tsien, Chemistry and Biology 4:
269-277, 1997; González y Tsien, Biophysical Journal
69: 1272-1280, 1995; y patente de los EE.UU. número
5.661.035 concedida el 26 de agosto de 1997). Este enfoque comprende
normalmente dos reactivos que experimentan transferencia de energía
para proporcionar una lectura fluorescente radiométrica que depende
del potencial de membrana. La lectura radiométrica proporciona
importantes ventajas para la selección de fármacos, incluyendo la
mejora en la sensibilidad, la fiabilidad y la reducción de muchos
tipos de artefactos experimentales.
En comparación con el uso de una técnica de
patch clamp, los métodos ópticos de análisis no proporcionan
intrínsecamente la capacidad de regular, o fijar, el potencial
transmembrana de una célula. Los métodos de fijación
("clampling") son sumamente deseables porque proporcionan
métodos significativamente mejorados y más flexibles de medición de
los canales iónicos. Por tanto, existe una necesidad de métodos
fiables y específicos para regular los potenciales de membrana de
células vivas que sean compatibles con los métodos ópticos de
análisis y sean fácilmente abordables para análisis de alto
rendimiento.
El documento WO 96/41166 A2 y el artículo de J.
González et al. (1999) "Cell-based assays
and instrumentation for screening ion-channel
targets" en DDT 4 (9), págs. 431-439, describen
un método para identificar un compuesto que modula la actividad de
un canal iónico, que comprende, entre otras, las etapas siguientes:
exponer una o más células al compuesto; exponer repetidamente la una
o más células a uno o más campos eléctricos, de manera que realice
un cambio controlado en el potencial transmembrana de la una o más
células; y monitorizar, sin utilizar una técnica de patch clamp, los
cambios en el potencial transmembrana de la una o más células. Este
método puede utilizarse para caracterizar la actividad biológica de
uno o más de los compuestos identificados.
El objeto de la presente invención es mejorar el
rendimiento que puede lograrse con tales métodos. Un objeto
adicional de la presente invención es proporcionar un método para
someter a ensayo la actividad bioquímica de un compuesto contra un
canal iónico objetivo, un método para someter a ensayo la actividad
del canal iónico en al menos una célula, y un método para someter a
ensayo la actividad del canal iónico en un canal iónico objetivo
seleccionado.
Estos objetos se logran con los métodos según la
reivindicación 1, 14, 19 y 25, respectivamente. Se utilizan campos
eléctricos bifásicos pulsados que tienen una amplitud máxima
inferior a aproximadamente 90 V/cm, se aplican a una tasa de al
menos aproximadamente 1 por segundo, y que tienen una duración total
de al menos aproximadamente 1 milisegundo. Las realizaciones
ventajosas de la invención constituyen el contenido de las
reivindicaciones dependientes.
La figura 1 muestra una realización de una
matriz de electrodos de inmersión.
La figura 2 muestra varias realizaciones de
placas de múltiples pocillos que comprenden electrodos de
superficie.
La figura 3 muestra un diagrama de bloques de
una realización del sistema de estimulación eléctrica.
La figura 4 muestra los efectos simulados de
campos eléctricos externos repetitivos sobre una célula que expresa
un canal de sodio dependiente de voltaje. El panel superior indica
el campo eléctrico aplicado, el panel medio indica la corriente de
sodio simulada hacia la célula, y el panel inferior indica el
potencial transmembrana promedio simulado.
La figura 5 muestra una representación
esquemática de una onda cuadrada.
La figura 6 muestra ejemplos de diversos núcleos
de onda.
La figura 7 muestra perfiles de campo eléctrico
calculados para diversos montajes de electrodos en pocillos redondos
de 6,2 mm de diámetro. El círculo discontinuo es un intervalo de
visualización de 3 mm de diámetro. En las zonas blancas, la
intensidad del campo eléctrico es inferior al 10% de la intensidad
del campo eléctrico promedio en el intervalo de visualización. En
las zonas grises, la intensidad del campo eléctrico está dentro del
10% de la intensidad del campo eléctrico promedio en el intervalo de
visualización. En las zonas negras, la intensidad del campo
eléctrico es superior al 10% de la intensidad del campo eléctrico
promedio en el intervalo de visualización.
La figura 8 muestra perfiles de campo eléctrico
calculados para diversos montajes de electrodos en pocillos redondos
y cuadrados 6,2 mm a través. El círculo discontinuo es un intervalo
de visualización de 3 mm de diámetro. En las zonas blancas, la
intensidad del campo eléctrico es inferior al 1% de la intensidad
del campo eléctrico promedio en el intervalo de visualización. En
las zonas grises, la intensidad del campo eléctrico, está dentro del
1% de la intensidad del campo eléctrico promedio en el intervalo de
visualización. En las zonas negras, la intensidad del campo
eléctrico es superior al 1% de la intensidad del campo eléctrico
promedio en el intervalo de visualización.
La figura 9 muestra diversos diseños de
electrodo y aislante para mejorar la uniformidad del campo eléctrico
en los pocillos redondos.
La figura 10 muestra el efecto de los protocolos
de estimulación eléctrica en amplitudes de impulso variables durante
el transcurso de tiempo de la estimulación eléctrica en células CHO
de tipo natural.
La figura 11 muestra la relación entre la
respuesta celular máxima y la amplitud de impulso aplicada durante
la estimulación eléctrica para células CHO de tipo natural. Los
datos proceden de la figura 10 tomados tras aproximadamente 5
segundos.
La figura 12 muestra la curva de respuesta a la
dosis para el efecto de TTX en células CHO de tipo natural. Los
parámetros de la estimulación fueron 33 V/cm, 50 Hz durante 3
segundos con un núcleo de onda cuadrada bifásica (5 ms por fase). La
línea continua es una función de Hill ajustada para los datos con
CE_{50} = 9 nM y un coeficiente de Hill de 1,47.
La figura 13 muestra la relación entre la
duración del impulso y la frecuencia y la respuesta celular de
células CHO de tipo natural durante la estimulación eléctrica. La
intensidad del campo eléctrico fue siempre de 25 V/cm. El estímulo
fue una ráfaga de tres segundos de impulsos bifásicos de duración y
frecuencia variables. Las líneas continuas son ajustes para la forma
R = 1 + \frac{Af}{f + f_{0}}.
La figura 14 muestra perfiles de tiempo para
células CHO que expresan el canal de sodio NaV2, células
eléctricamente estimuladas a diversas intensidades de campo. Las
células se estimularon en una placa de 96 pocillos, con una serie de
impulsos de 5 mg/voltaje de fase, de 20 Hz y 3 segundos de duración.
La estimulación se produjo durante la parte sombreada del gráfico.
En este experimento, las células se tiñeron con
CC2-DMPE 20 \muM y DiSBAC_{6}(3) 63 nM.
Esta combinación de colorantes tiene una constante de tiempo de 2 ms
y rastrea con precisión el potencial transmembrana. Los tiempos de
aumento y disminución de la respuesta se ajustaron para las
funciones de disminución exponencial y se encontró que eran de
\tau_{aumento} = 200 ms y \tau_{disminución} = 850 ms.
La figura 15 muestra la relación entre la
intensidad del campo eléctrico y la respuesta celular medida tras 4
segundos (cuadrados) y 10 segundos (círculos) de estimulación
eléctrica. La línea es un ajuste de Boltzman para los datos.
La figura 16 muestra el efecto de la duración
del impulso y la frecuencia de estimulación sobre la respuesta
celular de las Células CHO que expresan el canal de sodio NaV2.
La figura 17 muestra el parámetro T_{0} de
tiempo de acodamiento a partir del ajuste de los datos en la figura
16 representado frente a la duración del estímulo.
La figura 18 muestra la respuesta temporal de
células HEK-293 que expresan el canal de sodio NaV3
durante la estimulación eléctrica.
La figura 19 muestra curvas dosis - respuesta
para tetrotodoxina (figura 19A) y tetracaína (figura 19B) para
células HEK-293 que expresan el canal de sodio NaV3.
Las condiciones de estimulación eléctrica fueron: E = 33 V/cm, 10
ms/fase de estimulación bifásica, ráfaga de 15 Hz durante 1,5
segundos.
La figura 20 muestra una curva de respuesta a la
dosis para tetracaína para células HEK-293 que
expresan el canal iónico NaV4. Para este experimento, los parámetros
de estimulación eléctrica fueron E = 33 V/cm, 10 ms/fase de
estimulación bifásica, ráfaga de 15 Hz durante 1,5 segundos.
La figura 21 muestra una vista de placa completa
de la estimulación eléctrica de células HEK-293 de
tipo natural. Cada panel individual representa el indicio de tiempo
de la razón de fluorescencia normalizada de un único pocillo en la
placa de 96 pocillos. Cada pocillo en una columna vertical se
estimuló simultáneamente con la misma intensidad de campo. La
intensidad de campo aumenta de izquierda a derecha. Las filas
6-8 contenían TEA 10 mM para bloquear los canales de
potasio dependientes de voltaje.
\newpage
La figura 22 muestra la respuesta celular como
una función del campo de estímulo para las células HEK de tipo
natural. Las barras de error son desviaciones estándar. Símbolos
abiertos: sin añadir bloqueantes. Símbolos rellenos: con TEA 10 mM
añadido para bloquear los canales de potasio.
La figura 23 muestra los indicios de respuesta
al tiempo para concentraciones seleccionadas de los bloqueantes del
canal de sodio, tetrodotoxina (TTX) (figura 23A) y tetracaína
(figura 23B) en células CHO que expresan el canal de sodio NaV2.
La figura 24 muestra las curvas dosis -
respuesta para la inhibición por parte de TTX y tetracaína del canal
de sodio NaV2.
La figura 25 muestra un experimento de adiciones
conocidas "aleatorias" de TTX. Cada pequeño recuadro en esta
matriz de 11 x 8 contiene el indicio de tiempo de diez segundos de
un pocillo en la posición correspondiente de placa de 96 pocillos.
La columna duodécima fue un pocillo control sin células utilizado
para la resta de fondo y no se muestra. Los pocillos (1,1), (2,2),
(3,3), etc., contenían una concentración bloqueante de TTX.
La figura 26 muestra un análisis de los datos de
las adiciones conocidas "aleatorias" de TTX mostrados en la
figura 25. Los puntos de datos son la respuesta radiométrica en el
intervalo de tiempo desde 1,8-2,4 segundos tras el
comienzo de la ráfaga de estímulos (es decir, en el pico de la
respuesta). Los puntos de círculos rellenos fueron adiciones
conocidas con TTX 1 \muM; los círculos abiertos no tenían
bloqueante añadido.
La figura 27 muestra una vista de placa completa
de células de músculo cardiaco HL5 estimuladas eléctricamente. Cada
panel individual representa el indicio de tiempo de la razón de
fluorescencia normalizada de un único pocillo en la placa de 96
pocillos. Cada pocillo en una columna vertical se estimuló
simultáneamente con la misma intensidad de campo. La intensidad de
campo aumenta de izquierda a derecha. Las filas 5 y 6 contenían TTX
10 \muM para bloquear parcialmente los canales de sodio
dependientes de voltaje. Las filas 7 y 8 contenían TEA 10 mM para
bloquear parcialmente los canales de potasio dependientes de
voltaje.
La figura 28 muestra la respuesta de células HL5
como una función de la intensidad del campo eléctrico aplicado. Los
puntos negros son el promedio de la respuesta de cuatro pocillos sin
compuestos añadidos. La línea continua es un ajuste de Boltzman para
los datos con E_{50} = 22 V/cm. Los puntos constituyen el
intervalo de selección: la diferencia entre la respuesta y la
respuesta no estimulada normalizada para la desviación estándar de
la respuesta (véase el apéndice A3).
Figura 29. Respuesta típica al voltaje para
células CHO que expresan un canal de potasio y el canal de sodio
NaV3 tras tres ciclos de estimulación separados utilizando
electrodos de superficie.
La figura 30 muestra la respuesta radiométrica
promedio de una población de células que se hace crecer en una placa
de múltiples pocillos de 96 pocillos estimulada con estímulos
monofásicos de intensidades de campo variables a través de
electrodos de superficie. Los puntos en esta curva constituyen la
respuesta pico promedio de 4 estimulaciones en el mismo cultivo.
La figura 31 muestra la respuesta celular como
una función del campo de estímulo para las células RBL de tipo
natural. Las barras de error son desviaciones estándar. Símbolos
abiertos: sin añadir bloqueantes. Símbolos rellenos: con TEA 400
\muM añadido para bloquear los canales IRK1.
Generalmente, la nomenclatura utilizada en el
presente documento y muchos de los procedimientos de fluorescencia,
informática, detección, química y laboratorio descritos a
continuación son bien conocidos y se emplean comúnmente en la
técnica. Las técnicas convencionales se utilizan normalmente para
síntesis química, fluorescencia, óptica, biología molecular,
software informático e integración. Generalmente, las reacciones
químicas, ensayos celulares y reacciones enzimáticas se realizan
según las especificaciones del fabricante cuando sea apropiado.
Estas técnicas y procedimientos generalmente se realizan según
métodos convencionales en la técnica y diversa bibliografía general,
incluyendo la enumerada a continuación.
Lakowicz, J.R. Topics in Fluorescence
Spectroscopy, (3 volúmenes) Nueva York: Plenum Press (1991), y
Lakowicz, J. R. Emerging applications of fluorescence
spectroscopy to cellular imaging: lifetime imaging,
metal-ligand probes, multi-photon
excitation and light quenching. Scanning Microsc Supl. Vol. 10
(1996) páginas 213-24, para las técnicas de
fluorescencia.
Sambrook et al. Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, 2ª ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, N.Y., para los métodos de biología
molecular.
Cells: A Laboratory Manual, 1ª edición
(1998) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
N.Y., para los métodos de biología celular.
\newpage
Optics Guide 5 Melles Griot® Irvine CA,
Optical Waveguide Theory, Snyder & Love publicado por
Chapman & Hall para métodos ópticos generales.
Hille, B. Ionic Channels of Excitable
Membranes, Segunda Edición (1992) Sinauer Associates, Inc.,
Sunderland, Mass. para métodos electrofisiológicos generales y
propiedades de los canales iónicos.
Horowitz y Hill, The Art of Electronics,
Segunda Edición (1989) Cambridge University Press, Cambridge, R.U.
para circuitos electrónicos.
Las siguientes definiciones se explican para
ilustrar y definir el significado y el alcance de los diversos
términos utilizados para describir la invención en el presente
documento.
El término activación se refiere a la transición
desde un estado de reposo (no conductor) de un canal iónico hasta el
estado activado (conductor).
El término umbral de activación se refiere al
menor potencial, por encima del cual se produce la apertura medible
de un canal.
El término ánodo se refiere a un electrodo
cuando se excita a un potencial positivo con respecto a tierra
mediante una fuente externa.
El término zona de estimulación celular
significa la zona definida por dos electrodos que experimenta
estimulación eléctrica significativa (normalmente 5 V/cm o superior)
en la que se localizan las células de interés. Normalmente, la zona
de estimulación celular es mayor que, o igual a, la zona de
observación. Para las mediciones basadas en 96 pocillos
convencionales, la zona de estimulación celular normalmente es de
aproximadamente 16 mm^{2}.
El término zona de observación significa la
parte del sistema sobre el que se toma una medición. La zona de
observación normalmente está en un área de al menos 0,5 mm^{2}
para mediciones basadas en placas de múltiples pocillos.
El término proteína bioluminiscente se refiere a
una proteína que puede producir la emisión de luz a través de la
catálisis de una reacción química. El término incluye proteínas que
catalizan reacciones bioluminiscentes o quimioluminiscentes, tales
como las que producen la oxidación de luciferinas. El término
proteína bioluminiscente incluye, no sólo proteínas bioluminiscentes
que se producen en la naturaleza, sino también mutantes que muestran
propiedades físicas o espectrales alteradas.
El término bifásico se refiere a un impulso con
dos partes, cada una con una polaridad opuesta.
El término función de Boltzman se refiere a la
función de respuesta sigmoidal (es decir, similar a un escalón)
\vskip1.000000\baselineskip
y(x) =
y_{0} + \frac{A}{1 + exp \left( \frac{x - x_{50}}{\Delta
x}\right)}
En la que:
y es la variable independiente
y_{0} es un parámetro ajustable igual al
límite de la función cuando x \rightarrow \infty
A es un parámetro ajustable igual al tamaño del
escalón
x_{50} es un parámetro ajustable relacionado
con el punto medio del escalón
\Deltax es un parámetro ajustable que describe
la anchura del escalón.
El término cátodo se refiere a un electrodo
cuando se excita a un potencial negativo con respecto a tierra
mediante una fuente externa.
El término despolarizar significa hacer que el
potencial transmembrana de una célula se haga más próximo a cero. En
el caso de las células que normalmente están en potenciales de
reposo negativos, este término significa que el potencial
transmembrana cambia en una dirección positiva.
El término concentración efectiva (50%) o
CE_{50} se refiere a la concentración a la que un compuesto
farmacológico tiene la mitad de la efectividad, en comparación con
la efectividad máxima a altas concentraciones del compuesto.
\newpage
El término eléctricamente excitable se refiere a
una célula o tejido que responde a un estímulo eléctrico superior al
umbral mediante la generación de un potencial de acción. Las células
eléctricamente excitables contienen al menos un canal iónico
dependiente de voltaje tipo que genera una corriente hacia el
interior y al menos un canal iónico tipo que genera una corriente
hacia el exterior.
El término estimulación eléctrica significa
iniciar un cambio de voltaje en las células utilizando un impulso de
corriente extracelular.
El término electrodo significa una superficie de
contacto conductora controlable entre un instrumento y un sistema de
prueba.
El término electropermeabilización se refiere a
la electroporación leve, en la que los poros hidratados creados a
través de la membrana sólo son lo suficientemente grandes como para
que pasen moléculas de agua e iones de átomo individual
pequeños.
El término electroporación se refiere a un
fenómeno en el que la aplicación de un gran potencial eléctrico a
través de la membrana de una célula da como resultado la ruptura
dieléctrica de la membrana, y la creación de trayectorias hidratadas
a través de la membrana.
El término componente fluorescente se refiere a
un componente que puede absorber luz y después volver a emitir al
menos cierta fracción de esa energía como luz a lo largo del tiempo.
El término incluye compuestos, moléculas, proteínas naturalmente
fluorescentes y complejos macromoleculares diferenciados o mezclas
de compuestos o moléculas fluorescentes y no fluorescentes. El
término componente fluorescente también incluye componentes que
muestran una disminución de la fluorescencia de larga duración,
tales como los iones lantánido y los complejos de lantánido con
sensibilizadores de ligandos orgánicos, que absorben luz y después
vuelven a emitir la energía durante milisegundos.
El término FRET se refiere a la transferencia de
energía por resonancia de fluorescencia. Para los fines de esta
invención, FRET incluye procesos de transferencia de energía que se
producen entre dos componentes fluorescentes, un componente
fluorescente y un componente no fluorescente, un componente
luminiscente y un componente fluorescente y un componente
luminiscente con un componente no fluorescente.
El término deficiencia genética tal como se
utiliza en el presente documento, se refiere a la alteración
seleccionada como objetivo de un gen in vivo con pérdida
completa de la función que se ha logrado mediante cualquier
tecnología transgénica familiar para los expertos en la técnica. En
una realización, animales transgénicos que tienen deficiencias
genéticas son aquellos en los que el gen objetivo se ha convertido
en no funcional mediante una inserción seleccionada como objetivo en
el gen para convertirse en no funcional mediante recombinación
homóloga.
El término función de Hill se refiere a la
función de respuesta sigmoidal (es decir, similar a un escalón)
y(x) =
y_{0} + \frac{A}{x''_{0} +
x''}
en la
que:
y es la variable independiente
y_{0} es un parámetro ajustable igual al
límite de la función cuando x \rightarrow \infty
A es un parámetro ajustable igual al tamaño del
escalón
x_{0} es un parámetro ajustable relacionado
con el punto medio del escalón
n es un parámetro ajustable que describe la
pendiente del escalón.
El término coeficiente de Hill se refiere al
parámetro n en la función de Hill.
El término éxito se refiere a un compuesto de
prueba que muestra las propiedades deseadas en un ensayo.
El término homólogo se refiere a dos secuencias
o partes de las mismas, que son idénticas en más del o en igual al
75% cuando se alinean óptimamente utilizando el programa ALIGN. La
homología o identidad de secuencia se refiere a lo siguiente. Dos
secuencias de aminoácidos son homólogas si hay una identidad parcial
o completa entre sus secuencias. Por ejemplo, un 85% de homología
significa que el 85% de los aminoácidos son idénticos cuando las dos
secuencias se alinean para determinar el emparejamiento máximo. Se
permiten huecos (en cualquiera de las dos secuencias que se están
emparejando) en la maximización del emparejamiento; se prefieren
longitudes de los huecos de 5, siendo más preferido 2 o menos.
Alternativa y preferiblemente, dos secuencias de proteínas (o
secuencias de polipéptidos derivadas de ellas de al menos 30
aminoácidos de longitud) son homólogas, tal como se utiliza este
término en el presente documento, si tienen una puntuación de
alineación de más de 5 (en unidades de desviación estándar)
utilizando el programa ALIGN con la matriz de fecha de mutación y
una penalización de hueco de 6 o superior. Véase Dayhoff, M.O., en
Atlas of Protein Sequence and Structure, 1972, volumen 5,
National Biomedical Research Foundation, págs.
101-110, y Suplemento 2 a este volumen, págs.
1-10.
El término hiperpolarizar significa hacer que el
potencial transmembrana de una célula se aleje adicionalmente de
cero. En el caso de células que normalmente tienen potenciales de
reposo negativos, este término significa que los cambios del
potencial transmembrana van en una dirección negativa.
El término inactivación significa que un canal
iónico se mueve hacia el estado inactivado.
El término inactivado se refiere a un canal
iónico dependiente de voltaje en un estado conformacional no
conductor particular. Las transiciones hacia y desde el estado
inactivado generalmente son lentas con respecto a las transiciones
entre otros estados conformacionales. El estado inactivado
normalmente es el estado preferido a potenciales transmembrana
elevados. A potenciales transmembrana bajos, el estado inactivado es
inestable y se relaja hacia el estado de reposo.
El término núcleo significa una función
matemática pensada para entrelazarse con una o más de otras
funciones que varían con el tiempo. En teoría, el núcleo puede ser
cualquier función que tienda a cero cuando la variable independiente
tiende a \pm \infty. En la práctica, el núcleo puede ser
cualquier forma de onda que puede programarse en un generador de
función de onda arbitraria, o que puede generarse mediante un
convertidor de digital en analógico (D/A) controlado por
ordenador.
El término componente luminiscente se refiere a
un componente que puede absorber energía, tal como energía eléctrica
(por ejemplo, electro-luminiscencia), química (por
ejemplo, quimioluminiscencia) o acústica, y después emitir al menos
cierta fracción de esa energía como luz a lo largo del tiempo. El
término componente incluye compuestos, moléculas, proteínas
bioluminiscentes y complejos macromoleculares diferenciados o
mezclas de compuestos o moléculas luminiscentes y no luminiscentes
que actúan para producir la emisión de luz.
El modulador del potencial transmembrana se
refiere a componentes que pueden alterar el potencial transmembrana
de reposo o estimulado de un compartimento celular o subcelular. El
término incluye compuestos, canales iónicos, receptores, proteínas
de formación de poros diferenciados, o cualquier combinación de
estos componentes.
El término constante de tiempo de membrana o
\tau_{M} significa el producto de la resistencia (R_{M}) y la
capacitancia (C_{M}) de la membrana.
El término monofásico se refiere a un impulso
cuya polaridad no cambia a la polaridad opuesta.
El término proteína naturalmente fluorescente se
refiere a una proteína que puede formar un cromóforo intrínseco,
altamente fluorescente, o bien a través de la ciclación y la
oxidación de los aminoácidos internos dentro de la proteína o
mediante la adición enzimática de un cofactor fluorescente. El
término incluye proteínas fluorescentes de tipo natural y mutantes
obtenidos mediante ingeniería genética que muestran propiedades
físicas o espectrales alteradas. El término no incluye proteínas que
muestran fluorescencia débil en virtud de únicamente la contribución
de la fluorescencia de grupos de tirosina, triptófano, histidina y
fenilalanina no modificados dentro de la proteína.
El término que se produce en la naturaleza se
refiere a un componente producido por las células en ausencia de
modificaciones genéticas artificiales u otras de estas células.
El término placa de múltiples pocillos se
refiere a una matriz bidimensional de pocillos direccionables
situados sobre una superficie sustancialmente plana. Las placas de
múltiples pocillos pueden comprender cualquier número de pocillos
direccionables diferenciados y comprenden pocillos direccionables de
cualquier anchura o profundidad. Ejemplos comunes de placas de
múltiples pocillos incluyen las placas de 96 pocillos, las placas de
384 pocillos y las Nanoplates™ de 3456 pocillos.
El término operablemente unido se refiere a una
yuxtaposición en la que los componentes así descritos están en una
relación que les permite funcionar en su manera deseada. Una
secuencia control operablemente unida a una secuencia codificante se
une de tal manera que la expresión de la secuencia codificante se
logra en condiciones compatibles con las secuencias control.
El término célula polarizada significa una
célula con una diferencia de potencial eléctrico a través de su
membrana celular.
El término rectificación significa que la
conductancia es no lineal, con una dirección preferida.
El término liberación de la inactivación se
refiere a la conversión de un canal cerrado inactivado, en un canal
cerrado en reposo que ahora puede abrirse.
El término repetitivo significa repetir al menos
dos veces.
El término repolarizar significa hacer que el
potencial transmembrana de una célula se aproxime a su potencial en
reposo.
El término en reposo o estado de reposo se
refiere a un canal iónico dependiente de voltaje que está cerrado,
pero libre de inactivación.
El término potencial en reposo para una célula
significa el potencial transmembrana en equilibrio de una célula
cuando no se somete a influencias externas.
El término potencial de inversión para un ion
particular se refiere al potencial transmembrana para el que los
flujos hacia el interior y hacia el exterior de ese ion son
iguales.
El término sustancialmente paralelo significa
que la distancia entre las superficies de dos objetos que dan la una
hacia la otra varía en menos del 10%, preferiblemente en menos del
5%, cuando se mide en cada punto sobre la superficie relevante de
cada objeto.
El término que puede seleccionarse como objetivo
se refiere a un componente que puede situarse en una ubicación
específica en determinadas condiciones. Por ejemplo, una proteína
que puede existir en dos o más ubicaciones que puede translocarse a
un sitio definido en determinada(s) condición(es)
puede seleccionarse como objetivo para ese sitio. Ejemplos comunes
incluyen la translocación de la proteína cinasa C a la membrana
plasmática con la activación celular y la unión de proteínas que
contienen el dominio SH2 a residuos de tirosina fosforilada. El
término incluye componentes que están asociados continuadamente con
un sitio o ubicación específico, en la mayor parte de las
condiciones.
El término potencial de electroporación de
umbral se refiere a la intensidad de campo aplicada externamente por
encima de la cual se produce la electroporación de una célula
viva.
El término compuesto de prueba se refiere a un
compuesto químico que va a probarse mediante uno o más méto
do(s) de selección de la invención como un posible modulador. Un compuesto de prueba puede ser cualquier compuesto químico, tal como un compuesto químico inorgánico, un compuesto químico orgánico, una proteína, un péptido, un hidrato de carbono, un lípido, o una combinación de los mismos. Normalmente, se utilizan varias concentraciones predeterminadas de compuestos de prueba para la selección, tales como 0,01 micromolar, 1 micromolar y 10 micromolar. Los controles del compuesto de prueba pueden incluir la medición de una señal en ausencia del compuesto de prueba o la comparación con un compuesto que se sabe que modula el objetivo.
do(s) de selección de la invención como un posible modulador. Un compuesto de prueba puede ser cualquier compuesto químico, tal como un compuesto químico inorgánico, un compuesto químico orgánico, una proteína, un péptido, un hidrato de carbono, un lípido, o una combinación de los mismos. Normalmente, se utilizan varias concentraciones predeterminadas de compuestos de prueba para la selección, tales como 0,01 micromolar, 1 micromolar y 10 micromolar. Los controles del compuesto de prueba pueden incluir la medición de una señal en ausencia del compuesto de prueba o la comparación con un compuesto que se sabe que modula el objetivo.
El término transformada se refiere a una célula
en la que (o en una antecesora de la cual) se ha introducido,
mediante técnicas de ácido nucleico recombinante, una molécula de
ácido nucleico heterólogo.
El término transgénico se utiliza para describir
un organismo que incluye material genético exógeno dentro de todas
sus células. El término incluye cualquier organismo cuyo genoma se
ha alterado mediante la manipulación in vitro del embrión
temprano o el óvulo fertilizado o mediante cualquier tecnología
transgénica para inducir una deficiencia genética específica.
El término transgén se refiere a cualquier trozo
de ADN que se inserta mediante artificio en una célula, y que llega
a formar parte del genoma del organismo (es decir, o bien integrado
establemente o como un elemento extracromosómico estable) que se
desarrolla a partir de esa célula. Un transgén de este tipo puede
incluir un gen que es parcial o completamente heterólogo (es decir,
extraño) para el organismo transgénico, o puede representar un gen
homólogo a un gen endógeno del organismo. Dentro de esta definición
se incluye un transgén creado al proporcionar una secuencia de ARN
que se transcribe en ADN y después se incorpora en el genoma. Los
transgenes de la invención incluyen secuencias de ADN que codifican
para la proteína fluorescente o bioluminiscente que puede expresarse
en un animal transgénico no humano.
El término lógica
transistor-transistor o TTL se refiere a un sistema
lógico electrónico en el que un voltaje de aproximadamente +5 V es
VERDADERO y un voltaje de aproximadamente 0 V es FALSO.
Un campo eléctrico uniforme significa que el
campo eléctrico varía en no más del 15% de la intensidad media
dentro de la zona de observación en cualquier momento.
El término sensor de voltaje incluye sensores de
voltaje basados en FRET, colorantes para el potencial transmembrana
electrocrómicos, colorantes para el potencial transmembrana de
redistribución, electrodos extracelulares, transistores de efecto
campo, iones radiactivos, colorantes fluorescentes o luminiscentes
sensibles a iones, y proteínas fluorescentes o luminiscentes
sensibles a iones, que pueden proporcionar una indicación del
potencial transmembrana.
Los siguientes términos se utilizan para
describir las relaciones de secuencia entre dos o más
polinucleótidos: secuencia de referencia, intervalo de comparación,
identidad de secuencia, porcentaje idéntico a una secuencia e
identidad sustancial. Una secuencia de referencia es una secuencia
definida utilizada como base para una secuencia de comparación; una
secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia
mayor, por ejemplo, como un segmento de una secuencia genómica o
ADNc de longitud completa, o puede comprender una secuencia genómica
o ADNc completo. Generalmente, una secuencia de referencia es de al
menos 20 nucleótidos de longitud, frecuentemente de al menos 25
nucleótidos de longitud, y a menudo de al menos 50 nucleótidos de
longitud. Dado que los polinucleótidos pueden cada uno (1)
comprender una secuencia (es decir, una parte de la secuencia
completa de polinucleótidos) que es similar entre los dos
polinucleótidos, y (2) pueden comprender adicionalmente una
secuencia que es divergente entre los dos polinucleótidos, las
comparaciones de secuencias entre dos (o más) polinucleótidos
normalmente se llevan a cabo comparando las secuencias de los dos
polinucleótidos sobre un intervalo de comparación para identificar y
comparar regiones locales de similitud de secuencia. Un intervalo de
comparación, tal como se utiliza en el presente documento, se
refiere a un segmento conceptual de al menos 20 posiciones de
nucleótidos contiguos en el que una secuencia de polinucleótido
puede compararse con una secuencia de referencia de al menos 20
nucleótidos continuos y en el que la parte de la secuencia de
polinucleótidos en el intervalo de comparación puede comprender
adiciones o deleciones (es decir, huecos) del 20 por ciento o menos,
en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende
adiciones ni deleciones) para la alineación óptima de las dos
secuencias. La alineación óptima de las secuencias para alinear un
intervalo de comparación puede llevarse a cabo mediante el algoritmo
de homología local de Smith y Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:
482, mediante el algoritmo de alineación por homología de Needleman
y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443, mediante la búsqueda por el
método de similitud de Pearson y Lipman (1988) Proc. Natl. Acad.
Sci. (EE.UU.) 85: 2444, mediante las implementaciones por ordenador
de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el paquete de
software de Wisconsin Genetics Release 7.0, Genetics Computer Group,
575 Science Dr., Madison, WI), o mediante inspección, y se
selecciona la mejor alineación (es decir, la que da como resultado
el mayor porcentaje de homología sobre el intervalo de comparación)
generada por los diversos métodos. El término identidad de secuencia
significa que dos secuencias de polinucleótidos son idénticas (es
decir, partiendo de la base de nucleótido por nucleótido) sobre el
intervalo de comparación. El término porcentaje idéntico a una
secuencia se calcula comparando dos secuencias óptimamente alineadas
sobre el intervalo de comparación, determinando el número de
posiciones en las que se produce la base idéntica de ácido nucleico
(por ejemplo, A, T, C, G, U, o I) en ambas secuencias para dar el
número de posiciones apareadas, dividiendo el número de posiciones
apareadas entre el número total de posiciones en el intervalo de
comparación (es decir, el tamaño del intervalo) y multiplicando el
resultado por 100 para dar el porcentaje de identidad de secuencia.
El término identidad sustancial tal como se utiliza en el presente
documento indica una característica de una secuencia de
polinucleótido, en la que el polinucleótido comprende una secuencia
que tiene al menos el 30 por ciento de identidad de secuencia,
preferiblemente al menos del 50 al 60 por ciento de identidad de
secuencia, más normalmente al menos el 60 por ciento de identidad de
secuencia en comparación con una secuencia de referencia sobre un
intervalo de comparación de al menos 20 posiciones de nucleótidos,
frecuentemente sobre un intervalo de al menos 25-50
nucleótidos, en la que el porcentaje de identidad de secuencia se
calcula comparando la secuencia de referencia con la secuencia del
polinucleótido que puede incluir deleciones o adiciones que
totalizan el 20 por ciento o menos de la secuencia de referencia
sobre el intervalo de comparación.
Dado que se aplica a polipéptidos, el término
identidad sustancial significa que dos secuencias peptídicas, cuando
se alinean óptimamente, tal como mediante los programas GAP o
BESTFIT utilizando pesos de hueco por defecto, comparten al menos el
30 por ciento de identidad de secuencia, preferiblemente al menos el
40 por ciento de identidad de secuencia, más preferiblemente al
menos el 50 por ciento de identidad de secuencia, y lo más
preferiblemente al menos el 60 por ciento de identidad de secuencia.
Preferiblemente, las posiciones de residuos que no son idénticas
difieren en sustituciones de aminoácidos conservativas. Las
sustituciones de aminoácidos conservativas se refieren a la
intercambiabilidad de residuos que tienen cadenas laterales
similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tiene cadenas
laterales alifáticas es glicina, alanina, valina, leucina e
isoleucina; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales
alifáticas - hidroxilo es serina y treonina; un grupo de aminoácidos
que tiene cadenas laterales que contienen amida es asparagina y
glutamina; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales
aromáticas es fenilalanina, tirosina y triptófano; un grupo de
aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas es lisina, arginina
e histidina; y un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales
que contienen azufre es cisteína y metionina. Grupos preferidos de
sustitución de aminoácidos conservativa son:
valina-leucina-isoleucina,
fenilalanina-tirosina,
lisina-arginina, alanina-valina,
ácido glutámico-aspártico, y
asparagina-glutamina.
Dado que no puede englobarse toda la lista de
términos técnicos y científicos, se interpretará que cualquier
término no definido tiene el mismo significado que el que comprende
comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece esta
invención. Además, las formas singulares un, una, y el, la,
incluyen los referentes plurales, a menos que el contexto indique
claramente otra cosa. Por ejemplo, la referencia a una enzima de
restricción o una enzima de alta fidelidad puede incluir mezclas de
tales enzimas y cualquier otra enzima que se ajuste a los criterios
establecidos, o la referencia al método incluye referencia a uno o
más métodos para obtener secuencias de ADNc que conocerán los
expertos en la técnica o que llegarán a conocer con la lectura de
esta memoria descriptiva.
La presente invención reconoce por primera vez
que los potenciales transmembrana de células vivas intactas que
comprenden al menos un canal iónico regulado por voltaje, pueden
modularse con precisión mediante la aplicación de impulsos de
estimulación eléctrica repetitivos al fluido que baña las células.
La presente invención incluye instrumentos y métodos que
proporcionan modulación exacta y fidedigna de los potenciales
transmembrana de células vivas intactas sin perturbar
significativamente su integridad celular nativa.
Como introducción no limitativa a la amplitud de
la invención, la invención incluye varios aspectos generales y
útiles, incluyendo:
- 1)
- Instrumentos que incluyen electrodos, y matrices de electrodos para generar de manera fidedigna campos eléctricos uniformes en cultivos de células vivas en disolución acuosa.
- 2)
- Placas de múltiples pocillos que comprenden electrodos de superficie para alto rendimiento y estimulación miniaturizada y análisis de las actividades celulares y de los canales iónicos.
- 3)
- Sistemas para análisis de alto rendimiento de las actividades celulares y de los canales iónicos y para su uso en el descubrimiento, análisis, selección y obtención del perfil del fármaco.
- 4)
- Métodos para modular el potencial transmembrana de una célula viva mediante el uso de estimulación eléctrica repetitiva.
- 5)
- Métodos para seleccionar los efectos de los compuestos de prueba sobre las actividades de voltaje reguladas y los canales iónicos regulados sin voltaje, los transportadores y las corrientes de fuga. Incluyendo determinar la actividad farmacológica dependiente del estado de los compuestos contra el canal iónico y las proteínas transportadoras.
- 6)
- Métodos para obtener el perfil y seleccionar células o clones basándose en su respuesta a la estimulación eléctrica.
- 7)
- Métodos para la determinación cuantitativa de parámetros celulares y de canal iónico de una manera en alto rendimiento, y para la cuantificación de los efectos farmacológicos de los compuestos sobre esos parámetros.
- 8)
- Métodos para la introducción de compuestos exógenos en los espacios intracelulares de las células.
- 9)
- Métodos para modular el potencial transmembrana de los orgánulos intracelulares y para seleccionar compuestos de prueba contra los canales iónicos en estos orgánulos.
- 10)
- Métodos para caracterizar el efecto fisiológico del potencial transmembrana sobre la función y la regulación de las respuestas fisiológicas y bioquímicas, incluyendo la expresión génica, la función enzimática, la actividad proteica y la unión de ligandos.
- 11)
- Métodos para programar o formar redes neuronales adaptativas o bio-ordenadores para respuestas funcionales o lógicas específicas.
- 12)
- Métodos para proporcionar interfaces neuronales eficaces para dispositivos protésicos implantados en un animal, incluyendo un ser humano.
Estos aspectos de la invención y otros descritos
en el presente documento, pueden lograrse mediante el uso de los
métodos y los instrumentos descritos en el presente documento. Para
obtener una apreciación total del alcance de la invención, se
reconocerá además que pueden combinarse varios aspectos de la
invención para obtener las realizaciones deseables de la invención.
Tales combinaciones dan como resultado las realizaciones
particularmente útiles y sólidas de la invención.
En una realización, la presente invención
incluye electrodos y matrices de electrodos, para crear campos
eléctricos a través de la zona de observación. Normalmente, esto se
logra mediante el uso de un par de electrodos eléctricamente
conductores. Una importante característica de diseño es que los
pares de electrodos crean campos eléctricos bien definidos. Diseños
de electrodos preferidos incluyen configuraciones de electrodo que
maximizan la homogeneidad del campo eléctrico experimentada por las
células en observación.
Generar campos eléctricos uniformes sobre la
zona de observación es importante para la estimulación eléctrica por
varios motivos. En primer lugar, dado que la respuesta celular es
sensible a la magnitud del campo eléctrico local, los campos
eléctricos no uniformes normalmente producen respuestas no uniformes
en diferentes zonas, lo que conduce a un aumento de la dispersión en
los resultados. En segundo lugar, el umbral para la
electropermeabilización normalmente sólo es un factor de
2-5 mayor que los potenciales transmembrana
requeridos para la estimulación eléctrica de la membrana (véase
Teissie y Rols, 1993, Biophys. J. 65: 409-413). Por
tanto, si el campo eléctrico es demasiado no uniforme, puede que no
sea posible estimular todas las células en la zona de observación
sin electropermeabilizar también algunas de ellas.
La uniformidad del campo sobre una zona fijada
puede describirse de dos formas: (1) la desviación estándar de la
magnitud del campo dividida por la magnitud del campo promedio en la
zona, y (2) la diferencia entre las magnitudes de campo mayor e
inferior, normalizada para la magnitud de campo promedio en la
zona.
La forma más simple de generar un campo
eléctrico uniforme en un medio conductor es utilizar dos electrodos
planos idénticos con superficies que están alineadas de manera
sustancialmente paralela entre sí. Generalmente, cuanto más próximos
están los electrodos entre sí con respecto a su anchura en la
dirección transversal, mayor será la uniformidad del campo. Sin
embargo, los típicos pocillos redondos de la placa de múltiples
pocillos limitan la anchura de los electrodos que pueden insertarse
en los pocillos y también introducen otros efectos que reducen la
uniformidad del campo.
La redondez de los pocillos supone un reto a la
hora de crear un campo uniforme señalando en una dirección con dos
electrodos que la anchura de la solución salina conductora entre los
electrodos está cambiando constantemente. Adicionalmente, la alta
tensión superficial del agua genera variaciones en la altura de la
solución salina a través del pocillo cuando se insertan electrodos
más profundos. La superficie curvada, o menisco, puede alterar el
campo eléctrico en la totalidad del volumen del pocillo. La
profundidad de 100 \muL de solución salina en una placa de 96
pocillos normalmente es de aproximadamente 3,0 mm de profundidad en
el centro y de aproximadamente 2,9 mm de profundidad en los bordes
del pocillo. Cuando se insertan dos electrodos de placas paralelas
de acero inoxidable, la solución salina se acerca entre los
electrodos y las paredes del pocillo, produciendo variaciones de
profundidad sobre la zona de observación, lo que sugiere que las
trayectorias de corriente en la totalidad del volumen de la solución
salina se curvan alrededor del centro, generando una no uniformidad
del campo eléctrico.
En un aspecto, la presente invención incluye
diseños de electrodo mejorados y sistemas para la estimulación
eléctrica que dirigen estos puntos para crear campos eléctricos
sustancialmente uniformes sobre la zona de obser-
vación.
vación.
En una realización, (figura 9A) el par de
electrodos comprende dos electrodos sustancialmente paralelos que
comprenden un aislante eléctrico que se une al par de electrodos
para limitar el flujo de corriente a una región definida creando así
un campo eléctrico altamente uniforme.
En otra realización, (figura 9B) el par de
electrodos comprende adicionalmente electrodos satélite para crear
un campo eléctrico más uniforme.
En otra realización, (figura 9D) el par de
electrodos se subdivide en varias piezas separadas mediante finos
divisores aislantes. En este caso, el potencial aplicado a cada
electrodo, expresado como una fracción del potencial aplicado a la
pieza más central, puede sintonizarse individualmente para maximizar
la uniformidad de campo en la zona de observación.
En otro aspecto, la presente invención incluye
diseños de electrodo mejorados (figura 9C) que muestran uniformidad
de campo mejorada sobre la zona de observación mediante la
eliminación o reducción del efecto de menisco.
En otro aspecto, pueden fabricarse múltiples
sensores de potencial eléctrico en la superficie o las paredes de
los pacillos en una placa de múltiples pocillos, o unirse en
matrices al montaje de electrodo de inmersión. Estos sensores pueden
monitorizarse para ajustar manual o automáticamente los electrodos
individuales, de manera que se maximice la uniformidad del campo.
Esta disposición será útil para permitir una estimulación de la
matriz de electrodos para compensar las variaciones e imperfecciones
en la forma del pocillo, el volumen de solución salina, las
variaciones en el proceso de fabricación para los electrodos, el
daño al montaje de electrodos, etc.
Para los electrodos de inmersión, la situación
ideal (en lo que se refiere a la creación de un campo eléctrico
uniforme) sería tener los fondos de los electrodos tocando el fondo
del pocillo. De esta forma, no habrá campos marginales o no
uniformidad de campo asociados con trayectorias de corriente
verticales. Sin embargo, para una estructura desmontable, no es
deseable requerir que los electrodos hagan contacto con la
superficie. Pequeñas desviaciones en la geometría de la placa pueden
hacer que algunos electrodos se presionen hacia la superficie,
produciendo daño a la placa, las células, o los electrodos.
Adicionalmente, en algunos pocillos, los electrodos pueden no
extenderse en toda la trayectoria hasta la superficie. Por estos
motivos, puede ser deseable diseñar un hueco pequeño entre el fondo
del electrodo y el fondo del pocillo.
En consecuencia, en un aspecto, la presente
invención incluye placas de múltiples pocillos en los que la zona de
observación en el medio del pocillo está elevada con respecto a una
zona alrededor de la circunferencia del pocillo, en la que se
colocarían los electrodos.
Los campos marginales producirán la no
uniformidad sobre una distancia entre electrodos aproximadamente
igual al hueco entre el fondo del electrodo y el fondo del pocillo.
Por tanto, este hueco debe mantenerse tan pequeño como sea práctico,
preferiblemente en el intervalo de 0,1 a 0,5 mm y la zona de
observación normalmente no debe incluir ninguna parte del pocillo
dentro de esta distancia desde los electrodos.
Puede utilizarse cualquier material
eléctricamente conductor como un electrodo. Los materiales de
electrodo preferidos tienen muchas de las siguientes propiedades,
(1) no se corroen en solución salina, (2) no producen ni liberan
iones tóxicos, (3) son flexibles y resistentes, (4) son
relativamente baratos de fabricar, (5) son no porosos, y (6) se
limpian fácilmente. Los materiales preferidos incluyen metales
nobles (incluyendo, oro, platino y paladio), metales refractarios
(incluyendo titanio, tungsteno, molibdeno e iridio), aleaciones
resistentes a la corrosión (incluyendo acero inoxidable) y carbono u
otros conductores orgánicos (incluyendo grafito y polipirrol). Para
muchas realizaciones, el acero inoxidable proporciona un material de
electrodo preferido. Este material es barato, fácil de trabajar y
muy inerte en solución salina. El acero inoxidable se oxida
lentamente para producir óxido de hierro cuando pasa corriente en la
solución salina, pero esto no parece afectar al rendimiento del
sistema. El óxido de hierro tiene una solubilidad muy baja en agua y
no parecen liberarse niveles tóxicos de hierro. Adicionalmente,
cualquier depósito de óxido de hierro puede eliminarse fácilmente
sumergiendo los electrodos en ácido nítrico al 10% en agua durante
dos horas, y después enjuagando completamente con agua
destilada.
Pueden utilizarse electrodos sólidos de cobre y
plata para algunas aplicaciones, pero se prefieren menos para su uso
habitual porque se corroen rápidamente en solución salina. Los
electrodos de cobre chapados en oro son relativamente inertes, pero
parecen perder parte de su chapado en oro durante la estimulación
eléctrica prolongada.
Los productos de la electrolisis pueden
contenerse o eliminarse recubriendo las superficies de los
electrodos con recubrimientos protectores, tales como gelatina,
poliacrilamida, o geles de agarosa. Otro material de electrodo
potencialmente útil es una semicelda electroquímica, tal como un
electrodo de plata/cloruro de plata.
Los electrodos de inmersión normalmente
consisten en uno o más pares de electrodos que se disponen en una
matriz que puede moverse de manera retráctil hacia dentro y hacia
fuera de, uno o más pocillos de una placa de múltiples pocillos. Los
electrodos de inmersión pueden orientarse en matrices que se adaptan
al formato y la densidad de la placa, pero pueden estar en matrices
de cualquier configuración u orientación. Por ejemplo, para una
placa de 96 pocillos convencional, son posibles varias
configuraciones de electrodo, incluyendo las disposiciones de matriz
de electrodos para excitar selectivamente una o más columnas, o
filas, simultáneamente.
Un ejemplo de una realización de una matriz de
electrodos de este tipo se muestra en la figura 1. En este ejemplo,
se da formato a una matriz de 12 por 8 de pares de electrodos, de
manera que ajuste en una placa de múltiples pocillos de 96 pocillos
convencional. En este caso, los electrodos (10) son aproximadamente
de 4 mm de ancho, de 1 cm de largo y de 0,2 mm de espesor, y se
extienden desde un peine conductor (50) que está conectado a través
de un conmutador a un lado de la fase exterior de un generador de
función de alta potencia. Los electrodos se montan paralelos entre
sí, con una separación de 4 mm, con un espaciador (20) de nylon no
conductor en el centro. En este caso, el conmutador (330) permite
que una columna de la placa de 96 pocillos se estimule
selectivamente de una vez; sin embargo cualquier combinación
temporal o espacial de protocolos de estimulación es potencialmente
posible, dada la configuración apropiada de conmutación, cableado y
generador de función de potencia.
La totalidad de la matriz de electrodos se
mantiene en el registro correcto mediante un elemento rígido no
conductor (30) que mantiene cada par de electrodos separado
correctamente para adaptarse con exactitud a una distribución de
placa de 96 pocillos convencional. El elemento no conductor (30)
hace que los electrodos se muevan hacia arriba o hacia abajo
mientras se mantiene con precisión su registro con la placa de
múltiples pocillos.
Para proporcionar el registro correcto de la
matriz de electrodos con una placa de múltiples pocillos, el montaje
de electrodos puede comprender opcionalmente un borde externo o
saliente (40) que puede adaptarse a una placa de 96 pocillos
convencional, y permite el registro exacto de la placa. En algunas
realizaciones, el borde (40) puede incluir además una muesca o
indentación de registro (80) para proporcionar el registro no
ambiguo de la placa.
En una realización preferida (también mostrada
en la figura 1A) la matriz de electrodos comprende además medios
para insertar de manera retráctil la matriz de electrodos en los
pocillos de la placa de múltiples pocillos. En una realización de
esta configuración, la matriz de electrodos comprende además un
elemento de soporte móvil superior (90) al que se unen los
electrodos (10). El elemento de soporte móvil (90) puede moverse
hacia arriba o hacia abajo con respecto a al elemento no conductor
(30) deslizándose sobre cuatro pasadores de alineación (70). Existe
un muelle no mostrado en estas figuras que permite que la capa de
soporte móvil (90) vuelva automáticamente a la posición superior
cuando ya no se aplica la fuerza hacia abajo. Un espaciador (60)
proporciona la capacidad de bloquear la capa de soporte móvil (90) y
los electrodos (10) en la orientación completamente inferior. Este
dispositivo permite que se utilice la estimulación eléctrica en
modos de selección manuales y/o robóticos.
Las placas de múltiples pocillos de la presente
invención están diseñadas principalmente para proporcionar la
estimulación eléctrica eficaz de las células, mientras que al mismo
tiempo permiten el análisis óptico de los cambios del potencial
transmembrana. Para llevar a cabo esto, los electrodos de superficie
conductores pueden orientarse en o sobre las paredes, las partes
inferiores o las tapas de la placa de múltiples pocillos.
En general, tales placas de múltiples pocillos
pueden tener una huella de cualquier forma o tamaño, tal como
cuadrada, rectangular, circular, alargada, triangular, de riñón, u
otra forma geométrica o no geométrica. La huella puede tener una
forma que sea sustancialmente similar a la huella de las placas de
múltiples pocillos existentes, tales como la placa de microtítulo de
96 pocillos convencional, cuya huella es de aproximadamente 85,5 mm
de anchura por 127,75 mm de longitud, u otros tamaños que
representen un patrón industrial actual o futuro (véase T. Astle,
Standards in Robotics and Instrumentation, J. of Biomolecular
Screening, Vol. 1 páginas 163-168, 1996). Las placas
de múltiples pocillos de la presente invención que tienen esta
huella pueden ser compatibles con la robótica e instrumentos, tales
como lectores y translocadores de placa de múltiples pocillos, tal
como se conocen en la técnica.
Normalmente, los pocillos se dispondrán en
matrices lineales bidimensionales sobre la placa de múltiples
pocillos. Sin embargo, los pocillos pueden proporcionarse en
cualquier tipo de matriz, tal como en matrices geométricas o no
geométricas. La placa de múltiples pocillos puede comprender
cualquier número de pocillos. También pueden adaptarse fácilmente
números mayores de pocillos o una densidad de pocillos aumentada
utilizando los métodos de la invención reivindicada. Números de
pocillos comúnmente utilizados incluyen 6, 12, 96, 384, 1536, 3456 y
9600.
Los volúmenes de pocillos normalmente pueden
variar dependiendo de la profundidad y el área en corte transversal
del pocillo. Preferiblemente, el volumen del pocillo es de entre
aproximadamente 0,1 microlitros y 500 microlitros.
Los pocillos pueden realizarse de cualquier
forma en corte transversal (en una vista en planta) incluyendo,
cuadrada, redonda, hexagonal, otras formas geométricas o no
geométricas y combinaciones (intra-pocillo e
inter-pocillo) de las mismas. Se prefieren los
pocillos cuadrados o redondos, con fondos planos.
Las paredes pueden estar achaflanadas (por
ejemplo, que tienen un ángulo de diseño). Preferiblemente, el ángulo
es de entre aproximadamente 1 y 10 grados, más preferiblemente de
entre aproximadamente 2 y 8 grados, y lo más preferible de entre
aproximadamente 3 y 5 grados.
Los pocillos pueden colocarse en una
configuración de manera que la distancia de centro del pocillo a
centro del pocillo pueda ser de entre aproximadamente 0,5 milímetros
y aproximadamente 100 milímetros. Los pocillos pueden colocarse en
cualquier configuración, tal como una matriz
lineal-lineal, o en patrones geométricos, tales como
patrones hexagonales. La distancia de pocillo a pocillo puede ser de
aproximadamente 9 mm para una placa de 96 pocillos. Se prefieren
distancias de centro de pocillo a centro de pocillo menores para los
volúmenes más pequeños.
Los pocillos pueden tener una profundidad de
entre aproximadamente 0,5 y 100 milímetros. Preferiblemente, la
profundidad del pocillo es entre aproximadamente 1 milímetro y 100
milímetros, más preferiblemente de entre aproximadamente 2
milímetros y 50 milímetros, y lo más preferiblemente de entre
aproximadamente 3 milímetros y 20 milímetros.
Los pocillos pueden tener un diámetro (cuando
los pocillos son circulares) o una distancia diagonal máxima (cuando
los pocillos no son circulares) de entre aproximadamente 0,2 y 100
milímetros. Preferiblemente, el diámetro del pocillo es de entre
aproximadamente 0,5 y 100 milímetros, más preferiblemente de entre
aproximadamente 1 y 50 milímetros, y lo más preferiblemente, de
entre aproximadamente 2 y 20 milímetros.
La placa de múltiples pocillos, estará compuesta
generalmente de material eléctricamente no conductor y puede
comprender un material ópticamente opaco que puede interferir con la
transmisión de radiación, tal como la luz, a través de la pared de
un pocillo o del fondo de un pocillo. Tales materiales ópticamente
opacos pueden reducir el ruido de fondo asociado con los métodos de
detección óptica. Los materiales ópticamente opacos pueden ser
cualquiera de los conocidos en la técnica o que se desarrollen
posteriormente, tales como colorantes, pigmentos o negro de carbón.
El material ópticamente opaco puede evitar que la radiación pase de
un pocillo a otro, para evitar la interferencia cruzada entre
pocillos, de manera que se aumente la sensibilidad y la exactitud
del ensayo. El material ópticamente opaco también puede ser
reflectante, tal como los conocidos en la técnica, tal como capas
metálicas delgadas, revestimientos reflectantes, o pulido
reflectante. Los materiales ópticamente opacos pueden revestirse
sobre cualquier superficie de la placa de múltiples pocillos, o
puede ser una parte integrada de la placa o el fondo cuando se
fabrican. El material ópticamente opaco puede evitar la
transmitancia de entre aproximadamente el 100% a aproximadamente el
50% de la luz incidente, preferiblemente de entre aproximadamente el
80% y superior al 95%, más preferiblemente superior al 99%.
Dado que la mayor parte de las mediciones
normalmente no requerirán que la luz pase a través de la pared del
pocillo, los materiales tales como polímeros pueden incluir
pigmentos para oscurecer bien las paredes o absorber la luz. Tal
aplicación de pigmentos ayudará a reducir la fluorescencia de fondo.
Los pigmentos pueden introducirse mediante cualquier medio conocido
en la técnica, tal como revestir o mezclar durante la fabricación
del material o la placa de múltiples pocillos. La selección de
pigmentos puede basarse en una mezcla de pigmentos para humedecer
todo el fondo inherente al polímero, o un único pigmento o conjunto
de pigmentos seleccionados para filtrar o absorber la luz a
longitudes de onda deseadas. Los pigmentos pueden incluir negro de
carbón.
Los electrodos de superficie pueden incluirse o,
en cualquier caso, unirse a la pared en una variedad de formatos y
disposiciones, por ejemplo como varias bandas de electrodos
verticales y estrechas. Mediante la sintonización apropiada de los
potenciales relativos de cada banda, pueden generarse campos
eléctricos en la zona de observación. Además, utilizando un inserto
circular, o mediante la inclusión de electrodos de banda vertical
alrededor del pocillo, pueden generarse campos eléctricos uniformes
en cualquier dirección a través del pocillo. También sería posible
crear un campo uniforme en una dirección, seguido por un campo
uniforme en otra dirección. Esto podría ser útil para tipos
celulares cuyas características eléctricas son anisotrópicas, tales
como células neuronales o musculares, o para tipos celulares con
razones de aspecto grandes.
Cada pocillo también comprende un fondo que
tiene una alta parte de transmitancia y que tiene menos
fluorescencia que un fondo de poliestireno de al menos
aproximadamente el 90 por ciento de dicho espesor del fondo. Esta
propiedad puede determinarse comparando la fluorescencia de un
material de fondo de control apropiado con la fluorescencia de un
material de prueba. Estos procedimientos pueden llevarse a cabo
utilizando métodos bien conocidos. Preferiblemente, el fondo es una
placa o película, ya que estos términos son conocidos en la técnica.
El espesor del fondo puede variar dependiendo de las propiedades
globales requeridas del fondo de la placa que pueden dictarse por
una aplicación particular. Tales propiedades incluyen la cantidad de
fluorescencia intrínseca, rigidez, resistencia a la rotura y
necesidades de fabricación en relación con el material utilizado en
la placa. Las capas de fondo de los pocillos normalmente tienen un
espesor de entre aproximadamente 10 micrometros y aproximadamente
1000 micrometros. Preferiblemente, el fondo del pocillo tiene un
espesor de entre aproximadamente 10 micrometros y 450 micrometros,
más preferiblemente de entre aproximadamente 15 micrometros y 300
micrometros, y lo más preferiblemente de entre aproximadamente 20
micrometros y 100 micrometros.
El fondo de un pocillo puede tener una parte de
alta transmitancia, lo que normalmente significa que o bien todo o
una parte del fondo de un pocillo puede transmitir luz. El fondo
puede tener una parte ópticamente opaca y una parte de alta
transmitancia de cualquier forma, tal como circular, cuadrada,
rectangular, forma de riñón, poligonal, u otra forma geométrica o no
geométrica o combinaciones de las mismas.
Preferiblemente, el fondo de la placa de
múltiples pocillos puede ser sustancialmente plana, por ejemplo, que
tiene una textura de superficie de entre aproximadamente 0,001 mm y
2 mm, preferiblemente de entre aproximadamente 0,01 mm y 0,1 mm
(véase, Surface Roughness, Waviness y Lay, Am. Soc. of Mech. Eng. Nº
ANSI ASME B46.1-2985 (1986)). Si el fondo no es
sustancialmente plano, entonces la calidad óptica del fondo y los
pocillos puede disminuir debido a las propiedades ópticas y físicas
alteradas de uno o ambos.
Para realizaciones de electrodo de superficie,
el fondo comprenderá preferiblemente bandas de material
eléctricamente conductor o revestimientos que solapan el borde de
los pocillos de la placa de múltiples pocillos y están en contacto
eléctrico con el contenido de los pocillos. Las bandas
eléctricamente conductoras normalmente terminarán en conectores
eléctricos para permitir la fácil unión a la fase de salida de un
generador de función de alta potencia, tal como se describió
anteriormente. Las bandas eléctricamente conductoras deben tener una
resistencia suficientemente baja de manera que puedan llevar las
corrientes de estimulación sin pérdida excesiva en el voltaje en su
longitud. La resistencia del extremo del conector al extremo del
pocillo más alejado debe ser inferior a 10 \Omega, y más
preferiblemente inferior a 1 \Omega, y todavía más preferiblemente
inferior a 0,1 \Omega. El área en corte transversal de las bandas
eléctricamente conductoras debe ser lo suficientemente grande como
para conseguir el requisito de resistencia. Para los conductores
eléctricos comúnmente empleados, esta área en corte transversal debe
ser de al menos 10^{-4} mm^{2}, y más preferible de al menos
10^{-3} mm^{2}.
En la práctica, podría utilizarse cualquier
material conductor siempre que esté cubierto con un material
conductor que sea inerte en solución salina. Tales materiales
incluyen los metales nobles (incluyendo oro, platino y paladio) y
los metales refractarios (incluyendo cromo, molibdeno, iridio,
tungsteno, tantalo y titanio) así como aleaciones de los mismos. Los
materiales preferidos para el material conductor para electrodos de
superficie incluyen combinaciones de cromo, cobre, oro y óxido de
indio - estaño que pueden incluirse o electrodepositarse fácilmente
en o sobre la capa de fondo transparente. Los productos de
electrolisis pueden contenerse o eliminarse mediante el
revestimiento de las superficies de los electrodos con
revestimientos protectores, tales como geles de agarosa,
poliacrilamida o gelatina.
Otro material de electrodo potencialmente útil
es una semicélula electroquímica, tal como un electrodo de
plata/cloruro de plata.
Pueden introducirse modificaciones de superficie
o revestimientos de material eléctricamente conductor en el fondo
utilizando cualquier método adecuado conocido en la técnica,
incluyendo deposición en vacío, electrodeposición, impresión,
pulverización, energía radiante, técnicas de ionización o inmersión.
También pueden introducirse modificaciones de superficie mediante la
derivatización apropiada de un polímero u otro material, tal como
vidrio o cuarzo, antes, durante o después de que se fabrique la
placa de múltiples pocillos e incluyendo un polímero derivatizado
apropiado u otro material en la capa de fondo. El polímero
derivatizado u otro material puede hacerse reaccionar entonces con
un resto químico que se utiliza en una aplicación de la placa. Antes
de la reacción con un resto químico, tal polímero u otro material
puede proporcionar sitios de unión covalente o no covalente en el
polímero u otro material. Tales sitios en o sobre la superficie del
polímero u otro material pueden utilizarse para unir capas
conductoras a las placas. Ejemplos de polímeros derivatizados u
otros materiales incluyen los descritos por la patente de los EE.UU.
5.583.211 (Coassin et al.) y otros conocidos en la técnica o
que se desarrollen posteriormente.
Los materiales para la fabricación de la placa
de múltiples pocillos normalmente serán poliméricos, puesto que
estos materiales conducen a sí mismos a técnicas de fabricación en
masa. Sin embargo, pueden utilizarse otros materiales para obtener
el fondo de la placa de múltiples pocillos, tal como vidrio o
cuarzo. El fondo puede estar hecho del mismo o diferente material y
el fondo puede comprenden poliestireno u otro material.
Preferiblemente, los polímeros se seleccionan para que tengan
fluorescencia baja y/o transmitancia alta. Los materiales
poliméricos pueden facilitar particularmente la fabricación de
placas mediante métodos de moldeo conocidos en la técnica y
desarrollados en el futuro, tales como moldeo por inyección o
inserto.
La placa de múltiples pocillos de la presente
invención puede obtenerse de una o más piezas. Por ejemplo, la placa
y el fondo pueden obtenerse como una pieza diferenciada.
Alternativamente, la placa puede ser una pieza diferenciada, y el
fondo puede ser una segunda pieza diferenciada, que se combinan para
formar una placa de múltiples pocillos. En este caso, la placa y el
fondo pueden unirse entre sí mediante medios de sellado, tales como
adhesivos, soldadura sónica, soldadura térmica, fusión, moldeo por
inyección de inserto u otros medios conocidos en la técnica o que se
desarrollen posteriormente. La placa y el fondo pueden obtenerse del
mismo o de diferentes materiales. Por ejemplo, la placa puede
obtenerse de un polímero, y el fondo obtenerse de poliestireno,
cicloolefina, Aclar, vidrio o
cuarzo.
cuarzo.
Son viables los diseños de electrodo de
superficie miniaturizados en los formatos de placa convencionales
(96, 384, 1536) así como en 3456 y densidades de placa superiores.
El rendimiento de tales sistemas es extremadamente alto de manera
potencial. Por ejemplo, suponiendo que 3456 pocillos por placa
seleccionados a 30 placas por hora corresponde a un rendimiento
global de aproximadamente 800.000 pocillos por día de ocho oras, que
es aproximadamente 8 veces más rápido de lo que está disponible en
la actualidad, suponiendo tiempos de lectura de placa iguales.
Un ejemplo de una realización de placa de
múltiples pocillos con electrodos de superficie se muestra en la
figura 2A. En este ejemplo, pares de bandas conductoras (200) están
unidas en paralelo a una capa de fondo ópticamente transparente
(210) tal como vidrio o plástico, tal como COC (véase la patente de
los EE.UU. número 5.910.287, concedida el 8 de junio 1999) en un
formato de placa de 96 pocillos. En este ejemplo, las bandas de
material conductor (200) son aproximadamente de 2 mm de ancho, 10
\mum de espesor y están separadas en una distancia de
aproximadamente 4 mm para permitir el análisis óptico de las
células ubicadas en los pocillos (220), entre los electrodos a
través de la capa de fondo ópticamente transparente (210). En otras
realizaciones las bandas de material conductor pueden comprender
cables de acero inoxidable (desde aproximadamente 0,001 hasta
aproximadamente 0,010 de diámetro). La capa de fondo ópticamente
transparente (210) se une a una matriz de placa de múltiples
pocillos de 96 pocillos (230) y sustituye al fondo de placa normal.
Las bandas de material eléctricamente conductor (200) solapan el
borde de los pocillos (220) de la placa de múltiples pocillos de 96
pocillos y están en contacto eléctrico con el contenido de los
pocillos. Las bandas eléctricamente conductoras (200) terminan en
contacto eléctrico (240) para permitir la fácil unión a la fase de
salida de un generador de función de alta potencia, tal como se
describió anteriormente. En este ejemplo, hay dos contactos de
electrodo por columna de ocho pocillos en el primer pocillo de la
columna. Esto permite el uso de distribuciones convencionales de
placa de 96 pocillos, para un manejo más simple durante el cultivo
celular. No se introducen células ni solución salina en estos
pocillos. Este diseño permite la estimulación simultánea de siete
pocillos en una única columna. Durante el ensayo, el operario o un
robot unirán temporalmente cables a los contactos, por ejemplo, con
electrodos de prueba de pasador.
Otra realización de una placa de múltiples
pocillos con electrodos de superficie se muestra en la figura 2B. En
esta realización, la capa de fondo transparente (210) se extiende
más allá del borde de la placa de múltiples pocillos (230). En esta
configuración, todos los pocillos siguen estando disponibles para su
uso con células y compuestos. Además, se simplifica la unión de
cableado externo a los contactos (240). Pueden utilizarse contactos
de pasador, conectores de borde de placa de circuito, o zócalos de
fuerza de inserción cero para efectuar el contacto con los
electrodos. La capa de fondo extendida (210) puede hacer que las
placas sean menos convenientes para manipularse durante el uso
habitual. Esto puede remediarse llevando trazas de electrodo (200)
al lado inverso de la capa de fondo (210) durante el proceso de
fabricación. Esto puede llevarse a cabo mediante varios métodos. Por
ejemplo, utilizando el procesamiento bilateral de las placas para
crear zonas de contacto, pueden obtenerse agujeros pasantes y
someterse a electrodeposición, o pueden envolverse trazas de
conducción alrededor del borde de la capa de fondo. Como otro
ejemplo, la capa de fondo puede obtenerse de un material aislante
flexible. Entonces tras obtener la estructura tal como se muestra en
la figura 2B, la parte de la capa de fondo que sobresale del borde
de la placa puede doblarse y unirse al lado inferior de la
placa.
Otra realización de una placa de múltiples
pocillos con electrodos de superficie se muestra en la figura 2C. En
esta realización, los electrodos (200) están unidos a los
adaptadores de contacto (240) con estrechos cables (205). Esto
permite el uso de distribuciones convencionales de placa de 96
pocillos, para un manejo más simple durante el cultivo celular. En
esta realización, todos los electrodos de una polaridad se acortan a
la vez. La selección de una única columna se lleva a cabo mediante
el suministro de impulso de corriente a sólo un electrodo de la otra
polaridad. En esta realización, no se colocan células, ni solución
salina, ni compuestos en la columna final en la que están los
adaptadores de contacto. Durante el ensayo, el operario o un robot
unirán temporalmente los cables a los contactos, por ejemplo con
electrodos de prueba de pasador.
Otra realización de una placa de múltiples
pocillos con electrodos de superficie se muestra en la figura 2D. En
esta realización, los electrodos (200) se alinean paralelos a la
dimensión más larga de la placa de 96 pocillos. Este diseño es
esencialmente similar al diseño mostrado en la figura 2A, con la
excepción de once pocillos en una fila que se estimularán
simultáneamente.
Materiales preferidos para el material conductor
para los electrodos de superficie incluyen combinaciones de cromo,
cobre, oro y óxido de indio - estaño que pueden incluirse, unirse o
electrodepositarse fácilmente en o sobre la capa de fondo
transparente. En la práctica, podría utilizarse cualquier material
conductor siempre que esté cubierto con un material conductor que
sea inerte en solución salina. Tales materiales inertes incluyen los
metales nobles (incluyendo oro, platino, y paladio), los metales
refractarios (incluyendo cromo, molibdeno, iridio, tungsteno,
tantalo y titanio), aleaciones resistentes a la corrosión
(incluyendo acero inoxidable), y carbono u otros conductores
orgánicos (incluyendo grafito y polipirrol) así como combinaciones o
aleaciones de estos materiales.
La presente invención incluye sistemas para la
estimulación eléctrica y la medición espectroscópica automatizadas,
que comprende: al menos un montaje de electrodo, un medio para la
estimulación eléctrica, un detector óptico, y medios de control por
ordenador para coordinar la generación de los estímulos eléctricos,
la recogida de datos y el movimiento de placas de múltiples
pocillos. El sistema puede comprender además medios para la adición
de fluido. En un aspecto, estos sistemas están diseñados para
modular, caracterizar y someter a ensayo la actividad de los canales
iónicos, transportadores, corrientes de fuga presentes en o sobre
las superficies de células vivas, y para la selección rápida de los
efectos de los compuestos de prueba sobre los efectos de las
actividades celulares o de canal. La presente invención también se
refiere a entidades químicas e información (por ejemplo, moduladores
o actividades químicas o biológicas de los productos químicos)
generada o descubierta por el funcionamiento de las estaciones de
trabajo de la presente invención.
La figura 3 muestra un diagrama de bloques de
los principales componentes eléctricos y ópticos para una
realización de un sistema para la estimulación eléctrica y la
medición espectroscópica automatizadas. En este ejemplo se utilizó
una matriz de electrodos de inmersión de placa de múltiples pocillos
de 96 pocillos (figura 1) para la estimulación eléctrica. Además de
la matriz de electrodos del estimulador, el sistema tiene varios
componentes eléctricos, ópticos y mecánicos adicionales, tal como se
describe en detalle en la solicitud de patente de los EE.UU. de
titularidad común número 09/118,728, presentada el 24 de julio de
1998.
En esta realización, se utiliza una tarjeta de
entrada/salida digital PC-DIO 24 de National
Instruments (Austin, TX) dentro del ordenador (300) para establecer
el canal apropiado en un conmutador de 1 a 12 (330)
(ER-16 de National Instruments). El ordenador que
controla el lector de placa fluorescente (300) también emite una
señal TTL para desencadenar los generadores de funciones (310)
cuando el estímulo está programado para comenzar. Las señales de
estímulo se generan mediante dos generadores de forma de onda
arbitraria (310). Los generadores de funciones son Tektronix
(Beaverton, OR) número de modelo AFG310. El primero desencadena una
serie de impulsos TTL al segundo que está programado con la forma de
onda de estímulo individual. Pueden generarse trenes de formas de
onda más complejos mediante la conexión de generadores de formas de
onda múltiples en serie y/o en paralelo. Estos generadores de formas
de ondas se desencadenarían mediante el impulso de TTL generado por
ordenador o entre sí. Alternativamente, podría utilizarse un
convertidor de A/D o una tarjeta de sonido dentro del ordenador para
generar un tren de estímulos. En este caso, podría utilizarse un
software comercialmente disponible o a la medida para programar el
tren de formas de onda, o para cambiar la forma de onda durante el
tren.
El tren de estímulos se envía a través de un
amplificador de alta potencia (320), a través del conmutador (330),
y hacia el cabezal del estimulador (370). En este caso, el
amplificador se construyó utilizando el chip APEX PA93 (Apex
Microtechnology Corp, Tucson, AZ) siguiendo un circuito
proporcionado por el fabricante. Los amplificadores preferidos para
la presente solicitud normalmente cumplirían, o rebasarían las
siguientes especificaciones: \pm 100 V de CC (corriente continua)
en, 100 G\Omega de impedancia de entrada, 20X de ganancia de
voltaje, \pm 90 V de salida, \pm 3 A de salida, 10 \Omega de
impedancia de salida.
La mayor parte de la corriente pasa a través de
la solución salina entre los electrodos, normalmente en una única
columna de ocho pocillos de la placa de microtítulo (350) a la vez.
La luz de excitación a 400 \pm 7,5 nm ilumina las células teñidas
desde abajo, y la luz fluorescente emitida se mide en dos longitudes
de onda mediante el módulo de detector (340) azul a 460 +/- 20 nm y
naranja a 580 +/- 30 nm; (véase González et al., Drug
Discovery Today 4: 431-439, 1999). Una vez que se ha
estimulado una columna de células, el ordenador (300) desencadena el
motor (360) para que mueva la placa de múltiples pocillos (350)
hasta una nueva posición lista para la siguiente
estimulación.
estimulación.
Para una placa de múltiples pocillos de 96
pocillos típica, los electrodos tienen 4 mm de ancho con una
separación (g) de 4 mm. La estimulación se lleva a cabo normalmente
en un volumen de 100 \muL de solución salina fisiológica en el
pocillo. Con este volumen de solución salina, la profundidad es de
un promedio de aproximadamente 3,0 mm (esta profundidad varía en
hasta el 20% a través del pocillo debido al efecto de menisco). Los
electrodos descansan a aproximadamente 0,5 mm del fondo de los
pocillos. El campo eléctrico (E) aplicado a través de las células se
calcula como el voltaje a través de los electrodos (V_{0})
dividido por la separación del electrodo (g), E = V_{0}/g. Esto es
una sobreestimación del campo real debido a la influencia de las
reacciones electroquímicas en cada electrodo que consumen
aproximadamente 1,5 V. En los intervalos de voltaje típicos
utilizados para la estimulación (de 10 a 60 V/cm), esta
sobreestimación es del orden de aproximadamente el 10%. Puede
realizarse la medición y calibración exactas del campo mediante el
mapeo del potencial eléctrico en el pocillo cuando se hace pasar
la
corriente.
corriente.
La presente invención también incluye estaciones
de trabajo automatizadas que se controlan de manera programable para
minimizar los tiempos de procesamiento en cada estación de trabajo
que pueden integrarse para minimizar el tiempo de procesamiento de
las muestras líquidas para el análisis y la estimulación
eléctrica.
Normalmente, un sistema de la presente invención
incluiría uno o más de lo siguiente: A) un módulo de almacenamiento
y recuperación que comprende ubicaciones de almacenamiento para
almacenar una pluralidad de productos químicos en disolución en
pocillos químicos direccionables, un recuperador de pocillos químico
y que tiene selección programable y recuperación de los pocillos
químicos direccionables y que tiene una capacidad de almacenamiento
para al menos 100.000 pocillos direccionables, B) un módulo de
distribución de la muestra que comprende un manejador de líquidos
para aspirar o dispensar disoluciones a partir de pocillos químicos
direccionables seleccionados, teniendo el módulo de distribución
químico la selección programable de, y la aspiración a partir de,
los pocillos químicos direccionables seleccionados y la dispensación
programable en los pocillos de muestra direccionables seleccionados
(incluyendo la dispensación en matrices de pocillos direccionables
con diferentes densidades de pocillos direccionables por centímetro
cuadrado), C) un transportador de muestras para transportar los
pocillos químicos direccionables seleccionados hasta el módulo de
distribución de la muestra y que tiene opcionalmente el control
programable de transporte de los pocillos químicos direccionables
seleccionados (incluyendo encaminamiento adaptativo y procesamiento
en paralelo), D) un sistema para el lavado, la tinción y la
incubación temporizada automatizados de las células en las placas de
múltiples pocillos, E) un sistema para transportar automáticamente
placas de células y placas de compuestos de prueba entre las
diversas estaciones de trabajo, F) un sistema para la estimulación
eléctrica y la medición espectroscópica automatizadas, y un módulo
de integración y procesamiento de datos, G) un sistema de control
maestro que coordina las actividades de cualquiera de los
subsistemas anteriores.
El módulo de almacenamiento y recuperación, el
módulo de distribución de la muestra, y el sistema para la
estimulación eléctrica y la medición espectroscópica automatizadas
están integrados y controlados de manera programable por el módulo
de integración y procesamiento de datos. El módulo de almacenamiento
y recuperación, el módulo de distribución de la muestra, el
transportador de muestras, el sistema para la estimulación eléctrica
y la medición espectroscópica automatizadas y el módulo de
integración y procesamiento de datos están unidos operablemente para
facilitar el rápido procesamiento de los pocillos de muestra
direccionables. Normalmente, los dispositivos de la invención pueden
procesar al menos 100.000 pocillos direccionables en 24 horas. Este
tipo de sistema se describe en la patente de los EE.UU. número
5.985.214, concedida el 16/11/99.
La presente invención también incluye el uso de
electrodos que se han incorporado en chips microfluídicos y que
proporcionan estimulación eléctrica y análisis altamente
miniaturizados. Tales sistemas incluyen los descritos, por ejemplo,
en la patente de los EE.UU. número, 5.800.690 concedida el 1 de
septiembre de 1998 a Chow et al., la solicitud de patente
europea EP 0 810 438 A2 presentada el 5 de mayo de 1997, por Pelc
et al. y la solicitud PCT WO 98/00231 presentada el 24 de
junio 1997 por Parce et al. Estos sistemas normalmente
utilizan movimiento de fluido electrogénico para manipular pequeños
volúmenes de fluido dentro de los microcapilares presentes en los
chips de vidrio o silicio. Estos sistemas de análisis basados en
chips microfluídicos pueden proporcionar análisis miniaturizados
masivamente paralelos. Tales sistemas son sistemas preferidos de
mediciones espectroscópicas en algunos casos que requieren un
análisis miniaturizado.
Por ejemplo, el separador de células activado
por fluorescencia microfabricado descrito por Fu et al.
(Nature Biotechnology 17: 1109-11, 1999) podría
modificarse fácilmente para tener un par de electrodos colocados en
o cerca de la región de interrogación óptica. Utilizando los métodos
descritos en el presente documento, las células individuales podrían
estimularse eléctricamente y separarse individualmente basándose en
su respuesta a la estimulación. Este método simplificaría
enormemente el proceso de obtener clones estables que contengan la
expresión deseada de canales. En otro aspecto, la selección de
compuestos de prueba en células individuales podría realizarse con
un dispositivo microfluídico equipado con uno o más orificios de
inyección de fluido adicionales y uno o más dispositivos
estimuladores eléctricos insertados construidos y hechos funcionar
basándose en los métodos descritos en el presente
documento.
documento.
Sin pretender adherirse a ningún mecanismo de
acción, los presentes inventores facilitan la siguiente descripción
para el efecto de la estimulación eléctrica sobre los potenciales
transmembrana celulares.
Los canales iónicos dependientes de voltaje
típicos tienen una variedad de estados conductores y no conductores
que están regulados por el potencial transmembrana de la célula
relativo local. Mediante la aplicación apropiada de campos
eléctricos externos a las células, pueden excitarse partes de la
membrana celular a cualquier potencial transmembrana deseado,
permitiendo así la regulación de los estados de conducción de los
canales iónicos dependientes de voltaje presentes dentro de la
célula. Si el campo eléctrico aplicado se varía apropiadamente, es
posible tomar como muestra varios estados de conductancia de la
mayor parte de los canales iónicos, haciéndolos así cíclicos a
través de los estados de reposo, activado e inactivado.
Dependiendo del canal iónico en cuestión, la
activación del canal iónico puede conducir a la liberación, o la
captación, de iones en la célula que puede dar como resultado
cambios en el potencial transmembrana global en la célula. Mediante
la aplicación de un tren repetitivo de estímulos eléctricos,
separados en un intervalo de tiempo inferior a la constante de
tiempo de membrana, los cambios de voltaje de membrana sostenidos y
grandes pueden crearse a través de una acumulación o pérdida de
iones por etapas. Este proceso permite la medición directa de muchos
canales iónicos y proporciona un método fácil por el que puede
controlarse externamente el potencial transmembrana de la célula.
Por tanto, este enfoque proporciona métodos mejorados del
descubrimiento de fármacos que son compatibles con la selección de
alto rendimiento.
La influencia simulada de un protocolo de
estimulación eléctrica bifásica típica en una línea celular que
expresa un canal de sodio activado por voltaje se ilustra, de forma
simplificada, más adelante. La siguiente descripción supone que la
línea celular no tiene expresión significativa de otros canales
iónicos, y que el potencial transmembrana en reposo de la célula es
superior al umbral para la inactivación del canal de sodio en
cuestión. En la figura 4, el panel superior muestra el transcurso de
tiempo del campo eléctrico aplicado (E), el panel medio muestra las
corrientes de sodio estimuladas hacia dentro (I_{Na}) en respuesta
al campo eléctrico aplicado, y el panel inferior muestra el
potencial transmembrana promedio idealizado de la célula (V_{m}).
En este ejemplo, los registros se refieren a los cambios en estos
parámetros que normalmente se esperaría que experimentase una célula
individual colocada en el centro del campo eléctrico aplicado
durante un tren de ondas de estimulación eléctrica.
En referencia al primer impulso, el
establecimiento del primer campo eléctrico produce una disminución
de potencial a través de la célula que es máximo, con respecto al
potencial transmembrana en reposo de la célula, en los bordes de la
célula más próximos a los electrodos (véase Hibino et al.,
Biophysical Journal 64: 1789-1800, 1993; Gross et
al. 1986, Biophys. J. 50: 339-348). La magnitud
del cambio en el potencial transmembrana \DeltaV_{m} inducido
por el campo eléctrico en un punto dado de la membrana en una célula
esférica idealizada puede describirse mediante la fórmula (Ehrenberg
et al., Biophys. J. 51: 833-837, 1987):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En la ecuación 1, f es un factor
dependiente de la conductividad de la membrana, g es un
factor geométrico de orden 1, r es la mitad del diámetro de
la célula paralelo al campo eléctrico, E es la magnitud local del
campo eléctrico, y \theta es el ángulo entre la dirección local
del campo y una línea trazada desde el centro de la célula hasta el
punto de la superficie que se está considerando. Para la mayor parte
de las células de mamífero intactas, en las que la conductividad de
la membrana es muy baja en comparación con la conductividad de la
disolución que baña las células, el factor f \approx 1. En la
práctica, las células son rara vez esféricas cuando están unidas a
un sustrato y puede determinarse empíricamente un cálculo exacto de
la magnitud real de los cambios en el potencial transmembrana
inducidos por el campo eléctrico.
Como resultado del campo eléctrico aplicado, la
membrana en el lado más próximo al ánodo se excita negativamente,
mientras que la membrana en el lado más próximo al cátodo se excita
positivamente. En las células en las que un borde se excita de
manera suficientemente negativa como para disminuir localmente el
potencial transmembrana por debajo del potencial umbral para la
liberación de la inactivación para el canal iónico en cuestión, el
campo eléctrico aplicado hace que los canales de sodio ubicados en
este borde entren en el estado de reposo. En el otro lado de la
célula, el potencial transmembrana se excita positivamente con
respecto al potencial en reposo. Dado que se supone que el potencial
transmembrana en reposo de la célula es superior al umbral para su
inactivación, los canales de sodio en este lado de la célula
permanecen inactivados y no pasa corriente. Si el potencial
transmembrana en reposo fuera en cambio inferior al umbral de
inactivación, los canales en este lado de la célula se activarían y
pasaría corriente.
Cuando se invierte el campo aplicado, el perfil
de cambios del potencial transmembrana también se invierte. Los
cambios en el potencial transmembrana inducidos por el campo
eléctrico en los parches de membrana en los bordes de extremo de las
células cambian de polaridad. Los canales en el lado que se excitan
negativamente durante la primera fase de la estimulación se excitan
ahora positivamente. Si los parámetros de estimulación se escogen
apropiadamente, estos canales se excitan ahora por encima del
potencial de activación y comienzan a permitir que el ión sodio
fluya hacia el interior. Esto se muestra en la figura 4, como el
primer pico más pequeño de flujo de sodio hacia el interior de la
célula. Los canales de sodio se inactivan rápidamente tras un tiempo
característico. Mientras, en el otro lado de la célula, el potencial
transmembrana se excita negativamente, de manera que los canales de
sodio se liberan de la inactivación y se cambian al estado de
reposo.
Cuando finaliza la fase del segundo estímulo,
todas las partes de la membrana vuelven rápidamente a un nuevo
potencial transmembrana promedio. Si el potencial transmembrana
promedio es ahora superior al potencial de activación de los canales
de sodio, los canales en el lado de la célula que se excita
negativamente durante la segunda fase de estimulación, se activan y
comienzan a permitir que el ion sodio fluya hacia el interior. Esto
se muestra en la figura 4, como el segundo pico más grande de flujo
de sodio hacia el interior de la célula. Los canales de sodio se
inactivan rápidamente tras un tiempo característico. En este caso,
el flujo de sodio hacia el interior normalmente es mayor desde el
segundo lado que desde el primer lado, puesto que la fuerza de
conducción para la entrada de sodio es mayor cuando esta parte de la
membrana se excita más positivamente mediante un campo
eléctrico.
Cada impulso del flujo hacia el interior del
canal de sodio eleva el potencial transmembrana promedio de la
célula (figura 4, panel inferior). Esta elevación en el potencial
transmembrana puede detectarse mediante cualquiera de los métodos
descritos en el presente documento, pero se mide convenientemente
mediante los cambios en la razón de emisión de fluorescencia de un
colorante sensible a voltaje basado en FRET. Debido a las corrientes
de fuga presentes en todas las células, este cambio en el potencial
transmembrana promedio disminuye exponencialmente hasta el potencial
transmembrana en reposo original. La dependencia del tiempo de esta
respuesta, la constante de tiempo de membrana (\tau_{m}),
depende de la capacitancia de la membrana y la resistencia de la
membrana, y es sumamente variable de un tipo de célula a otro. Por
ejemplo, las constantes de tiempo pueden variar desde 100 \mus
hasta más de un segundo, dependiendo del tipo de célula.
Normalmente, la constante de tiempo de membrana es de
aproximadamente 100 ms para la mayor parte de las líneas celulares
obtenidas por ingeniería genética.
Para proporcionar una acumulación neta de flujo
hacia el interior de sodio, el impulso de estímulo se repite antes
de que el potencial transmembrana tenga tiempo para disminuir hasta
el potencial transmembrana en reposo. Durante las rondas posteriores
de estimulación eléctrica, la carga positiva se acumula
continuamente en la célula, elevando el potencial transmembrana
promedio de una forma aproximadamente por etapas con cada repetición
de estimulación eléctrica. Tras cada impulso de estimulación
eléctrica, la magnitud de los flujos hacia en interior del ion sodio
se hacen continuamente más pequeñas a medida que el potencial
transmembrana promedio se aproxima al potencial de inversión del ion
sodio. Finalmente, se estable un potencial transmembrana de
equilibrio en el que la fuga de corriente fuera de la célula
equivale al flujo hacia el interior de la corriente debido a la
estimulación eléctrica.
La presente invención incluye el uso de
cualquier núcleo de forma de onda con un procedimiento de repetición
que puede activar selectivamente canales iónicos en células vivas.
El núcleo es la estructura repetible que constituye la base del tren
de estímulos. En la figura 4, el núcleo es un impulso cuadrado
bifásico, pero en principio, podría ser cualquier función de onda de
tiempo limitado. La duración de tiempo del núcleo fija la tasa
máxima a la que puede repetirse. El procedimiento de repetición
dicta cómo y cuando el núcleo está presente en la muestra. En la
figura 4, la tasa de repetición es fija y continua para un total de
diez ciclos. Sin embargo, no es necesario que la tasa de repetición
sea fija.
Adicionalmente, el núcleo puede cambiarse
durante el tren de estímulos, de manera que cada vez que el
procedimiento de repetición requiere un impulso de estímulos, podría
utilizarse una función de onda diferente. Además, podría utilizarse
un mecanismo de realimentación para alterar el núcleo y/o el
procedimiento de repetición basándose en la respuesta del sistema
medido.
El uso de generadores de formas de ondas
arbitrarias para crear los trenes y núcleos del estímulo permite una
variación prácticamente ilimitada en la forma de onda con el fin de
sintonizar el estímulo eléctrico apropiado para un tipo de célula
particular o canal iónico específico. El tren de impulsos puede
modularse fácilmente mediante la variación de diversos componentes
controlables por separado.
El núcleo de forma de onda que se repite durante
el tren de estímulos puede cambiarse sin prácticamente permutaciones
interminables utilizando un generador de formas de ondas digitales
arbitrarias, tal como Tektronix AFG 310. La figura 5 muestra una
representación esquemática de una forma de onda cuadrada bifásica
para ilustrar algunas de las variables que pueden modularse. En la
figura 5, el tren de impulsos consiste en un campo de partida
E_{1} (400), que dura un tiempo t_{1}, un rápido aumento en el
potencial (410), que dura un tiempo t_{2}, hasta que alcanza un
primer campo de estimulación E_{2} (420) que dura un tiempo
t_{3}, una rápida disminución en el potencial (430) que tarda un
tiempo t_{4}, hasta que alcanza un segundo campo de estimulación
(440), E_{3} que dura un tiempo t_{5}, un rápido aumento en el
potencial (460) que tarda un tiempo t_{6}, hasta que alcanza el
campo de terminación (470), E_{4} que dura un tiempo t_{7} hasta
que el ciclo se repite. La magnitud y la polaridad de los campos
eléctricos E_{1} a E_{4} se pueden controlar por separado y
pueden variarse tanto estadística como dinámicamente tal como se
describe más adelante. Los tiempos para los que se aplican los
potenciales eléctricos a las células, tiempos t_{1}, t_{3},
t_{5}, y t_{7} también se pueden controlar por separado y pueden
variarse estadística y dinámicamente entre 0 y 10 s durante un tren
de ondas, tal como se describe más adelante. Finalmente los cambios
en el potencial que se producen durante los tiempos t_{2}, t_{4}
y t_{6}, pueden producirse durante periodos de tiempo variables
entre 0 y 100 ms y serán lineales o no lineales para crear formas de
onda de formas variables.
Algunos ejemplos de estos tipos de variación en
la forma de onda se muestran en la figura 6. (a) Forma de onda
bifásica, tal como se muestra en la figura 5, repetida a una tasa
f. (b) Una forma de onda bifásica modificada. Se ha añadido
un corto intervalo entre las fases de estimulación del tren de
ondas. Esto permite que la corriente fluya a través de los canales
liberados de la inactivación durante el primer impulso. (c) Forma de
onda monofásica. Sólo los canales en el lado de la célula que da
hacia el ánodo se liberarán de la inactivación. (d) Una forma de
onda en rampa. Los canales que dan hacia el ánodo se liberarán de la
inactivación mediante la onda cuadrada. Los canales se activarán y
pasarán la corriente durante la rampa. La rampa permite que los
canales se abran y que pasen corriente a potenciales locales más
negativos, de manera que aun cuando la célula está cerca del
potencial de inversión para los iones sodio, todavía pueden fluir
grandes corrientes. El punto a lo largo de la rampa a la que se
abrirán los canales, varía. (e) Una forma de onda bifásica
triangular o en dientes de sierra. La forma de rampa puede permitir
que se produzcan transiciones dependientes del voltaje entre los
estados de manera más uniforme cuando cambia el potencial de
membrana global. También son posibles formas de onda monofásicas
triangulares. (f) Una forma de onda sinusoidal. Este tipo de forma
de onda puede reducir el ruido eléctrico durante la estimulación de
alta frecuencia. (g) Una corta ráfaga de formas de onda
sinusoidales. (h) Ráfagas de formas de onda sinusoidales, cada una
con frecuencia fundamental diferente. Este tipo de estimulación
puede demostrar ser útil para estudiar los efectos de plasticidad.
La(s) primera(s) ráfaga(s) se utilizan para
entrenar al sistema o para comenzar un proceso, mientras que
la(s) ráfaga(s) posterior(s) se utilizan para
someter a ensayo al sistema.
Las variaciones en la forma de la forma de onda
pueden ser útiles para mantener condiciones fijas de estímulo
durante el tren de impulsos. Por ejemplo, las fluctuaciones de
potencial transmembrana experimentadas por una célula altamente
polarizada variarán a medida que cambie su potencial transmembrana
promedio desde aproximadamente -90 mV al comienzo del ciclo de
estimulación hasta aproximadamente +60 mV tras varios ciclos de
estimulación repetitivos. Como consecuencia, el campo eléctrico
aplicado requerido para liberar eficazmente un canal iónico de la
inactivación varía a medida que varía el potencial promedio de la
célula durante el transcurso de varios ciclos de estimulación. Tener
en cuenta este efecto puede ser útil, en determinadas
circunstancias, para cambiar el balance relativo entre las fases de
estimulación positiva (E_{2}) y negativa (E_{3}) a medida que
progresa el tren de ondas.
Algunas líneas celulares, por ejemplo
HEK-293, tienen un potencial transmembrana en reposo
promedio inferior al umbral de activación de algunos canales de
sodio activados por voltaje. En estas células, a medida que el
potencial transmembrana se eleva durante la estimulación como
resultado del flujo hacia el interior del ion sodio, los canales de
sodio pueden abrirse independientemente de la estimulación eléctrica
aplicada. Esto puede mejorarse mediante el uso de un impulso de
corriente en pendiente (es decir, mediante el aumento de t_{2} y
t_{4}). Entonces, los canales pueden pasar corriente durante un
tiempo definido justo por encima del voltaje de activación,
independientemente del potencial transmembrana promedio de la
célula.
La magnitud y la polaridad de la amplitud del
impulso controlan las fluctuaciones relativas del potencial
transmembrana experimentadas por la célula durante un impulso de
estímulo. Las amplitudes de impulso pueden modificarse para que el
tren completo, o para que los impulsos individuales se acomoden a
los diferentes canales y tipos celulares, tal como se trata en más
detalle a continuación. En general, las magnitudes de E_{2} y
E_{3} se seleccionan para garantizar que el canal iónico de
interés se activa eficazmente, y se libera de la inactivación
durante cada ciclo de estimulación, mientras que al mismo tiempo no
es de magnitud suficiente de manera que produzca la electroporación
irreversible de las células. Las amplitudes de impulso preferidas
para E_{2} y E_{3} están normalmente en el intervalo de 5 a 60
V/cm para la mayor parte de los canales iónicos cuando se expresan
en células de mamífero no excitables con tamaños promedio de desde
10 hasta 25 \mum, y pueden variar en cuanto a positivo y negativo
con respecto a tierra. Al igual que anteriormente, la amplitud del
estímulo puede cambiarse durante el tren de impulsos para mantener
condiciones de estímulo estables cuando cambia el potencial
transmembrana promedio. Las amplitudes de impulso preferidas
dependen inversamente del tamaño de célula promedio. Por tanto, la
técnica también puede utilizarse en células que son más pequeñas o
más grandes de 10 a 25 \mum, modificando la amplitud del
impulso.
Muchos canales requieren modificaciones en el
potencial transmembrana durante periodos de tiempo prolongados para
liberarlos de la inactivación, antes de abrirlos. Por ejemplo,
muchos canales de sodio dependientes de voltaje generalmente
necesitan experimentar un potencial transmembrana inferior a -90 mV
durante varios milisegundos antes de que se liberen de la
inactivación. El uso eficaz del protocolo de estimulación eléctrica
requiere por tanto normalmente que la duración de los impulsos
t_{3} y t_{5} sea suficiente para permitir la liberación de la
inactivación completa o casi completa, para el canal iónico de
interés. En algunos casos, puede ser deseable sintonizar la magnitud
de t_{3} y t_{5} para permitir la liberación selectiva de la
inactivación de una clase, pero no de otra clase de canal iónico en
una célula que expresa varios tipos de canales iónicos. En otros
casos, puede ser deseable hacer que t_{3} y t_{5} sean muy
pequeños para lograr bajos niveles de liberación de la inactivación
para los canales. Normalmente, la duración de impulso preferida se
ajusta al tiempo característico para las transiciones entre los
estados dependientes del voltaje deseados para el canal iónico de
interés, y estos están normalmente en el intervalo de
aproximadamente 0,1 a 100 ms para la mayor parte de los canales
iónicos.
Para evitar la electrólisis excesiva del agua y
la consiguiente generación de burbujas de gas, la duración de los
impulsos t_{3} y t_{5} debe mantenerse lo más corta posible,
mientras que todavía se logre la estimulación eléctrica deseada. La
electrólisis del agua en una superficie de contacto metal/agua
normalmente se produce cuando la magnitud de la diferencia de
voltaje entre el metal y el agua supera aproximadamente 0,8 V. En
algunos casos, los parámetros del estímulo requeridos para producir
la estimulación celular también producen la electrólisis del agua.
Normalmente es aceptable cierta generación de gas en los electrodos,
siempre que la carga por área unitaria de la superficie de contacto
electrodo/agua suministrada durante cualquier fase de polaridad
individual de un único impulso sea inferior a aproximadamente 100
\muC/mm^{2}. Superar este límite normalmente produce el
desprendimiento de gases y la formación de burbujas, lo que afecta
significativamente a la uniformidad del campo. La presencia de
burbujas en la superficie del electrodo ocluye esta parte del
electrodo y puede producir alteraciones en la uniformidad del campo
eléctrico. La generación de grandes cantidades de gas también puede
producir lesión oxidativa a las células y a los colorantes en el
pocillo.
En una placa de 96 pocillos con 100 \muL de
solución salina fisiológica con una resistividad de 70
\Omega-cm, la resistencia de la solución salina
entre dos electrodos de placas paralelas con una separación de 4 mm
entre ellos insertado en el pocillo hasta dentro de 0,5 mm del
fondo del pocillo, es de aproximadamente 230 \Omega. Cada
electrodo tiene una zona de contacto con la solución salina de
aproximadamente 24 mm^{2}. Por tanto, cualquier fase de polaridad
única del protocolo del estímulo no debe suministrar más de
aproximadamente 2,4 mC de carga. Una diferencia de voltaje de
aproximadamente 10 V aplicada entre la placas genera un campo
eléctrico de aproximadamente 25 V/cm en la solución salina. Este
voltaje extraerá aproximadamente 43 mA de corriente. Por tanto, para
esta configuración de electrodos, un impulso de polaridad única de
onda cuadrada no debe superar aproximadamente 55 milisegundos de
duración con el fin de limitar la carga a menos de 2,4 mC.
El cambio del valor de t_{1} y t_{7}
globalmente para el tren, o el ajuste para cada impulso individual
durante el tren, es útil para optimizar el protocolo de estimulación
para canales iónicos específicos. Adicionalmente, el enfoque también
es útil para determinar ciertas propiedades celulares y de los
canales, incluyendo el tiempo de canal abierto y el transcurso de
tiempo de la activación e inactivación del canal.
Por ejemplo, para los ensayos que suponen
canales de sodio regulados por voltaje, la inserción de un retraso
en el tiempo (t_{1} + t_{7}) entre impulsos igual a, o inferior,
que el tiempo de apertura promedio del canal de sodio, permite una
medición cuantitativa de la cinética de inactivación del canal. La
cinética de inactivación está directamente relacionada con el tiempo
de canal abierto promedio. Por tanto, los ensayos utilizando cortos
intervalos entre impulsos permiten la detección de compuestos cuyo
efecto principal es sobre la cinética de inactivación, un mecanismo
que en caso contrario, es inaccesible utilizando técnicas de alto
rendimiento.
En la mayor parte de los casos, el retraso en el
tiempo entre los estímulos sucesivos sería inferior que la constante
de tiempo de membrana con el fin de obtener aumentos sostenidos en
el potencial transmembrana. Normalmente, las frecuencias de
estimulación (f) óptimas están dentro del intervalo
\tau_{M}^{-1} \leq f \leq \tau_{b}^{-1}, en la que
\tau_{M} es la constante de tiempo para la disminución en los
cambios del potencial transmembrana, y \tau_{b} es el tiempo de
apertura promedio del canal. Algunos canales no se inactivan, y para
estas células, la frecuencia de estimulación puede determinarse
empíricamente. Adicionalmente, la frecuencia de estimulación f no
puede superar la inversa de la duración del tiempo del núcleo de
estímulo.
Adicionalmente, para ciertos tipos de células,
puede demostrarse que es deseable estimular a una tasa más lenta.
Por ejemplo, las tasas de estimulación más lentas pueden preferirse
para las células con altas densidades de canal, o para ensayos en
los que se requiere una sensibilidad farmacológica superior.
Alternativamente, para estos casos, podría utilizarse un estímulo
monopolar. Esto sólo liberaría de la inactivación los canales de
sodio en un lado de la célula, aunque podría doblarse la frecuencia
máxima de estimulación.
Las propiedades celulares y de los canales
pueden someterse a ensayo tanto en modo dinámico (es decir, tiempos
de aumento y disminución, alteraciones en la forma de la respuesta,
etc.) y estático. Ambos modos requieren duraciones de los trenes de
estímulo lo suficientemente largos como para explorar todos los
acontecimientos de interés, aunque no más largos de lo necesario
para completar el ensayo. Los tiempos de estimulación típicos
comprenden impulsos de 10 ms, a impulsos de 25 V/cm repetidos a una
frecuencia de 20 Hz durante 3 segundos. El ajuste de estos
parámetros permite que se reduzcan los tiempos de ensayo, o explorar
procesos con escalas de tiempo rápidas y lentas.
En algunos casos es útil repetir los trenes de
impulsos, o realizar una medición en las mismas células con dos
trenes de impulsos diferentes. Un ejemplo sería caracterizar
completamente las propiedades de un canal midiendo la respuesta como
una función de la duración y la frecuencia del estímulo, utilizando
una única placa de células sometida a múltiples trenes de estímulos.
Otro ejemplo sería examinar la plasticidad de la respuesta (es
decir, los cambios en la respuesta dependientes de la actividad).
Uno o más trenes de estímulos condicionarían la respuesta, mientras
que los conjuntos de trenes de mediciones antes y después del
acondicionamiento determinarían los cambios debido a la
actividad.
La presente invención también puede utilizarse
para crear un dispositivo de fijación de voltaje, mediante el uso de
un bucle de realimentación dinámico para mantener el potencial
transmembrana promedio en el valor prefijado. Mediante la medición
del potencial transmembrana utilizando una salida fluorescente
rápida tal como se describe a continuación, cambiando después los
parámetros del estímulo para compensar cualquier cambio en el
potencial transmembrana, es posible controlar dinámicamente el
potencial transmembrana de las células. La corriente necesaria para
mantener ese potencial se determinaría entonces mediante el control
por ordenador de los parámetros del
estímulo.
estímulo.
Durante los parámetros de estimulación típicos,
una corriente pico de aproximadamente 50 mA pasa a través de la
disolución entre los electrodos. Durante este tiempo, se producen
varias reacciones electroquímicas que normalmente generan especies
tóxicas para las células. Los experimentos preliminares han
demostrado que la mayor parte de las células de mamífero normalmente
responden durante aproximadamente dos minutos de estimulación
eléctrica utilizando electrodos de acero inoxidable. Sin embargo, la
estimulación prolongada durante periodos de tiempo más largo parece
conducir a una pérdida en la salud y la viabilidad de la célula. A
frecuencias de impulso suficientemente altas, de manera que la
superficie de contacto metal - solución salina no alcance el
potencial para la electrólisis del agua (aproximadamente \pm 1 V
para el acero inoxidable en solución salina), la corriente puede
hacerse pasar capacitativamente y no se generarán productos tóxicos.
En el estimulador eléctrico mostrado en la figura 1, en el que cada
electrodo tiene un área de aproximadamente 24 mm^{2} en contacto
con la solución salina, la capacitancia por electrodo es de
aproximadamente 1-10 \muF (Robinson, 1968, Proc.
IEEE 56: 1065-1071). A 50 mA, esta capacitancia
carga a 1 V en aproximadamente 20-200 \mus. Esto
es en el límite inferior de los tiempos de duración de
impulso
útiles.
útiles.
Alternativamente, es posible realizar la
estimulación eléctrica sin generar productos electrolíticos. Se
dispone de varios tratamientos que pueden aumentar la capacitancia
de la superficie de contacto metal - solución salina en los factores
de 2-100. Estos incluyen rugosificación de la
superficie, electrodeposición con negro de platino o negro de oro, y
deposición y activación de iridio/óxido de iridio, titanio/nitruro
de titanio, o películas de polipirrol. Utilizando los parámetros de
estimulación, que evitan la electroquímica irreversible, estos
tratamientos de superficie no degradan cuando pasa la corriente.
La presente invención puede utilizarse con
cualquier tipo de célula, incluyendo células animales, células
vegetales, células de insecto, células bacterianas, levaduras y
células de mamífero. Para la selección de agentes terapéuticos en
humanos se prefieren las líneas celulares de mamíferos, incluyendo
tales líneas celulares líneas celulares de cultivo tisular que
pueden hacerse crecer de forma relativamente fácil y pueden
transfectarse fácilmente con alta eficacia. Muchas líneas celulares
tisulares están comercialmente disponibles a través de la American
type culture collection (Colección Americana de Cultivos Tipo)
(ATCC), véase (http: //www.atcc.org), así como la European
collection of cell cultures (Colección Europea de Cultivos
Celulares) (ECACC) (http: //www.camr.org.uk).
Adicionalmente, en algunos casos también pueden
preferirse líneas celulares primarias, o cortes de tejido, para la
selección cuando se requiere expresar o medir la respuesta del canal
iónico de interés en su contexto fisiológico nativo. Este enfoque
puede ser útil o bien como una selección primaria o bien como una
secundaria para seleccionar según la especificidad, la selectividad
o la toxicidad de los agentes terapéuticos candidatos, y se trata en
detalle en la sección X.
Para los ensayos realizados en las líneas
celulares en cultivo, los principales criterios de selección son el
potencial transmembrana en reposo de la línea celular, y la
presencia de canales iónicos expresados endógenamente. La selección
de líneas celulares apropiadas para canales iónicos específicos de
interés depende de las propiedades dependientes del voltaje y de la
selectividad de iones del canal iónico de interés. Estas
consideraciones se revisan en detalle para varios los canales
iónicos en la sección VIII, Protocolos de estimulación.
En algunos casos es deseable utilizar una línea
celular que no tenga (o tenga muy poca) expresión endógena
detectable de otros canales iónicos. Las células de este tipo
incluyen las células CHO-K1, CHL y LTK(-). Estas
células tienen intrínsecamente un potencial en reposo en el
intervalo de +10 a -30 mV, que es superior a los umbrales de
activación e inactivación de la mayor parte de los canales
dependientes de voltaje. El uso de estas líneas celulares tiene la
ventaja de que el canal iónico de interés es el principal modulador
del potencial transmembrana dentro de las células de manera que los
datos del ensayo de selección generalmente se interpretan de forma
fácil e inequívoca.
En algunos casos, el uso de una línea celular
sin otros canales iónicos puede no resultar práctico para crear un
ensayo realizable. Por ejemplo, puede ser necesario mantener un ion
regulado por voltaje a un potencial transmembrana altamente
polarizado. En este caso, es necesario controlar el potencial
transmembrana mediante la expresión de un segundo canal iónico. Por
ejemplo, someter a ensayo un canal de sodio de tipo IIa de cerebro
de rata en el estado de reposo requiere que el potencial
transmembrana se mantenga por debajo del potencial de activación
umbral del canal de sodio, en este caso a aproximadamente -60 mV.
Para lograr esto es necesario, o bien coexpresar un canal iónico,
tal como un rectificador entrante de potasio, que puede mantener el
potencial transmembrana en reposo de la célula hasta aproximadamente
-90 mV, o identificar una línea celular que exprese endógenamente
canales iónicos similares. Los tipos celulares de este tipo incluyen
las células RBL y las células HEK-293.
En otros casos puede ser necesario utilizar la
expresión de un segundo canal iónico, junto con la estimulación
eléctrica para excitar la membrana celular a un potencial
transmembrana específico, para permitir que se someta a ensayo el
primer canal iónico de interés. Ejemplos de esta situación se
producen cuando se someten a ensayo canales iónicos no regulados por
voltaje tales como los canales iónicos regulados por ligando. La
coexpresión de un canal de sodio regulado por voltaje, por ejemplo,
junto con la estimulación eléctrica, puede utilizarse para fijar el
potencial transmembrana a potenciales transmembrana de entre
aproximadamente +10 a +60 mV. En comparación, la coexpresión de
canales de potasio regulados por voltaje junto con la estimulación
eléctrica puede fijar el potencial transmembrana a potenciales
transmembrana de entre aproximadamente -90 a -30 mV. Estos enfoques
permiten por tanto la manipulación eficaz del potencial
transmembrana durante un intervalo relativamente amplio permitiendo
así el análisis de prácticamente cualquier canal iónico.
Normalmente, cuando se utiliza este enfoque de
coexpresión es necesario volver a seleccionar cualquier resultado
obtenido con la línea celular que coexpresa ambos canales iónicos,
con la línea celular que expresa sólo el canal iónico utilizado para
fijar el potencial transmembrana. Esto permite que los fármacos que
afectan a este segundo canal iónico se diferencien de los que
realmente influyen en el canal iónico de interés. Alternativamente,
pueden utilizarse toxinas selectivas tales como TTX para inhibir
selectivamente una clase de canal iónico.
Los ácidos nucleicos utilizados para transfectar
células con secuencias que codifican para la expresión del canal
iónico de interés normalmente están en la forma de un vector de
expresión incluyendo secuencias de control de la expresión asociados
operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica para la
expresión del canal. Tal como se utiliza, el término secuencia de
nucleótidos que codifica para la expresión de un canal se refiere a
una secuencia que, con la transcripción y la traducción del ARNm,
produce el canal. Esta puede incluir secuencias que contienen, por
ejemplo, intrones. Tal como se utiliza en el presente documento, el
término secuencias de control de la expresión se refiere a
secuencias de ácido nucleico que regulan la expresión de una
secuencia de ácido nucleico a la que están operativamente unidas.
Las secuencias de control de la expresión están unidas
operativamente a una secuencia de ácido nucleico cuando las
secuencias de control de la expresión controlan y regulan la
transcripción y, según sea apropiado, la traducción de la secuencia
de ácido nucleico. Por tanto, las secuencias de control de la
expresión pueden incluir promotores, potenciadores
("enhancers"), terminadores de la transcripción, un codón de
inicio (es decir, ATG) delante de un gen que codifica para una
proteína, señales de corte y empalme para intrones, el mantenimiento
del marco de lectura correcto para ese gen para permitir la
traducción apropiada del ARNm y codones de terminación
apropiados.
apropiados.
Pueden utilizarse métodos que son bien conocidos
por los expertos en la técnica para construir vectores de expresión
que contienen la secuencia que codifica para el canal iónico,
acoplada operativamente a dominios de localización y selección como
objetivo apropiados y a señales de control de la
transcripción/traducción apropiados. Por ejemplo, haciendo
referencia a los números de registro de la secuencia, o a las
referencias en las tablas 1 a 3, un experto habitual en la técnica
puede identificar la secuencia del canal iónico de interés. Estos
métodos incluyen técnicas sintéticas, técnicas de ADN recombinante
in vitro, y recombinación in vivo/recombinación
genética. (Véanse, por ejemplo, las técnicas descritas en Maniatis,
et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor Laboratory, N.Y., 1989). Se dispone de muchos vectores
de expresión comercialmente disponibles de una variedad de fuente,
incluyendo Clontech (Palo Alto, CA), Stratagene (San Diego, CA) e
Invitrogen (San Diego, CA), así como muchas otras fuentes
comerciales.
Una versión contemplada del método es utilizar
secuencias de nucleótidos para el control inducible para producir un
aumento repentino en la expresión del canal iónico de interés por
ejemplo, induciendo la expresión del canal. Sistemas inducibles
ejemplo incluyen el sistema inducible de tetraciclina descrito por
primera vez por Bujard y sus colegas (Gossen y Bujard (1992) Proc.
Natl. Acad. Sci USA 89 5547-5551, Gossen et
al. (1995) Science 268 1766-1769) y descrito en
la patente de los EE.UU. número 5.464.758.
La transformación de una célula huésped con ADN
recombinante puede llevarse a cabo mediante técnicas convencionales
como se conoce bien por los expertos en la técnica. Cuando el
huésped es una célula procariota, tal como E. coli, pueden
prepararse células competentes que pueden captar ADN a partir de
células recogidas tras la fase de crecimiento exponencial y tratadas
posteriormente mediante el método del CaCl_{2} mediante
procedimientos bien conocidos en la técnica. Alternativamente,
pueden utilizarse MgCl_{2} o RbCl. La transformación también puede
llevarse a cabo tras la formación de un protoplasto de la célula
huésped o mediante electroporación.
Cuando el huésped es una célula eucariota,
pueden utilizarse métodos de transfección de ADN tales como
coprecipitados con fosfato de calcio, procedimientos mecánicos
convencionales tales como microinyección, electroporación, inserción
de un plásmido recubierto en liposomas, o vectores víricos. Las
células eucariotas también pueden cotransfectarse con secuencias de
ADN que codifican para el canal iónico, y una segunda molécula de
ADN extraña que codifica para un fenotipo seleccionable, tal como un
gen de timidina cinasa de herpes simple. Otro método es utilizar un
vector vírico eucariota, tal como el virus de simio 40 (SV40) o el
virus del papiloma bovino, para infectar o transformar de forma
transitoria células eucariotas y expresar el canal iónico.
(Eukaryotic Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory,
Gluzman ed., 1982). Preferiblemente, se utiliza un huésped eucariota
como la célula huésped tal como se describe en el presente
documento.
La selección de clones estables se realizará
normalmente partiendo de la base de la expresión satisfactoria del
canal iónico de interés a un nivel suficiente como para permitir la
detección fácil. En muchos casos, este análisis requerirá la
caracterización funcional de los clones individuales para
identificar los que muestran características electrofisiológicas
apropiadas coherentes con la expresión del clon de interés. Este
análisis puede complementarse mediante el uso de patch clamping, o
mediante la medición de potenciales transmembrana utilizando
colorantes sensibles al potencial transmembrana, tal como se
describe más adelante. Una ventaja para el uso de este último método
es que es compatible con la separación de células activadas por
fluorescencia y proporciona el análisis rápido de muchos miles de
clones individuales por segundo. En algunos casos en los que el
canal de sodio está eléctricamente silencioso en la célula en
reposo, también puede lograrse fácilmente la confirmación de la
expresión mediante inmunoquímica utilizando anticuerpos que surgen
frente al canal iónico natural, o un epítopo definido introducido en
el canal iónico mediante técnicas moleculares, tal como se describió
anteriormente.
En los casos en los que las células se
transfectan con un primer canal iónico de interés, y un segundo
canal iónico para fijar el potencial transmembrana, es importante la
optimización de la expresión relativa de ambos canales iónicos.
Normalmente, la expresión relativa óptima de los dos canales iónicos
se determina empíricamente seleccionando clones que proporcionan en
máximo intervalo dinámico y la mínima variación estadística en su
respuesta.
Los cambios en el potencial transmembrana y la
medición de la conductancia de los canales iónicos específicos
mediante el uso de la presente invención pueden detectarse mediante
el uso de cualquiera de los medios conocidos para medir el potencial
transmembrana o el movimiento de iones. Estos métodos incluyen, por
ejemplo, patch clamping (Hamill et al, Pfluegers Arch. 391:
85-100, 1981), sensores de voltaje basados en FRET,
colorantes para el potencial transmembrana electrocrómicos (Cohen
et al., Annual Reviews of Neuroscience 1:
171-82, 1978), colorantes para el potencial
transmembrana de redistribución (Freedman y Laris, Spectroscopic
membrane probes Ch 16, 1988), electrodos extracelulares (Thomas
et al., Exp. Cell Res. 74: 61-66, 1972),
transistores de efecto campo (Fromherz et al., Science 252:
1290-1293, 1991), ensayos de flujo radiactivo,
colorantes fluorescentes o luminiscentes sensibles a iones,
proteínas fluorescentes o luminiscentes sensibles a iones, la
expresión de proteínas endógenas o el uso de moléculas o genes
indicadores.
Los métodos preferidos de análisis para la
selección de alto rendimiento normalmente implican el uso de
lecturas ópticas del potencial transmembrana, o la conductancia del
canal iónico. Tales métodos incluyen el uso de colorantes o
moléculas sensibles a iones o al potencial transmembrana, que
normalmente muestran un cambio en sus características fluorescentes
o luminiscentes como resultado de cambios en el potencial
transmembrana o en la conductancia del canal iónico.
Un método óptico preferido de análisis para su
uso con la presente invención se ha descrito en la patente de los
EE.UU. número 5.661.035 concedida el 26 de agosto de 1997). Este
enfoque normalmente comprende dos reactivos que experimentan
transferencia de energía para proporcionar una lectura fluorescente
radiométrica que depende del potencial transmembrana. Normalmente,
el enfoque utiliza un colorante lipófilo sensible al voltaje y un
fluoróforo insensible al voltaje asociado con una membrana celular.
(Véase Gonzalez et al. Drug Discovery Today 4:
431-439, 1999).
En una realización, se cargan en la membrana
plasmática de las células dos moléculas de colorante, un fosfolípido
unido a cumarina (CC2-DMPE) y un colorante de
oxonol, tal como bis-(ácido
1,2-dibutilbarbitúrico)trimetina oxonol
[DiSBAC_{4}(3)]. CC2- DMPE divide en la parte exterior de
la membrana plasmática en la que actúa como un donador de FRET
fijado al aceptor de oxonol móvil sensible al voltaje. Las células
con potenciales relativamente negativos en su interior empujarán al
oxonol cargado negativamente hacia la parte exterior de la membrana
plasmática, dando como resultado una FRET eficaz (es decir, la
extinción del donador de cumarina y la excitación del aceptor de
oxonol). La despolarización da como resultado la rápida
translocación del oxonol a la superficie interior de la membrana
plasmática disminuyendo la FRET. Dado que la FRET sólo puede
producirse en distancias inferiores a 100 \ring{A}, la excitación
de la cumarina da como resultado la monitorización específica de los
movimientos del oxonol dentro de la membrana plasmática.
Los tiempos de respuesta para estos ensayos se
alteran fácilmente aumentando o disminuyendo la hidrofobicidad del
oxonol. Por ejemplo, el dibutil oxonol DiSBAC_{4}(3) más
hidrófobo tiene una constante de tiempo de aproximadamente 10 ms,
significativamente más rápida que el dietil oxonol
DiSBAC_{2}(3) menos hidrófobo.
La carga de los colorantes normalmente se logra
a temperatura ambiente antes del comienzo de las mediciones del
potencial transmembrana. Normalmente, las células se cargan
secuencialmente con el lípido de cumarina seguido por el oxonol. Las
concentraciones de carga típicas para los lípidos de cumarina
oscilan desde aproximadamente 4 hasta 15 \muM (concentración
final) y las disoluciones de tinción normalmente se preparan en
solución salina equilibrada de Hanks con HEMES 10 mM, glucosa 2 g/l
y aproximadamente Pluronic-127 al 0,02% a un pH de
aproximadamente 7,2 a 7,4. La carga normalmente es aceptable tras
aproximadamente 30 minutos de incubación, tras lo cual puede
eliminarse el colorante en exceso si se desea. Los colorantes de
oxonol normalmente se cargan a una concentración de entre 2 y 10
\muM durante 25 minutos a temperatura ambiente, el
DiSBAC_{4}(3) más hidrófobo normalmente se carga en
presencia de Pluronic-127 2-3
\muM. Las concentraciones de carga óptimas varían entre los tipos
celulares y pueden determinarse empíricamente mediante
experimentación de rutina. Normalmente tales experimentos de
optimización se llevan a cabo valorando sistemáticamente las
concentraciones del primer reactivo, y después para cada
concentración probada, valorando la concentración del segundo
reactivo. De esta forma es posible obtener tanto las concentraciones
de carga óptimas para cada reactivo, como la razón relativa óptima
para lograr una razón señal - ruido máxima.
En algunos casos puede preferirse añadir, o
cargar uno o más de los reactivos de FRET con una o más sustancias
que absorben luz con el fin de reducir la emisión de luz no deseada,
tal como se describe, por ejemplo, en la solicitud de patente de los
EE.UU. de titularidad común número 09/118.497, presentada el 17 de
julio de 1998; la solicitud de patente de los EE.UU. número
09/120.516, presentada el 21 de julio de 1998, y la solicitud de
patente de los EE.UU. número 09/122.477 presentada el 23 de julio de
1998.
Los sensores de voltaje basados en FRET también
pueden derivarse del uso de otros fluoróforos seleccionados como
objetivo de la membrana junto con un donador o aceptor hidrófobo
móvil. Otras de tales composiciones de describen, por ejemplo, en la
solicitud de patente de los EE.UU. número 09/459.956, presentada el
13 de diciembre de 1999.
Los instrumentos adecuados para medir los
cambios en el potencial transmembrana a través de métodos ópticos
incluyen microscopios, lectores de placas de múltiples pocillos y
otros instrumentos que pueden realizar una detección de
fluorescencia radiométrica rápida y sensible. Un instrumento
preferido de este tipo se describe en la solicitud de patente de los
EE.UU. 09/118.728 presentada el 17 de julio de 1998. Este
instrumento (el Voltaje/Ion Probe Reader (Lector de voltaje/sonda de
ionización) o VIPR™) es un manejador de líquidos integrado y un
lector de fluorescencia cinética para placas de múltiples pocillos
de 96 pocillos y superiores. El lector VIPR™ integra un manejador de
líquidos de ocho canales, una fase de colocación de los múltiples
pocillos y un sistema de detección e iluminación de fibra óptica. El
sistema está diseñado para medir la fluorescencia de una columna de
ocho pocillos simultáneamente antes, durante y tras la introducción
de una muestra líquida obtenida de otra placa de microtítulo o
cubeta. El lector VIPR™ se excita y detecta señales de emisión desde
el fondo de una placa de múltiples pocillos empleando ocho haces
ópticos trifurcados (un haz para cada pocillo). Una rama de la fibra
trifurcada se utiliza como una fuente de excitación, utilizándose
las otras dos ramas de la fibra trifurcada para detectar la emisión
de fluorescencia. Una lente esférica en el extremo de la fibra
aumenta la eficacia de la excitación y la recogida de luz. Las
fibras de emisión bifurcadas permiten que el lector detecte dos
señales de emisión simultáneamente y son compatibles con las señales
rápidas generadas por los colorantes sensibles al voltaje basados en
FRET. Los tubos fotomultiplicadores detectan entonces fluorescencia
de emisión, permitiendo la detección de la razón de emisión
sub-segunda.
En un aspecto, la presente invención incluye
métodos para modular los potenciales transmembrana de células vivas
mediante estimulación eléctrica, y el uso de estos métodos para
someter a ensayo la actividad de prácticamente cualquier canal
iónico o sistema transportador.
Se ha identificado una variedad de diferentes
isoformas de canales de sodio dependientes de voltaje de mamíferos y
se resumen más adelante en la tabla 1. Estos canales pueden
clasificarse en tres grupos principales (para revisión, véase Oroin,
Annals N.Y. Academy of Sciences 868: 38-50,
1999).
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Los canales de sodio dependientes de voltaje en
la tabla 1 varían ampliamente en su dependencia del voltaje y sus
cinéticas de activación e inactivación. Los canales de sodio
regulados por voltaje tienen muchas conformaciones diferentes, que
pueden clasificarse en tres estados. (1) El estado de reposo, en el
que el canal está cerrado y no puede fluir ninguna corriente. Este
es el estado típico cuando un canal de sodio se expresa en una
célula con un potencial transmembrana en reposo inferior a
aproximadamente -60 mV. El canal puede llevarse rápidamente al
estado abierto mediante despolarización, normalmente hasta un
potencial transmembrana superior a aproximadamente -50 mV. (2) El
estado activado, en el que el canal se abre y los iones pasan a su
través. Dado que la concentración intracelular de sodio es baja en
una célula en reposo normal, mientras que la concentración
extracelular es alta, los iones sodio fluyen hacia el interior de la
célula y hacen que el potencial transmembrana sea más positivo. El
estado abierto tiene una corta duración, generalmente del orden de
un milisegundo, tras el cual pasa al estado inactivado. (3) El
estado inactivado, en el que un canal se ha cerrado y los iones no
pueden pasar a través del canal. El canal no puede abrirse
directamente una vez en el estado inactivado. Primero irán al estado
de reposo, que se produce si el potencial transmembrana se mantiene
muy negativo (generalmente inferior a -80 mV) durante varios
milisegundos. Las constantes de tiempo y los potenciales umbral para
las transiciones entre estos tres estados varían enormemente entre
los subtipos de
canal.
canal.
Durante estos experimentos, se comparará la
respuesta para las células con canales activos, y para las células
en las que los canales están bloqueados farmacológicamente. Si no se
dispone de un agente farmacológicamente adecuado, el estado
bloqueado puede emularse con una línea celular no transfectada. Los
parámetros óptimos del estímulo darán el menor coeficiente de
variación de la diferencia en las señales de las dos poblaciones
celulares.
Las células preferidas incluyen aquellas con
potenciales transmembrana en reposo superiores al umbral de
activación para el canal iónico de interés, y en las que no se
expresan otros canales iónicos. Las células que cumplen estos
criterios incluyen las células CHL y LTK(-). Tras escoger un canal
iónico objetivo, las células se transfectan y se seleccionan los
clones, tal como se describe en la sección III. Alternativamente,
podría utilizarse una línea celular que expresa endógenamente el
canal de interés, y bajos niveles de otros canales. Por ejemplo, la
línea celular CHO-K1 expresa un canal de sodio
regulado por voltaje, y niveles muy bajos de otros canales iónicos.
Las células se siembran en placas de microtítulo de múltiples
pocillos, se cultivan y se tiñen con colorantes sensibles al voltaje
tal como se describe en la sección IV antes de iniciar la
estimulación eléctrica. Los experimentos iniciales normalmente se
llevan a cabo en una placa de múltiples pocillos de 96 pocillos, con
igual número de células en cada pocillo. Generalmente, las columnas
de ocho pocillos se estimulan simultáneamente en idénticas
condiciones para proporcionar datos estadísticamente significativos
sobre la variación en la respuesta celular.
Un protocolo de estimulación eléctrica óptimo
debe hiperpolarizar parte de la membrana plasmática de la mayoría de
las células lo suficiente como para liberar los canales de sodio de
la inactivación, antes de proporcionar una despolarización de
activación, sin someter a electroporación o eliminar las células.
Normalmente, esto requiere que se creen dentro de la célula
potenciales transmembrana continuos de aproximadamente -60 a -80 mV
durante periodos que oscilan desde aproximadamente 0,5 hasta
aproximadamente 20 ms.
Un protocolo de estimulación preferido que logra
este efecto es bifásico, de manera que los canales iónicos presentes
en ambos bordes de extremo de las células se liberan de la
inactivación cuando la forma de onda bifásica invierte la polaridad.
Normalmente, se comenzaría con condiciones iniciales utilizando un
núcleo de onda cuadrada bifásica de 5 ms por fase y una amplitud de
25 V/cm. El núcleo se repetiría a una tasa regular de
aproximadamente 20 Hz durante una duración de tren total de
aproximadamente tres segundos. Entonces se optimizaría la amplitud
(hasta un máximo de aproximadamente 60 V/cm), la duración (en el
intervalo de 0,1 a 50 ms), y después la frecuencia del impulso (en
el intervalo de 0 a 1 kHz). Si fuera necesario, también podrían
explorarse cambios en la forma del impulso para determinar si daban
como resultado una estimulación eléctrica más eficaz. Los parámetros
óptimos del estímulo darán la estimulación celular máxima (en
comparación con células con el canal bloqueado o no presente) con el
menor coeficiente de variación de la señal entre los diferentes
pocillos de prueba, a la menor intensidad del campo eléctrico, y al
menor ciclo de trabajo para el paso de la corriente a través de los
electrodos. Una vez elegido un conjunto particular de parámetros,
debe realizarse una valoración de las concentraciones de tinción
para el(los) colorante(s) sensor(es) de voltaje
tal como se describió anteriormente, para optimizar adicionalmente
el tamaño de la señal y el coeficiente de variación de las
respuestas. Estos procedimientos (concentraciones de colorante,
intensidad del campo eléctrico, y duración y frecuencia del
estímulo) pueden repetirse para optimizar la señal
adicionalmente.
Las células preferidas incluyen aquellas con
potenciales transmembrana en reposo inferiores al umbral de
activación para el canal iónico de interés, y en las que la
expresión de otros canales iónicos se limita en buena parte a
algunos tipos de canales iónicos caracterizados. Las células de este
tipo incluyen las células HEK-293 y RBL, así como
las células F11 y HL5. Tras escoger un canal iónico objetivo, las
células se transfectan con el canal iónico de interés y se
seleccionan los clones tal como se describió anteriormente.
Alternativamente, como en el caso de las células F11 y HL5, pueden
utilizarse canales de sodio endógenos. Tras la selección y la
caracterización, los clones celulares se siembran en placas de
microtítulo de múltiples pocillos y se tiñen con colorantes
sensibles al voltaje tal como se describió anteriormente. Al igual
que anteriormente, los experimentos iniciales normalmente se llevan
a cabo en una placa de múltiples pocillos de 96 pocillos, con un
número igual de células en cada pocillo. Generalmente, las columnas
de ocho pocillos se estimulan simultáneamente en idénticas
condiciones para proporcionar datos estadísticamente significativos
sobre la variación en la respuesta celular.
Son posibles varios enfoques de ensayo
dependiendo del nivel de expresión del canal de sodio de interés en
la célula. Para niveles altos de expresión del canal de sodio
dependiente de voltaje, la corriente de sodio puede ser lo
suficientemente grande como para crear un gran cambio en el
potencial transmembrana tras una única secuencia de
activación/inactivación del canal. En estos casos, pequeñas
perturbaciones positivas en el potencial transmembrana creado
mediante la estimulación eléctrica pueden ser suficientes para
activar suficientes canales de sodio de manera que la posterior
entrada del ion sodio despolarice la totalidad de la célula,
activando así todos los canales de sodio. El campo de estímulo
normalmente debe aplicarse durante un tiempo lo suficientemente
largo como para activar los canales, pero no tan largo como para
interferir con el posterior flujo de iones. Una vez que el potencial
transmembrana de la célula se ha repolarizado, puede repetirse el
procedimiento de estimulación. Los posteriores acontecimientos de
estimulación pueden ser idénticos al primero, o variarse para
examinar las propiedades de los canales dependientes del tiempo.
\newpage
Normalmente se comenzaría con condiciones
iniciales utilizando un núcleo de onda cuadrada bifásica de 500
\mus por fase y una amplitud de 10 V/cm. Entonces se optimizaría
la amplitud (entre 5 y 60 V/cm) y la duración del impulso (entre 0,1
y 1 ms). Si fuera necesario, también podrían explorarse cambios en
la forma del impulso para determinar si daban como resultado una
estimulación eléctrica más eficaz. Los parámetros óptimos del
estímulo darán la estimulación celular máxima con el menor
coeficiente de variación de la señal entre los diferentes pocillos
de prueba, a la menor intensidad del campo eléctrico, y al menor
ciclo de trabajo para el paso de la corriente a través de los
electrodos. Una vez elegido un conjunto particular de parámetros,
debe realizarse una valoración de las concentraciones de tinción
para el(los) colorante(s) sensor(es) de voltaje
tal como se describió anteriormente, para optimizar adicionalmente
el tamaño de la señal y el coeficiente de variación de las
respuestas. Estos procedimientos (concentraciones de colorante,
intensidad del campo eléctrico, y duración y frecuencia del
estímulo) pueden repetirse para optimizar la señal
adicionalmente.
A menudo será necesario utilizar células cuya
expresión de canales de sodio es demasiado baja como para dar
tamaños de señal aceptables a partir de un único estímulo. También
puede ser deseable mantener una gran señal durante un periodo de
tiempo prolongado. En estos casos, puede administrarse a las células
trenes de impulsos tal como se describió para los canales mantenidos
por encima del potencial de activación. Con impulsos de estimulo
bifásicos, los canales de sodio pueden activarse independientemente
del potencial transmembrana de partida. Manteniendo el intervalo
entre impulsos más corto que la constante de tiempo de membrana,
cada estímulo conducirá corriente hacia el interior de la célula
hasta que se establezca un equilibrio entre las corrientes hacia el
interior y hacia el exterior. Esta desviación del voltaje se
mantendrá siempre que continúe el tren de estímulos.
Los protocolos de estimulación en este caso son
esencialmente los mismos que los descritos para las células cuyo
potencial en reposo es superior al umbral de inactivación. En
general, se llevan a cabo una serie de experimentos iniciales
utilizando un núcleo de onda cuadrada bifásica repetido a una tasa
regular durante una duración de tren fijada. La duración de impulso
varía desde aproximadamente 1 \mus hasta aproximadamente 1 s, y
más preferiblemente desde aproximadamente 100 \mus hasta
aproximadamente 20 ms. La amplitud del impulso varía desde 0 V/cm
hasta aproximadamente 60 V/cm, y más preferiblemente desde 10 V/cm
hasta 50 V/cm. La frecuencia de estimulación varía entre 0 Hz (es
decir, un único impulso) y 100 kHz, y más preferiblemente desde 0 Hz
hasta aproximadamente 1 kHz. El tren de impulsos varía entre 0 s (es
decir, un único impulso) y aproximadamente 100 s, y más
preferiblemente entre 0 s y 10 s. Los parámetros óptimos del
estímulo darán los cambios máximos en el potencial transmembrana (en
comparación con células con el canal bloqueado o no presente) y el
menor coeficiente de variación de la señal entre los pocillos de
prueba, a la menor intensidad del campo eléctrico. Una vez elegido
un conjunto particular de parámetros, normalmente se realiza una
valoración de las concentraciones de tinción para el(los)
colorante(s) sensor(es) de voltaje tal como se
describió anteriormente para optimizar adicionalmente el tamaño de
la señal y el coeficiente de variación de las respuestas. Estos
procedimientos (concentraciones de colorante, intensidad del campo
eléctrico, y duración y frecuencia del estímulo) pueden repetirse
para optimizar la señal adicionalmente.
Los canales de potasio dependientes de voltaje
repolarizan las células nerviosas y musculares tras la
despolarización del potencial de acción. También pueden desempeñar
papeles reguladores importantes en los sistemas neurológico,
muscular, secretor y excretor. La mayor parte de las células
mantienen activamente una alta concentración de potasio
intracelular, de manera que el potencial transmembrana de inversión
para el potasio es de aproximadamente -90 mV. El potasio normalmente
fluye fuera de la célula, de manera que abrir más canales selectivos
de potasio tiende a hacer que el potencial transmembrana sea más
negativo, a diferencia de la apertura del canal de sodio que
normalmente hace que el potencial transmembrana sea más
positivo.
En la tabla 2 a continuación se presenta un
resumen de los numerosos subtipos de potasio.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Los canales de potasio muestran una enorme
diversidad en lo que se refiere a las constantes de tiempo de
activación e inactivación y a las dependencias del voltaje. En
general, los canales de potasio dependientes de voltaje muestran una
dependencia del voltaje similar a la de los canales de sodio,
estando cerrados a potenciales muy negativos y abriéndose por encima
de un cierto umbral. Los canales de potasio pueden tener múltiples
estados de reposo, múltiples estados inactivados, y normalmente un
único estado activado. A diferencia de los canales de sodio
dependientes de voltaje, se permiten las transiciones entre la
mayoría de los estados. Estas transiciones son activación
(movimiento desde un estado de reposo hasta uno abierto),
desactivación (movimiento desde un estado abierto hasta un estado de
reposo), inactivación (movimiento desde un estado de reposo o
abierto hasta un estado inactivado), liberación de la inactivación
(movimiento desde un estado inactivado hasta un estado de reposo), y
oscilación (movimiento desde un estado inactivado hasta el estado
abierto). Hay una gran diversidad en los umbrales de las
transiciones y en las dependencias del voltaje de las tasas de
transición. Las constantes de tiempo de activación oscilan desde 0,1
hasta 1000 ms con potenciales de activación umbral desde -80 hasta
+20 mV. Las constantes de tiempo de inactivación oscilan desde 0,1
hasta el infinito (es decir, sin inactivación) con potenciales
umbral desde -60 hasta 0 mV. Las constantes de tiempo para la
liberación de la inactivación oscilan desde 0,5 ms hasta 100 ms con
potenciales umbral desde -70 hasta 0 mV.
Los protocolos de estímulo necesarios para
obtener señales medibles dependientes de canal son algo dependientes
de las propiedades específicas del canal en cuestión. Debido a la
diversidad en los parámetros en los canales de potasio dependientes
de voltaje, la optimización de un protocolo de estimulación
eléctrica puede llevar varias repeticiones.
Durante estos experimentos, se comparará la
respuesta para las células con canales activos, y para las células
en las que los canales están bloqueados farmacológicamente. Si no se
dispone de un agente farmacológicamente adecuado, el estado
bloqueado puede estimularse con una línea celular no transfectada.
Los parámetros óptimos del estímulo darán el menor coeficiente de
variación de la diferencia en las señales de las dos poblaciones
celulares.
Dado que los canales de potasio generan
corrientes hacia el exterior, la activación de los canales produce
cambios negativos en el potencial transmembrana. En condiciones
fisiológicas, el potencial de inversión para el potasio es de
aproximadamente -90 mV. Dado que las células que expresan sólo un
canal de potasio dependiente de voltaje generalmente tienen
potenciales en reposo próximos al umbral de activación, la
estimulación directa debe funcionar para aquellos canales de potasio
dependientes de voltaje que tienen un umbral de activación superior
a aproximadamente -50 mV. Aunque pueden detectarse de manera fiable
pequeñas desviaciones negativas en el potencial transmembrana
(cambio inferior a 40 mV) utilizando colorantes sensibles al voltaje
de FRET, a menudo es preferible realizar selecciones de alto
rendimiento con señales mayores.
Los tipos celulares preferidos incluyen aquellas
células que expresan un nivel mínimo de otros canales iónicos, tales
como CHO-K1, CHL y LTK(-). La transfección y la
selección de clones que expresan canales iónicos de interés
generalmente se llevarán a cabo tal como se describió anteriormente
para los canales iónicos de sodio normalmente en el estado de
reposo. Alternativamente, podría utilizarse una línea celular que
expresa endógenamente el canal de interés. El marcaje y la medición
de las células con colorantes para el potencial transmembrana
generalmente se llevarán a cabo tal como se describió para los
canales iónicos de sodio normalmente en el estado de reposo.
El protocolo de estimulación despolarizará
ventajosamente parte de la membrana plasmática de longitud
suficiente como para activar los canales de potasio dependientes de
voltaje. A diferencia del caso para los canales de sodio
dependientes de voltaje, los canales de potasio dependientes de
voltaje normalmente pasarán corriente durante la fase de
despolarización del impulso de estímulo. En el lado de la célula en
el que el potencial transmembrana se lleva en una dirección
negativa, los canales de potasio se liberan de la inactivación (si
el canal en cuestión experimenta inactivación dependiente de
voltaje). En el lado de la célula en el que el potencial
transmembrana se lleva en una dirección positiva, los canales de
potasio se activan y pasan la corriente hacia el exterior. Por
tanto, la duración del impulso de estímulo no debe superar mucho el
tiempo de inactivación. La corriente de potasio tiende a llevar al
potencial transmembrana promedio en dirección negativa desde el
potencial en reposo. Tras el impulso de estímulo, el potencial
transmembrana se relajará exponencialmente hasta el potencial en
reposo. Mediante la repetición del estímulo tras un tiempo más corto
que la constante de tiempo de membrana, la membrana celular promedio
puede hacerse más negativa. Utilizando un tren de estímulos, puede
obtenerse una señal grande y continua.
Un protocolo de estimulación preferido que logra
este efecto es bifásico, de manera que los canales iónicos presentes
en ambos bordes de extremo de las células pueden participar en la
mejora del movimiento del ion potasio. Normalmente se comenzaría con
condiciones iniciales utilizando un núcleo de onda cuadrada bifásica
de 5 ms por fase y una amplitud de 25 V/cm. El núcleo se repetiría a
una tasa regular de aproximadamente 20 Hz durante una duración de
tren total de aproximadamente tres segundos. Entonces se optimizaría
la amplitud, la duración y después la frecuencia del impulso. Si
fuera necesario, también podrían explorarse cambios en la forma del
impulso para determinar si daban como resultado una estimulación
eléctrica más eficaz. Los parámetros óptimos del estímulo darán el
cambio máximo promedio en el potencial transmembrana (en comparación
con células con el canal bloqueado o no presente) con el menor
coeficiente de variación de la señal entre los diferentes pocillos
de prueba, a la menor intensidad del campo eléctrico, y al menor
ciclo de trabajo para el paso de la corriente a través de los
electrodos. Una vez elegido un conjunto particular de parámetros,
debe realizarse una valoración de las concentraciones de tinción
para el(los) colorante(s) sensor(es) de voltaje
tal como se describió anteriormente, para optimizar adicionalmente
el tamaño de la señal y el coeficiente de variación de las
respuestas. Estos procedimientos (concentraciones de colorante,
intensidad del campo eléctrico, y duración y frecuencia del
estímulo) pueden repetirse para optimizar la señal
adicionalmente.
Contrariamente a su nombre, la función del canal
rectificador entrante es no permitir que entre potasio en la célula.
El flujo hacia el interior de potasio sólo puede producirse (1)
cuando el potencial transmembrana cae por debajo de los potenciales
de equilibrio del potasio, o (2) si aumenta la concentración
extracelular de potasio. Normalmente no se produce ninguna de estas
situaciones, porque (1) en condiciones fisiológicas normales, dado
que el potasio es el ion con el potencial de inversión más negativo,
ninguna corriente iónica puede hacer que el potencial sea más
negativo que el potencial de inversión del potasio, y (2) excepto en
condiciones patológicas, la concentración extracelular de potasio
está rigurosamente controlada. Sin embargo, utilizando la
estimulación eléctrica, partes de la membrana celular pueden
llevarse a niveles por debajo de V_{K}, potenciando la entrada del
ion potasio en la célula. Esto producirá un cambio en el potencial
transmembrana positivo neto y puede detectarse como una señal
positiva. Para desarrollar y optimizar un ensayo para bloqueantes
del rectificador entrante, podría seguirse, por tanto, el
procedimiento siguiente.
Los tipos celulares preferidos incluyen aquellas
células que expresan un nivel mínimo de otros canales iónicos, tales
como CHO-K1, CHL, y LTK(-). La transfección y la
selección de clones que expresan canales iónicos de interés
generalmente se llevarán a cabo tal como se describió anteriormente
para los canales iónicos de sodio normalmente en el estado de
reposo. Alternativamente, podría utilizarse una línea celular que
expresa endógenamente el canal de interés. El marcaje y la medición
de las células con colorantes para el potencial transmembrana
generalmente se llevarán a cabo tal como se describió para los
canales iónicos de sodio normalmente en el estado de reposo.
Un protocolo de estimulación preferido utiliza
un núcleo bifásico, de manera que participen los canales iónicos
presentes en ambos bordes de extremo de las células. Normalmente se
comenzaría con condiciones iniciales utilizando un núcleo de onda
cuadrada bifásica de 5 ms por fase y una amplitud de 25 V/cm. El
núcleo se repetiría a una tasa regular de aproximadamente 20 Hz
durante una duración de tren total de aproximadamente tres segundos.
Entonces se optimizaría la amplitud, la duración y después la
frecuencia del impulso. Si fuera necesario, también podrían
explorarse cambios en la forma del impulso para determinar si daban
como resultado una estimulación eléctrica más eficaz. Los parámetros
óptimos del estímulo darán la estimulación celular máxima (en
comparación con células con el canal bloqueado o no presente) con el
menor coeficiente de variación de la señal entre los diferentes
pocillos de prueba, a la menor intensidad del campo eléctrico, y al
menor ciclo de trabajo para el paso de la corriente a través de los
electrodos. Una vez elegido un conjunto particular de parámetros,
debe realizarse una valoración de las concentraciones de tinción
para el(los) colorante(s) sensor(es) de voltaje
tal como se describió anteriormente, para optimizar adicionalmente
el tamaño de la señal y el coeficiente de variación de las
respuestas. Estos procedimientos (concentraciones de colorante,
intensidad del campo eléctrico, y duración y frecuencia del
estímulo) pueden repetirse para optimizar la señal
adicionalmente.
Este método supone el uso de una línea celular
que expresa el canal de potasio dependiente de voltaje de interés y
que también expresa un canal de sodio dependiente de voltaje. En
este método el enfoque es utilizar protocolos de estimulación
eléctrica diseñados para activar específicamente el canal de sodio
dependiente de voltaje. En este caso, la estimulación eléctrica hace
que los iones sodio entren en la célula, produciendo un cambio de
voltaje positivo. La presencia del canal de potasio de interés
tenderá a suprimir la respuesta positiva del canal de sodio
permitiendo que los iones potasio salgan de la célula. El ensayo se
aprovecha de la ausencia de corriente hacia el exterior cuando un
compuesto químico de prueba bloquea el canal de potasio,
restableciendo así la gran respuesta al voltaje positivo inducida
normalmente por la activación de los canales de sodio. La
optimización del equilibrio de las corrientes es importante en este
método para garantizar que el ensayo es sensible al bloqueo del
canal de potasio. Si la corriente de sodio es demasiado pequeña con
respecto a la corriente de potasio, la curva dosis - respuesta para
el bloqueante del canal de potasio cambiará hacia las
concentraciones superiores. Por ejemplo, en el caso extremo en el
que la corriente de potasio sea 100 veces superior que la corriente
de sodio, el 99% de los canales de potasio tendrían que estar
bloqueados con el fin de conseguir una respuesta del 50% de los
canales de sodio.
Dado que este método supone excitar un canal de
sodio dependiente de voltaje con impulsos repetitivos, el desarrollo
del protocolo es esencialmente el mismo al descrito anteriormente
para los canales de sodio activados por voltaje en un estado
inactivado. Normalmente se comenzaría con condiciones iniciales
utilizando un núcleo de onda cuadrada bifásica de 5 ms por fase y
una amplitud de 25 V/cm. El núcleo se repetiría a una tasa regular
de aproximadamente 20 Hz durante una duración de tren total de
aproximadamente tres segundos. Entonces se optimizaría la amplitud,
la duración y después la frecuencia del impulso. Si fuera necesario,
también podrían explorarse cambios en la forma del impulso para
determinar si daban como resultado una estimulación eléctrica más
eficaz. Los parámetros óptimos del estímulo darán la estimulación
celular máxima (en comparación con células con el canal bloqueado o
no presente) con el menor coeficiente de variación de la señal entre
los diferentes pocillos de prueba, a la menor intensidad del campo
eléctrico, y al menor ciclo de trabajo para el paso de la corriente
a través de los electrodos. Una vez elegido un conjunto particular
de parámetros, debe realizarse una valoración de las concentraciones
de tinción para el(los) colorante(s) sensor(es)
de voltaje tal como se describió anteriormente, para optimizar
adicionalmente el tamaño de la señal y el coeficiente de variación
de las respuestas. Estos procedimientos (concentraciones de
colorante, intensidad del campo eléctrico, y duración y frecuencia
del estímulo) pueden repetirse para optimizar la señal
adicionalmente.
En este formato de ensayo, idealmente no habrá
respuesta (o habrá una muy pequeña) a la estimulación en ausencia de
bloqueo del canal, debido a que la corriente de potasio
contrarrestará la corriente de sodio. Por tanto, para optimizar las
condiciones del estímulo, será necesario comparar las respuestas con
y sin la actividad del canal de potasio. Idealmente, esto se llevará
a cabo utilizando un bloqueante selectivo del canal de potasio. En
aquellos casos en los que tal bloqueante todavía se desconozca, será
posible utilizar la línea celular que contiene sólo el contracanal
de sodio.
Dado que este formato de ensayo implica dos
canales iónicos, los moduladores de cualquiera de los canales
afectarán a la respuesta al voltaje. En este caso, un éxito (un
bloqueante del canal de potasio) restablecerá la respuesta al
voltaje. El formato de selección hace caso omiso automáticamente de
los compuestos que sólo bloquean el canal de sodio. Sin embargo, la
estimulación de las células en presencia de compuestos que bloquean
ambos canales también dará como resultado la no desviación del
voltaje, lo que sugiere que el compuesto es inactivo. Dado que los
compuestos de este tipo pueden ser de interés, también se dispone de
un método para desenmascararlos. Mediante la realización de la
selección de compuesto idéntica utilizando la línea celular
original, que contiene el canal de sodio pero no el canal de
potasio, pueden encontrarse bloqueantes del canal de sodio. Los
compuestos que se encuentra que bloquean el canal de sodio pueden
someterse a prueba entonces separadamente para encontrar si tienen
actividad frente al canal de potasio.
Los canales de calcio se encuentran generalmente
en muchas células en las que, entre otras funciones, desempeñan
importantes papeles en la transducción de la señal. En las células
excitables, el calcio intracelular suministra una corriente hacia el
interior mantenida durante largas respuestas de despolarización y
sirve como el enlace entre la despolarización y otros mecanismos
intracelulares de transducción de la señal. Al igual que los canales
de sodio regulados por voltaje, los canales de calcio regulados por
voltaje tienen múltiples estados de reposo, activado e
inactivado.
Se han identificado múltiples tipos de canales
de calcio en células de mamífero procedentes de diversos tejidos,
incluyendo músculo esquelético, músculo cardiaco, pulmón, músculo
liso y cerebro, [véase, por ejemplo, Bean, B. P. (1989) Ann. Rev.
Physiol. 51: 367-384 y Hess, P. (1990) Ann. Rev.
Neurosci. 56: 337]. Los diferentes tipos de canales de calcio se han
clasificado ampliamente en cuatro clases, los tipos L, T, N y P,
distinguiéndose por las cinéticas de corriente, la sensibilidad del
potencial basal y la sensibilidad a agonistas y antagonistas del
canal de calcio. Se han propuesto cuatro subtipos de canales de
calcio neuronales dependientes de voltaje (Swandulla, D. et
al., Trends in Neuroscience 14: 46, 1991).
Se han determinado el ADNc y las secuencias de
aminoácidos correspondientes de las subunidades \alpha1,
\alpha2, \beta y \gamma del canal de calcio del músculo
esquelético del conejo [véase, Tanabe et al. (1987) Nature
328: 313-318; Ruth et al. (1989) Science 245:
1115-1118; y patente de los EE.UU. número
5.386.025]. Además, también se han determinado el ADNc y las
secuencias de aminoácidos correspondientes de las subunidades
\alpha1 de los canales de calcio del músculo cardiaco [Mikami, A.
et al. (1989) Nature 340: 230-233] y el
pulmón [Biel, M. (1990) FEBS Letters 269: 409-412]
del conejo. Además, se han aislado clones de ADNc que codifican para
un canal de calcio de cerebro de conejo (designado como el canal BI)
[Mori, Y. et al. (1991) Nature 350:
398-402].
Se han aislado clones de ADNc parciales que
codifica para partes de varios subtipos diferentes, denominados las
clases A, B, C y D de cerebro de rata, de la subunidad \alpha1 del
canal de calcio a partir de bibliotecas de ADNc de cerebro de rata
[Snutch, T. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:
3391-3395]. Más recientemente, se han aislado clones
de ADNc de longitud completa de la clase A [Starr, T. et al.
(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 5621-5625] y
la clase C [Snutch, T. et al. (1991) Neuron 7:
45-57] de cerebro de rata. Aunque la secuencia de
aminoácidos codificada por el ADN de clase C de cerebro de rata es
aproximadamente idéntica en un 95% a la codificada por el ADN que
codifica para la subunidad \alpha1 del canal de calcio del músculo
cardiaco del conejo, la secuencia de aminoácidos codificada por el
ADN de clase A del cerebro de rata sólo comparte un 33% de identidad
de secuencia con la secuencia de aminoácidos codificada por el ADN
que codifica para la subunidad \alpha1 del músculo cardiaco o
esquelético del conejo. También se ha obtenido un clon de ADNc que
codifica para otra subunidad \alpha1 del canal de calcio del
cerebro de rata [Hui, A. et al. (1991) Neuron 7:
35-44]. La secuencia de aminoácidos codificada por
este clon es aproximadamente homóloga en un 70% a las proteínas
codificadas por el ADN del canal de calcio del músculo cardiaco y
esquelético del conejo. También se ha aislado un clon de ADNc
estrechamente relacionado con el ADNc que codifica para la subunidad
\alpha1 de la clase C del cerebro de rata y secuencias de clones
de ADNc parciales estrechamente relacionadas con otros clones de
ADNc parciales aparentemente diferentes de las subunidades \alpha1
del canal de calcio [véase, Snutch, T. et al. (1991) Neuron
7: 45-57; Perez-Reyes, E. et
al. (1990) J. Biol. Chem. 265: 20430; y Hui, A. et al.
(1991) Neuron 7: 35-44].
Para los canales de calcio conocidos que se han
caracterizado, las constantes de tiempo de activación oscilan desde
0,1 hasta 10 ms con potenciales umbral desde -80 hasta -20 mV. Las
constantes de tiempo de inactivación oscilan desde 0,1 hasta
\infty (es decir, no inactivación) con potenciales umbral desde
-60 hasta -20 mV. Las constantes de tiempo para la liberación de la
inactivación oscilan desde 0,5 ms hasta 100 ms con potenciales
umbral desde -70 hasta -40 mV.
La elección de la línea celular y la inducción
de las corrientes de calcio dependientes de voltaje se llevan a cabo
utilizando las directrices y enfoques generales tratados
anteriormente para los canales de sodio.
Los tipos celulares preferidos incluyen aquellas
células que expresan un nivel mínimo de otros canales iónicos, tales
como CHO-K1, CHL y LTK(-). La transfección y la
selección de clones que expresan canales iónicos de interés
generalmente se llevarán a cabo tal como se describió anteriormente
para los canales iónicos de sodio normalmente en el estado de
reposo. Alternativamente, podría utilizarse una línea celular que
expresa endógenamente el canal de interés. El marcaje y la medición
de las células con colorantes para el potencial transmembrana
generalmente se llevarán a cabo tal como se describió para los
canales iónicos de sodio normalmente en el estado de reposo.
Alternativamente, las células pueden cargarse con colorantes
fluorescentes sensibles al calcio tales como Calcium Green,
fluo3-AM, o indo-1.
En las células con bajas corrientes de fondo,
pueden generarse fuertes corrientes de calcio hacia el interior
haciendo que partes de la membrana sean lo suficientemente negativas
como para liberar los canales de la inactivación. Entonces, mediante
la inversión o la liberación del campo eléctrico externo, los
canales se exponen a potenciales que activan los canales y permiten
que la corriente de calcio fluya hacia el interior de la célula. El
potencial de inversión para el calcio en la mayoría de las células
generalmente es de +60 a +100 mV, por lo que son posibles grandes
cambios en el voltaje debidos al flujo hacia el interior del calcio.
Se pueden utilizar, o bien colorantes sensibles al voltaje unidos a
la membrana o colorantes de calcio intracelulares para monitorizar
la actividad de las células. Debido a la similitud en las
propiedades de los canales de calcio y de sodio, se aplicarán los
mismos procedimientos de optimización del ensayo generales
explicados anteriormente para los canales de sodio.
Normalmente se comenzaría con condiciones
iniciales utilizando un núcleo de onda cuadrada bifásica de 5 ms por
fase y una amplitud de 25 V/cm. El núcleo se repetiría a una tasa
regular de aproximadamente 20 Hz durante una duración de tren total
de aproximadamente tres segundos. Entonces se optimizaría la
amplitud, la duración y después la frecuencia del impulso. Si fuera
necesario, también podrían explorarse cambios en la forma del
impulso para determinar si daban como resultado una estimulación
eléctrica más eficaz. Los parámetros óptimos del estímulo darán la
estimulación celular máxima (en comparación con células con el canal
bloqueado o no presente) con el menor coeficiente de variación de la
señal entre los diferentes pocillos de prueba, a la menor intensidad
del campo eléctrico, y al menor ciclo de trabajo para el paso de la
corriente a través de los electrodos. Una vez elegido un conjunto
particular de parámetros, debe realizarse una valoración de las
concentraciones de tinción para el(los) colorante(s)
sensor(es) de voltaje tal como se describió anteriormente,
para optimizar adicionalmente el tamaño de la señal y el coeficiente
de variación de las respuestas. Estos procedimientos
(concentraciones de colorante, intensidad del campo eléctrico, y
duración y frecuencia del estímulo) pueden repetirse para optimizar
la señal adicionalmente.
Durante estos experimentos, se comparará la
respuesta para las células con canales activos, y para las células
en las que los canales están bloqueados farmacológicamente. Si no se
dispone de un agente farmacológicamente adecuado, el estado
bloqueado puede emularse con una línea celular no transfectada. Los
parámetros óptimos del estímulo darán el menor coeficiente de
variación de la diferencia en las señales de las dos poblaciones
celulares.
Los canales de cloruro se encuentran en las
membranas plasmáticas de prácticamente todas las células del
organismo. Los canales de cloruro median una variedad de funciones
celulares, incluyendo la regulación de los potenciales transmembrana
y la absorción y la secreción de iones a través de las membranas
epiteliales. Cuando están presentes en las membranas intracelulares
del aparato de Golgi y las vesículas endocíticas, los canales de
cloruro también regulan el pH del orgánulo. Para una revisión, véase
Greger, R (1988) Annu. Rev. Physiol. 50:
111-122.
Las tres clases distintas de canales de cloruro
se basan aparentemente en su tipo de regulación y en la conformación
estructural, tabla 3. La primera clase incluye las superfamilias del
receptor de GABA y glicina, la segunda clase incluye el CFTR (Cystic
Fibrosis Transmembrana Conductance Regulator, regulador de la
conductancia transmembrana de la fibrosis cística) y la tercera
clase incluye los canales de cloruro regulados por voltaje.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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A diferencia de los iones como el sodio y
especialmente el calcio, el gradiente electroquímico del cloruro a
través de la membrana plasmática generalmente no se aleja del
equilibrio. Por tanto, al potencial en reposo de las células, la
apertura de los canales de cloruro no conducirá a grandes
fluctuaciones del voltaje de la membrana plasmática ni a cambios
drásticos en la concentración de cloruro intracelular. Dado que la
estimulación eléctrica normalmente genera cambios de voltaje
simétricos a través de la membrana celular, no puede generarse un
flujo de cloruro neto, a menos que la conductividad del canal sea no
lineal. Para una conductancia de fuga lineal, un campo eléctrico
uniforme conducirá cloruro hacia el interior de la célula en un lado
y hacia fuera de la célula en el otro lado.
La estimulación eléctrica directa de los canales
de cloruro que tienen curvas de conductancia no lineares
(rectificadores) o regulación activada por voltaje, puede generar
flujos de iones netos que, a su vez, producirán cambios detectables
en el potencial transmembrana. Dependiendo de la dependencia del
voltaje de la conductancia y la regulación, el cambio en el
potencial transmembrana puede ser positivo o negativo. Para los
canales de cloruro típicos (que se activan a potenciales elevados y
se cierran a los potenciales más negativos) y para los
rectificadores hacia el exterior, el cloruro fluirá hacia el
interior de la célula y hará que el potencial transmembrana sea
negativo. Para los rectificadores hacia el interior, el cloruro se
conducirá hacia fuera de la célula y el potencial transmembrana se
hará positivo.
Debido a la pequeña diferencia entre el
potencial de inversión del cloruro y el potencial transmembrana en
reposo, la estimulación directa de un canal de cloruro regulado por
voltaje puede dar como resultado cambios insuficientes en el
potencial transmembrana. Entonces, pueden desarrollarse ensayos para
estos canales iónicos utilizando la coexpresión y la estimulación
eléctrica de un contracanal de sodio o potasio, con el fin de
producir una corriente hacia el interior o hacia el exterior. La
presencia o ausencia de la corriente de cloruro puede determinarse
entonces mediante la ausencia o presencia de un cambio en el
potencial transmembrana cuando el contracanal se estimula
eléctricamente.
Los tipos celulares preferidos incluyen aquellas
células que expresan un nivel mínimo de otros canales iónicos, tales
como CHO-K1, CHL, y LTK(-). La transfección y la
selección de clones que expresan canales iónicos de interés
generalmente se llevarán a cabo tal como se describió anteriormente
para los canales iónicos de sodio normalmente en el estado de
reposo. Alternativamente, podría utilizarse una línea celular que
expresa endógenamente el canal de interés (o el contracanal). El
marcaje y la medición de las células con colorantes para el
potencial transmembrana generalmente se llevarán a cabo tal como se
describió para los canales iónicos de sodio normalmente en el estado
de reposo.
Normalmente se comenzaría con condiciones
iniciales utilizando un núcleo de onda cuadrada bifásica de 5 ms por
fase y una amplitud de 25 V/cm. El núcleo se repetiría a una tasa
regular de aproximadamente 20 Hz durante una duración de tren total
de aproximadamente tres segundos. Entonces se optimizaría la
amplitud, la duración y después la frecuencia del impulso. Si fuera
necesario, también podrían explorarse cambios en la forma del
impulso para determinar si daban como resultado una estimulación
eléctrica más eficaz. Los parámetros óptimos del estímulo darán la
estimulación celular máxima (en comparación con células con el canal
bloqueado o no presente) con el menor coeficiente de variación de la
señal entre los diferentes pocillos de prueba, a la menor intensidad
de campo eléctrico, y al menor ciclo de trabajo para el paso de la
corriente a través de los electrodos. Una vez elegido un conjunto
particular de parámetros, debe realizarse una valoración de las
concentraciones de tinción para el(los) colorante(s)
sensor(es) de voltaje tal como se describió anteriormente,
para optimizar adicionalmente el tamaño de la señal y el coeficiente
de variación de las respuestas. Estos procedimientos
(concentraciones de colorante, intensidad del campo eléctrico, y
duración y frecuencia del estímulo) pueden repetirse para optimizar
la señal adicionalmente.
Durante estos experimentos, se comparará la
respuesta para las células con canales activos, y para las células
en las que los canales están bloqueados farmacológicamente. Si no se
dispone de un agente farmacológicamente adecuado, el estado
bloqueado puede emularse con una línea celular no transfectada. Los
parámetros óptimos del estímulo darán el menor coeficiente de
variación de la diferencia en las señales de las dos poblaciones
celulares.
La familia de canales iónicos dependientes de
ligando es grande y diversa. Los canales iónicos dependientes de
ligando se abren en respuesta a la unión de moléculas específicas.
Normalmente median la transmisión sináptica rápida entre neuronas, y
desde las neuronas hasta las células musculares. También median la
transmisión sináptica lenta y controlan una variedad de mecanismos
reguladores. Los canales iónicos regulados por ligando generalmente
sólo son selectivos de carga; es decir, permiten el flujo de un
intervalo de aniones o cationes, pero tienen poca especificidad.
Tienen una enorme variación en sus cinéticas de activación,
desactivación, y desensibilización, pudiendo variar todas ellas
desde constantes de tiempo de submilisegundos hasta de segundos.
Cuando el ligando se une al receptor del canal,
el canal experimenta uno o más cambios conformacionales para activar
el canal. Si el ligando se extrae de la solución salina que baña,
los ligando unidos se disocian y el canal se cierra. Si el ligando
permanece en la solución salina que baña, algunos canales se
desensibilizan y retienen el ligando pero moviéndose hacia un estado
conformacional diferente en el que el canal está cerrado. Las
distribuciones de equilibrio entre los estados activado, desactivado
y desensibilizado varían enormemente entre canales.
En los formatos de ensayo actuales, el potencial
transmembrana de las células se monitoriza durante una adición de
ligando. El aumento repentino en la conductancia cuando el canal se
abre lleva el potencial transmembrana hacia un nuevo potencial de
inversión. Desgraciadamente, para muchos canales regulados por
ligando el nuevo potencial de inversión normalmente está dentro de
15 mV de potencial en reposo. Este pequeño cambio es suficiente para
su uso en la señalización dentro de las células, pero dificulta los
ensayos farmacológicos.
En un ensayo de estimulación eléctrica para los
canales iónicos regulados por ligando, un enfoque es coexpresar un
contracanal de sodio regulado por voltaje con el canal iónico
regulado por ligando de interés. Este enfoque permite modular el
potencial transmembrana mediante estimulación eléctrica. Si se
añaden los compuestos de prueba a las células durante o antes de la
estimulación eléctrica, el método permite un análisis de si el canal
regulado por ligando está abierto o cerrado. Si los canales
regulados por ligando están abiertos, la alta conductancia en reposo
de la célula suprimirá la respuesta de voltaje a la estimulación
eléctrica. Sin embargo, si los canales regulados por ligando están
bloqueados, las células tendrán una gran respuesta a la estimulación
eléctrica. La gran cantidad de flexibilidad en los parámetros de
estimulación eléctrica debe permitir someter a ensayo un gran
intervalo de conductancias en reposo. Esto es importante en el caso
de los canales regulados por ligando, porque la conductancia en
reposo en presencia del ligando es muy sensible a la
desensibilización en equilibrio. Al considerar la desensibilización
y las variaciones en la expresión del canal, se pueden obtener
resistencias en reposo de la membrana que oscilan en cualquier parte
desde 10 M\Omega hasta 10 G\Omega. Con canales de sodio de tipo
IIa de cerebro de rata como el contracanal, se puede cubrir la
totalidad de este intervalo. También debe ser posible seleccionar
tanto agonistas como antagonistas. Al escoger los parámetros de
estimulación de manera que la respuesta sea de la mitad, los
agonistas reducirán la respuesta mientras que los antagonistas la
aumentarán. Los mejores intervalos de selección pueden obtenerse
mediante la estimulación a frecuencias superiores (ensayo de
agonista) o inferiores (ensayo de antagonista). Debe observarse que
se detectarán todos los moduladores de la conductancia del canal,
tiempo de apertura, desensibilización, y desactivación.
Los tipos celulares preferidos incluyen aquellas
células que expresan un nivel mínimo de otros canales iónicos, tales
como CHO-K1, CHL, y LTK (-). La transfección y la
selección de clones que expresan canales iónicos de interés
generalmente se llevarán a cabo tal como se describió anteriormente
para los canales iónicos de sodio normalmente en el estado de
reposo. Alternativamente, podría utilizarse una línea celular que
expresa endógenamente el canal de interés (o el contracanal). El
marcaje y la medición de las células con colorantes para el
potencial transmembrana generalmente se llevarán a cabo tal como se
describió para los canales iónicos de sodio normalmente en el estado
de reposo.
Normalmente se comenzaría con condiciones
iniciales utilizando un núcleo de onda cuadrada bifásica de 5 ms por
fase y una amplitud de 25 V/cm. El núcleo se repetiría a una tasa
regular de aproximadamente 20 Hz durante una duración de tren total
de aproximadamente tres segundos. Entonces se optimizaría la
amplitud, la duración y después la frecuencia del impulso. Si fuera
necesario, también podrían explorarse cambios en la forma del
impulso para determinar si daban como resultado una estimulación
eléctrica más eficaz. Los parámetros óptimos del estímulo darán la
estimulación celular máxima (en comparación con las células con el
canal regulado por ligando bloqueado, o no presente) con el menor
coeficiente de variación de la señal entre los diferentes pocillos
de prueba, a la menor intensidad del campo eléctrico, y al menor
ciclo de trabajo para el paso de la corriente a través de los
electrodos. Una vez elegido un conjunto particular de parámetros,
debe realizarse una valoración de las concentraciones de tinción
para el(los) colorante(s) sensor(es) de voltaje
tal como se describió anteriormente, para optimizar adicionalmente
el tamaño de la señal y el coeficiente de variación de las
respuestas. Estos procedimientos (concentraciones de colorante,
intensidad del campo eléctrico, y duración y frecuencia del
estímulo) pueden repetirse para optimizar la señal
adicionalmente.
Durante estos experimentos, se comparará la
respuesta para las células con canales activos, y para las células
en las que los canales están bloqueados farmacológicamente. Si no se
dispone de un agente farmacológicamente adecuado, el estado
bloqueado puede emularse con una línea celular no transfectada. Los
parámetros óptimos del estímulo darán el menor coeficiente de
variación de la diferencia en las señales de las dos poblaciones
celulares.
Muchos canales tienen cambios de conductancia
activada por voltaje lentos o ausencia de los mismos. Ejemplos
principales son algunos de los canales implicados en la fibrosis
cística, particularmente el regulador transmembrana de la fibrosis
cística (CFTR, un canal de cloruro), el canal de sodio epitelial
(ENaC) y los miembros de la familia de canales de potasio 4 TM (Wang
et al. Ann. N. Y. Acad. Sci. 868: 286-303,
1999). Una pequeña molécula que actúa como un agonista para
cualquiera de estos canales podría ser un candidato para un fármaco
que alivie la fibrosis cística. En la actualidad, no hay ningún
método de selección de alto rendimiento realizable conveniente para
los canales de este tipo.
El formato de ensayo propuesto para las dianas
del canal iónico de este tipo incluye una célula que expresa el
canal de fuga de interés en una célula que también expresa un canal
de sodio dependiente de voltaje. El canal de interés se clona en una
célula con un canal de sodio dependiente de voltaje. La presencia de
la corriente pasiva suprimirá la respuesta positiva del canal de
sodio cuando se estimulan las células. El bloqueo del canal pasivo
restaurará la gran respuesta positiva al voltaje. La optimización
del equilibrio de las corrientes será importante en este método. La
célula CHO de tipo natural puede ser útil para este fin, aunque
sería preferible una célula con corrientes de sodio mayores (tanto
endógenas como obtenidas por ingeniería genética). Si la corriente
de sodio es demasiado pequeña con relación a la corriente de
potasio, la curva dosis-respuesta para el bloqueante
del canal pasivo cambiará hacia concentraciones superiores. Por
ejemplo, en el caso extremo en el que la corriente pasiva sea 100
veces mayor que la corriente de sodio, el 99% de los canales pasivos
tendría que estar bloqueado con el fin conseguir una respuesta del
50% con respecto a la de los canales de sodio.
Los tipos celulares preferidos incluyen aquellas
células que expresan un nivel mínimo de otros canales iónicos, tales
como CHO-K1, CHL, y LTK (-). La transfección y la
selección de clones que expresan canales iónicos de interés
generalmente se llevarán a cabo tal como se describió anteriormente
para los canales iónicos de sodio normalmente en el estado de
reposo. Alternativamente, podría utilizarse una línea celular que
expresa endógenamente el canal de interés (o el contracanal). El
marcaje y la medición de las células con colorantes para el
potencial transmembrana general-
mente se llevarán a cabo tal como se describió para los canales iónicos de sodio normalmente en el estado de reposo.
mente se llevarán a cabo tal como se describió para los canales iónicos de sodio normalmente en el estado de reposo.
Un protocolo de estimulación preferido utiliza
un núcleo bifásico. En general, se llevan a cabo una serie de
experimentos iniciales utilizando un núcleo de onda cuadrada
bifásica repetido a una tasa regular durante una duración de tren
fijada. La duración de impulso varía desde aproximadamente 1 \mus
hasta aproximadamente 1 s, y más preferiblemente desde
aproximadamente 100 \mus hasta aproximadamente 20 ms. La amplitud
del impulso varía desde 0 V/cm hasta aproximadamente 60 V/cm, y más
preferiblemente desde 10 V/cm hasta 50 V/cm. La frecuencia de
estimulación varía entre 0 Hz (es decir, un único impulso) y 100
kHz, y más preferiblemente desde 0 Hz hasta aproximadamente 1 kHz.
El tren de impulsos varía entre 0 s (es decir, un único impulso) y
aproximadamente 100 s, y más preferiblemente entre 0 s y 10 s.
Normalmente se comenzaría con condiciones
iniciales utilizando un núcleo de onda cuadrada bifásica de 5 ms por
fase y una amplitud de 25 V/cm. El núcleo se repetiría a una tasa
regular de aproximadamente 20 Hz durante una duración de tren total
de aproximadamente tres segundos. Entonces se optimizaría la
amplitud, la duración y después la frecuencia del impulso. Si fuera
necesario, también podrían explorarse cambios en la forma del
impulso para determinar si daban como resultado una estimulación
eléctrica más eficaz. Los parámetros óptimos del estímulo darán la
estimulación celular máxima (en comparación con las células con el
canal dependiente de ligando bloqueado, o no presente) con el menor
coeficiente de variación de la señal entre los diferentes pocillos
de prueba, a la menor intensidad del campo eléctrico, y al menor
ciclo de trabajo para el paso de la corriente a través de los
electrodos. Una vez elegido un conjunto particular de parámetros,
debe realizarse una valoración de las concentraciones de tinción
para el(los) colorante(s) sensor(es) de voltaje
tal como se describió anteriormente, para optimizar adicionalmente
el tamaño de la señal y el coeficiente de variación de las
respuestas. Estos procedimientos (concentraciones de colorante,
intensidad del campo eléctrico, y duración y frecuencia del
estímulo) pueden repetirse para optimizar la señal
adicionalmente.
Debe ser posible seleccionar tanto agonistas
como antagonistas. Al escoger los parámetros de estimulación de
manera que la respuesta sea la mitad de la máxima, los agonistas
reducirán la respuesta mientras que los antagonistas la aumentarán.
Pueden obtenerse mejores intervalos de selección mediante la
estimulación a frecuencias superiores (ensayo de agonista) o
inferiores (ensayo de antagonista).
Durante estos experimentos, se comparará la
respuesta para las células con canales activos, y para las células
en las que los canales están bloqueados farmacológicamente. Si no se
dispone de un agente farmacológicamente adecuado, el estado
bloqueado puede emularse con una línea celular no transfectada. Los
parámetros óptimos del estímulo darán el menor coeficiente de
variación de la diferencia en las señales de las dos poblaciones
celulares.
La presente invención también incluye métodos
para la determinación cuantitativa de los parámetros celulares y del
canal iónico, y para la cuantificación de los efectos farmacológicos
de los compuestos de prueba en estos parámetros utilizando
estimulación eléctrica.
Una vez que finaliza el estímulo eléctrico, el
potencial transmembrana de la célula se relaja hasta un nuevo
potencial en reposo. En el caso de los ensayos de canal dependiente
de voltaje, los canales generalmente se cerrarán o inactivarán, y el
potencial de equilibrio en reposo final será el mismo que antes del
estímulo. En la mayor parte de los casos, la carga acumulada sobre
la capacitancia de la membrana se disipará exponencialmente a través
de la resistencia de la membrana. La constante de tiempo de membrana
es simplemente el producto de la capacitancia de la membrana y la
resistencia de la membrana, \tau_{m} = R_{m}C_{m}. Puede
determinarse fácilmente midiendo la capacitancia de la membrana y la
constante de tiempo de membrana.
La capacitancia promedio de la membrana para las
células utilizadas comúnmente en estos ensayos es independiente del
canal exógeno y puede medirse fácilmente mediante métodos de patch
clamp. La constante de tiempo de membrana puede medirse fácilmente
midiendo la tasa de disminución del potencial transmembrana y
ajustando este dato a una función de disminución exponencial. Por
tanto, dividiendo la constante de tiempo de membrana entre la
capacitancia promedio de la membrana para el tipo de célula dado, se
puede determinar cuantitativamente la resistencia de la membrana en
reposo o fuga.
Puede realizarse un análisis similar para medir
cuantitativamente la resistencia de la membrana mientras se abre un
canal dependiente de voltaje. Durante la estimulación eléctrica, el
potencial transmembrana también se relajará aproximadamente
exponencialmente hacia un nuevo potencial de equilibrio. Por tanto,
la constante de tiempo de membrana del cambio de voltaje al comienzo
del estímulo constituye una medida de la resistencia de la membrana
promediada en el tiempo. Utilizando factores de escala apropiados
para explicar la fracción de tiempo que el canal está realmente
abierto, se puede realizar una estimación cuantitativa de la
resistencia de la membrana con el canal abierto.
La apertura de un canal iónico de inactivación
requiere mantener el potencial transmembrana por debajo de un umbral
durante un tiempo del orden de varios milisegundos. Esta liberación
de la inactivación tiene importantes implicaciones fisiológicas. Por
ejemplo, la liberación de la inactivación fuerza un periodo de
resistencia que evita la nueva propagación de los potenciales de
acción, y limita las tasas de activación máximas de las neuronas. La
manipulación farmacológica de esta propiedad puede ser
terapéuticamente relevante.
Utilizando una estimulación eléctrica
repetitiva, se puede estimar la liberación promedio del tiempo de
inactivación. Esto puede realizarse utilizando impulsos de campo
eléctrico de anchura variable. Cuando la anchura del impulso cae por
debajo de la liberación del tiempo de inactivación, se activarán
menos canales y disminuirá el aumento en el potencial transmembrana
en respuesta a la estimulación.
El tiempo de canal abierto \tau_{abierto} es
una función de las propiedades de inactivación del canal. Se pueden
detectar la manipulación farmacológica de este parámetro en un modo
de rendimiento de medio a alto mediante la estimulación a frecuencia
muy alta. Por ejemplo, se considera un ensayo para un canal de sodio
dependiente de voltaje utilizando el método de múltiples estímulos.
Con un núcleo de estímulo monofásico fijo de onda cuadrada repetido
a una tasa constante, la respuesta al voltaje aumenta cuando aumenta
la tasa de repetición del estímulo. Esto se debe a que el canal de
sodio pasa relativamente más tiempo abierto a una frecuencia
superior. Sin embargo, si el intervalo entre impulsos se hace más
corto que el tiempo de canal abierto, los canales de sodio activados
se harán negativos y, por tanto, estarán desactivados, mediante el
impulso de estímulo posterior. La frecuencia de la ráfaga de
estimulación a la que se aplana la respuesta está relacionada con el
tiempo de canal abierto.
En el registro de célula completa, la fijación
de corriente es un modo en el que las corrientes de control pueden
llevarse hacia el interior de la célula mientras se registra el
potencial transmembrana. Aunque el registro mediante la técnica de
patch-clamp es extremadamente preciso, es una
técnica de rendimiento muy bajo. En un máximo absoluto en
condiciones perfectas, un científico altamente cualificado podría
determinar los parámetros celulares a una tasa de aproximadamente
diez células por hora. A menudo, el nivel de detalle obtenido con la
técnica de patch-clamp no es necesario para la
selección de fármacos, pero en la actualidad no existe ningún método
para cambiar el detalle por la velocidad. Una alta velocidad es
absolutamente crucial para detectar grandes bibliotecas de
compuesto.
compuesto.
La técnica de estimulación por campo eléctrico
tratada en el presente documento permite un nuevo tipo de
electrofisiología de fijación de corriente que se denomina fijación
de corriente extracelular. Pueden utilizarse canales dependientes de
voltaje para llevar corrientes de control hacia el interior de
cultivos celulares, lo que permite la determinación de varias
propiedades celulares y de canal. La fijación de corriente
extracelular tiene un rendimiento muy alto, de manera que será
posible obtener un alto contenido de información de los efectos
farmacológicos de las bibliotecas de compuestos frente a dianas
específicas del canal iónico. La farmacología y la fisiología de un
canal pueden estudiarse directamente, o el canal puede utilizarse
como un generador de corriente para el estudio de la propia membrana
celular o de un segundo canal iónico.
Aunque la precisión final de los parámetros
microscópicos que se pueden obtener con la fijación de corriente
extracelular no puede aproximarse a la del método de
patch-clamp, ahora se puede cambiar el contenido de
información por el rendimiento. Es decir, el grado de precisión en
el que puede establecerse arbitrariamente la obtención de
mediciones. Con un único conjunto de parámetros de estímulo, pueden
seleccionarse grandes bibliotecas para posibles compuestos de
interés. Puede llevarse a cabo una selección secundaria de
rendimiento medio utilizando una valoración de las concentraciones
de los compuestos en los éxitos para determinar la potencia y la
especificidad. Finalmente, se puede determinar propiedades
terapéuticamente relevantes tales como la dependencia del uso y el
mecanismo de acción variando los parámetros del estímulo en
presencia de los compuestos. En cada fase, las mediciones se
promedian automáticamente para muchas células, reduciendo
enormemente las incertidumbres asociadas con la variabilidad de una
célula a otra.
Al menos hay dos ventajas adicionales de la
fijación de corriente extracelular en comparación con el análisis de
patch-clamp. En primer lugar, la integridad de la
membrana celular no se altera durante la estimulación por campo
eléctrico. El fluido intracelular se sustituye completamente con una
disolución pipeteada durante el registro de patch clamp de célula
completa. Muchas proteínas dentro de la célula, incluyendo los
canales iónicos, son extremadamente sensibles a los moduladores, los
mensajeros intracelulares y el entorno iónico. Los componentes del
citoplasma sólo se conocen de modo rudimentario, por lo que los
componentes solubles en el espacio intracelular siempre están
alterados. Por tanto, el estado fisiológico "normal" de la
célula sólo es aproximado durante el análisis de patch clamp de
célula completa, pero permanece intacto cuando se utiliza la
fijación de corriente extracelular.
En segundo lugar, la mayor parte de las células
experimenta alteraciones espectaculares en el comportamiento y la
expresión génica cuando entra en contacto con otras células. Dado
que la mayor parte de las células también forma conexiones de unión
en hendidura ("gap junctional connections"), con las de las
células vecinas, el análisis de patch clamp de célula completa no
sólo es fidedigno cuando las células están completamente aisladas
entre sí. La fijación de corriente extracelular puede utilizarse
sobre las células independientemente de su grado de confluencia, por
lo que las células pueden ser más relevantes desde el punto de vista
fisiológico. Se puede utilizar la fijación de corriente extracelular
para descubrir si hay cualquier efecto del contacto célula - célula
sobre la electrofisiología del canal. Entonces, junto con el
análisis de la expresión génica, se puede relacionar estos cambios
con los componentes reguladores de la célula.
En la fijación de voltaje, se controla el
potencial transmembrana de la célula mientras se monitoriza el flujo
de corriente. La fijación de voltaje generalmente se logra añadiendo
un bucle de realimentación a un circuito de fijación de corriente.
En el caso del método de célula completa, esto puede lograrse
fácilmente con el uso de dos pipetas unidas simultáneamente a la
misma célula. Una pipeta pasa una corriente de control, mientras que
la otra detecta el voltaje. Un circuito de realimentación compara el
voltaje medido con el voltaje de control, y ajusta la corriente de
control en consecuencia. Generalmente, dado que la resistencia de la
membrana celular es grande en comparación con la resistencia de
acceso de la pipeta, la misma pipeta puede utilizarse para controlar
la corriente y medir el voltaje. En comparación con la fijación de
corriente, la fijación de voltaje generalmente es un método más
potente para el análisis electrofisiológico. Los canales iónicos son
extremadamente sensibles al potencial transmembrana, de manera que
el análisis de los datos es mucho más sencillo cuando trata con
mediciones de corriente a un voltaje
fijado.
fijado.
La fijación de corriente extracelular puede
convertirse en un método de fijación de voltaje añadiendo un bucle
de realimentación entre la medición del voltaje (la fluorescencia
del colorante sensor) y el generador de corriente (los parámetros
del estímulo). En este caso, se requiere un colorante del potencial
transmembrana con suficiente velocidad. La combinación de colorantes
CC2-DMPE/DiSBAC_{6} (3) tiene una constante de
tiempo de submilisegundos y debe ser suficientemente rápida para
captura todos, salvo los acontecimientos celulares más rápidos.
Basándose en la diferencia de las mediciones del voltaje de control
y el potencial transmembrana, un ordenador alterará los parámetros
del estímulo. Los parámetros del estímulo están relacionados con la
corriente dirigida hacia el interior de la célula, por lo que se
puede determinar el transcurso de tiempo de la corriente como una
función del voltaje de control. Este método debe demostrar ser útil
en la determinación del mecanismo de acción de los agentes
farmacológicos en las dianas de los canales iónicos.
Los métodos de estimulación descritos en el
presente documento también pueden utilizarse para modular los
potenciales transmembrana de los orgánulos intracelulares que tienen
membranas fosfolipídicas, incluyendo la mitocondria y el núcleo.
Esto puede llevarse a cabo aumentando en primer lugar la
conductancia de la membrana plasmática o bien mediante
electropermeabilización o bien mediante la adición de ionóforos
tales como valinomicina o gramicidina A. Entonces, el espacio
intracelular ya no está aislado del campo eléctrico aplicado. Esto
permite que se aplique un campo eléctrico a la solución salina para
generar cambios en el potencial transmembrana a través de las
membranas de los orgánulos intracelulares. Entonces, mediante la
tinción de las células con colorantes que son sensibles a la
concentración de iones o al potencial transmembrana, y que se
seleccionan como diana sólo para la membrana del orgánulo específico
de interés, los métodos presentados en el presente documento pueden
utilizarse para modular y someter a ensayo los canales iónicos de
estos orgánulos. La selección como diana puede lograrse, por ejemplo
mediante el uso de una proteína naturalmente fluorescente que
contiene señales de localización subcelular adecuadas, tal como se
conoce en la técnica.
La ruptura dieléctrica de las membranas
celulares de los mamíferos se produce si el potencial eléctrico a
través de la membrana supera aproximadamente 200 mV (Teissie y Rols,
1993, Biophys. J. 65: 409-413). Cuando la membrana
se rompe, se forman poros a través de la membrana, que conectan los
espacios intracelular y extracelular. El número y el tamaño de los
poros aumenta con el aumento de los potenciales transmembrana
(Kinoshita y Tsong, 1977, Nature 268: 438-441). El
aumento de la intensidad del campo eléctrico superior a
aproximadamente 60 V/cm en líneas celulares de mamífero típicas
puede electropermeabilizar las células. A campos relativamente
bajos, se crean poros pequeños en la membrana celular que
aparentemente son los suficientemente grandes como para dejar entrar
iones pequeños, pero no lo suficientemente grandes como para dejar
entrar moléculas tan grandes como el ADN (Tsong, 1991, Biophys. J.
60: 297-306). Estos poros despolarizan totalmente la
célula, haciendo que el potencial transmembrana se aproxime a cero.
Mediante la electropermeabilización de las células y la
monitorización del cambio en el potencial transmembrana con un
colorante sensible al voltaje, la presente invención puede
utilizarse para determinar el potencial transmembrana en reposo de
una célula. Esto será útil para determinar las interacciones
farmacológicas con las células o los canales iónicos, o bien como
selección primaria o bien secundaria. Por ejemplo, en una selección
de compuestos frente a un canal de sodio dependiente de voltaje,
puede llevarse a cabo un protocolo de múltiples estímulos para
determinar la actividad del canal. Entonces, siguiendo con un
protocolo de permeabilización, se podría determinar si la membrana
celular tenía o no un potencial en reposo normal en presencia del
compuesto.
Adicionalmente, utilizando una línea celular
altamente polarizada tal como las células RBL, podrían calibrarse
fácilmente los colorantes sensibles al voltaje mediante
electropermeabilización. El potencial transmembrana de partida en
determinadas condiciones (por ejemplo, varias concentraciones de
potasio extracelular), y el potencial transmembrana final tras la
electropermeabilización es cero.
Adicionalmente, el tamaño de los poros creados
por la electropermeabilización aumenta como una función del campo
eléctrico aplicado. Por debajo de 50 V/cm, no se crean poros. Entre
aproximadamente 60 V/cm y 100 V/cm, se crean poros lo
suficientemente grandes como para dejar entrar iones monovalentes.
Por encima de aproximadamente 600 V/cm, se crean poros lo
suficientemente grandes como para dejar entrar ADN (Tsong, 1991,
Biophys. J. 60: 297-306). Por tanto, esta invención
puede utilizarse para crear poros de tamaño definido en las
membranas celulares, de una manera de alto rendimiento. Esto podría
ser útil para muchas aplicaciones, incluyendo la administración al
espacio intracelular de iones que no atraviesan los canales,
compuestos de prueba que no atraviesan los canales u otros
moduladores, ADN o ARN para el fin de la transfección transitoria o
estable, y colorantes fluorescentes y otros indicadores.
La presente invención proporciona la detección
fidedigna de compuestos de prueba que modulan la función del canal
iónico que es significativamente más versátil y sólida que los
sistemas de ensayo anteriores. Y lo que es más importante, la
presente invención proporciona la capacidad de modular el potencial
transmembrana en células intactas sin la necesidad de agentes
farmacológicos, o la destrucción de la membrana, y la pérdida del
contenido intracelular, como ocurre en el caso de la técnica de
patching clamping. Al proporcionar la capacidad de modular
externamente el potencial transmembrana de células vivas, la
presente invención permite que se someta a ensayo una amplia
variedad de canales iónicos.
Además, esta capacidad para modular con
precisión el estado dependiente del voltaje de un canal iónico,
tiene importantes ventajas para el descubrimiento de fármacos donde
se proporciona la oportunidad de seleccionar compuestos que
interaccionan preferentemente con un estado, (es decir, bloqueantes
dependientes del uso). Por ejemplo, se sabe que varios fármacos
conocidos terapéuticamente útiles (incluyendo antiarrítmicos,
anticonvulsivantes y anestésicos locales) funcionan como bloqueantes
dependientes del uso de los canales de sodio y/o calcio dependientes
de voltaje. En cada caso, el bloqueo total del canal seleccionado
como objetivo normalmente daría como resultado la muerte. Ciertas
condiciones, tales como el dolor crónico, la arritmia y las
convulsiones se producen cuando las células se vuelven hiperactivas.
Estas condiciones pueden aliviarse o eliminarse bloqueando los
canales si comienzan a abrirse con demasiada frecuencia. Los
compuestos que pueden bloquear el canal, pero que se unen
preferentemente al(a los) estado(s) activado(s)
o inactivados(s), en lugar de al(a los)
estado(s) de reposo, pueden reducir la excitabilidad del
músculo y las neuronas. Estos fármacos son eficaces porque no
afectan al canal en circunstancias normales, sino que sólo lo
bloquean cuando es necesario para evitar la
hiper-excitabilidad. Sin embargo, los métodos de
análisis existentes que son compatibles con la selección de alto
rendimiento no proporcionan la capacidad para controlar de manera
rutinaria el estado de activación del canal iónico en tiempo
real.
real.
En particular, la presente invención proporciona
un método para seleccionar el efecto de un compuesto de prueba sobre
un canal iónico en un estado funcional definido dentro de una
célula. El método supone modular el potencial transmembrana de la
célula mediante el uso de estimulación eléctrica repetitiva para
efectuar ciclos del canal iónico de interés a través de su ciclo de
activación y para fijar el potencial transmembrana hasta un nivel
deseado adecuado para un estado de activación específico o una
transición entre estados. A continuación, durante o después de este
proceso, se añade un compuesto de prueba a la célula, y se mide el
potencial transmembrana.
Normalmente, los resultados obtenidos en
presencia del compuesto de prueba se compararán con una muestra
control incubada en ausencia del compuesto de prueba. Las mediciones
control normalmente se llevan a cabo con una muestra que contiene
todos los componentes y en las mismas condiciones de estimulación
que para la muestra de prueba, excepto por el supuesto fármaco.
Pueden realizarse estudios control adicionales con el canal iónico
en otro estado dependiente de voltaje para identificar
específicamente los compuestos de prueba específicos del estado. La
detección de un cambio en el potencial transmembrana en presencia
del agente de prueba con respecto al control indica que el agente de
prueba es activo y es específico sobre el canal iónico en ese
estado, o durante la transición desde un estado hasta el otro.
Los potenciales transmembrana también pueden
determinarse en presencia o ausencia de un agente farmacológico de
actividad conocida (es decir, un agente patrón) o actividad posible
(es decir, un agente de prueba). Una diferencia en los potenciales
transmembrana tal como se detecta mediante los métodos descritos en
el presente documento permite que se compare la actividad del agente
de prueba con el del agente patrón. Se reconocerá que los expertos
en la técnica conocen muchas combinaciones y permutaciones de
protocolos de selección de fármacos y pueden adaptarse fácilmente
para su uso con las presentes invenciones descritas en el presente
documento para identificar compuestos, que afectan a los canales
iónicos y o a los potenciales transmembrana. Esta invención
contempla el uso de las presentes invenciones en combinación con
todos estos métodos.
En otro aspecto, la presente invención incluye
el uso de un segundo canal iónico junto con los métodos de
estimulación eléctrica descritos en el presente documento para fijar
el potencial transmembrana en reposo o estimulado en un valor
predefinido proporcionando así la capacidad de someter a ensayo un
primer canal iónico de interés. En una realización, el segundo canal
iónico es un canal de sodio o calcio regulado por voltaje que
permite la generación de potenciales transmembrana positivos
continuos. En otra realización el segundo canal iónico es un canal
de potasio regulado por voltaje, que permite la generación de
potenciales transmembrana negativos. El uso de estos segundos
canales iónicos permite que se utilice el método de estimulación
eléctrica para fijar el potencial transmembrana hasta prácticamente
cualquier nivel predefinido.
Dado que este formato de ensayo implica dos
canales iónicos, los moduladores de cualquiera de los canales
afectarán a la respuesta al voltaje. En este caso, pueden llevarse a
cabo estudios control adicionales con la línea celular parental que
expresa sólo el segundo canal iónico utilizado para fijar el
potencial transmembrana. Entonces pueden volverse a probar
separadamente los compuestos que bloquean el primer canal iónico
para averiguar si tienen actividad frente al segundo canal
iónico.
Normalmente, los compuestos de prueba
seleccionados estarán presentes en bibliotecas de compuestos
relacionados o diversos. La biblioteca puede tener miembros
individuales que se prueban individualmente o en combinación, o la
biblioteca puede tener una combinación de miembros individuales.
Tales bibliotecas pueden tener al menos dos miembros,
preferiblemente superior a aproximadamente 100 miembros o superior a
aproximadamente 1.000 miembros, más preferiblemente superior a
aproximadamente 10.000 miembros, y lo más preferiblemente superior a
aproximadamente 100.000 ó 1.000.000 miembros.
Una vez identificados, los moduladores
candidatos pueden evaluarse para determinar la selectividad y los
efectos toxicológicos utilizando métodos conocidos (véase, Lu,
Basic Toxicology, Fundamentals, Target Organs, and Risk
Assessment, Hemisphere Publishing Corp., Washington (1985);
patente de los EE.UU. número: 5.196.313 concedida a Culbreth (el 23
de marzo de 1993) y patente de los EE.UU. número 5.567.952 concedida
a Benet (el 12 de octubre de 1996).
Por ejemplo, pueden utilizarse líneas celulares
primarias o cortes de tejido para detectar el efecto del modulador
candidato sobre la respuesta del canal iónico de interés en su
contexto fisiológico nativo. Por ejemplo, para seleccionar fármacos
que muestran efectos específicos y/o selectivos sobre células
cardiacas, puede ser preferible utilizar miocitos u otras líneas
celulares modelo de cultivo celular in vitro. En este caso,
podría completarse una selección primaria en una línea celular
derivada de miocitos para identificar los compuestos que acortan,
prolongan o bloquean los potenciales de acción inducidos
eléctricamente.
La selección secundaría se diseñaría entonces
para identificar los compuestos que muestran efectos potencialmente
adversos sobre el organismo. Por ejemplo, esto puede llevarse a cabo
seleccionando los efectos del fármaco candidato sobre tejidos
eléctricamente excitables tales como los tejidos cardiacos o
neuronales, o cultivos de células inmortalizadas derivados de estos
cultivos. Estos tejidos desempeñan papeles críticos dentro de un
organismo y podría predecirse que cualquier efecto no deseado del
fármaco candidato sobre la capacidad de estos tejidos para
estimularse eléctricamente crearía posibles efectos secundarios
graves al administrarse. Como consecuencia, los compuestos activos
que también afectan a la capacidad de estos tejidos para funcionar,
podrían dejar de considerarse como candidatos de fármacos en un
estadio temprano, o podría realizarse química farmacéutica para
reducir los efectos secun-
darios.
darios.
El análisis toxicológico adicional de los
moduladores candidatos puede establecerse mediante la determinación
de la toxicidad in vitro hacia una línea celular, tal como
una línea celular de mamífero (preferiblemente de ser humano). Los
moduladores candidatos pueden tratarse con, por ejemplo, extractos
de tejido, tales como preparaciones de hígado, tales como
preparaciones microsómicas, para determinar el aumento o la
disminución de las propiedades toxicológicas del compuesto químico
tras metabolizarse por un organismo completo, o mediante su
capacidad para degradarse mediante los sistemas de citocromo P450,
tal como se describió en la solicitud de patente de los EE.UU. de
titularidad común número 09/301.525, presentada el 28 de abril de
1999, la solicitud de patente de los EE.UU. número 09/301.395
presentada el 28 de abril de 1999 y la solicitud de los EE.UU.
número 09/458.927 presentada el 10 de diciembre de 1999. Los
resultados de estos tipos de estudio a menudo predicen las
propiedades toxicológicas de los compuestos químicos en animales,
tales como los mamíferos, incluyendo los seres humanos.
La actividad toxicológica puede medirse
utilizando genes indicadores que se activan durante la actividad
toxicológica o mediante la lisis celular (véase el documento WO
98/13353, publicado el 02/04/98). Los genes indicadores preferidos
producen un producto de traducción fluorescente o luminescente (tal
como, por ejemplo, una proteína fluorescente verde (véase, por
ejemplo, la patente de los EE.UU. número 5.625.048 concedida a Tsien
et al., el 29/049/98; la patente de los EE.UU. número
5.777.079 concedida a Tsien et al., el 07/07/98; el documento
WO 96/23810 concedido Tsien, publicado el 08/08/96; el documento WO
97/28261, publicado el 07/08/97; el documento PCT/US97/12410,
presentado el 16/07/97; el documento PCT/US97/14595, presentado el
15/08/97)) o un producto de la traducción que puede producir un
producto fluorescente o luminiscente (tal como, por ejemplo,
beta-lactamasa (véase, por ejemplo, la patente de
los EE.UU. número 5.741.657 concedida a Tsien, el 21/04/98, y el
documento WO 96/30540, publicado el 03/10/96)), tal como un producto
de la degradación enzimática. En la presente invención, la lisis
celular puede detectarse como una reducción en la señal de
fluorescencia a partir de al menos un agente productor de fotones
dentro de una célula en presencia de al menos un agente reductor de
fotones. Tales determinaciones toxicológicas pueden llevarse a cabo
utilizando células procariotas o eucariotas, utilizando
opcionalmente perfiles toxicológicos, tal como se describe en el
documento CT/US94/00583, presentado el 21/1/94 (documento WO
94/17208), la patente alemana número 69406772.5-08,
concedida el 25/11/97; documento EPC 0680517, concedido el 12/11/94;
patente de los EE.UU. número 5.589.337, concedida el 31/12/96;
documento EPO 651825, concedido el 14/01/98; y la patente de los
EE.UU. número 5.585.232, concedida el 17/12/96).
Alternativamente, o además de estos estudios
in vitro, las propiedades toxicológicas y de
biodisponibilidad de un modulador candidato en un modelo animal, tal
como ratones, ratas, conejos o monos, pueden determinarse utilizando
métodos establecidos (véase, Lu, citado anteriormente (1985); y
Creasey, Drug Disposition in Humans, The Basis of Clinical
Pharmacology, Oxford University Press, Oxford (1979), Osweiler,
Toxicology, Williams y Wilkins, Baltimore, MD (1995), Yang,
Toxicology of Chemical Mixtures; Case Studies, Mechanisms,
y Novel Approaches, Academic Press, Inc., San Diego, CA
(1994), Burrell et al., Toxicology of the Immune
System; A Human Approach, Van Nostrand Reinhld, Co. (1997),
Niesink et al., Toxicology; Principles and
Applications, CRC Press, Boca Ratón, FL (1996)). Dependiendo de
la toxicidad, del órgano, tejido o locus diana y del presunto
mecanismo del modulador candidato, el experto en la técnica no se
cargaría de trabajo para determinar las dosis apropiadas, los
valores de DL_{50}, las vías de administración, y los regímenes
que resultarán apropiados para determinar las propiedades
toxicológicas del modulador candidato. Además de los modelos
animales, pueden realizarse ensayos clínicos con seres humanos
siguiendo los procedimientos establecidos, tales como los explicados
por la Food and Drug Administration de los EE.UU. (USFDA) o
equivalentes de otros gobiernos. Estos estudios de toxicidad
proporcionan la base para determinar la utilización terapéutica de
un modulador candidato in vivo.
La eficacia de un modulador candidato puede
estimarse utilizando varios métodos reconocidos en la técnica, tales
como los métodos in vitro, los modelos animales o los ensayos
clínicos con seres humanos (véase, Creasey, citado anteriormente
(1979)). Existen modelos in vitro reconocidos para diversas
enfermedades o estados. Por ejemplo, la capacidad de un compuesto
químico para prolongar la vida de células infectadas por el VIH
in vitro se reconoce como un modelo aceptable para
identificar compuestos químicos que se espera que sean eficaces para
tratar la infección por VIH o SIDA (véase, Daluge et al.,
Antimicro. Agents Chemother. 41: 1082-1093 (1995)).
Además, se ha establecido la capacidad de ciclosporina A (CsA) para
evitar la proliferación de las células T in vitro como un
modelo aceptable para identificar compuestos químicos que se espera
que sean eficaces como inmunosupresores (véase, Suthanthiran et
al., citado anteriormente, (1996)). Para casi cualquier clase de
agente terapéutico, enfermedad o estado, se dispone de un modelo
in vitro o animal aceptable. Tales modelos existen, por
ejemplo, para los trastornos gastrointestinales, cánceres,
cardiología, neurobiología e inmunología. Además, estos métodos
in vitro pueden utilizar extractos de tejido, tales como
preparaciones de hígado, tales como preparaciones microsómicas, para
proporcionar una indicación fidedigna de los efectos del metabolismo
sobre el modulador candidato. De manera similar, pueden utilizarse
modelos animales para establecer la eficacia de los compuestos
químicos para tratar varias enfermedades o estados. Por ejemplo, la
rodilla del conejo es un modelo aceptado para probar la eficacia de
compuestos químicos en el tratamiento de la artritis (véase, Shaw y
Lacy, J. Bone Joint Surg. (Br) 55: 197-205 (1973)).
La hidrocortisona, que está aprobada para su uso en seres humanos
para tratar la artritis, es eficaz en este modelo, lo que confirma
la validez de este modelo (véase, McDonough, Phys. Then 62:
835-839 (1982)). Cuando se escoge un modelo
apropiado para determinar la eficacia de un modulador candidato, el
experto en la técnica puede guiarse por el estado de la técnica para
escoger un modelo, dosis, y vía de administración, régimen y
criterio de valoración apropiados y como tal, no constituiría una
carga excesiva de trabajo.
Además de los modelos animales, puede utilizarse
ensayos clínicos con seres humanos para determinar la eficacia de un
modulador candidato en seres humanos. La USFDA, o agencias
gubernamentales equivalentes, han establecido procedimientos para
tales estudios (véase, www.fda.gov).
Los métodos in vitro e in vivo
descritos anteriormente también establecen la selectividad de un
modulador candidato. La presente invención proporciona un método
rápido para determinar la especificidad del modulador candidato. Por
ejemplo, pueden utilizarse líneas celulares que contienen miembros
de la familia de canales iónicos relacionados para obtener
rápidamente un perfil de la selectividad de un compuesto químico de
prueba con respecto a su capacidad para inhibir canales iónicos
relacionados, y a su capacidad relativa para modular diferentes
estados dependientes de voltaje de los canales iónicos. Un sistema
de este tipo proporciona por primera vez la capacidad para obtener
rápidamente el perfil de grandes números de compuestos químicos de
prueba con el fin de evaluar sistemáticamente en un formato de alto
rendimiento, simple y miniaturizado la selectividad de canal iónico
de un modulador
candidato.
candidato.
La invención incluye composiciones, tales como
compuestos químicos y agentes terapéuticos novedosos identificados
mediante al menos un método de la presente invención como que tienen
actividad mediante el funcionamiento de los métodos, sistemas o
componentes descritos en el presente documento. Los compuestos
químicos novedosos, tal como se utiliza en el presente documento, no
incluyen compuestos químicos ya conocidos públicamente en la técnica
en el momento de la fecha de presentación de esta solicitud.
Normalmente, un compuesto químico se identificaría como que tiene
actividad a partir del uso de la invención y después se revelaría su
estructura a partir de una base de datos patentada de estructuras
químicas o se determinaría utilizando técnicas analíticas, tales
como la espectroscopia de masas.
Una realización de la invención es un compuesto
químico con una actividad útil, que comprende un compuesto químico
identificado mediante el método descrito anteriormente. Tales
composiciones incluyen pequeñas moléculas orgánicas, ácidos
nucleicos, péptidos y otras moléculas fácilmente sintetizadas
mediante las técnicas disponibles en la técnica y desarrolladas en
el futuro. Por ejemplo, los siguientes compuestos de combinación son
adecuados para la selección: peptoides (publicación PCT número WO
91/19735, 26 de diciembre de 1991), péptidos codificados
(publicación PCT número WO 93/20242, 14 de octubre de 1993),
bio-oligómeros aleatorios (publicación PCT WO
92/00091, 9 de enero de 1992), benzodiacepinas (patente de los
EE.UU. número 5.288.514), diversómeros tales como hidantoínas,
benzodiacepinas y dipéptidos (Hobbs DeWitt, S. et al., Proc.
Nat. Acad. Sci. USA 90: 6909-6913 (1993)),
polipéptidos análogos de vinilo (Hagihara et al., J. Amer.
Chem. Soc. 114: 6568 (1992)), peptidomiméticos no peptídicos con una
estructura principal de
Beta-D-Glucosa (Hirschmann, R. et
al., J. Amer. Chem. Soc. 114: 9217-9218 (1992)),
síntesis orgánica análoga de pequeñas bibliotecas de compuestos
(Chen, C. et al., J. Amer. Chem. Soc. 116: 2661 (1994)),
oligocarbamatos (Cho, C. Y. et al., Science 261: 1303
(1993)), y/o peptidilfosfonatos (Campbell, D.A. et al., J.
Org. Chem. 59: 658 (1994)). Véase, generalmente, Gordon, E. M. et
al., J. Med Chem. 37: 1385 (1994).
La presente invención también engloba las
composiciones identificadas en una composición farmacéutica que
comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable preparado para el
almacenamiento y la posterior administración, que tienen una
cantidad farmacéuticamente eficaz de los productos descritos
anteriormente en un vehículo o diluyente farmacéuticamente
aceptable. Vehículos o diluyentes aceptables para el uso terapéutico
son bien conocidos en la técnica farmacéutica, y se describen, por
ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co.
(A. R. Gennaro edit. 1985). En la composición farmacéutica pueden
proporcionarse agentes conservantes, estabilizantes colorantes e
incluso aromatizantes. Por ejemplo, pueden añadirse como
conservantes el benzoato de sodio, el ácido ascórbico y los ésteres
del ácido p-hidroxibenzoico. Además, pueden
utilizarse agentes antioxidantes y de suspensión.
Las composiciones de la presente invención
pueden formularse y utilizarse como comprimidos, cápsulas o elixires
para la administración oral; supositorios para la administración
rectal; disoluciones, suspensiones estériles para la administración
inyectable; y similares. Los compuestos inyectables pueden
prepararse en las formas convencionales, o bien como disoluciones o
suspensiones líquidas, formas sólidas adecuadas para la disolución o
suspensión en líquido antes de la inyección, o como emulsiones. Los
excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, solución salina,
dextrosa, manitol, lactosa, lecitina, albúmina, glutamato de sodio,
clorhidrato de cisteína, y similares. Además, si se desea, las
composiciones farmacéuticas inyectables pueden contener cantidades
menores de sustancias auxiliares no tóxicas, tales como agentes
humectantes, agentes tamponantes del pH, y similares. Si se desea,
pueden utilizarse preparaciones que mejoran la absorción (por
ejemplo, liposomas).
La cantidad farmacéuticamente eficaz de la
composición requerida como una dosis dependerá de la vía de
administración, el tipo de animal que se está tratando y las
características físicas del animal específico en consideración. La
dosis puede adaptarse para lograr un efecto deseado, pero dependerá
de factores tales como el peso, la dieta, la medicación simultánea y
otros factores que reconocerán los expertos en las técnicas médicas.
En la puesta en práctica de los métodos de la invención, los
productos o composiciones pueden utilizarse solos o unos en
combinación con otros, o en combinación con otros agentes
terapéuticos o diagnósticos. Estos productos pueden utilizarse in
vivo, normalmente en un mamífero, preferiblemente en un ser
humano, o in vitro. Cuando se emplean in vivo, los
productos o composiciones pueden administrarse al mamífero en una
variedad de formas, incluyendo por vía parenteral, intravenosa,
subcutánea, intramuscular, colónica, rectal, nasal o
intraperitoneal, empleando una variedad de formas farmacéuticas.
Tales métodos también pueden aplicarse para probar la actividad
química in vivo.
Tal como será fácilmente evidente para un
experto en la técnica, la dosis in vivo útil que va a
administrarse y el modo particular de administración variarán
dependiendo de la edad, el peso y la especie de mamífero tratada, de
los compuestos particulares empleados, y del uso específico para el
que se emplean estos compuestos. La determinación de los niveles de
dosificación eficaces, es decir, los niveles de dosificación
necesarios para lograr el resultado deseado, puede llevarse a cabo
por un experto en la técnica mediante el uso de métodos
farmacológicos de rutina. Normalmente, las aplicaciones clínicas de
los productos en seres humanos comienzan a niveles de dosificación
inferiores, aumentando el nivel de dosificación hasta que se logra
el efecto deseado. Alternativamente, pueden utilizarse estudios
in vitro aceptables para establecer las dosis y vías de
administración útiles de las composiciones identificadas por los
presentes métodos utilizando los métodos farmacológicos
establecidos.
En estudios con animales no humanos, las
aplicaciones de los posibles productos comienzan a niveles de
dosificación superiores, disminuyéndose la dosis hasta que ya no se
logre el efecto deseado o hasta que desaparezcan los efectos
secundarios adversos. La dosis para los productos de la presente
invención pueden oscilar ampliamente dependiendo de los efectos y de
la aplicación terapéutica deseados. Normalmente, las dosis pueden
estar entre aproximadamente 10 \mug/kg y 100 mg/kg de peso
corporal, y preferiblemente entre aproximadamente 100 \mug/kg y 10
mg/kg de peso corporal. La administración es preferiblemente oral de
manera diaria.
La formulación, la vía de administración y la
dosis exactas pueden escogerse por el médico individual en vista del
estado del paciente. (Véase por ejemplo, Fingl et al., en
The Pharmacological Basis of Therapeutics, 1975). Debe
observarse que el médico que atienda debería saber cómo y cuando
terminar, interrumpir o ajustar la administración debido a toxicidad
o disfunciones orgánicas. A la inversa, el médico que atienda
también debería saber ajustar el tratamiento hasta niveles
superiores si la respuesta clínica no fuera la adecuada (descartando
la toxicidad). La magnitud de una dosis administrada en el
tratamiento del trastorno de interés variará con la gravedad del
estado que va a tratarse y con la vía de administración. La gravedad
del estado puede evaluarse, por ejemplo, en parte, mediante métodos
de evaluación pronósticos convencionales. Además, la dosis y puede
que la frecuencia de dosificación, también variarán según la edad,
el peso corporal y la respuesta del paciente individual. Puede
utilizarse un programa comparable al tratado anteriormente en
medicina veterinaria.
Dependiendo del estado específico que se esté
tratando, tales agentes pueden formularse y administrarse sistémica
o localmente. Las técnicas para la formulación y la administración
pueden encontrarse en Remington's Pharmaceutical Sciences,
18ª Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990). Las vías adecuadas
pueden incluir la administración oral, rectal, transdérmica,
vaginal, transmucosa o intestinal; la administración parenteral,
incluyendo las inyecciones intramusculares, subcutáneas e
intramedulares, así como las inyecciones intratecales,
intraventriculares directas, intravenosas, intraperitoneales,
intranasales o intraoculares.
Para la inyección, los agentes de la invención
pueden formularse en disoluciones acuosas, preferiblemente en
tampones fisiológicamente compatibles, tales como la solución de
Hanks, solución de Ringer o tampón salino fisiológico. Para tal
administración transmucosa, se utilizan en la formulación agentes
penetrantes apropiados para que permeen a través de la barrera.
Tales agentes penetrantes son generalmente conocidos en la técnica.
El uso de vehículos farmacéuticamente aceptables para formular los
compuestos en el presente documento descritos para la puesta en
práctica de la invención en dosis adecuadas para la administración
sistémica está dentro del alcance de la invención. Con la elección
apropiada del vehículo la práctica de fabricación adecuada, las
composiciones de la presente invención, en particular, aquellas
formuladas como disoluciones, pueden administrarse por vía
parenteral, tal como mediante inyección intravenosa. Los compuestos
pueden formularse fácilmente utilizando vehículos farmacéuticamente
aceptables bien conocidos en la técnica en dosis adecuadas para la
administración oral. Tales vehículos permiten que los compuestos de
la invención se formulen como comprimidos, píldoras, cápsulas,
líquidos, geles, jarabes, suspensiones acuosas, suspensiones y
similares, para la ingestión oral por un paciente que se está
tratando.
Los agentes destinados a administrarse por vía
intracelular pueden administrarse utilizando técnicas bien conocidas
por los expertos habituales en la técnica. Por ejemplo, tales
agentes pueden encapsularse en liposomas, y después administrarse
tal como se describió anteriormente. Todas las moléculas presentes
en una disolución acuosa en el momento de la formación del liposoma
se incorporan en el interior acuoso. Los contenidos de los liposomas
se protegen del micro-entorno externo y, dado que
los liposomas se funden con las membranas celulares, se administran
eficazmente hacia el interior del citoplasma de la célula.
Adicionalmente, debido a su hidrofobicidad, pueden administrarse
directamente de manera intracelular pequeñas moléculas
orgánicas.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para
su uso en la presente invención incluyen composiciones en las que
los principios activos están contenidos en una cantidad eficaz para
lograr su fin deseado. La determinación de las cantidades eficaces
está completamente dentro de la capacidad de los expertos en la
técnica, especialmente a la luz de la descripción detallada
facilitada en el presente documento. Además de los principios
activos, estas composiciones farmacéuticas pueden contener vehículos
farmacéuticamente adecuados que comprenden excipientes y agentes
auxiliares que facilitan el tratamiento de los principios activos en
las preparaciones que pueden utilizarse farmacéuticamente. Las
preparaciones formuladas para la administración oral pueden estar en
la forma de comprimidos, comprimidos recubiertos de azúcar, cápsulas
o disoluciones. Las composiciones farmacéuticas de la presente
invención pueden fabricarse de una manera que se conoce por sí
misma, por ejemplo, mediante procedimientos convencionales de
mezclado, disolución, granulación, fabricación de comprimidos
recubiertos de azúcar, levitación, emulsión, encapsulación,
atrapamiento o liofilización.
Las formulaciones farmacéuticas para la
administración parenteral incluyen disoluciones acuosas de los
principios activos en una forma soluble en agua. Adicionalmente,
pueden prepararse suspensiones de los principios activos como
suspensiones de inyección oleosas apropiadas. Los disolventes o
vehículo lipófilos adecuados incluyen ácidos grasos tales como
aceite de sésamo, o ésteres de ácidos grasos sintéticos, tales como
oleato de etilo o triglicéridos, o liposomas. Las suspensiones de
inyección acuosas pueden contener sustancias que aumentan la
viscosidad de la suspensión, tales como carboximetilcelulosa de
sodio, sorbitol, o dextrano. Opcionalmente, la suspensión también
puede contener estabilizadores adecuados o agentes que aumentan la
solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de
disoluciones altamente concentradas.
Las preparaciones farmacéuticas para el uso oral
pueden obtenerse mediante la combinación de los principios activos
con un excipiente sólido, opcionalmente moliendo una mezcla
resultante, y tratando la mezcla de gránulos, tras añadir agentes
auxiliares adecuados, si se desea, para obtener comprimidos o
núcleos de comprimidos recubiertos de azúcar. Los excipientes
adecuados son, en particular, cargas tales como azúcares, incluyendo
lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol; preparaciones de celulosa
tales como, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón
de arroz, almidón de patata, gelatina, goma tragacanto,
metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa de
sodio y/o polivinilpirrolidona (PVP). Si se desea, pueden añadirse
agentes disgregantes, tales como polivinilpirrolidona reticulada,
agar, o ácido algínico o una sal de los mismos tal como el alginato
de sodio. Los núcleos de los comprimidos recubiertos de azúcar están
provistos de recubrimientos adecuados. Para este fin, pueden
utilizarse disoluciones concentradas de azúcar, que opcionalmente
pueden contener goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel de
Carbopol, polietilenglicol y/o dióxido de titanio, disoluciones de
laca y disolventes orgánicos adecuados o mezclas de disolventes.
Pueden añadirse colorantes o pigmentos a los recubrimientos de los
comprimidos o comprimidos recubiertos de azúcar para su
identificación o para caracterizar diferentes combinaciones de dosis
del principio activo. Para este fin, pueden utilizarse disoluciones
concentradas de azúcar, que opcionalmente pueden contener goma
arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel de Carbopol,
polietilenglicol y/o dióxido de titanio, disoluciones de laca y
disolventes orgánicos adecuados o mezclas de disolventes. Los
colorantes o pigmentos pueden añadirse a los recubrimientos de los
comprimidos o comprimidos recubiertos de azúcar para su
identificación para caracterizar diferentes combinaciones de dosis
del principio activo. Tales formulaciones pueden obtenerse
utilizando métodos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, las
patentes de los EE.UU. números 5.733.888 (composiciones
inyectables); 5.726.181 (compuestos escasamente solubles en agua);
5.707.641 (proteínas o péptidos terapéuticamente activos); 5.667.809
(agentes lipófilos); 5.576.012 (agentes poliméricos de
solubilización); 5.707.615 (formulaciones antivirales); 5.683.676
(medicamentos particulados); 5.654.286 (formulaciones tópicas);
5.688.529 (suspensiones orales); 5.445.829 (formulaciones de
liberación sostenida); 5.653.987 (formulaciones líquidas); 5.641.515
(formulaciones de liberación controlada) y 5.601.845 (formulaciones
de microesferas.
La invención puede entenderse mejor con
referencia a los ejemplos adjuntos, que sólo se destinan a fines de
ilustración y no debe interpretarse como en ningún sentido
limitantes del alcance de la invención, tal como se define en las
reivindicaciones adjuntas al presente documento.
Para analizar el efecto de diseños de pocillos y
electrodos diversos, se produjeron una serie de simulaciones
numéricas bidimensionales de los campos eléctricos utilizando el
paquete de análisis de software Quickfield™ 4.1, (versión para
estudiantes, Tera Analysis,
bttp://www.tera-analysis.com). Este paquete de
software crea mapas de intensidad de campo eléctrico de tipo de
malla de grano grueso resolviendo la ecuación de Poisson con un
método de análisis por elementos finitos en dos dimensiones. Para
los fines de este análisis, se ignoraron los efectos marginales
debido a la separación entre la parte inferior del electrodo y el
fondo del pocillo, y también se supusieron que deben ser
insignificantes los descensos del voltaje de los electrodos a la
solución salina. La resolución espacial del modelado es de
aproximadamente 0,5 mm.
La figura 7A muestra los resultados de la
simulación utilizando electrodos de placas paralelas (710) de 4 mm
de ancho con una separación de 4 mm con una diferencia de potencial
eléctrico convencional de 2 V situado en una placa de 96 pocillos
circulares convencional. En esta figura, el circulo exterior (700)
es el borde del pocillo, las dos líneas verticales (710) son los
electrodos, y el círculo discontinuo en el centro (720) es la zona
de observación. La zona gris (740) es la zona en la que el campo
eléctrico permanece dentro del \pm 10% del campo medio en la zona
de observación. En la zona blanca (730), el campo es inferior al 10%
de la media, y en la zona negra (750), el campo es más del 10% mayor
que el campo medio. Dentro de la zona de observación, la desviación
estándar de la intensidad de campo es del 2% de la media, y la
diferencia entre los campos máximo y mínimo es del 10% de la media.
Por tanto, esta geometría satisface las necesidades establecidas
para la uniformidad del campo para su uso en la presente
invención.
Para determinar la uniformidad del campo
prevista para dos electrodos de aguja redondos de 1,0 mm de diámetro
colocados en un pocillo de 6,2 mm de diámetro convencional,
separados por una distancia de 4,0 mm, se completaron las
simulaciones con las mismas condiciones y suposiciones tal como se
describió en el ejemplo 1.
En la figura 7B, el circulo continuo exterior
(705) es el borde del pocillo, los dos círculos más pequeños (715)
son los electrodos, y el círculo discontinuo en el centro es la zona
de observación. La zona gris (745) es la zona en la que el campo
eléctrico permanece dentro del \pm 10% del campo medio en la zona
de observación. En la zona blanca (735), el campo es inferior al 10%
de la media, y en la zona negra (755), el campo es más del 10% mayor
que el campo medio. Dentro de la zona de observación (725), la
desviación estándar de la intensidad de campo es del 15% de la
media, y la diferencia entre los campos máximo y mínimo es del 87%
de la media. Por tanto, esta geometría no crea campos eléctricos
uniformes y como consecuencia no es adecuado para su uso con la
presente invención.
La figura 8A muestra un simulación del perfil de
campo para dos electrodos de placas paralelas de 6 mm de ancho con
una separación de 4 mm en un pocillo cuadrado de 6,2 mm. En esta
figura, el cuadrado exterior (800) es el borde del pocillo. Las dos
líneas verticales (810) son los electrodos. El círculo discontinuo
en el centro (820) es la zona de observación. Es de observación
particular que la escala del campo eléctrico para la figura 8 se ha
amplificado mucho comparado con la figura 7 para proporcionar
contraste para las variaciones en la intensidad de campo eléctrico.
La zona gris (840) es la zona en la que el campo eléctrico permanece
dentro del \pm 1% del campo medio en la zona de observación. En la
zona blanca (830), el campo es inferior al 1% de la media. En esta
simulación, no es el campo más del 1% mayor que el campo medio en
ningún punto. Dentro de la zona de observación, la desviación
estándar de la intensidad de campo es del 0,02% de la media, y la
diferencia entre los campos máximo y mínimo es del 0,12% de la
media. Por tanto, esta geometría mejora mucho la uniformidad del
campo.
Los resultados de la simulación indican que la
fuente primaria de la no uniformidad del campo en el sistema de
placas paralelas mostrado en la figura 7A deriva de las paredes
redondas del pocillo. En un pocillo convencional con una sección
transversal circular, la densidad de corriente se extenderá y
después se contraerá a medida que pasa desde un electrodo hasta el
otro, y esta expansión genera no uniformidad. Esto puede corregirse
utilizando placas de múltiples pocillos con pocillos cuadrados.
La figura 8B muestra una simulación del perfil
de campo para dos electrodos de placas paralelas de 4 mm de ancho
con una separación de 4 mm en un pocillo redondo de 6,2 mm de
diámetro utilizando las condiciones y los procedimientos de análisis
habituales tal como se describieron en el ejemplo 1. Los aislantes
se unen a los electrodos para desenmascarar las zonas redondas del
pocillo entre los electrodos, tal como se muestra en la figura 9A.
En la figura 8B, el circulo exterior (802) es el borde del pocillo.
Las dos líneas verticales (812) son los electrodos. El círculo
discontinuo en el centro (822) es la zona de observación. Las zonas
sombreadas (862) son aislantes unidos a los electrodos. La zona gris
(842) es la zona en la que el campo eléctrico permanece dentro del
\pm 1% del campo medio en la zona de observación. En la zona
blanca (832), el campo es inferior al 1% de la media. En esta
simulación, el campo no es más del 1% mayor que el campo medio en
ningún punto. Dentro de la zona de observación, la desviación
estándar de la intensidad de campo es del 0,2% de la media, y la
diferencia entre los campos máximo y mínimo es del 1,0% de la media.
Por tanto, esta geometría mejora mucho la uniformidad del campo con
respecto al caso en el que no se usa aislante, pero no tanto como en
el caso de los pocillos cuadrados.
Los resultados demuestran que la uniformidad del
campo en placas de pocillos redondos convencionales puede aumentarse
mucho rellenando la zona externa de la zona definida por los
electrodos con un material aislante. En la práctica, podrían usarse
plásticos inertes tales como el nylon, tetrafluoroetileno,
policarbonato, o cualquier otro polímero no poroso, o vidrio, como
material aislante, siempre que sean relativamente estables en
disoluciones acuosas, se fabriquen fácilmente y preferiblemente no
sean fluorescentes. Normalmente, el aislante debería unirse al
electrodo y no debería ocultar ninguna parte de la zona definida por
los electrodos.
Para probar si es posible compensar la pérdida
de corriente en el borde curvo del pocillo por medio del uso de
electrodos satélite, se llevaron a cabo simulaciones en una variedad
de geometrías de electrodos. La figura 9B muestra una realización
posible de este concepto, y la figura 8C muestra el perfil del campo
eléctrico cuando se analiza esta geometría utilizando Quickfield™
tal como se describió en el ejemplo 1. En este ejemplo, se colocaron
dos pares extra de electrodos de placas paralelas de 0,7 mm de ancho
con una separación de 2 mm. Estos electrodos están fuera de la zona
de observación, y se mantienen a la mitad de los potenciales de sus
electrodos originales.
En la figura 8C, el círculo continuo exterior
(804) es el borde del pocillo. Las dos líneas verticales continuas
largas (814) son los electrodos originales, y las cuatro líneas
verticales continuas más cortas (816) son los electrodos satélite.
El círculo discontinuo en el centro (824) es la zona de observación.
La zona gris (844) es la zona en la que el campo eléctrico permanece
dentro del \pm 1% del campo medio en la zona de observación. En la
zona blanca (834), el campo es inferior al 1% de la media, y en la
zona negra (854), el campo es más del 1% mayor que el campo medio.
Dentro de la zona de observación, la desviación estándar de la
intensidad de campo es del 0,2% de la media, y la diferencia entre
los campos máximo y mínimo es del 1,2% de la media. Por tanto, esta
geometría mejora mucho la uniformidad del campo con respecto al caso
en el que no se usa aislante, pero no tanto como en el caso de
pocillos cuadrados.
Este ejemplo demostró el uso de cuatro
electrodos satélite en una configuración específica. Añadiendo más
electrodos satélite fuera de la zona de observación, y asignando
adecuadamente sus potenciales como una función de los potenciales
aplicados a los electrodos originales, en principio puede mejorarse
la uniformidad del campo eléctrico hasta una precisión
arbitraria.
Por ejemplo en una configuración de pocillo
redondo, la uniformidad del campo en la zona central de observación
puede mejorarse subdividiendo los electrodos de placas paralelas en
varias piezas separadas por divisores aislantes finos, tal como se
describe en la figura 9D. El potencial aplicado a cada electrodo
(expresado como una fracción del potencial aplicado a la pieza más
centrada) puede ajustarse individualmente para maximizar la
uniformidad del campo en la zona de observación.
Este concepto puede expandirse para permitir el
uso de electrodos de inmersión no paralelos, que tienen varias
bandas conductoras verticales, cada una de las que se controlan
independientemente.
El menisco creado por los electrodos de
inmersión cuando se insertan en un pocillo genera variaciones de la
profundidad de la solución salina de aproximadamente el 10% a través
de la zona de observación. Esto a su vez genera variaciones en el
campo eléctrico de aproximadamente el 10% a través de la zona de
observación. Estas variaciones existen incluso si se predice que el
diseño del electrodo va a crear una uniformidad de campo perfecta.
Por tanto, eliminar el efecto de menisco mejorará la uniformidad del
campo real. Un método posible para realizar esto es añadir una
barrera aislante entre los electrodos. La figura 9C representa una
realización de este tipo, en la que se usa la barrera aislante para
crear una superficie superior plana para el líquido en el pocillo.
La parte inferior de esta barrera, cuando se insertan los electrodos
en el pocillo, podría diseñarse para asentarse aproximadamente a 2,5
mm por encima del fondo de pocillo. Por tanto, la barrera podría
sumergirse parcialmente en la solución salina y su superficie de la
parte inferior podría definir la parte superior de la cámara
conductora para que sea plana y perpendicular a las superficies de
los electro-
dos. De esta manera, el campo eléctrico no se perturbaría por irregularidades en las superficies del volumen conductor.
dos. De esta manera, el campo eléctrico no se perturbaría por irregularidades en las superficies del volumen conductor.
En una realización del simulador eléctrico, el
dispositivo se compone de una estructura de autocolocación que
coloca los electrodos de inmersión en la serie de pocillos en un
formato de placa de múltiples pocillos de 96 pocillos (figura 1). La
figura 1 describe la posición insertada de la matriz de electrodos.
En este ejemplo, el dispositivo de estimulación eléctrica puede
ensamblarse a partir de tres partes funcionales. La primera parte es
la estructura de posicionamiento (40) que sitúa el dispositivo con
respecto a los pocillos de la placa. Esta estructura está compuesta
por metal y es de ajuste sin holgura a la placa de múltiples
pocillos. Esta estructura sirve como base de colocación para la
segunda parte funcional del sistema, el mecanismo de retractor.
El sistema de retractor consiste en pernos de
tope (70) y resortes de retorno (no visibles). Los resortes se
envuelven alrededor de los pernos de tope, y presionan contra la
estructura de posicionamiento (40) y la parte inferior de la
cobertura aislante (90). Los resortes de retorno mantiene el montaje
de electrodo en la posición retraída hasta que los electrodos
descienden hacia los pocillos de la placa. El mecanismo de retractor
sitúa la tercera parte funcional del sistema, la matriz de
electrodos.
La tercera parte funcional del sistema es la
matriz de electrodos. La matriz de electrodos está compuesta por
ocho pares de peines de electrodos idénticos (10). Los peines de
electrodos están compuestos por acero inoxidable y se cortan con
láser de precisión para impedir la distorsión. Cada peine tiene ocho
lengüetas de anchura suficiente para abarcar casi el diámetro de los
pocillos de la placa de múltiples pocillos. El esqueleto del peine
forma la conexión eléctrica a las lengüetas (50). Dos de estos
peines forman los pares de electrodos que se insertan en una columna
de ocho pocillos. Los peines se mantienen en su sitio unos con
respecto a otros mediante una placa perforada de precisión aislante
(30) que sitúa los electrodos con respecto a la estructura de
posicionamiento. Los espaciadores aislantes (20) mantienen la
separación de los electrodos e indexan los peines con respecto a la
placa perforada por medio de una superficie de contacto articulada.
Un segundo conjunto de espaciadores (25) garantiza el
posicionamiento preciso de los electrodos (10) con respecto a la
placa (30). Los ejes de alineación (15) se insertan a través de
agujeros de alineación en los espaciadores (20) y los peines de
electrodos (10) para una estabilidad adicional. Los peines y los
espaciadores se mantienen en su sitio contra la placa perforada
mediante una cubierta aislante (90).
El dispositivo puede utilizarse manualmente
colocando el dispositivo sobre la placa de múltiples pocillos y
presionando hacia abajo sobre el montaje de electrodo para hacer
descender los electrodos hacia los pocillos. Cuando se extienden
completamente los electrodos, se inserta un par de barras de bloqueo
(60) para mantener los electrodos extendidos dentro de los pocillos.
Alternativamente, la matriz de electrodos puede insertarse y
retraerse automáticamente de los pocillos por medio de sistemas de
control robóticos o mecánicos convencionales conocidos en la
técnica.
La figura 3 muestra un diagrama de bloques de
los componentes ópticos y eléctricos principales. Se crearon
estímulos eléctricos por medio de un amplificador de alta potencia
(320), accionado por un par de generadores de función digitales (380
y 310). En una realización, el conmutador (330) era un
ER-16 de National Instruments (Austin TX) controlado
por una tarjeta de entrada/salida digital PC-DIO 24
de National Instruments integrada en el ordenador controlador de
lector VIPR™ (300). El conmutador (330) dejó que los pocillos
definidos dentro de una placa de 96 pocillos se estimulen
eléctricamente con cualquier protocolo de tiempo dado. En este caso,
se estimuló una única columna de ocho pocillos simultáneamente. El
amplificador (320) se construyó utilizando el chip APEX PA93 (Apex
Microtechnology Corp, Tucson, AZ) siguiendo un circuito
proporcionado por el fabricante. El amplificador tenía las
especificaciones siguientes: \pm 100 V de CC dentro, 100 G\Omega
de impedancia de entrada, 20 X ganancia de voltaje, \pm 90 V
fuera, \pm 3 A fuera, 10 \Omega de impedancia de salida. Los
generadores de función fueron Tektronix (Beaverton, OR) modelo
AFG310. El primer generador de función (380) se activó por el
software de lector VIPR™ cuando se requirió que comenzase el tren de
impulsos del estímulo, y se produjo un tren de impulsos TTL para
activar el segundo generador de función (310). El segundo generador
de función se programó con el núcleo de forma de onda del
estímulo.
Las células de ovario de hámster chino de tipo
natural (células CHO) expresan de manera endógena un canal de sodio
dependiente de voltaje y pueden utilizarse convenientemente para
validar y optimizar parámetros de estimulación eléctrica. Además de
este canal de sodio, estas células parecen tener conexiones de unión
en hendidura entre las células adyacentes y una corriente de salida
dependiente de voltaje muy pequeña (\sim20 pA).
El canal de sodio dependiente de voltaje en
estas células (denominada más adelante en el presente documento como
NaV1) tiene características electrofisiológicas similares a los
canales de sodio de tipo IIa de cerebro de rata. Los análisis de las
características de corriente/voltaje de este canal por medio de la
electrofisiología convencional revela que normalmente las células
CHO de tipo natural tienen una corriente pico promedio de 100 pA por
célula a -20 mV. Esto corresponde a un resistividad de membrana
(R_{Na}) de aproximadamente 800 M\Omega. Suponiendo una
conductancia del canal único de 10 pS, esto sugiere que sólo hay
\sim125 canales de sodio por célula. Las células CHO que estamos
manejando normalmente muestran un potencial transmembrana en reposo
(R_{m}) de aproximadamente -35 mV, una resistencia de membrana en
reposo > 10 G\Omega, y una capacitancia de membrana celular
(C_{m}) de 15 pF.
Para probar la dependencia con el voltaje de la
estimulación eléctrica, se sembraron las células CHO de tipo natural
en placas de microtitulación de 96 pocillos y se incubaron en medio
de crecimiento durante 24-48 horas. Entonces se
enjuagar con disolución de baño 1 y se tiñeron durante 30 minutos
cada vez con CC2-DMPE 10 \muM (cumarina), entonces
DiSBAC_{2}(3) 3 \muM (etil-oxonol tal
como se describe en el apéndice A1). Se colocó un montaje de
estimulador con 96 pares de electrodos de acero inoxidable (4 mm de
ancho, 4 mm de separación) en la parte superior de la placa de
ensayo, tal como se describió en el ejemplo 7. Se hicieron descender
los electrodos hacia la solución salina que cubría a las células y
se mantuvo a 0,5 mm del fondo del pocillo. Se realizaron mediciones
de fluorescencia radiométricas durante la estimulación eléctrica
utilizando un lector VIPR™ tal como se describió anteriormente, y se
analizaron los datos según los procedimientos en el apéndice A2. En
un momento cualquiera, se sometió a ensayo sólo una columna de ocho
pocillos; los pocillos restantes no recibieron luz de excitación ni
estimulación eléctrica. Después que se sometiera a ensayo cada
placa, se enjuagaron cuidadosamente los electrodos con agua
destilada y se secaron con aire comprimido, para evitar la
contaminación cruzada entre las placas.
Para determinar los cambios de potencial
transmembrana que se producen en las células como resultado de la
estimulación eléctrica, se analizaron las placas de múltiples
pocillos que contenían las células en un lector VIPR™. Se excitaron
con luz a 400 \pm 7,5 nm las células en una zona de observación de
3 mm de diámetro situada en un punto medio entre los electrodos. La
luz se generó mediante una lámpara de arco de xenón de 300 W, y pasó
a través de un par de filtros de paso de banda de interferencia
dieléctrica para seleccionar la longitud de onda de excitación
correcta. La luz se dirigió hacia y desde las células por medio de
un cable de fibra óptica trifurcado, con un cable para la luz de
excitación y dos para la emisión de fluorescencia. Se registraron
mediciones simultáneas de señales en el azul (460 \pm 20 nm) y en
el naranja (580 \pm 30 nm) de cada pocillo a 50 Hz, se
digitalizaron y almacenaron en un ordenador. Los ensayos iniciales
fueron de 15 segundos de duración, y consistieron en una
estimulación de 6 segundos de estimulación de onda cuadrada bifásica
(5 ms/fase) repetitiva (tasa de repetición de 90 Hz) que comenzaba a
los 2 segundos a las amplitudes eléctricas mostradas. Durante dos
segundos antes y siete segundos después de la ráfaga de
estimulación, no pasó corriente a través de los electrodos. La
figura 10 muestra las respuestas radiométricas a diversas
intensidades de campo hasta 32 V/cm. En este caso, el tiempo de
aumento aparente de la respuesta registrada se limita mediante el
tiempo de respuesta del DiSBAC_{2}(3) que tiene una
constante de tiempo de respuesta de aproximadamente 1 segundo. Por
debajo de amplitudes de impulso de 10 V/cm, no se detecta respuesta.
Por encima de 20 V/cm, la respuesta es robusta y sólo aumenta
ligeramente a medida que aumenta adicionalmente el voltaje hasta 32
V/cm. Tal como se muestra en la figura 11, a voltajes superiores, la
respuesta pico (medida tras aproximadamente 5 segundos) sólo muestra
adicionalmente aumentos pequeños de la respuesta. Los datos en la
figura 11 pueden ajustarse a una función de Boltzman, que tenía un
punto medio a 18,0 V/cm con una anchura de 2,0 V/cm. La brusquedad
del comienzo y la planeidad de la respuesta en campos altos sugieren
sólidamente un fenómeno de umbral. El campo eléctrico en el que la
respuesta es la mitad del máximo (18 V/cm) corresponde a
aproximadamente desviaciones de \pm 30 mV en el potencial
transmembrana en los bordes extremos de las células, utilizando
fórmulas publicadas previamente (ecuación 1, véase también Tsong,
1991, Biophys. J. 60:297-306; y suponiendo un
diámetro promedio de las células de 30 \mum). Por tanto esto es
coherente cuantitativamente con el mecanismo de estimulación
descrito anteriormente para canales de sodio regulados por voltaje
normalmente en el estado inactivado.
Los campos eléctricos de alta intensidad pueden
dar como resultado la electroporación de las membranas celulares,
dando como resultado cambios no específicos relativamente grandes en
el potencial transmembrana (Tsong, 1991, Biophys. J.
60:297-306). Para establecer si esto es o no también
un factor principal en las repuestas de las células a intensidades
de campo eléctrico inferiores utilizadas en el presente documento,
se llevaron a cabo experimentos con la toxina específica del canal
de sodio, tetrodotoxina (TTX). Si pueden bloquearse los efectos de
estimulación eléctrica por la toxina, esto podría sugerir que el
efecto de estimulación eléctrica está mediado principalmente por la
activación de los canales de sodio. Los resultados de este
experimento se muestran en la figura 12. Los datos se obtuvieron con
una intensidad del campo eléctrico de 33 V/cm y demostraron que TTX
podía bloquear completamente el efecto de estimulación eléctrica con
características farmacológicas típicas coherentes con el bloqueo de
los canales de sodio. La CE_{50} procedente del ajuste a este dato
es de 9 nM, similar al valor notificado para TTX en células de tipo
IIa de cerebro de rata (8 nM, West et al., 1992, Neuron 8:
59-70). El hecho de que esta señal se bloquee por
TTX con farmacología normal es una fuerte evidencia de que la señal
generada por medio de la estimulación eléctrica es casi totalmente
debida a NaV1.
Para examinar el comportamiento de la respuesta
celular a medida que se variaron la frecuencia y anchura de impulso
del estímulo, se llevaron a cabo experimentos utilizando células CHO
de tipo natural tal como se describieron en el ejemplo 8 anterior a
una intensidad de campo constante de 25 V/cm, mientras que se
variaba la frecuencia y la duración del impulso.
Los resultados se exponen en la figura 13. Cada
punto de datos representa el promedio de ocho pocillos estimulados
al mismo tiempo a partir de experimentos derivados de cinco placas
separadas de células CHO de tipo natural. Los resultados muestran
generalmente que a medida que aumenta la frecuencia de estimulación,
aumenta la magnitud de la repuesta. Se podría predecir que este
efecto finalmente debe saturarse a medida que el potencial de
transmembrana se conduce al potencial de inversión de sodio
(V_{Na}). En este caso esto no se produce porque la densidad del
canal de sodio es demasiado baja.
El aumento de la duración del impulso da como
resultado grados de estimulación eléctrica relativamente superiores
a frecuencias de estimulación inferiores de hasta aproximadamente 10
ms, más allá del cual los aumentos adicionales son menos
pronunciados. Las duraciones del impulso muy pequeñas (inferiores a
1 ms) también limitan la respuesta, aparentemente porque los canales
no se liberan eficazmente de la inactivación. Para inducir
eficazmente respuestas celulares grandes, los mejores parámetros de
estimulación están normalmente en el intervalo en el que la duración
del impulso es superior o igual a la constante de tiempo para la
recuperación de la inactivación, y suficientemente corta de manera
que la frecuencia de estimulación es superior que la constante de
tiempo de membrana. Adicionalmente, la frecuencia de estimulación
óptica es normalmente inferior a la inversa del tiempo promedio de
apertura del canal.
Estos experimentos demuestran que la
estimulación eléctrica puede utilizarse con éxito incluso en células
que expresan incluso niveles relativamente bajos de canales
dependientes de voltaje, y pueden completarse con éxito en
condiciones que no conducen a una electroporación o muerte celular
significativa. Estos experimentos también demuestran métodos
mediante los que pueden optimizarse la frecuencia de repetición y la
duración de impulso del estímulo para producir respuestas de un
tamaño deseado.
Se transfectaron de manera estable las células
de ovario de hámster chino con un plásmido que codifica para un
canal de sodio dependiente de voltaje (denominado a continuación en
el presente documento como NaV2) tal como se describió en la sección
VI. Se utilizó el análisis de patch clamp de célula completa para
confirmar las propiedades electrofisiológicas y farmacológicas de
este canal antes del análisis por medio de estimulación
eléctrica.
Se midió que la corriente de sodio transitoria
pico a -20 mV era de 600 \pm 300 pA (N=5), con una capacitancia de
membrana celular promedio de 15 \pm 5 pF. La resistencia de la
membrana celular en reposo era demasiado grande para medirse con
precisión (R_{L} > 10 G\Omega). El potencial transmembrana en
reposo era de -31 \pm 3 mV.
Para determinar el campo eléctrico umbral para
la estimulación, se pusieron en placas de 96 pocillos células que
expresan de manera estable el canal de sodio y se tiñeron según el
protocolo en el apéndice A1. El protocolo de estimulación eléctrica
implicó una ráfaga de 3 segundos, de 20 Hz, de estímulos bifásicos
(5 ms/fase) con intensidad de campo variable utilizando el
estimulador eléctrico descrito en el ejemplo 7.
La figura 14 muestra perfiles de tiempo
representativos a varias intensidades de campo (cada curva es el
promedio de ocho pocillos). A intensidades de campo bajas, no hay
repuesta celular detectable, lo que sugiere que el potencial
transmembrana promedio cambia menos de aproximadamente 1 mV. Entre
35 y 90 V/cm, la respuesta está estereotipada, con una amplitud y
forma fijas. Por encima de 90 V/cm, la respuesta pico permanece
relativamente constante, pero el tiempo de desactivación de la
respuesta tras haberse retirado el estímulo se vuelve
considerablemente prolongado.
Coherente con los experimentos mostrados en el
ejemplo 8, la respuesta inducida por la intensidad del campo
eléctrico de hasta 85 V/cm pudo inhibirse por TTX mientras que la
respuesta obtenida de las células estimuladas por encima de 90 V/cm
no pudo (datos no mostrados). Por tanto, se concluye que la
respuesta rápida es debida al mecanismo de apertura del canal de
sodio explicado anteriormente, mientras que la respuesta lenta se
produce principalmente por electropermeabilización de la membrana
por el campo eléctrico.
Este efecto se observa más fácilmente comparando
el comportamiento de la respuesta rápida (4 segundos tras la
estimulación) y la respuesta lenta (diez segundos tras la
estimulación) con una intensidad de campo creciente. Este dato se
muestra en la figura 15. Ajustando la respuesta rápida a una función
de Boltzman, el punto medio de la respuesta temprana estaba a
E_{50} = 26 V/cm, con una anchura de \DeltaE = 3,5 V/cm. La
respuesta era independiente de la intensidad de campo entre 40 y 80
V/cm, con un ligero aumento cuando la electropermeabilización se
fija superior a
90 V/cm.
90 V/cm.
La respuesta más lenta debida a la
permeabilización fue detectable en primer lugar a 90 V/cm, y es ella
misma de uso potencial en algunas aplicaciones. Por ejemplo, la
permeabilización puede utilizarse para volver a poner el potencial
transmembrana a cero, o si la permeabilización es selectiva para un
ion específico, para volver a poner el potencial transmembrana en el
valor de equilibrio para ese ion. Esto puede ser útil, por ejemplo,
en un ensayo para un canal que coloque el potencial transmembrana.
Ejemplos incluyen canales de fuga de potasio y cloruro,
rectificadores entrantes de potasio, y canales de potasio regulados
por voltaje activados por voltaje bajo.
Estos resultados son coherentes con los estudios
publicados en los que la electropermeabilización comienza con un
potencial transmembrana umbral de aproximadamente \pm 200 mV,
independientemente del tipo de célula (Teissie y Rols, 1993,
Biophys. J. 65:409-413). Basándose en las fórmulas
notificadas en ese artículo y ampliamente aceptadas en la
bibliografía, las células CHO con un diámetro promedio de 30 \mum
experimentarán cambios de potencial transmembrana de \pm 200 mV si
se exponen a un campo eléctrico extracelular de 90 V/cm.
Para hacer estimaciones cuantitativas de la
liberación eficaz del tiempo de inactivación y la conductancia del
canal abierto, pero sin restringirse a ningún mecanismo de acción
específico, se desarrolló la siguiente teoría para la verificación
experimental.
Tras la apertura, los canales de sodio se
inactivan con una constante de tiempo dependiente de voltaje del
orden de 1 milisegundo. Debido a que la corriente que pasa por los
canales de sodio abiertos depende mucho del tiempo y del voltaje, no
es posible generar fácilmente una expresión analítica para el cambio
del voltaje tras una única estimulación. Sin embargo, haciendo
algunas aproximaciones de simplificación, se pueden modelar
respuestas idealizadas promedio para crear una teoría que pueda
probarse. Para los fines del presente documento, se supone que con
la apertura, los canales de sodio se comportan como una conductancia
lineal superior a V_{t} = -40 mV con un potencial de inversión a
E_{Na} = +60 mV. La conductancia g_{Na} se determina como la
corriente máxima obtenida a -20 mV en un experimento patch clamp de
célula completa. La dependencia con el tiempo de la conductancia del
canal de sodio se simplifica suponiendo que, cuando el canal se
activa, tiene una conductancia fija g_{Na} 1/ R_{Na} para un
tiempo fijo t_{Na} = 1,0 ms, tras lo que se inactiva el canal.
Utilizando un núcleo de estímulo de onda
cuadrada bifásica (cada fase tiene un tiempo t1 y se repite a una
frecuencia f = 1/T), la corriente total que entra en la célula
durante T es:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Aquí, \tau_{Na} es el tiempo que los canales
de sodio están abiertos. R_{Na} = 1/g_{Na} es la resistencia de
la membrana cuando los canales de sodio están abiertos. R_{L} es
la resistencia de la membrana normal (fuga). V_{L} es el potencial
de inversión de fuga (es decir, el potencial de membrana en reposo).
V_{Na} es el potencial de inversión de sodio. \tau_{r} es la
constante de tiempo para la recuperación de la inactivación;
realmente esto es una función del voltaje de hiperpolarización
conseguido durante el impulso, pero se supone en el presente
documento que es constante.
En realidad, los canales de sodio de partes
diferentes de la célula experimentan cambios de potencial de
membrana diferentes, y los parámetros \tau_{Na}, \tau_{r}, y
R_{Na} tienen una fuerte dependencia con el potencial de membrana.
El modelo completo debería tener en cuenta la morfología celular,
una distribución aleatoria de orientaciones celulares, y la
dependencia con el potencial y el tiempo de estos parámetros.
Entonces debería ser posible, convolucionar estas dependencias para
producir valores eficaces para estos parámetros. Estos
procedimientos son demasiado complicados para la presente discusión.
En su lugar, se reconocerá que los valores que se extraen de los
ajustes a estas ecuaciones representan promedios complicados de las
propiedades del canal subyacente.
\newpage
La resolución de la ecuación (2) para el cambio
del potencial transmembrana durante la estimulación
(V-V_{L}) da:
Si la estimulación se lleva a cabo durante un
tiempo suficientemente largo de manera que se alcance un nuevo
potencial transmembrana, la ecuación del estado estacionario es:
Para determinar la liberación eficaz del tiempo
de inactivación y la conductancia del canal abierto, se llevaron a
cabo experimentos tal como se describieron en el ejemplo 8,
utilizando un núcleo de onda cuadrada bifásica en una amplitud
constante de 43 V/cm en frecuencias variables y con duraciones de
impulso de 20 ms, 10 ms, 5 ms, 2 ms y 0,3 ms. Los resultados,
mostrados en la figura 16, exponen la respuesta como una función de
frecuencia de estimulación para varias duraciones de impulso. En
este caso tal como se predijo, la respuesta se satura a altas
frecuencias a medida que el potencial transmembrana se aproxima
aparentemente al potencial de inversión de sodio. Para determinar la
libración eficaz del tiempo de inactivación y el tiempo de apertura
del canal, se ajustó la respuesta R a la ecuación de Hill modificada
de a continuación.
La ecuación (5) puede derivarse de la ecuación
(4) reconociendo que la respuesta radiométrica R = 1 para ningún
cambio de potencial transmembrana, y es lineal en el cambio de
potencial transmembrana con una constante A de proporcionalidad no
calibrada.
En la ecuación (5), A y f_{0} son parámetros
ajustables. El ajuste se realizó utilizando un análisis de mínimos
cuadrados no lineales utilizando el software Origin 6.0 (Microcal,
Northampton MA).
Los parámetros T_{0} = 1/f_{0} de la
ecuación (5) anterior se extrajeron de estos ajustes y se
representaron frente a la duración del impulso y se muestran en la
figura 17. La línea en esta figura es un ajuste para una
desactivación exponencial, y a partir de este ajuste, se extrae la
liberación de la constante de tiempo de inactivación (\tau_{r})
\tau_{r} = 5,7 ms y R_{L}_{\tau}_{Na}/R_{Na} =
0,314.
Suponiendo que \tau_{Na}=1 ms y R_{L}=45
G\Omega, entonces R_{Na}=140 M\Omega. Esto a su vez significa
que la conductancia de sodio pico debería ser de 100 mV/140
M\Omega = 700 pA. Esto concuerda de manera excelente con el valor
medido en el patch clamp de célula completa.
Normalmente, las células HEK-293
de tipo natural expresan una variedad de corrientes de cloruro y
potasio endógenas (Zhu et al., 1998, J. Neurosci. Meth.
81:73-83), de manera que la resistencia de membrana
en reposo para estas células es de 5-10 G\Omega.
Como consecuencia, la constante de tiempo de membrana para estas
células es correspondientemente menor, por tanto para la
estimulación óptima de las células, se predeciría que el protocolo
de estimulación eléctrica debe repetirse a frecuencias relativamente
superiores comparadas con las células sin canales de potasio
endógenos con el fin de generar señales comparables.
Para probar que un canal de sodio regulado por
voltaje podría estimularse eléctricamente de manera eficaz
utilizando la presente invención en este fondo celular, se
transfectaron de manera estable células HEK-293 con
un canal de sodio dependiente de voltaje denominado a continuación
en el presente documento como NaV3. Las células se transfectaron y
se seleccionaron tal como se describió en la sección VI y se
marcaron con colorantes FRET tal como se describió en el ejemplo 8.
Las células se pusieron en placas y se cargaron con
CC2-DMPE 15 \muM y DiSBAC_{6} (3) 2 \muM y
entonces se sometieron a un tren de estímulos bifásicos de 25 V/cm,
repetidos a una frecuencia de 90 Hz y con una duración de impulso de
5 ms/fase. El tren de impulsos de estimulación se produjo durante
una duración total de 3 segundos y la tasa de digitalización para la
recogida de datos era de 50 Hz.
La respuesta como una función del tiempo (la
figura 18) muestra una fase inicial rápida (tiempo de ascenso <
20 ms) que disminuye con una constante de tiempo de aproximadamente
40 ms hasta una meseta estable. También está presente un cambio de
potencial de rebote pequeño entre el pico transitorio y la meseta.
Este comportamiento se interpreta como debido a la activación de
canales de potasio dependientes de voltaje endógenos (K_{V}) que
se produce tras el primer impulso de estímulo. Podría esperarse que
la activación de estos canales de potasio endógenos ocasione una
reducción del potencial transmembrana a medida que el potasio
abandona la célula coherente con los datos experimentales. A medida
que la estimulación eléctrica continúa, el potencial transmembrana
alcanza un nuevo equilibrio que se establece por el equilibrio del
flujo de sodio hacia el interior de la célula y el flujo de potasio
hacia el exterior de la célula. Al final de la estimulación, la
constante de tiempo de desactivación de la respuesta es de
aproximadamente 143 ms, correspondiente a una resistencia de fuga de
aproximadamente 9 G\Omega.
Para determinar si esta menor respuesta global
podría utilizarse de manera fiable para el descubrimiento de
fármacos, se realizaron para determinar si los efectos de TTX o
tetracaína podrían caracterizarse de manera precisa. Los resultados
mostrados en la figura 19 demuestran que los perfiles de inhibición
farmacológica de estos fármacos utilizando la presente invención son
coherentes con el comportamiento conocido del canal de sodio NAV3
con estos agentes. La curva dosis-respuesta para TTX
pudo ajustarse con una función de Hill con una CE_{50} = 25 nM y
un coeficiente de Hill de 1,1. La curva
dosis-respuesta para tetracaína pudo ajustarse a una
curva con una CE_{50} = 11 \muM y un coeficiente de Hill de
0,97. Estos resultados sugieren que la respuesta se produce por la
actividad del canal de sodio y que la información farmacológica
sobre compuestos conocidos y desconocidos puede obtenerse utilizando
este método.
Para determinar si el presente método puede
aplicarse generalmente a una amplia variedad de diferentes canales
de sodio, se transfectaron de manera estable células
HEK-293 con otro canal de sodio dependiente de
voltaje, denominado a continuación en el presente documento como
NaV4. Estas células se transfectaron, se seleccionaron y se cargaron
con colorantes FRET tal como se describió en la sección VI y el
ejemplo 8. Los resultados de una curva
dosis-respuesta para tetracaína en este canal se
muestran en la figura 20. Aquí, los puntos de datos son promedios y
desviaciones estándar de ocho pocillos y la línea continua es un
ajuste a una función de Hill con una CE_{50} = 35 \muM estimada
y un coeficiente de Hill de 1,35. Estos resultados son coherentes
con la farmacología conocida de este canal iónico y demuestra de
nuevo que la respuesta celular está producida principalmente por la
actividad del canal de
sodio.
sodio.
Se realizó una demostración de la estimulación
directa de canales de potasio y cloruro dependientes de voltaje
utilizando células HEK-293 de tipo natural, que
expresan de manera endógena una mezcla de varios canales de potasio
y cloruro activados por voltaje (Zhu, Zhang et al. 1998). Se
hicieron crecer las células de tipo natural en placas de microtítulo
de 96 pocillos y se sometieron a ensayo en confluencia tras la
tinción con los colorantes de FRET según el protocolo en el apéndice
A1. Los parámetros de los estímulos iniciales incluyeron una
estimulación eléctrica durante 3 segundos de duración a 20 Hz con un
núcleo de estímulo de onda cuadrada bifásica con una duración de
impulso de aproximadamente 5 ms/fase. Se realizaron estímulos en
intensidades de campo eléctrico variables para determinar la
intensidad de campo umbral para una respuesta celular medible, y en
presencia o ausencia de bloqueantes del canal de potasio.
La figura 21 muestra la respuesta de voltaje
celular obtenida durante este experimento. En esta figura, cada
panel contiene el perfil de tiempo de 10 segundos de la respuesta
para un único pocillo. Los paneles se disponen para hacer coincidir
sus posiciones relativas en la placa. El eje vertical en cada panel
es la razón de fluorescencia normalizada, restada del fondo, de la
combinación de colorante de FRET sensible al voltaje
CC2-DMPE/DiSBAC2(3), los cambios en esta
cantidad son aproximadamente proporcionales a los cambios en el
potencial de membrana. Cada columna tenía condiciones de
estimulación idénticas, aumentando la intensidad del campo eléctrico
de izquierda a derecha a través de la placa. La columna
decimosegunda de la placa de 96 pocillos (no mostrada) no contenía
células y se utilizó para restar el fondo. Las filas
6-8 contenían TEA 10 mM para bloquear los canales de
potasio dependientes de voltaje. A las intensidades de campo más
bajas probadas, no había respuesta detectable. En campos eléctricos
intermedios, puede observarse una respuesta de voltaje negativa que
decae rápidamente cuando se elimina el estímulo. En los campos
superiores se provoca una gran respuesta positiva. Este
comportamiento se fija en por encima de 50 V/cm, de manera similar
al umbral de electropermeabilización observado en células CHO que
expresan NaV1, (ejemplo 8).
La figura 22 muestra la respuesta promediada
entre 4,5 y 5,0 segundos de estimulación como una función de la
intensidad del campo eléctrico. Se excluyeron las respuestas
positivas grandes superiores a 60 V/cm para mostrar las respuestas
negativas dependientes de canal. El coeficiente de variación de la
respuesta generalmente es extremadamente pequeño, dando intervalos
de selección extremadamente grandes (véase el apéndice A3). Para los
datos de desbloqueo para 20-40 V/cm, la diferencia
entre los pocillos estimulados y no estimulados es de
aproximadamente 20 desviaciones estándar.
Se añadió tetraetilamonio (TEA), un bloqueante
del canal de potasio bien conocido (Hille, 1992, Ionic Channels of
Excitable Membranes), a las filas 6, 7, y 8 en una concentración
completamente bloqueante de 10 mM. Este tratamiento bloquea
parcialmente la respuesta. Este resultado es compatible con la
existencia de los dos canales de potasio (bloqueado por TEA) y
cloruro (no afectado por TEA) en estas células que responden a la
estimulación eléctrica. Puede aislarse el efecto de los canales de
potasio bloqueando los canales de cloruro con ácido
4,4'-diisotiocianoestilbeno-2,2'-disulfónico
(DIDS) o ácido
4-acetamido-4-isotiocianoestilbeno-2,2'-disulfónico
(SITS; véase Hille, 1992, Ionic Channels of Excitable Membranes).
Entonces, puede utilizarse la misma línea celular para seleccionar
dos clases de canales.
Cualquier sistema de selección propuesto podrá
reproducir preferiblemente la farmacología de los compuestos
conocidos tal como se determinaron mediante métodos aceptados. Para
verificar que este era el caso de la presente invención, se analizó
una serie de compuestos de prueba de actividad definida utilizando
una línea celular CHO que expresa el canal NaV2. Para llevar a cabo
esto, se cultivaron las células en placas de 96 pocillos y se
tiñeron con colorantes sensibles al voltaje tal como se describe en
el apéndice A1. Los compuestos de prueba se añadieron a las células
con el tampón que portaba oxonol. A menos que se observe lo
contrario, los compuestos se sometieron a prueba tal como en 8
réplicas, con diluciones 1/3 en once columnas de la placa de
ensayo.
La figura 23 muestra los perfiles de tiempos
para las concentraciones seleccionadas de los bloqueantes del canal
de sodio, tetrodotoxina (TTX) y tetracaína.
Tetrodotoxina es un antagonista del canal de
sodio no específico de estado, reversible y potente. Por
comparación, tetracaína es un bloqueante del canal de sodio
dependiente del uso que muestran afinidades diferentes para los
diferentes estados del canal de sodio.
Los resultados muestran que la presente
invención proporciona resultados altamente reproducibles con
variabilidad relativamente pequeña o bien entre muestras o bien
entre placas. En la figura 23 puede observarse el efecto de TTX como
una pérdida progresiva de la repuesta, sin cambios significativos en
la forma de la respuesta. Por comparación con tetracaína, las
respuestas no sólo disminuyen, sino que cambia la forma a medida que
la concentración varía. Los CV de estos experimentos fueron del 10%
(TTX) y del 9% (tetracaína), comparados con los CV normales
utilizando los mismo colorantes de voltaje, pero las adiciones de
líquido tradicionales fueron del 16% (TTX) y del 18%
(tetracaína).
De manera importante, los resultados muestran
también que la presente invención puede identificar el bloqueo
dependiente del estado del canal de sodio por tetracaína. El bloqueo
dependiente del uso de tetracaína es más evidente en las curvas
dosis-respuesta mostradas en la figura 24. Para TTX,
el bloqueo del canal es independiente del intervalo de tiempo
utilizado para calcular la respuesta. Para tetracaína, sin embargo,
el bloqueo es de un orden de magnitud superior en 3 segundos que en
1 segundo. Con las mismas condiciones de estimulación, otros
bloqueantes dependientes de uso (lidocaína y bupivacaína) mostraron
una cantidad más pequeña de desplazamiento en las curvas
dosis-respuesta. Los valores de CE_{50} obtenidos
mediante el protocolo de estimulación eléctrica para lidocaína
fueron similares a los valores de alta frecuencia notificados en la
bibliografía (véase la tabla 4); esto sugiere que lidocaína y
bupivacaína tienen dependencia del uso lo suficientemente rápida
para saturarse completamente en los estímulos de 20 Hz utilizados en
el presente documento. Esto, a su vez, sugiere que pueden explorarse
las propiedades dependientes de uso de anestésicos locales variando
la frecuencia de estimulación.
La tabla 4 enumera las concentraciones
bloqueantes de varios antagonistas del canal de sodio. Los valores
de la bibliografía notificados se han medido todos utilizando la
técnica de patch clamp de célula completa, y por tanto se basan en
mediciones directas de la corriente del canal de sodio.
a Ragsdale et al., 1996,
Proceedings of the National Academy of Sciences, U.S.A. 93:
9270-9275
b Wanner et al., 1999,
Biochemistry 38: 11137-11146.
c West et al., 1992,
Neuron 8: 59-70.
d Ragsdale et al., 1991,
Molecular Pharmacology 40: 756-65.
En la tabla 4, las entradas de la tabla son
valores de CE_{50} (en micromolar) para los ajustes a las curvas
dosis-respuesta de cada ensayo. Cada experimento se
realizó dos veces, con cuatro pocillos por concentración del fármaco
por experimento. En cada experimento, se utilizaron once
concentraciones, abarcando cinco ordenes de magnitud en
concentración. Los valores notificados son los promedios de las
CE_{50} calculadas de cada experimento. En los que casos de
bloqueantes dependientes de uso, se indican los valores notificados
más bajos.
WIN-17317 y TTX son bloqueantes
tónicos potentes de una serie de canales de sodio. Estos compuestos
pueden detectarse utilizando el formato de estimulación eléctrica,
que da potencias de bloqueo próximas a los valores de la
bibliografía.
Los primeros cuatro fármacos (lidocaína,
bupivacaína, tetracaína, y fenitoína) son bloqueantes dependientes
de uso. Es decir, tienen afinidades diferentes para los diversos
estados del canal. Son de relevancia terapéutica grande ya que a
concentraciones apropiadas pueden bloquear roturas repetitivas
perjudiciales de las neuronas y células musculares no afectando la
actividad normal a baja frecuencia. En todos los casos, la
concentración de bloqueo medida, medida con la estimulación
eléctrica, se aproxima al valor notificado en la bibliografía. El
formato de ensayo de estimulación eléctrica es el único método de
alto rendimiento fidedigno para detectar todos los moduladores de
los canales de sodio, incluyendo agonistas, antagonistas, y
bloqueantes dependientes de uso.
Para los fines de selección de alto rendimiento,
las repuestas deben ser suficientemente fiables para hablar con
confianza de la diferencia entre compuestos activos e inactivos.
Esto puede cuantificarse examinando la distribución de las
respuestas obtenidas con condiciones de estimulación idénticas,
comparando canales nativos con canales bloqueados completamente.
Debido a la incertidumbre y ruido experimental en el sistema, habrá
alguna dispersión en las respuestas. Sería idóneo poder cuantificar
estadísticamente esta dispersión, y usarla como predicción de
probabilidades de respuestas mal identificadas como falsos positivos
o falsos negativos.
Para hacer esto, se cargó una placa de células
que expresan el canal de sodio dependiente de voltaje NaV2 con los
colorantes de FRET. Se realizó "aleatoriamente" una adición
conocida en un pocillo por columna de TTX 1 \muM, aproximadamente
200 veces la concentración de la mitad del bloqueo. Las células se
sometieron a ensayo con un estímulo bifásico de 5 ms/fase, con
ráfagas de 25 V/cm durante 3 segundos, a 20 Hz. Los resultados se
muestran en la figura 25. Los pocillos con adiciones conocidas de
TTX pueden distinguirse fácilmente mediante observación como los
pocillos con respuesta pequeña o no detectable.
La respuesta radiométrica dos segundos tras el
comienzo del estímulo se muestran en el figura 26. Pueden
distinguirse fácilmente las dos poblaciones (bloqueada y
desbloqueada). La repuesta bloqueada promedio era de 1,011 \pm
0,004, mientras que la respuesta desbloqueada promedio era de 2,67
\pm 0,21. El coeficiente de variación de la respuesta desbloqueada
es del 13%. El intervalo de selección (es decir, la diferencia entre
las poblaciones normalizadas para las desviaciones estándar, véase
el apéndice A3) es de 7,8 (\sigma_{1} + \sigma_{2}), en el
que \sigma_{1} = 0,21 es la desviación estándar de la respuesta
desbloqueada y \sigma_{2} = 0,004 es la desviación estándar de
la respuesta bloqueada. Si se toma el punto de corte para distinguir
los bloqueantes de los no bloqueantes a medio camino entre las
poblaciones (en 1,042), entonces la tasa de falsos positivos y
falsos negativos estadísticos (suponiendo una distribución normal)
es 1-prob(7,75) = 10^{14}. Esto sugiere que
durante una selección de una biblioteca de compuestos grande
(10^{8} compuestos), la probabilidad de encontrar un único falso
positivo o falso negativo durante la selección completa es sólo una
en un millón. Para comparación, si la diferencia entre las
poblaciones fuera sólo de 3 y se colocara el punto de corte de
manera óptima, la tasa falso positivo/negativo sería del 0,3%, un
factor de 10^{11} superior. Para una selección real, en la que se
quiere incluir como compuestos de éxito los que no producen un
bloqueo completo, existe un equilibrio entre la actividad
farmacológica débil de detección y la tasa de falsos positivos. Si,
por ejemplo, se desea una tasa de falso positivo del 0,1%, entonces
en esta selección puede ponerse el punto de corte de la selección en
desviaciones estándar de 3,3 inferiores a la media de la respuesta
desbloqueada, o en 1,97. En este caso, la tasa de falsos negativos
es efectivamente cero, y los compuestos que bloquean sólo el 50% de
la respuesta se identificarán como éxitos.
Matemáticamente, hay dos razones por las que las
poblaciones bloqueadas y desbloqueadas se solapan tan poco. En
primer lugar, el coeficiente de variación de la respuesta
desbloqueada es relativamente pequeño. Es decir, cada respuesta es
casi idéntica a cada una de las otros respuestas. En segundo lugar,
y quizás más importante, no hay respuesta absolutamente detectable
de los pocillos bloqueados. La dispersión de los pocillos bloqueados
consecuentemente es extremadamente pequeña, de manera que el límite
para distinguir las poblaciones puede colocarse muy bajo.
En los ensayos realizados utilizando protocolos
de adición de líquidos para la estimulación, generalmente los
artefactos de la adición dan una respuesta algo pequeña con una
dispersión asociada. La dispersión de la respuesta bloqueada reduce
el intervalo de selección, aumenta la probabilidad de falsos
positivos y falsos negativos, y limita la capacidad de la persona
que selecciona para identificar bloqueantes parciales.
Se demostró la viabilidad de la estimulación
eléctrica de células que expresan múltiples canales utilizando
cultivos de la línea celular HL5. Estas células se generaron
inmortalizando células de músculo cardíaco (Claycomb et al.,
1998, PNAS 95: 2979-84). Contienen varios canales de
potasio, calcio y sodio activados por voltaje, así como una
corriente de potasio rectificadora entrante y corrientes de fuga de
cloruro y potasio. Se hicieron crecer las células en placas de
microtítulo de 96 pocillos y se sometieron a ensayo en confluencia.
Se tiñeron según el protocolo en el apéndice A1. Se realizaron las
mediciones de fluorescencia radiométrica durante la estimulación
eléctrica utilizando VIPR™ tal como se describió anteriormente, y se
analizaron los datos según los procedimientos en el apéndice A2. Se
eligieron arbitrariamente los parámetros del estímulo para que
fueran: ráfaga largas de 3 segundos de duración a 10 Hz con un
núcleo de estímulos de onda cuadrada bifásica con una duración de
impulso de 5 ms/fase. Se realizaron los estímulos en campos
eléctricos variables para determinar el campo umbral. Dos filas de
pocillos contenían TTX 10 \muM para bloquear parcialmente el canal
de sodio cardíaco, y dos filas contenían TEA 10 mM para bloquear los
canales de potasio dependientes de voltaje. La figura 27 muestra las
respuestas normalizadas de cada pocillo. Generalmente, a medida que
aumenta la intensidad del campo eléctrico, aumenta la respuesta
celular. Las tres últimas columnas muestran señales de
electropermeabilización a medida que el voltaje continúa aumentando.
En las columnas 6, 7, y 8, la razón realmente se recupera por debajo
de la razón de partida, lo que sugiere una hiperpolarización
posterior (un fenómeno producido por el cierre lento de los canales
de potasio dependientes de voltaje).
La tasa de la respuesta celular es
extremadamente rápida, y puede limitarse aparentemente por la
capacidad del etil oxonol de redistribuirse rápidamente dentro de la
membrana. La respuesta rápida es compatible con una alta
conductancia en reposo de la célula debido a las corrientes de fuga
y la expresión de los canales rectificadores entrantes de potasio.
TTX bloquea parcialmente la respuesta positiva, lo que indica que
ésta se debe, al menos parcialmente, a la corriente de sodio
dependiente de voltaje.
La figura 28 muestra la respuesta de las células
no tratadas (filas 1-4) como una función del campo
eléctrico aplicado. La respuesta aumenta sigmoidalmente con el campo
eléctrico. Por encima de 50 V/cm, hay una señal sostenida que no
resulta afectada por TTX. Tal como se trató previamente, este
comportamiento es compatible con la electropermeabilización de la
membrana celular en alta intensidad del campo eléctrico. También se
muestra en la figura 28 el intervalo de selección (véase el apéndice
A3) como una función del campo de estímulo.
Estos resultados demuestran que las células HL5
pueden someterse a ensayo eficazmente utilizando la técnica de
estimulación eléctrica. Los compuestos que se conocen para modificar
diferentes canales iónicos producen cambios detectables en la
respuesta. Debido a que estos canales iónicos son idénticos a los
expresados por el corazón, un ensayo de este tipo puede ser útil
como una selección secundaria, para eliminar o marcar para la
modificación los compuestos que pueden interferir con la función
cardiaca normal. Esto podría ser útil también como una selección
primaria, para descubrir compuestos que pueden tener efectos
deseables sobre uno cualquiera (o una combinación) de los canales
iónicos del corazón.
Se prepararon electrodos montados de superficie
en cubreobjetos de vidrio recubiertos con cromo (como una capa de
adhesión) y oro (como una capa conductora). Se construyeron por
encargo los cubreobjetos metalizados por Thin Film Devices, Inc.
(Anaheim CA). Los cubreobjetos eran vidrio Corning 7059 de una
pulgada cuadrada, de 0,17 mm de espesor. La metalización se realizó
por deposición por pulverización a vacío. La capa de cromo era de
aproximadamente 1000 \ring{A} de espesor y servía como una capa de
adhesión. La capa de oro era de aproximadamente 5000 \ring{A} de
espesor, y servía como una capa conductora. La resistividad del
metal depositado era inferior a 0,1 \Omega/cuadrada. Se grabó un
hueco de 4 mm a través del metal enmascarando a mano la superficie
metálica con un polímero químicamente resistente
(S1400-27, Shipley Co., Marlborough MA), grabando
entonces a través de las capas metálicas durante cinco minutos en
Gold Etchant TFA, seguido de cinco minutos en Chromium Etchant TFD
(Transene Co., Danvers MA). Los cubreobjetos se unieron a las partes
inferiores de las placas de 96 pocillos con elastómero de silicona
(Sylgard 184 (Coming) y se curaron durante 90 minutos a 70°C). Tras
la esterilización con irradiación UV a 365 nm durante 30 minutos y
el recubrimiento con la molécula de adhesión celular de
poli-D-lisina (peso molecular de
300.000, 1 mg/ml en solución salina tamponada con fosfato de
Dulbecco durante 30 minutos, enjuagada después tres veces con agua
destilada), pudieron hacerse crecer con éxito las células vivas y se
cultivaron en los electrodos de superficie.
Para validar las células CHO de estimulador de
electrodos de superficie en una densidad inicial de aproximadamente
1000 células/mm^{2} se sembraron en placa en los pocillos de la
placa de 96 pocillos y se permitió que se unieran durante
aproximadamente 16 horas. Estas células se transfectaron para
expresar un canal de potasio, que establece el potencial
transmembrana a aproximadamente -80 mV, y el canal de sodio NaV3.
Tras alcanzar la confluencia, se cargaron las células con la
combinación colorante de FRET sensible al voltaje de
CC2-DMPE y DiSBAC_{2} (3) tal como se describe en
el apéndice A1. Los electrodos de superficie metálicos se conectaron
a la salida de un generador de impulsos, que en este caso era un
electroporador de disminución exponencial (Gene Pulser II,
Bio-Rad Corp., Hercules CA). Se realizó la obtención
de imágenes por fluorescencia radiométrica en un microscopio Zeiss
Axiovert TV, equipado con una fuente de luz de lámpara de arco de
xenón de 75 W. Se filtró la luz de excitación utilizando un filtro
de interferencia dieléctrica de 405 \pm 10 nm y un espejo dicroico
de 445 DXCR. La luz de emisión se dividió con un segundo espejo
dicroico 525XR, y se midió con un par de tubos fotomultiplicadores
(TFM) de Hamamatsu HC124. Un TFM tenía un filtro de interferencia
dieléctrica de 475 \pm 40 nm en frente de él para monitorizar la
señal de fluorescencia azul. El segundo TFM tenía un filtro de
interferencia dieléctrica de 580 \pm 35 nm en frente de él para
monitorizar la señal de fluorescencia naranja. Los filtros ópticos y
los espejos dicroicos se adquirieron de Chroma Technology Corp.,
Battleboro VT. La obtención de imágenes por fluorescencia
radiométrica se realizó en campos que contenían aproximadamente 100
células. Se realizó la corrección de la fluorescencia de fondo
midiendo las señales naranja y azul en un campo sin células,
restando después éstas de las señales obtenidas de las células.
Entonces se calculó la señal radiométrica, proporcional a los
cambios de potencial transmembrana, tal como se describe en el
apéndice A2.
El protocolo de estimulación utilizó impulsos de
campo eléctrico monofásico únicos de amplitud variable. Los impulsos
eran formas de onda de disminución exponencial con una constante de
tiempo de disminución de 4,3 ms. La amplitud al comienzo del impulso
se varió desde cero hasta 56 V/cm.
Una respuesta de voltaje normal de células CHO
que expresan un canal de potasio y el canal de sodio NaV3 tras tres
respuestas de estimulación de 45 V/cm separadas se muestran en la
figura 29 para el mismo campo de células, lo que muestran
repetibilidad de la respuesta. La rapidez de la respuesta en este
caso está limitada principalmente por el tiempo de respuesta del
colorante hidrófobo móvil, que para el etil oxonol utilizado es de
aproximadamente 0,5 segundos.
La respuesta radiométrica promedio de una
población de células que crecieron en una placa de múltiples
pocillos de 96 pocillos estimulada con estímulos monofásicos de
intensidades de campo variables se muestra en la figura 30. Los
puntos en esta curva son la respuesta máxima promedio de 4
estimulaciones en el mismo cultivo. Como es de esperar a partir de
una curva de repuesta del tipo acción-potencial, no
hay respuesta detectable por debajo de aproximadamente 18 V/cm. La
región umbral es relativamente estrecha. Entre aproximadamente 20 y
40 V/cm, la respuesta aumenta con el aumento de la intensidad de
campo. Por encima de 40 V/cm, la respuesta formó una meseta.
Las células de leucemia basófila de rata (RBL)
expresan endógenamente el canal rectificador entrante de potasio
IRK1 (Wischmeyer et al, Pflugers Arch.
429:809-819, 1995). Este canal conduce de manera
selectiva iones potasio, con una característica de conductancia
altamente no lineal. La conductancia es casi lineal por debajo del
potencial de inversión de potasio V_{K}, y desciende rápidamente
hasta cerca de cero comenzando en aproximadamente 10 mV positivo de
V_{K}. Las células que expresan cantidades grandes de canales
rectificadores entrantes tienden a tener potenciales transmembrana
en reposo dentro de algunos milivoltios de V_{k}.
En el lado de la célula en el que el potencial
transmembrana se hace positivo por un campo eléctrico externo
aplicado a las células que expresan IRK1 y algunos otros canales
iónicos, los canales IRK1 se cerraran rápidamente y cesará la
conducción. En el lado de la célula en el que el potencial
transmembrana se hace negativo, los canales IRK1 se abrirán y
pasarán la corriente de potasio. Si este lado de la célula se hace
suficientemente negativo, de manera que el potencial transmembrana
local sea más negativo que V_{K}, existirá una corriente de
potasio hacia dentro neta. Esta corriente producirá un cambio en el
potencial transmembrana global positivo. Dado que el canal IRK1 no
se inactiva, esta corriente debe mantenerse durante tanto tiempo
como se aplique el campo externo.
Se sembraron células RBL adherentes en placas de
96 pocillos y se cargaron con colorantes de FRET tal como se
describe en el apéndice A1. Tres filas de pocillos contenían cloruro
de bario 400 \muM para bloquear el canal IRK1. Se analizaron las
placas utilizando un lector VIPR™ mientras que se estimularon
eléctricamente con un tren de estímulos bifásico repetido a una
frecuencia de 50 Hz y con una duración de impulso de 5 ms/fase. El
tren de impulso de estimulación se produjo durante una duración
total de 5 segundos y la tasa de digitalización para la recogida de
datos fue de 50 Hz. Se fijó el campo eléctrico aplicado para cada
columna de ocho pocillos, y se varió desde 7,2 hasta 72 V/cm. Los
datos se analizaron según los procedimientos en el apéndice A2. Se
calculó la razón normalizada tras tres segundos de estimulación,
promediada para las dos poblaciones de pocillos (con y sin bloqueo
de bario) y se representó como una función del campo aplicado en la
figura 31. Las barras de error son desviaciones estándar de las
respuestas. Los cuadrados en blanco son las respuestas sin el
bloqueo de bario; los círculos rellenos son las respuestas con el
bloqueo de bario. Los datos de los pocillos con el bloqueo de bario
indican que no hay cambio de voltaje detectable durante la
estimulación hasta que el campo alcanza 80 V/cm, punto en el que
puede producirse alguna electropermeabilización. Los pocillos no
bloqueados muestran respuesta casi lineal por encima de un umbral de
aproximadamente 20 V/cm. Este ejemplo muestra claramente que la
presente invención puede utilizarse para modular el potencial
transmembrana en las direcciones o bien positiva o bien negativa,
dependiendo de los parámetros del estímulo y de las propiedades de
los canales iónicos expresados por la célula.
La presente invención aumenta la aplicabilidad
de la estimulación eléctrica para incluir células no excitables,
proporcionando instrumentos y métodos que permiten el control
gradual eficaz del potencial de membrana sin dar como resultado
electroporación significativa. La presente invención consigue este
resultado por medio del uso de impulsos repetitivos, altamente
uniformes de estimulación eléctrica aplicada al medio que rodea las
células. Normalmente los campos eléctricos aplicados no alteran
directamente al potencial transmembrana promedio de la célula, sino
que en su lugar crean cambios de potencial transmembrana positivos y
negativos simétricos en los lados de la células que dan hacia el
cátodo y el ánodo, respectivamente.
El enfoque se aprovecha de la selectividad
iónica y de las características de conductancia y regulación no
lineal de los canales iónicos dependientes de voltaje. El enfoque
también se aprovecha del hecho de que las células intactas típicas
tienen constantes de tiempo largas para la disminución de los
cambios en el potencial transmembrana. Incluso en aquellos casos en
los que la carga inyectada a la célula mediante un impulso de
estímulos único es demasiado pequeña como para detectarse de manera
fiable, los impulsos de estímulos múltiples aplicados apropiadamente
pueden desarrollar grandes fluctuaciones del potencial transmembrana
neto. Variando el número, la duración, y la forma y amplitud de los
impulsos, es posible fijar de manera artificial, o cambiar el
potencial transmembrana de las células vivas en un modo que es
similar al de la técnica de patch clamp. Otros canales, corrientes
de fuga o transportadores que no se consideran clásicamente
dependientes de voltaje, también pueden someterse a ensayo mediante
la inducción de cambios en el potencial transmembrana utilizando un
segundo canal dependiente de voltaje y detectando el flujo de
corriente o los cambios de potencial transmembrana como resultado de
la activación de transportador o canal diana.
El presente método es sólido, compatible con las
metodologías de detección óptica y fácilmente modificable para un
intervalo amplio de aplicaciones de potencial incluyendo la
selección del alto rendimiento para su uso en el descubrimiento de
fármacos. En muchos formatos de ensayo, la estimulación eléctrica
directa evita la necesidad de la adición de líquido, haciendo el
ensayo más simple. Las manipulaciones complejas del potencial
transmembrana pueden realizarse fácilmente utilizando variaciones en
el protocolo de estimulación. Por tanto, prácticamente cualquier
canal sensible al voltaje puede inducir la apertura a pesar del
estado de inactivación o la dependencia de voltaje. Para el
descubrimiento de fármacos de alto rendimiento esto relaja las
necesidades de tipos de células especializadas y permite que los
ensayos se realicen rápidamente con líneas celulares fácilmente
disponibles.
Reactivos:
Tampón de ensayo nº 1:
- NaCl 140 mM
- KCl 4,5 mM
- CaCl_{2} 2 mM
- MgCl_{2} 1 mM
- HEPES 10 mM
- Glucosa 10 mM pH 7,40, 330 mOs/kg
Disolución madre de Pluronic (1000X):
- Pluronic 127 100 mg/mL en DMSO seco
Disolución madre de oxonol (3333X):
- DiSBAC_{2}(3) 10 mM en DMSO seco
Disolución madre de cumarina (1000X):
- CC2-DMPE 10 mM en DMSO seco
Disolución madre de ESS-CY4
(400X):
- ESS-CY4 200 mM en agua.
1. Preparación del tampón de carga
CC2-DMPE. Normalmente para una placa de 96 pocillos,
se preparará 10 ml de disolución de tinción por placa.
- i)
- Mezclar volúmenes iguales (10 \mul) de disolución madre de cumarina y disolución madre de Pluronic en un tubo.
- ii)
- Añadir 10 ml de tampón de ensayo nº 1 al tubo mientras se agita con vórtex suavemente.
- Concentración de carga: CC2-DMPE 10 \muM y Pluronic 0,1 \mug/ml.
2. Preparar el tampón de carga de oxonol
- i)
- Mezclar volúmenes iguales (3,3 \mul) de disolución madre de oxonol y de disolución madre de Pluronic en un tubo.
- ii)
- Añadir 10 ml de tampón de ensayo nº 1 al tubo mientras se agita con vórtex suavemente.
- iii)
- Añadir 25 \mul de ESS-CY4 mientras se agita con vórtex.
- Concentración de carga: DiSBAC_{2}(3) 3 \muM, Pluronic 0,2 \mug/ml, y ESS-CY4 0,5 mM.
- iv)
- Si es necesario, combinar los compuestos de ensayo con el tampón de carga en este momento.
3. Enjuagar las células dos veces con el tampón
de ensayo nº 1, eliminando cada vez todo el líquido de los
pocillos.
4. Añadir 100 \mul de tampón de carga de
CC2-DMPE a cada pocillo. Incubar durante 30 minutos
a temperatura ambiente, evitando la luz brillante.
5. Enjuagar las células dos veces con el tampón
de ensayo nº 1, eliminando cada vez todo el líquido de los
pocillos.
6. Añadir 100 \mul de tampón de carga de
oxonol a cada pocillo.
7. Incubar durante 30 minutos a temperatura
ambiente, evitando la luz brillante. Utilizar inmediatamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Se analizaron y se notificaron los datos como
razones normalizadas de las intensidades medidas en los canales a
460 nm y 580 nm. Se realizó el proceso de cálculo de estas razones
tal como sigue. En todas las placas, la columna 12 contenía tampón
de ensayo nº 1 con las mismas concentraciones de DiSBAC2(3) y
de ESS-CY4 que las utilizadas en las placas de
célula, sin embargo no se incluyeron células en la columna 12. Se
promediaron los valores de intensidad a cada longitud de onda en los
intervalos inicial (antes del estímulo) y final (durante el
estímulo). Estos valores promedio se restaron de los valores de
intensidad promediados durante los mismos periodos de tiempo en
todos los pocillos sometidos a ensayo. Las razones obtenidas de las
muestras en los intervalos inicial (Ri) y final (Rf) se definen
como:
(A2.1)Ri =
\frac{\text{(intensidad a 460 nm, inicial - fondo a 460nm,
inicial)}}{\text{(intensidad a 580nm, inicial - fondo a 580 nm,
inicial)}}
(A2.2)Rf =
\frac{\text{(intensidad a 460 nm, final - fondo a 460nm,
final)}}{\text{(intensidad a 580nm, final - fondo a 580 nm,
final)}}
Se normalizaron los datos finales para la razón
de partida de cada pocillo y se notificaron como Rf/Ri.
\vskip1.000000\baselineskip
El intervalo de selección W de una respuesta se
define tal como sigue. Se necesitan datos de múltiples pocillos en
condiciones de estímulos idénticas. Los pocillos control pueden o
bien bloquearse farmacológicamente o bien estimularse con célula no
transfectada con el campo eléctrico total. Alternativamente, se
pueden usar células transfectadas sin estímulos aplicados.
Se miden las repuestas de los pocillos control y
experimental. Se calculan los promedios y las desviaciones estándar
de las respuestas en los pocillos experimentales (R \pm \DeltaR)
y control (C \pm \DeltaC). Se define el intervalo de selección
como la diferencia entre las señales experimental y control
normalizadas para la suma de las desviaciones estándar.
Una regla general para un intervalo de selección
aceptable es W>3. Esto permite seleccionar una línea de punto
corte a medio camino entre las repuestas control y experimental, lo
que garantiza una tasa de falso negativo/positivo inferior al 1%.
Suponiendo una distribución normal, la tasa de falso
positivo/negativo como una función del intervalo de selección W
es:
Claims (27)
1. Un método de caracterización de la
actividad biológica de un compuesto candidato que comprende:
exponer una o más células a dicho compuesto;
exponer repetidamente dichas una o más células a
una pluralidad de impulsos de campo eléctrico bifásico en el que
dichos impulsos tienen una amplitud máxima inferior a
aproximadamente 90 V/cm, en el que dichos impulsos se aplican a una
tasa de al menos aproximadamente 1 por segundo, y en el que la
duración total de cada impulso es de al menos aproximadamente 1
milisegundo, de manera que realice un cambio controlado en el
potencial transmembrana de dichas una o más células; y
monitorizar, sin utilizar un patch clamp, los
cambios en el potencial transmembrana de dichas una o más
células.
2. Método según la reivindicación 1, en
el que dicha monitorización comprende detectar la emisión de
fluorescencia de una zona de observación que contiene dichas una o
más células.
3. Método según la reivindicación 1 ó
2, que comprende adicionalmente limitar la variación espacial en la
intensidad del campo eléctrico de manera que se minimize la
electroporación irreversible de las células.
4. Método según la reivindicación 1, en
el que dichos impulsos de campo eléctrico hacen que un canal iónico
de interés efectúe ciclos entre diferentes estados dependientes de
voltaje, en particular, hacen que un canal iónico de interés se abra
o se libere de la inactivación.
5. Método según la reivindicación 1, en
el que dichas una o más células comprenden un sensor de voltaje
seleccionado del grupo que consiste en un sensor de voltaje basado
en FRET, un colorante de potencial de transmembrana electrocrómico,
un colorante de redistribución de potencial transmembrana, una
molécula fluorescente o luminiscente sensible a los iones y un ion
radiactivo.
6. Método según la reivindicación 1, en
el que dichas una o más células comprenden un canal iónico regulado
por voltaje, en particular en el que dicho canal iónico regulado por
voltaje se selecciona del grupo que consiste en un canal de potasio,
un canal de calcio, un canal de cloruro y un canal de sodio.
7. Método según la reivindicación 1, en
el que dichos impulsos de campo eléctrico muestran variación
espacial limitada en intensidad en la zona de observación inferior a
aproximadamente el 25% con respecto a una intensidad media en esa
zona.
8. Método según la reivindicación 7, en
el que dichos impulsos de campo eléctrico varían sobre una zona de
observación en no más de aproximadamente el 15%, preferiblemente en
no más de aproximadamente el 5% con respecto al campo eléctrico
medio en cualquier momento.
9. Método según la reivindicación 1, en
el que dichos impulsos de campo eléctrico comprenden la estimulación
con cualquiera de una forma de onda cuadrada, una forma de onda
sinusoidal o una forma de onda de diente de sierra.
10. Método según la reivindicación 1, en el
que dicho uno o más campos eléctricos tienen una amplitud dentro del
intervalo de aproximadamente 10 V/cm a aproximadamente 90 V/cm,
preferiblemente dentro del intervalo de aproximadamente 20 V/cm a
aproximadamente 80 V/cm.
11. Método según la reivindicación 1, en el
que dichos impulsos de campo eléctrico se repiten a una frecuencia
de estimulación que es mayor o igual que la inversa de la constante
de tiempo transmembrana de dichas una o más células, preferiblemente
a una frecuencia de estimulación dentro del intervalo de 1 Hz a 1
kHz.
12. Método según la reivindicación 1, en el
que dichos impulsos de campo eléctrico tienen una duración de
impulso dentro del intervalo de aproximadamente 1 milisegundo a
aproximadamente 20 milisegundos.
13. Método según la reivindicación 1, en el
que dicho potencial transmembrana se desarrolla a través de la
membrana plasmática de dichas una o más células.
14. Método para someter a ensayo la
actividad bioquímica de un compuesto contra un canal iónico objetivo
que comprende:
seleccionar una línea celular que tiene un
potencial transmembrana normal en reposo correspondiente a un estado
dependiente del voltaje seleccionado de dicho canal iónico
objetivo;
expresar dicho canal iónico objetivo en una
población de células de dicha línea celular seleccionada;
exponer dicha población de células a dicho
compuesto;
exponer repetidamente dicha población de células
a una pluralidad de impulsos de campo eléctrico bifásico en el que
dichos impulsos tienen una amplitud máxima inferior a
aproximadamente 90 V/cm, en el que dichos impulsos se aplican a una
tasa de al menos aproximadamente 1 por segundo, y en el que la
duración total de cada impulso es de al menos aproximadamente 1
milisegundo, de manera que realice un cambio controlado en el
potencial transmembrana de dichas una o más células; y
monitorizar los cambios en el potencial
transmembrana de dichas una o más células.
15. Método según la reivindicación 14, en
el que dicho canal iónico objetivo se expresa exógenamente en dicha
línea celular.
16. Método según la reivindicación 14, en
el que dicha línea celular se transfecta con ácido nucleico que
codifica para dicho canal iónico objetivo, en particular en el que
dicha línea celular expresa niveles insignificantes de otros canales
iónicos y preferiblemente en el que dicha línea celular se
selecciona del grupo que consiste en CHL, LTK(-) y
CHO-K1.
17. Método según la reivindicación 14, en
el que dicho canal iónico objetivo es un canal de sodio, y en el que
dicha población de células se selecciona del grupo que consiste en
células CHL, células LTK(-), y células CHO-K1 o del
grupo que consiste en células HEK-293, células RBL,
células F11 y células HLS.
18. Método según la reivindicación 14, en
el que dicho canal iónico objetivo es un canal de potasio o de
calcio, y en el que dicha población de células se selecciona del
grupo que consiste en células CHL, células LTK(-), y células
CHO-K1.
19. Un método para someter a ensayo la
actividad del canal iónico que comprende:
exponer al menos una célula a una pluralidad de
impulsos de campo eléctrico bifásico en el que dichos impulsos
tienen una amplitud máxima inferior a aproximadamente 90 V/cm, en el
que dichos impulsos se aplican a una tasa de al menos
aproximadamente 1 por segundo, y en el que la duración total de cada
impulso es de al menos aproximadamente 1 milisegundo, de manera que
crea un cambio controlado en el potencial transmembrana y de manera
que activa un canal iónico de interés; y
detectar la actividad del canal iónico mediante
la detección de uno o más cambios en el potencial transmembrana sin
utilizar una técnica de patch clamp.
20. Método según la reivindicación 19, en
el que dicha al menos una célula comprende un detector de voltaje
seleccionado del grupo que consiste en un detector de voltaje basado
en FRET, un colorante de potencial de transmembrana electrocrómico,
un colorante de redistribución de potencial transmembrana, una
molécula fluorescente o luminiscente sensible a los iones y un ion
radiactivo.
21. Método según la reivindicación 20 en el
que dicho detector de voltaje comprende un detector de voltaje
basado en FRET.
22. Método según la reivindicación 19, en
el que dicho canal iónico de interés es un canal iónico regulado por
voltaje.
23. Método según la reivindicación 19, en
el que dicha pluralidad de impulsos de campo eléctrico hace que
dicho canal iónico de interés efectúe ciclos entre diferentes
estados dependientes de voltaje.
24. Método según la reivindicación 19, en
el que dicha al menos una célula es una célula eucariota, una célula
no excitable, una célula procariota, una célula de cultivo tisular,
una línea celular primaria y/o parte de un organismo vivo
intacto.
25. Método para someter a ensayo la
actividad del canal iónico que comprende:
expresar un canal iónico objetivo seleccionado
en al menos una célula;
expresar un canal iónico contador seleccionado
en dicha al menos una célula;
exponer dicha al menos una célula a una
pluralidad de impulsos de campo eléctrico bifásico en el que dichos
impulsos tienen una amplitud máxima inferior a aproximadamente 90
V/cm, en el que dichos impulsos se aplican a una tasa de al menos
aproximadamente 1 por segundo, y en el que la duración total de cada
impulso es de al menos aproximadamente 1 milisegundo, de manera que
crea un cambio controlado en el potencial transmembrana y de manera
que activa dicho canal iónico contador; y
monitorizar el potencial transmembrana de dicha
al menos una célula
\newpage
26. Método según la reivindicación 25, en
el que se detecta un cambio en el potencial transmembrana cuando se
bloquea dicho canal iónico de interés, en particular en el que dicho
canal iónico de interés comprende un canal iónico asociado a un
ligando y preferiblemente en el que dicho canal contador comprende
un canal de sodio.
27. Método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicha amplitud máxima es de
aproximadamente 20 a 40 V/cm y/o en el que dicha duración de impulso
es de aproximadamente 2 a 10 milisegundos por fase y/o en el que
dichos impulsos se aplican a una tasa de aproximadamente 20 a 100
impulsos por segundo.
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