JP5209835B2 - イオンチャネルアッセイ法 - Google Patents
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Description
この出願は、2000年7月10日にMaher他により出願された「INSTRUMENTATIONAND METHOD FORELECTRICAL STIMULATION(電気刺激の測定装置及び方法」という名称の米国仮出願出願番号60/217,671、2000年7月10日にMendleinにより出願された「INSTRUMENTATION AND METHOD FOR ELECTRICAL STIMULATION(電気刺激の測定装置及び方法)」という名称の米国仮出願出願番号60/217,666、2000年7月10日にMaher他により出願された「INSTRUMENTATIONAND METHOD FOR ELECTRICAL STIMULATION(電気刺激の測定装置及び方法」という名称の米国仮出願出願番号60/217,221、2000年7月10日にMaher他により出願された「INSTRUMENTATION AND METHOD FOR ELECTRICAL STIMULATION(電気刺激の測定装置及び方法)」という名称の米国仮出願出願番号60/217,219、2001年3月12日にMaher他により出願された「ION CHANNEL ASSAY METHODS(イオンチャネルアッセイ方法)」という名称の米国特許出願出願番号09/804,457、2001年3月12日にMaher他により出願された「ION CHANNEL ASSAY METHODS(イオンチャネルアッセイ方法)」という名称の米国特許出願出願番号09/804,480、2001年3月12日にMaher他により出願された「HIGH THROUGUPUT METHOD ANDSYSTEM FORSCREENING CANDIDATE COMPOUNDS FOR ACTIVITY AGAINST TARGET IONCHANNELS(ターゲットイオンチャネルに対する活性のための候補化合物をスクリーニングする大量処理法および装置)」という名称の米国特許出願出願番号09/804,580、及び、2001年3月12日に出願された「MULTI-WELL PLATE AND ELECTRODE ASSEMBLIES FOR ION CHANNEL ASSAYS(イオンチャネルアッセイのためのマルチウェルプレートおよび電極組立体)」どいう名称の米国特許出願出願番号09/804,458に対する優先権を主張する。
本発明は、概して、生きている細胞の膜ポテンシャルを電気刺激を介して取り扱う測定装置および方法に関する。
動物の細胞および植物の細胞の内部はその外部に対して電気的に負であることが、ずっと以前から知られていた。この電位差の大きさは、一般に、5mVと90mVの間であって、電位(ポテンシャル)のほとんどは細胞膜の両側の間で発生している。所与の細胞のトランスメンブレンポテンシャル(細胞膜をはさむ電位差)は、電気化学的勾配を形成して維持するイオン輸送の活動度と、イオンが原形質膜を通じて流れるようにするイオンチャネルの活動度すなわち受動拡散や他の要因とのバランスにより設定される。
一実施態様では、イオンチャネルの活動度(activity)を測定する(assaying)方法は、トランスメンブレンポテンシャルの制御された変化を発生させ、かっ対象とするイオンチャネルを活性化するように、複数の電界パルスを少なくとも1つの細胞に加えることと、パッチクランプを使用することなく、トランスメンブレンポテンシャルの1または複数の変化を検出することにより、イオンチャネルの活動度を検出することと、を有する。モニタリングは、細胞を含んでいる観察領域からの蛍光放出を検出することを含んでいてもよい。いくつかの有利な実施態様では、電界は二相である。
一般に、ここで使用する用語、および以下に記述する蛍光、コンピュータ、検出、化学および実験室手法の多くは、この技術分野において周知のものであって、一般的に採用されているものである。標準的な技術が、化学合成、蛍光、光学、分子生物学、コンピュータソフトウエアおよび統合化(インテグレーション)において、一般に用いられている。一般に、化学反応と細胞測定(セルアッセイ)と酵素反応とは、適切な場合には、製造者の仕様にしたがって実行される。技術および手順は、一般に、当該分野、および下記のものを含めた種々の一般的な参考文献における通常の方法にしたがって行われる。
y0はx→∞となったときの関数の極限に等しい調整可能なパラメータ、
Aはステップサイズに等しい調整可能なパラメータ、
x50はステップの中点に関連する調整可能なパラメータ、
Δxはステップの幅を記述する調整可能なパラメータである。
y0はx→∞での関数の極限に等しい調整可能なパラメータ、
Aはステップサイズに等しい調整可能なパラメータ、
x0はステップの中点に関連する調整可能なパラメータ、
nはステップの鋭さを記述する調整可能なパラメータである。
Dayoff, M.O.,in Atlas of Protein Sequence and Structure(タンパク質配列および構造の地図において),1972,第5巻, National Biomedical Research Foundation,pp.101-110およびその巻のSupplement 2, pp.1-10を参照。
本発明は、少なくとも1つの電圧が規制された(voltage regulated)イオンチャネルを含んでいる完全な(無損傷の)生きている細胞のトランスメンブレンポテンシャルが、それらの細胞を浸している流体に電気刺激パルスを繰り返し加えることによって、精密に変調できることを最初に認識した。本発明は、完全な生きている細胞の本来の完全性(integrity)を大きく乱すことなく、それらの細胞のトランスメンブレンポテンシャルの正確かつ確実な変調をもたらすための装置および方法を含む。
1)水溶液中の生きている細胞の培養基に一様な電界を確実に発生するための電極と、電極アレイを含んでいる装置。
2)高いスループットおよび小型化された刺激のための、イオンチャネルまたは細胞の活動度の分析のための表面電極を有しているマルチウェルプレート。
3)イオンチャネルおよび細胞の活動度の高スループット分析のための、および薬剤発見、分析、スクリーニングおよびプロファイリングのためのシステム。
4)繰り返し電気刺激の使用による、生きている細胞のトランスメンブレンポテンシャルを変調する方法。
5)電圧が規制されているまたは電圧が規制されていないイオンチャネルの活動度、トランスポータおよび漏れ電流に対する試験化合物の作用をスクリーニングする方法。イオンチャネルおよびトランスポータタンパク質に対する化合物の状態に依存する薬理学的活性の決定を含む。
6)電気刺激に対する細胞またはクローンの反応に基づく、それら細胞またはクローンをプロファイルリングし選別する方法。
7)細胞およびイオンチャネルパラメータを高いスループット態様で定量的に決定し、それらのパラメータに対する化合物の薬理学的作用を定量化する方法。
8)細胞の細胞間空間中への外因性化合物の導入方法。
9)細胞間オルガネラのトランスメンブレンポテンシャルを変調し、それらのオルガネラにおけるイオンチャネルに対して試験化合物をスクリーニングする方法。
10)遺伝子発現、酵素機能、タンパク質活性および配位結合を含めた、生理学的および生化学的反応の機能および調整に対するトランスメンブレンポテンシャルの生理学的作用を測定(キャラクタライズ)する方法。
11)特定の機能または論理的反応のための適応ニューラルネットワークまたはバイオコンピュータをプログラミングし、あるいは訓練する方法。
12)ヒトを含めた動物に埋め込まれた補綴装置のための効率的な神経インタフェースを提供する方法。
一実施形態では、本発明は、観察領域にわたって電界を発生するために、電極および電極アレイを含む。通常は、これは一対の導電性電極を使用することによって達成される。重要な設計上の特徴は、電極対がよく画定された電界を生ずることである。好適な電極の設計は、観察下の細胞が受ける電界の一様性を最大にする電極配置を含む。
導電性媒体内に一様な電界を発生する最も簡単なやり方は、相互にほぼ平行に整列されている表面を持つ2つの同一の平らな電極を使用することである。一般的には、電極がそれの横方向の幅に対して互いにより接近するにつれて、電界の一様性はより大きくなる。しかし、典型的な円形マルチウェルプレートのウェルは、ウェル内に挿入できる電極の幅を制限するとともに、かつ電界の一様性を減ずる2つの他の作用をもたらす。
ディッパー電極については、理想的な状況(一様な電界の形成における)は、電極の底をウェルの底に接触させることである。このやり方では、垂直電流路に関連する縁部電界または電界の不均一はない。しかし、取り外し可能な構造の場合には、電極が表面に接触することを求めることは望ましくない。プレートの形状の小さいずれが、ある電極を表面に押しつけて、プレート、細胞または電極に損傷を及ぼすことがある。また、あるウェルでは、電極は表面まで延びないことがある。これらの理由から、電極の底とウェルの底との間に小さい隙間を設けることが望ましいことがある。
どのような導電性物質も電極として使用できる。好適な電極材料は、次の諸特性の多くを持つ。(1)それらは塩化ナトリウム水溶液で腐食されない、(2)それらは有毒なイオンを発生または放出しない、(3)それらは可撓性で強い、(4)それらは比較的安価に製作される、(5)それらは多孔質でない、(6)それらは容易に清浄にされる。好適な材料には、貴金属(金、白金およびパラジウムを含む)、耐熱金属(チタン、タングステン、モリブデンおよびイリジウムを含む)、耐食性合金(ステンレス鋼を含む)および炭素その他の有機導電体(黒鉛およびポリピロールを含む)が含まれる。多くの実施形態ではステンレス鋼が好適な電極材料である。この材料は、安価で、機械加工が容易であり、かつ塩化ナトリウム水溶液中で非常に不活性である。ステンレス鋼は、塩化ナトリウム水溶液中で電流が流れた時に徐々に酸化して酸化鉄を生ずるが、これは装置の性能に影響を及ぼすようにはみえない。酸化鉄は水中での溶解度が非常に低く、毒性レベルの鉄が放出されるようには見えない。また、どのような酸化鉄堆積物も、10%硝酸水溶液中に2時間浸し、その後で蒸留水で完全に水洗いすることによって、容易に除去できる。
ディッパー電極は、通常、マルチウェルプレートの1つまたは複数のウェルの中に、かつそれから、抜き出し可能に動かすことができるアレイ中に配置されている1つまたは複数の電極対で構成される。ディッパー電極は、プレートの様式および密度に合致するアレイに合わせることができるが、任意の形状または向きのアレイにできる。例えば、標準の96個ウェルプレートでは、1つまたは複数の行または列を同時に選択的に励起するための電極アレイ構成をおそらく含む、何種類かの電極は位置が可能である。
本発明のマルチウェルプレートは、細胞の効率的な電気刺激を行うと同時に、トランスメンブレンポテンシャル変化の光学的分析を可能にするように、主として設計されている。これを行うために、導電性表面電極をマルチウェルプレートの壁、底またはふたの中または上に向けることができる。
マルチウェルプレートを製作する材料は、通常、ポリマー材料である。その理由は、これらの材料が大量生産技術に向いているからである。しかしながら、ガラスや石英などのその他の材料も、マルチウェルプレートの底を製作するために使用できる。底は、同じ材料または異なる材料で製作でき、かつ底は、ポリスチレンまたはその他の材料を含むことができる。好ましくは、低い蛍光性と高い透過率を持つポリマーを選択する。ポリマー材料は、インサート成型や射出成型などの、この技術分野で知られている成型法および将来開発される成型法によって、プレート製作を特に容易にできる。
本発明は、少なくとも1つの電極組立体と、電気刺激のための手段と、光検出器と、電気刺激の発生、データの収集およびマルチウェルプレートの動きを調整するコンピュータ制御手段とを備えている、自動化された電気刺激および分光測定装置を含む。この装置は、流体添加のための手段も有する。1つの様相では、それらの装置は、生きている細胞の表面の内部または上部に存在するイオンチャネル、トランスポーター、漏れ電流の活動度を変調し、測定(キャラクタライズ)しおよび測定(アッセイ)し、チャネルまたは細胞の活動度に対する試験化合物の効果を迅速にスクリーニングするように、設計されている。本発明は、また、本発明のワークステーションの動作によって発生または発見された化学的実体(chemical entity)および情報(例えば、モジュレータ、あるいは化学薬品の化学的または生物学的活動度)にも向けられている。
本発明は、微小流体チップに組み込まれて、高度に微小化された電気刺激および分析のために設けられている電極の使用も含む。そのような装置は、例えば、Chow et al.への1998年9月1日に発行された米国特許第5,800,690号、Percetal.によって1997年5月5日に出願されたヨーロッパ特許出願EP0810438A2、およびParce et al.によって1997年6月24日に出願されたPCT出願WO98/00231に記述されているものを含む。それらの装置は、通常、ガラスまたはシリコンチップに存在する微小毛管内の小さい流体体積を取り扱うために、電位勾配(electrogenic)流体運動を使用する。これらの微小流体チップをベースとする分析装置は、微小化された分析を多数並列に行うことができる。そのような装置は、微小化された分析を要するいくつかの場合における好適な分光測定装置である。
どのような作用機序にも結び付けられることなしに、本発明者らは、細胞のトランスメンブレンポテンシャルに対する電気刺激の作用についての下記の説明を行う。
電圧で活性化するナトリウムチャネルを発現するある細胞系統への典型的な二相電気刺激プロトコルのシミュレーションによる作用を、以下に簡略化した形式で示す。以下の説明は、細胞系統が他のイオンチャネルの大きい発現を持たないこと、および細胞の休止トランスメンブレンポテンシャルが、問題としているナトリウムチャネルの不活性化のためのしきい値より上であること、を仮定している。図4において、上のパネル(枠状区画)は、加えられた電界(E)の時間的経過を示し、中間のパネルは加えられた電界に応答するシミュレーションされた内向きナトリウム電流(INa)を示し、下のパネルは、細胞の理想化した平均トランスメンブレンポテンシャル(Vm)を示す。この例では、それらの記録は、加えられた電界の中央に置かれている単細胞が、通常、電気刺激波列中に経験することを予測されるそれらのパラメータの変化に関連する。
本発明は、生きている細胞中のイオンチャネルを選択的に活性化できる任意の繰り返し手順を有する任意の波形カーネルの使用を含む。カーネルは、刺激列の基礎を形成する繰り返し可能な構造である。図4において、カーネルは二相方形パルスであるが、原則的には、時間が限定された任意の波関数である。カーネルの持続時間は、それが繰り返すことができる最高速度を設定する。繰り返し手順は、カーネルがどのようにして、かついつ試料に提示されるかを支配する。図4において、繰り返し速度は固定され、全部で10サイクル継続する。しかしながら、繰り返し速度は固定される必要はない。
刺激列中に繰り返される波形カーネルは、Tektronix AFG310などの任意のデジタル波形発生器を用いて、ほぼ無限の順列で変化できる。図5は、変調できる変数のいくつかを示すための二相方形波形の概略図を示している。図5においてパルス列は、時間t1の間持続する出発電界E1(400)と、時間t3の間持続する第1の刺激電界E2(420)に達するまでの、時間t2を要する電位の急速な上昇(410)と、時間t5の間持続する第2の刺激電界E3(440)に達するまでの、時間t4を要する電位の急速な降下(430)と、サイクルが繰り返されるまで時間t7の間持続する終了電界E4(470)に達するまでの、時間t6を要する電位の急速な上昇(460)とで構成されている。電界E1〜E4の大きさと極性は別々に制御可能であり、下記のように、静的および動的に変化できる。電位が細胞に加えられる時間すなわち時間t1、t3、t5およびt7も別々に制御可能であり、波形列中において0と10秒の間に下記のように静的および動的に変化できる。最後に、時間t2、t4およびt6にわたって生ずる電位の変化は、0と100ミリ秒の間の可変の時間期間にわたって起きることがあり、かつ可変形の波形を生ずるために、直線形または非直線形のことがある。
パルス振幅の大きさと極性は、刺激パルス中に細胞が経験する相対的なトランスメンブレンポテンシャル行程を制御する。下でより詳細に説明するように、種々のチャネルと細胞タイプとに適応できるようにするために、パルス振幅は全体の列に対して、または個々のパルスに対して変更できる。一般に、E2とE3の大きさは、各刺激サイクル中において、対象とするイオンチャネルが効率的に活性化され、不活性から解放されることを確実にするように、同時に、細胞の不可逆的エレクトロポレーションをひき起こすほどの大きさでないことを確実にするように、選択される。E2とE3の好適なパルス振幅は、通常、平均寸法が10ないし25μmである励起できない哺乳動物の細胞で発現される時は、ほとんどのイオンチャネルに対して5なし60V/cmの範囲にあり、接地(アース)に対して正または負に変化することがある。上記のように、刺激の振幅は、平均トランスメンブレンポテンシャルが変化しても安定な刺激条件を維持するために、パルス列中で変化することができる。好適なパルス振幅は、平均細胞寸法に逆依存する。したがって、パルス振幅を変化することによって、10ないし25μmより小さいか大きい細胞に対して、この技術を使用することもできる。
多くのチャネルは、開通する前に、不活性からそれらを解放するために、トランスメンブレンポテンシャルを延長された時間期間の間変更することを求める。例えば、多くの電圧依存ナトリウムチャネルは、一般に、それらが不活性から解放される前に、−90mVより低いトランスメンブレンポテンシャルを何ミリ秒間か経験することを必要とする。したがって、電気刺激プロトコルの効率的な使用は、通常、パルスの持続時間t3とt5が、対象とするイオンチャネルに対して不活性からの完全なまたはほとんど完全な解放を可能にするために十分であることを要求する。ある場合には、いくつかのイオンチャネル型を発現する細胞における1つのクラスの不活性化からの選択的解放を可能にするが他のクラスのイオンチャネルではそうではないように、t3とt5の大きさを調整することが必要なことがある。他の場合には、チャネルの不活性からの解放のレベルが低くなるように、t3とt5を非常に小さくすることが望ましいことがある。通常は、好適なパルス持続時間は、対象とするイオンチャネルの所望の電圧依存状態の間の遷移のための特性時間に合致させられ、それらは、通常は、ほとんどのイオンチャネルに対しては約0.1ないし100ミリ秒の範囲にある。
列に対してt1とt7の値を全体的に変えること、または列中の個々の各パルスに対してそれを調整することは、特定のイオンチャネルに対する刺激プロトコルを最適にするために有用である。またこのやり方は、チャネル開放時間とチャネルの活性化および不活性化の時間的経過を含めた、ある細胞特性およびあるチャネル特性を決定するために有用でもある。
細胞およびチャネルの特性は、動的モード(すなわち、立ち上がりおよび立ち下がり時間、反応形状における変化など)および静的モードでアッセイできる。両方のモードは、対象とする全ての事象を調べるために十分長いが、アッセイを終了するために必要なものよりも長くない、刺激列持続時間を必要とする。典型的な刺激時間は、20Hzの周波数で3秒間にわたって繰り返される、25V/cmで10msecのパルスを有する。これらのパラメータを調整することによりアッセイ時間を短縮でき、または高速および低速時間スケールでプロセスを調べることができるようにされる。
ある場合には、パルス列を繰り返すこと、または同じ細胞に対して2つの異なるパルス列を用いて測定することが、有用である。1つの例は、多数の刺激列を受ける細胞の単一プレートを用いて、刺激周波数および持続時間の関数としての反応を測定することにより、チャネルの諸特性を完全にキャラクタライズすることである。他の例は、反応の柔軟性(すなわち、反応の活性依存する変化)を調べることである。1つまたは複数の刺激列が反応を整え、一方、整える前または後の測定列の組が、活性に起因する変化を決定する。
本発明は、平均トランスメンブレンポテンシャルを予め設定されている値に維持するために動的帰還ループを用いることにより、電圧クランプ装置を形成するためにも使用することができる。下で説明するように、高速蛍光出力を用いてトランスメンブレンポテンシャルを測定し、その後でトランスメンブレンポテンシャルのいかなる変化も補償するように刺激パラメータを変化することにより、細胞のトランスメンブレンポテンシャルを動的に制御することが可能である。そして、その電位を維持するために必要な電流は、刺激パラメータのコンピュータ制御によって決定される。
典型的な刺激パラメータ中、約50mAのピーク電流が、電極の間の溶液中を流れる。この時間中、種々の電気化学的反応が起こり、それらの電気化学的反応は、通常、細胞にとって有毒な化学種を発生する。予備実験によって、ほとんどの哺乳動物の細胞が、通常は、ステンレス鋼電極を使用しての約2分間の電気刺激に対して正常に反応することが示されている。しかし、より長い時間にわたる延長された刺激は、細胞の健全さと生存能力を損なうことをもたらすようである。十分に高いパルス周波数では、金属−食塩水界面が水の電気分解のための電位(食塩水中のステンレス鋼に対しては約±1V)に達しないように、電流を容量的に流すことができ、それにより有毒な生成物は発生しないだろう。各電極の食塩水に接触している面積が約24mm2である、図1に示されている電気刺激器では、電極当りの容量は約1〜10μFである(Robinnson, 1968,Proc.IEEE,56:1065-1071)。50mAでは、この容量は、約20〜200マイクロ秒で1Vまで充電する。これは、有用なパルス持続時間の下限である。
a)細胞タイプの選択:
本発明は、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、バクテリア細胞、酵母および哺乳動物細胞を含めて、任意のタイプの細胞で使用できる。ヒトの治療のためのスクリーニングには、哺乳類の細胞系統が好ましく、そのような細胞系統は、比較的容易に成長でき、かつ高い効率で容易にトランスフェクションできる組織培養細胞系統を含む。多くの組織細胞系統は、American type culture collection(ATCC)(http://ww.atcc.orgを参照)、およびEuropean collection of cell cultures(ECACC)(http://www.camr.org.ukを参照)を通じて商業的に入手できる。
対象とするイオンチャネルの発現のために配列符号で細胞をトランスフェクトするために用いられる核酸は、通常、チャネルの発現のためのヌクレオチド配列符号に作動的にリンクされている発現制御配列を含めた発現ベクターの形態である。使用されているように、チャネルの発現のためのヌクレオチド配列符号という用語は、mRNAの転写および翻訳に際し、チャネルを生ずる配列を指す。これは、例えばイントロンを包含している配列を含んでいる。ここで使用しているように、発現制御配列という用語は、それが作動的にリンクされている核酸配列の発現を規制する核酸配列を指す。発現制御配列は、発現制御配列が核酸配列の転写と適切であれば翻訳とを制御および規制する時に、核酸配列に作動的にリンクされる。したがって、発現制御配列は、適切なプロモーター、エンハンサー、転写夕ーミネー夕ー、タンパク質符号化遺伝子の前の出発コドン(すなわちATG)、イントロンのための切り継ぎ信号、mRNAの適切な翻訳を許すためのその遺伝子の正確な読出しフレームの維持、および終止コドンを含むことができる。
本発明の使用によるトランスメンブレンポテンシャル変化と特定のイオンチャネルのコンダクタンスの測定とは、トランスメンブレンポテンシャルまたはイオンの運動の既知の測定手段のいずれかを用いて検出できる。それらの方法は、たとえば、パッチクランピング(Hamille et al., Pfluegers Arch., 391:85-100,1981)、FRETをベースとする電圧センサ、エレクトロクロミック・トランスメンブレンポテンシャル染料(Cohen et al.,Annul Reviews of Neuroscience,1:171-82, 1978)、トランスメンブレンポテンシャル再分配染料(Freedom and Laris, Spectroscopic membrane probes Ch 16, 1968)、細胞外電極(Thomas et al., Exp. Cell Res., 74:61-66, 1972)、電界効果トランジスタ(Fromherz et al., Science, 252:1290-1293, 1991)、放射性フラックスアッセイ、イオン感応性蛍光またはルミネッセント染料、イオン感応性蛍光またはルミネッセントタンパク質、内生タンパク質の発現またはリポーター遺伝子または分子の使用を含む。
1つの様相では、本発明は、生きている細胞のトランスメンブレンポテンシャルを電気刺激を通じて変調する方法と、ほぼ任意のイオンチャネルまたはトランスポーターシステムの活動度をアッセイするためにそれらの方法を使用することを含む。
哺乳類の電圧依存ナトリウムチャネルの各種のアイソフォーム(isoform)が特定され、下の表1に要約されている。これらのチャネルは3つの主な群に分類できる(総説として、Goldwin, Annals N.Y. Academy of Sciences,868:38-50,l999を参照)。
好適な細胞は、対象とするイオンチャネルの活性しきい値より上の休止トランスメンブレンポテンシャルを持つものを含み、そのような細胞では、他のイオンチャネルは発現されない。これらの基準に合致する細胞は、CHL細胞とLTK(−)細胞を含む。目標イオンチャネルを選択した後で、細胞は、トランスフェクトされクローンがIII節で説明したように選択される。あるいは、対象とするチャネルと低レベルでの他のチャネルとを内生的に発現する細胞系統を使用できる。例えば、CHO−K1細胞系統は電圧ゲートされたナトリウムチャネルと、非常に低いレベルの他のチャネルとを発現する。細胞は、IV節に説明されているように、電気刺激を開始する前に、マルチウェル微量滴定プレートに付着され、培養され、電圧感応性染料で染色される。最初の実験は、通常、各ウェル内に等しい数の細胞を有する96ウェルマルチウェルプレートで行われる。一般に、8個のウェルの行が同一の条件の下に同時に電気的に刺激されて、細胞の反応の変化について統計的に重要なデータを提供する。
好適な細胞は、対象とするイオンチャネルの活性化しきい値より下の休止トランスメンブレンポテンシャルを持つものを含み、その細胞では、他のイオンチャネルの発現は少数のキャラクタライズされているイオンチャネルタイプに大きく限られる。このタイプの細胞は、HEK−293細胞およびRBL細胞と、F11細胞とHL5細胞を含む。目標とするイオンチャネルの選択の後、上述したように、細胞は、対象とするイオンチャネルでトランスフェクトされ、クローンが選択される。あるいは、F11細胞とHL5細胞の場合におけるように、内生的なナトリウムチャネルを使用できる。選択およびキャラクタライザーションの後で、上記のように細胞クローンがマルチウエル微量滴定プレートに付着され、電圧感応性染料で染色される。前のように、最初の実験は、典型的には、各ウェルに等しい数の細胞がある、96ウェルマルチウェルプレートで行われる。一般に、8つのウェルの行が同一の条件の下で同時に刺激されて、細胞の反応の変化についての統計的に重要なデータを提供する。
電圧依存カリウムチャネルは、動作電位消極の後で、神経細胞および筋肉細胞を再び分極する。それらは、神経、筋肉、分泌器官および排出器官において重要な調整役割を演じもする。ほとんどの細胞は、高い細胞内カリウム濃度を積極的に維持するので、カリウムに対する反転トランスメンブレンポテンシャルは、およそ−90mVである。カリウムは、通常、細胞から流れ出るので、よりカリウム選択性のチャネルを開くと、トランスメンブレンポテンシャルを一層正へと通常は駆動するナトリウムチャネルの開放と対照的に、トランスメンブレンポテンシャルを一層負へと駆動しようとする。
カリウムチャネルは外向き電流を生ずるので、チャネルの活性化は、負のトランスメンブレンポテンシャル変化を生じる。生理学的諸条件の下では、カリウムの反転電位は−90mVくらいである。電圧依存カリウムチャネルのみを発現している細胞は、活性化しきい値に近い休止電位を一般に有するので、直接刺激は、約−50mVより上の活性化しきい値を持つそれらの電圧依存カリウムチャネルに対して働き掛けねばならない。トランスメンブレンポテンシャルの小さな負の偏移(40mVの変化より小さい)をFRET電圧感応性染料を用いて確実に検出できるが、より大きい信号で高いスループットのスクリーニングを行うことがしばしば好ましい。
それの名称とは反対に、内向きレクチファイヤチャネルの機能は、カリウムを細胞内に入れないようにすることである。カリウムの内向きの流れは、(1)トランスメンブレンポテンシャルがカリウム平衡電位より下に降下した時、または(2)細胞外部のカリウム濃度が上昇する時、にのみ生ずることができる。いずれの状況も通常は起きない。その理由は、(1)正常な生理学的諸条件の下では、カリウムは最も負の反転電位を持つイオンであるので、どのイオン電流も電位をカリウム反転電位よりも一層負に駆動できず、(2)病理学的諸条件下を除いて、細胞外部のカリウム濃度は厳しく制御される、からである。しかし、電気刺激を用いると、細胞膜の部分をVKより下に駆動できて、カリウムイオンの細胞内への入り込みを促進する。これによってトランスメンブレンポテンシャルは正味の正変化を起こさせられ、それは正信号として検出できる。内向きレクチファイヤのブロッカーについてのアッセイを行いかつ最適にするために、したがって、下記の手順に従うことができる。
この方法は、対象とする電圧依存カリウムチャネルを発現し、かつ電圧依存ナトリウムチャネルも発現する細胞系統の使用を含む。この方法では、やり方は、電圧依存ナトリウムチャネルを特に活性化するために構成されている電気刺激プロトコルを使用することである。この場合には、電気刺激は、ナトリウムイオンを細胞内に入らせて、正電圧変化を起こさせる。対象とするカリウムチャネルが存在することにより、カリウムイオンが細胞を離れることができるようにすることによって、ナトリウムチャネルの正の反応が抑制される傾向が生じる。アッセイは、試験化学薬品がカリウムチャネルをブロックする時に外向き電流が存在しないことを利用することにより、ナトリウムチャネルの活性化により通常ひき起こされる大きな正電圧反応を回復する。電流の平衡の最適化は、アッセイがカリウムチャネルの閉塞に敏感であることを確保するために、この方法では重要である。ナトリウム電流がカリウム電流に対して小さすぎるとすると、カリウムチャネルブロッカーについての服量反応曲線は、より高い濃度へ向かって移動する。例えば、カリウム電流がナトリウム電流より100倍大きいという極端な場合には、ナトリウム電流から50%の反応を得るためには、カリウムシャネルの99%をもブロックしなければならない。
カルシウムチャネルは、多くの細胞内で一般に見出される。カルシウムチャネルは、細胞内で、他の機能のうちで、信号形質導入という重要な役割を演ずる。励起可能な細胞では、細胞内のカルシウムは、長い消極反応のために維持された内向き電流を供給し、消極機構とその他の細胞内部信号形質導入機構との間のリンクとして作用する。電圧ゲートされたナトリウムチャネルのように、電圧ゲートされたカルシウムチャネルは、多数の休止、活性および不活性状態を有する。
塩化物チャネルは、体内のほぼあらゆる細胞の原形質膜中で見出される。塩化物チャネルは、トランスメンブレンポテンシャルの規制と、上皮膜を横切るイオンの吸収および分泌を含めた、各種の細胞機能を仲介する。ゴルジ装置および細胞内分裂小嚢の細胞内膜中に存在する時は、塩化物チャネルは、細胞小器官pHの調整もする。総説として、Greger, R., (1988) Annu. Rev. Physiol., 50:111-122を参照。
配位子(リガンド)依存イオンチャネルファミリーは大きくて多様である。配位子依存イオンチャネルは、特定の分子の結合に反応して開く。それらは、典型的には、ニューロンの間と、ニューロンから筋肉細胞へとの高速シナプス伝達を仲介する。それらは低速シナプス伝達も仲介し、種々の調整機構を制御する。配位子ゲートされたイオンチャネルは、一般に、電荷選択的なだけである。すなわち、それらはある範囲のアニオンまたはカチオンの流れを許すが特異性は持たない。それらは活性、脱活性、および感度低下キネティクスにおいて数多くの変形を有し、それらの全てはミリ秒以下から秒までの時定数まで変化できる
多くのチャネルは、遅い、または電圧で活性化されないコンダクタンス変化を有する。主要な例は、包嚢繊維症に関連させられているチャネルのいくらか、特に包嚢繊維症トランスメンブレンレギュレーター(CFTR、塩素チャネル)、上皮ナトリウムチャネル(ENaC)および4TMカリウムチャネルファミリーメンバー(Wang et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 868:286-303, 1999)である。それらのチャネルのいずれかにアゴニストとして作用する小さい分子は、包嚢繊維症を緩和する薬品の候補である。現在、この型のチャネルに対する便利に動作できる高スループットのスクリーニング法はない。
電気刺激が終った後で、細胞のトランスメンブレンポテンシャルは新しい休止電位に緩和する。電圧依存チャネルのアッセイでは、チャネルは、一般に、閉じているか不活性であり、最終的な休止平衡電位は、刺激前と同じである。ほとんどの場合には、膜容量に蓄積される電荷は、膜の抵抗値を通じて指数関数的に散逸する。膜の時定数は、簡単にいえば、膜の容量と膜の抵抗値との積、すなわちτ=RmCmである。それは、膜の容量と膜の時定数を測定することにより容易に決定できる。
不活性イオンチャネルを開くには、トランスメンブレンポテンシャルをしきい値より下に数ミリ秒のオーダーの時間、保持することを要する。この不活性からの解放は、重要な生理学的意味を持つ。例えば、不活性からの解放は、動作電位の後戻り伝播を阻止する御し難い期間を強制して、ニューロンの最高興奮率を制限する。この性質の薬理学的取扱いは治療的に関連する。
開放チャネル時間τopenは、チャネルの不活性特性の関数である。非常に高い周波数で刺激することにより、このパラメータの薬理学的取扱いを、非常に高い頻度で刺激することによって検出できる。例えば、多重刺激法を用いる電圧依存ナトリウムチャネルのアッセイについて考えることにする。定常レートで繰り返される固定した単相方形波刺激カーネルでは、電圧反応は、刺激繰り返し率が高くなるにつれて増加する。その理由は、より高い周波数では、ナトリウムチャネルが、開放している時間をより多く過ごすからである。しかし、パルス同士の間隔がチャネル開放時間よりも短くなるとすると、活性化されたナトリウムチャネルは負へ駆動されるので、以後の刺激パルスによって不活性にされる。反応が平坦になる刺激バースト周波数はチャネル開放時間に関連する。
全細胞記録において、電流クランプは、トランスメンブレンポテンシャルを記録している間に指令電流を細胞内へ駆動できるようにするモードである。パッチクランプ記録は極めて正確ではあるが、スループットが非常に小さい技術である。完全な条件の下における絶対最大数で、高度に訓練された科学者は、細胞のパラメータを1時間当り細胞10個の率で決定できる。しばしば、パッチクランプ技術で得られる結果は詳細すぎて、薬品のスクリーニングのためには必要ではないほどであるのに、それを簡単にして測定の速さを高くする方法は現在のところない。大規模な化合物ライブラリをスクリーニングするためには、高い速度は絶対に重要である。
電圧クランプでは、細胞のトランスメンブレンポテンシャルは、電流の流れをモニタしている間に制御される。電圧クランプは、フィードバックループを電流クランプ回路に加えることによって、一般に達成される。全細胞法の場合には、これは、同じ細胞に同時に取り付けられている2つのピペットを用いて容易に達成できる。1つのピペットは指令電流を通し、他方は電圧を検出する。フィードバック回路が測定電圧を指令電圧と比較し、それにしたがって指令電流を調整する。一般に、細胞膜抵抗値はピペットのアクセス抵抗値と比較して高いので、同じピペットを用いて電流を指令し、電圧を測定できる。電流クランプと比較して、電圧クランプは、一般に、電気生理学的分析のためのより強力な方法である。イオンチャネルはトランスメンブレンポテンシャルに極めて敏感であるので、データの分析は、固定されている電圧での電流測定を取り扱う時には、はるかに直接的である。
ここで説明している刺激法は、ミトコンドリアおよび核を含めて、リン脂質膜を有する細胞内オルガネラのトランスメンブレンポテンシャルを変調するために使用することもできる。これは、電気的透過性(electropermeablization)により、またはバリノマイシンあるいはグラミシヂンAなどのイオン透過担体を加えることにより、まず原形質膜のコンダクタンスを上昇させることにより達成できる。そうすると、細胞内空間が、もはや、加えられている電界から分離されない。これによって、食塩水に加えられた電界は、細胞内オルガネラの膜を横切ってトランスメンブレンポテンシャルの変化を生じさせることができるようになる。その後で、イオン濃度またはトランスメンブレンポテンシャルに敏感で、対象とする特定のオルガネラ膜にのみターゲットにされている染料で細胞を染色することにより、ここに提示した方法を用いて、それらのオルガネラのイオンチャネルを変調およびアッセイできる。ターゲットにすることは、例えば、この技術で知られている適切な細胞下位置信号を含んでいる天然の蛍光タンパク質の使用を通じて達成できる。
哺乳類の細胞膜の絶縁破壊は、膜の両側の電位が約200mVを超えると起きる(Teissie and Rols, 1993, Biophys. J., 65:409-413)。膜が絶縁破壊すると、膜を通じて孔が形成されて、細胞内部空間と細胞外部空間を結びつける。孔の数と大きさはトランスメンブレンポテンシャルの上昇とtもに増大する(Kinoshita and Tsong, 1977, Nature, 268:438-441)。典型的な哺乳類の細胞系統に加えられる電界の強さが約60V/cmより強くなると、細胞は電気的に透過できることになる。比較的低い電界では、小さいイオンを通すのに明らかに十分大きいが、DNAほどの大きさの分子を通すには十分大きくない、小さな穴が細胞膜に形成される(Tsong, 1991, Biophys. J., 60:297-306)。これらの孔は、細胞を全面的に消極して、トランスメンブレンポテンシャルをゼロ近くに駆動する。細胞を電気的に透過できるようにし、電圧感応性染料でトランスメンブレンポテンシャルの変化をモニタすることによって、本発明は、細胞の休止トランスメンブレンポテンシャルを決定するために使用できる。これは、一次スクリーニングまたは二次スクリーニングとして、細胞またはイオンチャネルとの薬理学的相互作用を決定するのに有用である。例えば、電圧依存ナトリウムチャネルに対する化合物スクリーニングにおいて、チャネルの活動度を決定するために、多数の刺激プロトコルを実行できる。その後で、透過プロトコルでしたがうことによって、細胞膜が化合物が存在する中で正常な休止電位を持っていたか否かを決定できる。
本発明は、従来のアッセイ装置よりもはるかに多用途でロバストな、イオンチャネル機能を変調する試験化合物の確実な検出を行う。重要なことに、本発明は、パッチングクランピングにおけるような、薬理学的試薬、または膜の破壊、および細胞内内容物の喪失の要求なしに、損なわれていない細胞内のトランスメンブレンポテンシャルを変調する性能を提供する。生きている細胞のトランスメンブレンポテンシャルを外部で変調する性能を提供することにより、本発明は広範囲なイオンチャネルのアッセイを可能にするものである。
ひとたび特定されると、候補モジュレーターは、選択性および毒性作用を既知の方法を用いて評価されることができる(Lu, Basic Toxicology, Fundamentals,Target Organs, and Risk Assessment,Hemisphere Publishing Corp., Washington (1985);Culbrethに付与された米国特許第5,196,313号(1993年3月23日発行)およびBenetに付与された米国特許第5,567,952号(1996年10月22日発行)を参照)。
候補モジュレーターの有効性は、生体外(in vitro)法、動物モデルまたはヒトの臨床試験などのこの分野で認識されているいくつかの方法を用いて判定できる(Creasey, supra, (1979)を参照)。認識されている生体外モデルは、いくつかの疾患すなわち異常に対して存在する。例えば、HIVに感染している生体外の細胞の寿命を延長するための化学薬品の効能は、HIV感染すなわちエイズを治療するために効果があると予測される化学薬品を特定するための許容できるモデルとして認識されている(Daluge et al., Antimicro. Agents Chemother., 41:1082-1093(1995)を参照)。さらに、生体外のT細胞の増殖を阻止するためのシクロスポリンA(CsA)の効能は、免疫抑制剤として効果があることが予測される化学薬品を特定するために許容できるモデルとして確立されている。(Sauthanthiran et al., supra (1996)を参照)。ほとんどあらゆる種類の治療、疾患または異常に対して、許容できる生体外モデルまたは動物モデルを利用できる。それらのモデルは、例えば、胃腸の異常、癌、心臓学、神経生物学、および免疫学のために存在する。また、それらの生体外法は、候補モジュレーターに対する代謝の影響の確実な指標を与えるために、ミクロソーム標本などの肝臓の標本などの、組織抽出物を使用できる。同様に、許容できる動物モデルを種々の疾患および異常を治療する化学薬品の有効性を確立するために使用できる。例えば、ラビットの膝は、関節炎の治療に有効な化学薬品を試験するための受け容れられるモデルである(Shaw and Lacy, J. Bone Joint Surg,(Br)55:197-205(1973)を参照)。関節炎の治療のためにヒトに使用するととが承認されているヒドロコルチゾンは、このモデルの有効性を裏付けるこのモデルにおいて有効である(McDonough, Phys. Ther., 62:835-839(1982)を参照)。候補モジュレーターの有効性を判定するために適切なモデルを選択する場合は、当業者は、適切なモデル、用量、投与経路、養生法および終点を選択するために、技術の現状を頼りにすることができ、したがって、過度に負担が掛かることはない。
上記の生体外(in vitro)法および生体内(in vivo)法は、候補モジュレーターの選択性をも定める。本発明は、候補モジュレーターの特効性を判定する迅速な方法を提供するものである。例えば、関連するイオンチャネルファミリーメンバーを含んでいる細胞系統を用いて、関連するイオンチャネルを阻害する効能と、イオンチャネルの異なる電圧依存状態を変調する相対的な性能との両方に関して、試験化学薬品の選択性を迅速にプロファイリングすることができる。そのような装置は、最初に、簡単で微小化された高スループット態様で、候補モジュレーターのイオンチャネル選択性を系統的に評価するために、多数の試験化学薬品を迅速にプロファイルする性能を提供する。
本発明は、新規な化学物質などの組成品と、ここで説明している方法、装置または成分の実施による活性を有するものとして本発明の少なくとも1つの方法により特定される治療と、を含む。新規な化学物質は、ここで使用されているように、この出願の出願日における技術で既に公然と知られている化学物質は含まない。通常は、化学物質は、本発明を使用することから活性を有することが示され、その後で化学構造の専用のあるデータベースからその構造が明らかされ、または質量分光分析などの分析技術からその構造が決定される。
本発明の実施例のいくつかは次の通りである。
1または複数の細胞を前記化合物に曝すことと、
前記1または複数の細胞のトランスメンブレンポテンシャルにおいて制御された変化がもたらされるように、前記1または複数の細胞に1または複数の電界を繰り返し加えることと、
パッチクランプを使用することなしに、前記1または複数の細胞のトランスメンブレンポテンシャルの変化をモニタすることと、
を有する方法。
前記目標とするイオンチャネルの選択された電圧依存状態に対応する正常な休止トランスメンブレンポテンシャルを有する細胞系統を選択することと、
前記選択された細胞系統の細胞の集団において前記目標とするイオンチャネルを発現させることと、
前記細胞の集団を前記化合物に曝すことと、
前記1または複数の細胞のトランスメンブレンポテンシャルにおいて制御された変化がもたらされるように、前記細胞の集団に1または複数の電界を繰り返し加えることと、
前記1または複数の細胞のトランスメンブレンポテンシャルの変化をモニタすることと、
を有する方法。
れる、上記方法。
トランスメンブレンポテンシャルにおける制御された変化を発生させ、かつ対象とするイオンチャネルを活性化するように、複数の電界パルスを少なくとも1つの細胞に加えることと、
パッチクランプを使用することなく、トランスメンブレンポテンシャルの1または複数の変化を検出することにより、イオンチャネルの活動度を検出することと、
を有する方法。
少なくとも1つの細胞中で、選択された目標とするイオンチャネルを発現させることと、
前記少なくとも1つの細胞中で、選択された対イオンチャネルを発現させることと、
トランスメンブレンポテンシャルの制御された変化を発生させ、かつ前記対イオンチャネルを活性化するように、複数の電界パルスを少なくとも1つの細胞に加えることと、
前記少なくとも1つの細胞のトランスメンブレンポテンシャルをモニタすることと、
を有する方法。
1つまたは複数の細胞を試料ウェル中の観察領域内に置くことと、
前記1つまたは複数の細胞を候補化合物に曝すことと、
前記観察領域内において強さにおけるその空間的変動がその領域内の平均強さの約25%より小さい限られており、かつ前記1つまたは複数の細胞のトランスメンブレンポテンシャルの制御された変化を生ずるような電界で、一連の二相電界を、1秒間当り約20ないし100パルスの率で前記1つまたは複数の細胞に繰り返し曝すことと、
前記1つまたは複数の細胞のトランスメンブレンポテンシャルの変化を、前記1つまたは複数の細胞を含んでいる観察領域からの、FRETをベースとする電圧センサの蛍光放出を検出することによりモニタすることと、
を備えている方法。
前記複数のウェルのおのおのの内部の2個の電極と、
前記高い透過率の部分を通じて前記ウェルから出る光を検出するように構成されている光検出器と、
前記電極に接続された電源であって、前記電源および前記電極は前記観察領域内のウェルに一連の電界を加えるように構成されており、前記電界は、前記観察領域内において、その領域内での平均強さの約25%よりも小さい空間的変動を有して、前記細胞の一部のトランスメンブレンポテンシャルを制御可能に変える、電源と、
前記ウェルから前記高い透過率の部分を通って出る前記光を、前記トランスメンブレンポテンシャルの変化の結果としてのイオンチャネル活動として解釈するデータ処理器と、
を備える、高スループットスクリーニング装置。
試薬および/または細胞を前記試料ウェルに加える液体ハンドリング部と、
イオンチャネルの活動を選択的にひき起こさせるように、前記試料ウェル内部の細胞のトランスメンブレンポテンシャルを制御する手段と、
前記トランスメンブレンポテンシャルの変化を光学的にモニタする手段と、
を備える高スループットスクリーニング装置。
前記ターゲットイオンチャネルを宿主細胞の集団で発現することと、
複数の前記宿主細胞を複数の試料ウェルのおのおのの内部に置くことと、
候補薬品化合物を前記複数の試料ウェルの少なくとも1つに加えることと、
前記トランスメンブレンポテンシャルを前記ターゲットイオンチャネルの予め選択された電圧依存状態に対応するレベルに設定するように、前記複数の試料ウェル内の宿主細胞のトランスメンブレンポテンシャルを電界の繰り返し印加で変調することと、
を備える方法。
。
。
前記列に沿って延長し、前記ウェルの場所の第1の部分の上に重なり合う導電性物質の第1の条と、
前記列に沿って延長し、前記ウェルの場所の第2の部分の上に重なり合う導電性物質の第2の条と、
を備えているマルチウェルプレート用の底パネル。
前記第1の条の端部に近接している第1の電気接点と、前記第2の条の端部に近接している第2の電気接点とをさらに備えている上記底パネル。
前記試料ウェル内部に配置されている第1の対の電極と、
前記試料ウェル内部に配置されている少なくとも1つの追加のサテライト電極と、
を備えているアッセイ装置。
本発明は添付した実施例を参照すると一層良く理解できる。それらの実施例は示すことだけを目的とするものであって、ここに添付されている特許請求の範囲で定められている本発明の範囲を限定するものとは、いかなる意味においても解してはならない。
種々の電極とウェルの設計との作用を解析するために、電界の一連の二次元数値シミュレーションを、ソフトウエア解析パッケージQuickfieldTM4.1, (Student´s Version, Tera Analysis, http://www.tera-anaiysis.com)を用いて発生した。このソフトウエアパッケージは、二次元での有限要素解析法でポアソンの方程式を解くことによって目の粗い網型の電界強度マップを生ずる。この解析のために、電界の底とウェルの底の間の間隙に起因する端効果は無視し、電極から食塩水までの電圧降下も無視できるものと仮定した。モデルの空間分解度は約0.5mmである。
標準の直径6.2mmのウェル内部に置かれて、4.0mmの距離で隔てられている、直径1.0mmの2本の丸ピン電極について予測される電界の一様性を決定するために、実施例1において説明したのと同じ条件および同じ仮定でシミュレーションを行った。
図8Aは、6.2mmの正方形ウェル内部の4mmの間隙を持つ2枚の6mm幅の平行プレート電極の電界プロファイルのシミュレーションを示す。この図で、外側の正方形(800)はウェルの縁部である。2本の垂直線(810)は電極である。中間の破線の円(820)は観察領域である。特に注目すべきことは、電界の強さの変化に対比をつけるために、図8の電界のスケールが、図7と比較して非常に大きくされていることである。灰色の領域(840)は電界が観察領域内の平均電界の±1%以内に維持される領域である。白い領域(830)では、電界は平均よりその1%よりも小さい。このシミュレーションでは、平均電界よりその1%よりも大きい点はない。観察領域内では、電界の強さの標準偏差は平均の0.02%であり、最大電界と最小電界の間の差は平均の0.12%である。したがって、この構成は電界の一様性を極めて大きく改善する。
図8Bは、図1において説明した標準の状態と解析手順を用いて、6.2mmの直径の円形ウェル内部の4mmの間隙を持つ2枚の4mm幅の平行プレート電極の電界プロファイルのシミュレーションを示す。図9Aに示されているように、絶縁体が電極に取り付けられて、電極の間のウェルの丸くされている領域を覆い隠す。図8Bで、外側の円(802)はウェルの縁部である。2本の垂直線(812)は電極である。中間の破線の円(822)は観察領域である。クロスハッチされている領域(862)は電極に取り付けられている絶縁体である。灰色の領域(842)は、電界が観察領域内の平均電界の±1%以内に維持されている領域である。白い領域(832)内では、電界は平均よりその1%よりも小さい。このシミュレーションでは、平均電界よりその1%よりも大きい点はない。観察領域内では、電界の強さの標準偏差は平均の0.2%であり、最大電界と最小電界の間の差は平均の1.0%である。したがって、この構成は、絶縁体が使用されていない場合よりも電界の一様性を極めて大きく改善するが、正方形ウェルの場合におけるほど大きくはない。
ウェルの湾曲している縁部内への電流の損失をサテライト電極の使用によって補償することが可能かどうかを判定するために、各種の電極構成でシミュレーションを行った。図9Bはこの概念の1つの可能な実施形態を示し、図8Cはこの構成が、実施例1で説明したQuickfieldTMを用いて解析された時の電界プロファイルを示す。この実施例では、余分の0.7mm幅の平行平板電極の2対を2mm間隙をおいて設けた。それらの電極は観察領域の外部にあって、それの親電極の電位の半分に保たれていた。
ウェル内に挿入された時にディッパー電極により形成されるメニスカスは、観察領域にわたってほぼ10%、生理的食塩水の深さを変化させる。そうすると観察領域にわたってほぼ10%の電界変化が生ずる。それらの変化は、電極の構造が完全な電界一様性を生ずると予測されていたとしても存在する。したがって、メニスカス効果を解消すると実際の電界一様性が改善される。これを行う1つの可能な方法は、電極の間に絶縁バリアを付加することである。図9Cは、1つのそのような実施形態を示すものであって、絶縁バリアが、ウェル内の液体に対して平らな上表面を形成するために用いられている。このバリアの底が、電極がウェル内に挿入された時に、ウェルの底の約2.5mm上に位置するように設計されている。したがって、バリアは、生理食塩水中に部分的に浸され、それの底面が、導電性の室の上部を平らに、かつ電極表面に垂直に画定する。このようにして電界は、導電性容積の表面の凹凸によって乱されることはない。
電気刺激器の一実施形態では、装置は、ディッパー電極を96ウェルマルチウェルプレート形態におけるウェルのアレイ中に配置する自己位置決めフレームで構成されている(図1)。図1は電極アレイの挿入された位置を示す。この例では、電気刺激装置は、3つの機能部品から製作できる。第1の部品は、装置をプレートウェルに対して配置する位置決めフレーム(40)である。このフレームは金属で製作され、マルチウェルプレートにぴったりはめ込まれる。このフレームは、装置の第2の機能部品すなわち引き込み機構の位置決め基準として機能する。
野生型のチャイニーズハムスターの卵巣細胞(CHO細胞)は、電圧依存ナトリウムチャネルを内生的に発現し、電気刺激パラメータの妥当性検証と最適化のために便宜に使用できる。このナトリウムチャネル以外に、それらの細胞は、付近の細胞との間の間隙接合接続と、非常に小さい(〜20pA)電圧依存外向き電流を有するように見える。
刺激パルスの幅と周波数が変えられた際の細胞反応の挙動を調べるために、上で実施例8において説明したように野生型CHO細胞を用いて、一定の電界強さ25V/cmで、パルスの持続時間と周波数を変化させて実験を行った。
VI節で説明したように、電圧依存ナトリウムチャネル(以後、NaV2と呼ぶ)を符号化するプラスミドでチャイニーズハムスターの卵巣細胞を安定にトランスフェクトした。電気刺激による分析前に、このチャネルの電気生理学的特性および薬学的特性を確認するために、細胞全体のパッチクランプ分析を用いた。−20mVにおけるピーク過渡ナトリウム電流は、600±300pA(N=5)で、平均細胞膜容量は15±5pfであると測定された。静止細胞膜抵抗値は、高すぎて正確に測定することができなかった(RL>10GΩ)。休止トランスメンブレンポテンシャルは−31±3mVであった。
いかなる特定の作用機構にもしばられることなく、不活性からの解放の実効的な時間および開放チャネルコンダクタンスの定量的な評価を行うために、実験的検証のために下記の理論を発展させた。
野生型HEK−293細胞は、通常、種々の内因性のカリウム電流および塩化物電流を発現するので(Zhu et al,. 1998, J. Neurosci. Meth., 81:73-83)、それらの細胞の休止膜抵抗は5〜10GΩである。その結果、それらの細胞の膜時定数は、対応してより小さいために、細胞を最適に刺激するためには、匹敵する信号を発生するために、内因性カリウムチャネルのない細胞と比較して、電気刺激プロトコルを比較的より高い周波数で繰り返すべきであることが予測される。
この方法を広い範囲の種々のナトリウムチャネルに一般に適用できるかどうかを判定するために、HEK−293細胞を別の電圧依存ナトリウムチャネル、以後NAV4と呼ぶ、で安定にトランスフェクトした。それらの細胞をVI節および実施例8で説明したように、トランスフェクトし、選択し、FRET染料でロードした。このチャネルでのテトラカインについての用量反応曲線の結果を図20に示す。ここでは、データ点は、8つのウェルでの平均と標準偏差であり、実線は、見積もられたEC50=351nMおよびヒル係数1.35でのヒル関数へのフィッティングである。それらの結果は、このイオンチャネルの既知の薬理学と矛盾せず、細胞反応が主としてナトリウムチャネルの活性によりひき起こされることを再度示している。
電圧依存塩化物チャネルと電圧依存カリウムチャネルの直接刺激の実証を野生型HEK−293細胞を用いて行った。それらの細胞は、いくつかの電圧で活性化された塩化物チャネルおよびカリウムチャネルの混合したものを内生的に発現する(Zhu, Zhang et al., 1998)。野生型細胞は、96ウェル微小滴定プレート内で成長させられ、付録A1におけるプロトコルにしたがって、FRET染料で染色された後、全面で(コンフルエンス)でアッセイされた。最初の刺激パラメータは、20Hzでの、パルス持続時間が約5ms/相の二相方形波刺激電気カーネルでの3秒の長さの電気刺激を含んでいた。刺激は、変化する電界強度で行って、カリウムチャネルブロッカーが存在する間または存在しない間に、測定可能な細胞反応についてのしきい値電界強さを決定した。
提案されているいかなるスクリーニング装置も、受け入れられた方法により決定された既知化合物の薬理学を再現すべきであることが好ましい。これが本発明の場合であったことを検証するために、定められた活性の一連の試験化合物を、NaV2チャネルを発現するCHO細胞系統を用いて分析した。これを行うために、細胞を96ウェルプレートで培養し、付録A1に述べられているように電圧感応性染料で染色した。試験化合物をオキシノールローディングバッファとともに細胞に加えた。特に記載がなければ、化合物は、アッセイプレートの11の列にまたがって1/3希釈して、8の繰り返しとして試験した。
高スループットスクリーニングの目的のためには、反応は、活性化合物と不活性化合物との間の違いを確信をもって語るために十分に信頼できるものでなければならない。これは、同一の刺激条件の下で得た反応の分布を調べ、もともとのチャネルを完全にブロックされたチャネルと比較することによって、定量化できる。実験上の不確定性と装置内の雑音のために、反応にいくらかの乱れが存在するであろう。我々はこの乱れを統計的に定量化し、偽陽性または偽陰性として反応を誤って識別する確率を予測するために、それを使用したいものである。
多数のチャネルを発現する細胞の電気刺激の可能性は、HL5細胞系統の培養を用いて示された。それらの細胞は、心筋細胞を不死化することにより発生された(Claycomb et al.,1998,PNAS 95:2979-84)。それらは電圧で活性化されるいくつかのナトリウム、カルシウムチャネルおよびカリウムチャネルと、強い内向きレクチファイヤカリウム電流と、カリウムおよび塩化物漏れ電流を含む。細胞は96ウェル微少滴定プレート内で成長させられ、コンフルエンスでアッセイされた。それらは、付録A1におけるプロトコルにしたがって染色された。電気刺激中に、上記のようにVIPRTMを用いて比率測定法蛍光測定を行い、データを付録A2における手順にしたがって解析した。刺激パラメータを:パルス持続時間が5ms/相である二相方形波刺激カーネルで、10Hzの3秒長さのバースト、であるように随意に選択した。刺激は、しきい値電界を決定するために、変化する電界で行った。2行のウェルが心臓ナトリウムチャネルを部分的にブロックするために10μMのTTXを含んでおり、2行が電圧依存カリウムチャネルをブロックするために、10mMのTEAを含んでいた。図27は、各ウェルの正規化された反応を示す。一般に、電界の強さが増大するにつれて、細胞の反応は大きくなる。最後の3つの列は、電圧が上昇するにつれた電気的透過化の符号を示す。列6、7、8では、比は実際には出発比よりも下にはね返り(リバウンドし)、後過分極(電圧依存カリウムチャネルのゆっくりとした閉鎖によりひき起こされる現象)を示唆する。
表面に装着されている電極は、クロム(付着層として)および金(導電層として)によって被覆されたガラスカバーリップ上に用意された。金属を被覆されたカバーリップは、Thin Film Devices,Inc.社(カリフォルニア州アナハイム(Anaheim CA))により特注で製作された。カバーリップは、1インチ(25.4mm)四方で、厚さ0.17mmのCorning(コーニング)7059ガラス製であった。金属付着は、真空スパッタリング付着により行なわれた。クロム層の厚さは約1000オングストロームで、付着層として機能した。金層の厚さは約5000オングストロームで、導電層として機能した。付着された金属の抵抗率は、0.1Ω/平方より小さかった。耐薬品性ポリマー(S1400−27,Shipley Co.,Marlborough MA)によって金属の表面を手作業で覆い、その後で、金エッチング剤TFAで金属層を5分間エッチングし、それに続いてクロムエッチング剤TFD(Transene Co.,マサチューセッツ州ダンバース(Danvers MA))で5分間エッチングすることにより、金属に4mmの間隙(ギャップ)をエッチングで形成した。カバーリップは、96ウェルプレートの底にシリコーンエラストマー(Sylgard184 (Corning)、70℃で90分間硬化した)で取付けられた。30分間の365nmのUV放射で滅菌し、細胞付着分子ポリ−D−リシンを付着した後で(分子量300,000、Dulbeccoのリン酸塩で緩衝された食塩水中で1mg/mLで30分間浸し、その後で蒸留水で3回リンスした)、生きている細胞を電極表面上で成長および培養することに成功した。
ラット好塩基球性白血病(RBL)細胞は、カリウム内向きレクチファイヤチャネルIRK1を内生的に発現する(Wischmeyer et al.,Pfluger Arch.,429:809-819,1995)。このチャネルは、カリウムイオンを選択的に導き、高い非線形コンダクタンス特性を持つ。コンダクタンスはカリウムの反転電位VK以下ではほぼ直線形であり、VKよりおよそ10mV正で始まってゼロ近くまで降下する。多数の内向きレクチファイヤチャネルを発現している細胞は、VKの数ミリボルト以内である休止トランスメンブレンポテンシャルを有する傾向にある。
A.1 電圧FRET染料の染色プロトコル:
アッセイ緩衝液(バッファ)#1:
140mM MaCl
4.5mM KCl
2mM CaCl2
1mM MgCl2
10mM HEPES
10mMグルコース pH7.40,330mOs/kg
プルロニック(pluronic)ストック(1000倍)
乾燥DMSO中の100mg/mL pluronic 127
オキソノール(oxonol)ストック(3333倍)
乾燥DMSO中の10mM DiSBAC2(3)
クマリン(coumarin)ストック(1000倍)
乾燥DMSO中の10mM CC2−DMPE
ESS−CY4ストック(400倍)
水中の200mM ESS−CY4
i) 等体積(10μL)のクマリンストックとプルロニックストックとを試験管内で混合する。
ii) 試験管内を緩やかにかきまぜながら、10mLのアッセイバッファ#1を試験管に加える。
ローディング濃度:10μMのCC2−DMPEおよび0.1μg/mlのプルロニック。
i) 等体積(3.3μL)のオキソノールストックとプルロニックストックとを試験管内で混合する。
ii) 試験管内を緩やかにかきまぜながら、10mLのアッセイバッファ#1を試験管に加える。
iii) かきまぜながら25μLのESS−CY4を加える。
ローディング濃度:3μMのDiSBAC2(3),0.2μg/mlのプルロニックおよび0.5mMのESS−CY4。
iv) 要求があれば、この時に試験化合物にローディングバッファを加える。
データは、460nmと580nmチャネルで測定された強度の正規化された比として、解析および報告された。それらの比を計算する過程は、以下のようにして行われた。全てのプレートにおいて、列12は、細胞プレートで用いられている濃度と同じDiSBAC2(3)およびESS−CY4濃度のアッセイバッファ#1を含んでいたが、列12には細胞は含まれていなかった。各波長における強度値は、最初の(刺激前)ウィンドウと最後の(刺激後)ウィンドウで平均された。それらの平均値は、全てのアッセイウェルにおいて、同じ時間期間にわたって平均された強度値から差し引かれた。最初のウィンドウの標本(Ri)と最後のウィンドウの標本(Rf)とから得られる比は、
反応に対するスクリーニングウィンドウWは、次のようにして定義される。同一の刺激条件における多数のウェルからのデータが求められる。対照ウェルは、薬理学的に遮断されているものか、またはフル電界で刺激された、トランスフェクトされていない細胞である。あるいは、刺激されていないトランスフェクトされた細胞を使用するかもしれない。
Claims (17)
- 候補化合物の生物学的活動度を測定する方法であって、
1または複数の細胞を前記化合物に曝すことと、
前記1または複数の細胞のトランスメンブレンポテンシャルにおいて制御された変化がもたらされるように、細胞外電極を用いて、複数の二相電界のパルスを繰り返し加えることと、
前記1または複数の細胞のトランスメンブレンポテンシャルの変化を光学的にモニタすることと、
を有し、
細胞膜の抵抗と容量との積をトランスメンブレン時定数として、前記パルスは、10V/cmから100V/cmまでの範囲内の最大振幅を有し、前記パルスは、前記1または複数の細胞のトランスメンブレン時定数の逆数より大きいかそれに等しい刺激周波数で繰り返され、各パルスの総持続時間は100マイクロ秒から20ミリ秒までの範囲内にある、方法。 - 前記モニタすることは、前記1または複数の細胞を含んでいる観察領域からの蛍光放出を検出することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記電界は二相的である、請求項1に記載の方法。
- 不可逆的な細胞のエレクトロポレーション(electroporation)を最小にするように、電界の強さの空間的変動を制限することをさらに備える、請求項3に記載の方法。
- 1または複数の電界は、対象とするイオンチャネルを異なる電圧依存状態の間で循環させる、請求項1に記載の方法。
- 前記1または複数の電界は、対象とするイオンチャネルを開かせる請求項5に記載の方法。
- 前記1または複数の電界は、対象とするイオンチャネルを非活動状態から解き放つ、請求項5に記載の方法。
- 前記1または複数の細胞は、FRETをベースとする電圧センサ、エレクトロクロミックトランスメンブレンポテンシャル染料、トランスメンブレンポテンシャル再分配染料、イオン感応性蛍光またはルミネッセント分子、および放射性イオンからなる群から選択された電圧センサを備えている、請求項1に記載の方法。
- 前記1または複数の細胞は、電圧が規制されたイオンチャネルを備えている請求項1に記載の方法。
- 前記電圧が規制されたイオンチャネルは、カリウムチャネル、カルシウムチャネル、塩化物チャネル及びナトリウムチャネルよりなる群から選択される、請求項9に記載の方法。
- 前記電界は、前記観察領域内で、強度において、その領域内の平均強さの25%より小さい空間的変動を示す請求項1に記載の方法。
- 前記1または複数の電界は、観察領域にわたって、任意の一時刻における平均電界からその15%以下だけしか変動しない、請求項11に記載の方法。
- 前記1または複数の電界は、観察領域にわたって、任意の一時刻における平均電界からその5%以下だけしか変動しない、請求項12に記載の方法。
- 前記1または複数の電界は、方形波形、正弦波形または鋸歯状波形のいずれかによる刺激を備えている、請求項1に記載の方法。
- 前記1または複数の電界は、20V/cmから80V/cmまでの範囲内の振幅を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記1または複数の電界は、0から1kHzまでの範囲内の刺激周波数で繰り返される、請求項1に記載の方法。
- 前記トランスメンブレンポテンシャルは、前記1または複数の細胞の原形質膜の両側の間で発生する、請求項1に記載の方法。
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