DE60123797T2 - Ionenkanal-testverfahren - Google Patents

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Description

  • Querverweis auf verwandte Anmeldungen
  • Diese Anmeldung beansprucht die Priorität aus den vorläufigen US-Anmeldungen mit den Anmeldenummern 60/217,671 mit dem Titel INSTRUMENTATION AND METHODS FOR ELECTRICAL STIMULATION, eingereicht am 10. Juli 2000 durch Maher et al.; 60/217,666 mit dem Titel INSTRUMENTATION AND METHODS FOR ELECTRICAL STIMULATION, eingereicht am 10. Juli 2000 durch Mendlein; 60/217,221 mit dem Titel INSTRUMENTATION AND METHODS FOR ELECTRICAL STIMULATION, eingereicht am 10. Juli 2000 durch Maher et al., 60/217,219 mit dem Titel INSTRUMENTATION AND METHODS FOR ELECTRICAL STIMULATION, eingereicht am 10. Juli 2000 durch Maher et al.; und den US-Anmeldungen mit den Anmeldenummern 09/804,457 mit dem Titel ION CHANNEL ASSAY METHODS, eingereicht am 12. März 2001 durch Maher et al.; 09/804,480 mit dem Titel ION CHANNEL ASSAY METHODS und eingereicht am 12. März 2001 durch Maher et al.; 09/804,580 mit dem Titel HIGH THROUGHPUT METHOD AND SYSTEM FOR SCREENING CANDIDATE COMPOUNDS FOR ACTIVITY AGAINST TARGET ION CHANNELS, eingereicht am 12. März 2001 durch Maher et al.; und 09/804,458 mit dem Titel MULTIWELL PLATE AND ELECTRODE ASSEMBLIES FOR ION CHANNEL ASSAYS, eingereicht am 12. März 2001.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich im Allgemeinen auf die Instrumentierung und Verfahren zur Manipulation von Membranpotentialen lebender Zellen durch Elektrostimulation.
  • Beschreibung des verwandten Stand der Technik
  • Es ist seit langem bekannt, dass das Innere von Tier- und Pflanzenzellen bezüglich des Äußeren elektrisch negativ ist. Die Größenordnung dieser Potentialdifferenz liegt im Allgemeinen zwischen 5 und 90 mV, wobei der größte Teil des Potentials über die Zellmembran entwickelt wird. Das Transmembranpotential einer bestimmten Zelle wird bestimmt durch das Gleichgewicht der Aktivitäten von Ionentransportmechanismen, die den elektrochemischen Gradienten erzeugen und aufrechterhalten und die Aktivitäten von Ionenkanälen, durch passive Diffusion und andere Faktoren, die ermöglichen, dass Ionen durch die Plasmamembran strömen.
  • Ionenkanäle sind am Ablauf und der Regulierung von so verschiedenen zellulären Prozessen wie der Generierung und Zeitsteuerung von Aktionspotentialen, der Erzeugung von Energie, der synaptischen Übertragung, der Sekretion von Hormonen und der Kontraktion von Muskeln, etc beteiligt. Viele Medikamente erzielen ihre spezifische Wirkung über eine Modulation von Ionenkanälen. Beispiele hierfür beinhalten antiepileptische Präparate wie Phenytoin und Lamotrigin, die spannungsabhängige Natriumkanäle im Gehirn blockieren, blutdrucksenkende Medikamente wie Nifedipin und Diltiazem, die spannungsabhängige Calciumkanäle in Zellen der glatten Muskulatur blockieren sowie Substanzen, die die Insulinausschüttung stimulieren, wie Glibenclamid und Tolbutamid, die ATP-regulierte Kaliumkanäle im Pankreas blockieren.
  • Das Finden neuer Medikamente, die spezifische regulierende Wirkungen auf Ionenkanäle haben, erfordert Verfahren zur Messung und Manipulation des Membranpotentials von Zellen, bei denen die Ionenkanäle in der Membran vorhanden sind. Es gibt heutzutage eine Reihe von Verfahren, die verwendet werden können, um Transmembranpotentiale von Zellen zu messen und um die Aktivitäten spezifischer Ionenkanäle zu messen. Das bekannteste Verfahren ist wahrscheinlich das Patch-Clamp-Verfahren, das ursprünglich von Neher, Sakmann und Steinback entwickelt wurde. (The Extracellular Patch Clamp, A Method for Resolving Currents Through Individual Open Channels in Biological Membranes, Pfluegers Arch. 375; 219-278, 1978). Weitere Verfahren beinhalten die optische Aufzeichnung von spannungssensitiven Farbstoffen (Cohen et al., Annual Reviews of Neuroscience 1: 171-82, 1978) und die extrazelluläre Aufzeichnung von Kurzzeitvorgängen unter Verwendung von Metall-Elektroden (Thomas et al., Exp. Cell Res. 74: 61-66, 1972) oder Feldeffekttransistoren-(FET)-Elektroden (Fromherz et al., Science 252: 1290-1293, 1991).
  • Das Patch-Clamp-Verfahren ermöglicht die Messung des Ionenstroms durch Ionenkanalproteine und die Analyse der Wirkung von Medi kamenten auf die Funktion von Ionenkanälen. In Kürze beschrieben, wird beim Standard-Patch-Clamp-Verfahren eine dünne Glaspipette erhitzt und so lange gezogen, bis sie bricht und sich an der Spitze eine sehr dünne (< 1 μm Durchmesser) Öffnung bildet. Die Pipette wird mit einer Salzlösung gefüllt, die annähernd der intrazellulären Ionen-Zusammensetzung der Zelle entspricht. Eine Metallelektrode wird in das große Ende der Pipette eingeführt und mit der zugehörigen Elektronik verbunden. Die Spitze der Patch-Pipette wird gegen die Oberfläche der Zellmembran gedrückt. Die Spitze der Pipette dichtet an der Zelle ab und isoliert einige Ionenkanalproteine an einer winzigen Stelle (der Patch = Membranfleck) der Membran. Die Aktivität dieser Kanäle kann elektrisch gemessen werden (Einzelkanalaufzeichnung) oder, alternativ, kann der Patch geöffnet werden, was Messungen der kombinierten Kanalaktivität der gesamten Zellmembran (Whole-Cell-Aufzeichnung) ermöglicht.
  • Sowohl während der Einzelkanalaufzeichnung als auch der Whole-Cell-Aufzeichnung, kann die Aktivität der einzelnen Kanal-Subtypen weiter aufgelöst werden, indem ein Voltage-Clamp über die Membran angelegt wird. Durch die Verwendung einer Feedback-Schleife legt der Voltage-Clamp eine benutzerspezifische Potentialdifferenz an der Membran an, was die Messung der Abhängigkeiten zwischen Spannung, Ionen und Zeit verschiedener Ionenkanalströme ermöglicht. Diese Verfahren ermöglichen die Auflösung einzelner Ionenkanal-Subtypen.
  • Eine der größten Einschränkungen des Patch-Clamp-Verfahrens als allgemeines Verfahren des pharmakologischen Screenings ist der niedrige Durchsatz. Typischerweise kann ein einziger, sehr gut ausgebildeter Bediener mit dem Patch-Clamp-Verfahren weniger als zehn Verbindungen pro Tag testen. Darüber hinaus kann das Verfahren nicht einfach automatisiert werden und ergibt komplexe Ergebnisse, die eine ausführliche Analyse durch qualifizierte Elektrophysiologen erforderlich machen. Im Vergleich ergibt die Verwendung Optischer Nachweissysteme einen deutlich höheren Durchsatz für Screening-Anwendungen (derzeit bis zu 100.000 Verbindungen pro Tag), während sie gleichzeitig hochempfindliche Analysen des Transmembranpotentials ermöglicht. Verfahren zur optischen Erfassung des Membranpotentials basieren typischerweise auf Translokation, Redistribution, Richtungsänderungen oder Verschiebungen des Spekt rums fluoreszierender, lumineszierender oder absorbierender Farbstoffe als Reaktion auf das zelluläre Membranpotential (siehe allgemein González, et al., Drug Discovery Today 4:431-439, 1999).
  • Ein bevorzugtes optisches Analyseverfahren wurde bereits beschrieben (González and Tsien, Chemistry and Biology 4: 269-277, 1977; González and Tsien, Biophysical Journal 69: 1272-1280, 1995; und US-Patent Nr. 5,661,035, veröffentlicht am 26. August 1997). Dieser Lösungsansatz umfasst typischerweise zwei Reagenzien, die eine Energieübertragung durchlaufen, um ein ratiometrisches, fluoreszierendes Ergebnis zur Verfügung zu stellen, das vom Membranpotential abhängt. Das ratiometrische Ergebnis bietet für das Medikamenten-Screening große Vorteile, einschließlich einer verbesserten Empfindlichkeit, Verlässlichkeit und einer Verringerung vieler Arten experimenteller Artefakte.
  • Verglichen mit der Verwendung eines Patch Clamp bieten optische Analyseverfahren an sich nicht die Möglichkeit, das Transmembranpotential einer Zelle zu regulieren oder festzulegen. Clamp-Verfahren sind sehr wünschenswert, da sie deutlich verbesserte und flexiblere Verfahren der Ionenkanalmessung bieten. Somit besteht ein Bedarf an verlässlichen und spezifischen Verfahren zur Regulierung des Membranpotentials lebender Zellen die mit optischen Analyseverfahren kompatibel sind und leicht an Analysen mit hohem Durchsatz angepasst werden können.
  • WO 96/41166 A2 und der Artikel von J. González et al. (1999) „Cell-based assays and instrumentation for screening ion-channel targets" in DDT 4 (9), Seiten 431-439, offenbaren ein Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, die die Aktivität eines Ionenkanals moduliert. Es enthält unter anderem folgende Schritte: Eine oder mehrere Zellen der Verbindung auszusetzen; die einen oder mehreren Zellen wiederholtes einem oder mehreren elektrischen Feldern auszusetzen, um eine kontrollierte Änderung des Transmembranpotentials der einen oder mehreren Zellen zu bewirken; und Überwachen, ohne Verwendung eines Patch Clamp, der Änderungen des Transmembranpotentials der einen oder mehreren Zellen. Ein solches Verfahren kann verwendet werden, um die biologische Aktivität von einer oder mehreren der identifizierten Verbindungen zu charakterisieren.
  • Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, den Durchsatz dessen zu erhöhen, was mit solchen Verfahren möglich ist. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zum Testen der biochemischen Aktivität einer Verbindung gegenüber einem Zielionenkanal zur Verfügung zu stellen, sowie ein Verfahren zum Testen der Ionenkanalaktivität in mindestens einer Zelle, und ein Verfahren zum Testen der Ionenkanalaktivität in einem ausgewählten Zielionenkanal.
  • Diese Aufgaben werden mit den Verfahren gemäß den Ansprüchen 1, 14, 19 bzw. 25 erreicht. Es werden gepulste biphasische elektrische Felder, die eine Maximalamplitude von weniger als annähernd 90 V/cm haben, verwendet und mit einer Rate von mindestens etwa 1 pro Sekunde und einer Gesamtdauer von mindestens etwa 1 Millisekunde angelegt. Vorteilhafte Ausführungsformen der Erfindung sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 zeigt eine Ausführungsform eines Tauchelektroden-Arrays.
  • 2 zeigt eine Reihe von Ausführungsformen von Multiwell-Platten, die Oberflächenelektroden enthalten.
  • 3 zeigt ein Blockdiagramm einer Ausführungsform des Elektrostimulationssystems.
  • 4 zeigt die simulierten Wirkungen wiederholter externer elektrischer Felder auf eine Zelle, die einen spannungsabhängigen Natriumkanal exprimiert. Das obere Feld zeigt das angelegte elektrische Feld, das mittlere Feld zeigt den simulierten Natriumstrom in die Zelle und das untere Feld zeigt das simulierte durchschnittliche Transmembranpotential.
  • 5 zeigt eine schematische Darstellung einer Rechteckwelle.
  • 6 zeigt Beispiele verschiedener Wellenkerne.
  • 7 zeigt berechnete elektrische Feldprofile für verschiedene Elektrodenanordnungen in runden Wells mit einem Durchmesser von 6,2 mm. Der in unterbrochener Linie gezeichnete Kreis ist ein Sichtfenster mit einem Durchmesser von 3 mm. In den weißen Bereichen liegt die Stärke des elektrischen Feldes unter 10 % der durchschnittlichen Stärke des elektrischen Feldes im Sichtfenster. In den grauen Bereichen liegt die Stärke des elektrischen Feldes innerhalb 10 % der durchschnittlichen Stärke des elektrischen Feldes im Sichtfenster. In den schwarzen Bereichen ist die Stärke des elektrischen Feldes höher als 10 % der durchschnittlichen Stärke des elektrischen Feldes im Sichtfenster.
  • 8 zeigt berechnete elektrische Feldprofile für verschiedene Elektrodenanordnungen in runden und quadratischen Wells mit einer Querabmessung von 6,2 mm. Der in unterbrochener Linie gezeichnete Kreis ist ein Sichtfenster mit einem Durchmesser von 3 mm. In den weißen Bereichen liegt die Stärke des elektrischen Feldes unter 1 % der durchschnittlichen Stärke des elektrischen Feldes im Sichtfenster. In den grauen Bereichen liegt die Stärke des elektrischen Feldes innerhalb 1 % der durchschnittlichen Stärke des elektrischen Feldes im Sichtfenster. In den schwarzen Bereichen ist die Stärke des elektrischen Feldes höher als 1 % der durchschnittlichen Stärke des elektrischen Feldes im Sichtfenster.
  • 9 zeigt verschiedene Elektroden- und Isolatoren-Anordnungen zur Verbesserung der Einheitlichkeit elektrischer Felder in runden Wells.
  • 10 zeigt die Wirkung elektrischer Stimulationsprotokolle bei variierenden Pulsamplituden im Zeitverlauf der Elektrostimulation bei Wildtyp-CHO-Zellen.
  • 11 zeigt die Beziehung zwischen der maximalen Zellreaktion und der angelegten Pulsamplitude während der Elektrostimulation bei Wildtyp-CHO-Zellen. Die Daten wurden nach etwa 5 Sekunden aus 10 entnommen.
  • 12 zeigt die Dosis-Wirkungs-Kurve für die Wirkung von TTX bei Wildtyp-CHO-Zellen. Die Stimulationsparameter waren 33 V/cm, 50 Hz über drei Sekunden mit einem biphasischen quadratischen Wellenkern (5 ms pro Phase). Die durchgezogene schwarze Linie ist eine Hill-Funktion angepasst an die Daten mit EC50 = 9 nM und einem Hill-Koeffizienten von 1,47.
  • 13 zeigt die Beziehung zwischen Pulsdauer und -frequenz und der Zellreaktion von Wildtyp-CHO-Zellen während der Elektrostimulation. Die Stärke des elektrischen Feldes betrug immer 25 V/cm. Die Stimulation war ein drei Sekunden langer Impulsstoß biphasischer Pulse variierender Dauer und Frequenz. Die durchgezogenen schwarzen Linien sind Anpassungen an die Formel
    Figure 00070001
  • 14 zeigt Zeitspuren für CHO-Zellen, die die NaV2 Natriumkanalzellen exprimieren, die mit verschiedenen Feldstärken elektrisch stimuliert wurden. Die Zellen wurden in einer 96-Well-Platte, mit einer drei Sekunden langen Folge von biphasischen Spannungspulsen mit 20 Hz und 5 ms pro Phase stimuliert. Die Stimulation erfolgte während des schattierten Teils der graphischen Darstellung. Bei diesem Experiment wurden die Zellen mit 20 μM CC2-DMPE und 63 nM DiSBAC6(3) eingefärbt. Diese Farbstoffkombination hat eine Zeitkonstante von 2 ms und verfolgt das Transmembranpotential sehr genau. Die Anstiegs- und Abfallzeiten der Reaktion wurden auf exponentiale Zerfallfunktionen angepasst und waren τAnstieg = 200 und τAbfall = 850 ms.
  • 15 zeigt die Beziehung zwischen der Stärke des elektrischen Feldes und der Zellreaktion gemessen nach 4 Sekunden (Quadrate) und 10 Sekunden (Kreise) Elektrostimulation. Es handelt sich um eine Boltzman-Linie angepasst an die Daten.
  • 16 zeigt die Wirkung der Pulsdauer und Stimulationsfrequenz auf die Zellreaktion von CHO-Zellen, die den NaV2-Natriumkanal exprimieren.
  • 17 zeigt den knee-Zeitparameter T0 aus den Anpassungen an die Daten in 16, aufgetragen über der Stimulationsdauer.
  • 18 zeigt die temporäre Reaktion der HEK-293-Zellen, die den NaV3-Natriumkanal während der Elektrostimulation exprimieren.
  • 19 zeigt Dosis-Wirkungs-Kurven für Tetrodotoxin (19A) und Tetracain (19B) für HEK-293, die den NaV3-Natriumkanal exprimieren. Die Bedingungen der Elektrostimulation waren: E = 33 V/cm, biphasische Stimulation mit 10 ms pro Phase, Impulsstoß von 15 Hz für 1,5 Sekunden.
  • 20 zeigt eine Dosis-Wirkungs-Kurve für Tetracain für HEK-293, die den NaV4-Ionenkanal exprimieren. Bei diesem Experiment waren die Parameter für die Elektrostimulation E = 33 V/cm, biphasische Stimulation mit 10 ms pro Phase, Impulsstoß von 15 Hz für 1,5 Sekunden.
  • 21 zeigt eine Ansicht der gesamten Platte der Elektrostimulation von Wildtyp-HEK-293-Zellen. Jedes einzelne Feld stellt die Zeitspur des normalisierten Fluoreszenzverhältnisses eines einzigen Well in der 96-Well-Platte dar. Jedes Well in einer vertikalen Säule wurde gleichzeitig mit der gleichen Feldstärke stimuliert. Die Feldstärke nimmt von links nach rechts zu. Die Reihen 6-8 enthielten 10 mM TEA, um die spannungsabhängigen Kaliumkanäle zu blockieren.
  • 22 zeigt die Zellreaktion als eine Funktion des Stimulationsfeldes für Wildtyp-HEK. Fehlerbalken sind Standardabweichungen. Leere Symbole: keine Blocker hinzugefügt. Gefüllte Symbole: 10 nM TEA hinzugefügt, um die Kaliumkanäle zu blockieren.
  • 23 zeigt die Zeit-Reaktions-Spuren für ausgewählte Konzentrationen der Natriumkanal-Blocker Tetrodoxin (TTX) (23A) und Tetracain (23B) bei CHO-Zellen, die den NAV2-Natriumkanal exprimieren.
  • 24 zeigt die Dosis-Wirkungs-Kurven für TTX- und Tetracain-Hemmung des NAV2-Natriumkanals.
  • 25 zeigt ein „randomisiertes" TTX-Spiking-Experiment. Jedes kleine Feld in diesem 11 × 8 Array enthält die 10-Sekunden-Zeitspur eines Wells an der entsprechenden Position einer 96-Well-Platte. Die zwölfte Säule war ein Kontroll-Well ohne Zellen, das für die Hintergrund-Subtraktion verwendet wurde und nicht dargestellt ist. Die Wells (1,1), (2,2), (3,3) etc. enthielten eine blockierende Konzentration von TTX.
  • 26 zeigt eine Analyse der „randomisierten" TTX-Spiking-Daten, die in 25 gezeigt werden. Die Datenpunkte entsprechen der ratiometrischen Reaktion im Zeitfenster von 1,8-2,4 Sekunden nach Beginn des Stimulationsimpulsstoßes (d.h. am Höhepunkt der Reaktion). Die gefüllten Kreise wurden mit 1 μM TTX beimpft; den leeren Kreisen wurde kein Blocker hinzugefügt.
  • 27 zeigt eine Ansicht der gesamten Platte von elektrisch stimulierten HL5-Herzmuskelzellen. Jedes einzelne Feld stellt die Zeitspur des normalisierten Fluoreszenzverhältnisses eines einzigen Well in der 96-Well-Platte dar. Jedes Well in einer vertikalen Säule wurde gleichzeitig mit der gleichen Feldstärke stimuliert. Die Feldstärke nimmt von links nach rechts zu. Die Reihen 5 und 6 enthielten 10 μM TTX, um die span nungsabhängigen Natriumkanäle teilweise zu blockieren. Die Reihen 7 und 8 enthielten 10 mM TEA, um die spannungsabhängigen Kaliumkanäle teilweise zu blockieren.
  • 28 zeigt die Reaktion der HL5-Zellen als eine Funktion der Stärke des angelegten elektrischen Feldes. Die schwarzen Punkte stellen den Durchschnitt der Reaktion von vier Wells ohne hinzugefügte Verbindungen dar. Die durchgezogene schwarze Linie ist eine Boltzman-Linie angepasst an die Daten mit E50 = 22 V/cm. Die Punkte stellen das Screening-Fenster dar: der Unterschied zwischen der Reaktion und der nicht stimulierten Reaktion angepasst an die Standardabweichung der Reaktion (siehe Anhang A3).
  • 29 zeigt die typische Spannungsreaktion bei CHO-Zellen, die einen Kaliumkanal und den NaV3-Natriumkanal exprimieren, nach drei einzelnen Stimulationszyklen unter Verwendung von Oberflächenelektroden.
  • 30 zeigt die durchschnittliche ratiometrische Reaktion einer Zellpopulation, die in einer 96-Well-Platte gezüchtet und mit monophasischen Stimuli von variierender Feldstärke über Oberflächenelektroden stimuliert wurde. Die Punkte in dieser Kurve stellen die durchschnittliche Höhepunkt-Reaktion von 4 Stimulation der gleichen Kultur dar.
  • 31 zeigt die Zellreaktion als eine Funktion des Stimulationsfeldes für Wildtyp-RBL. Fehlerbalken sind Standardabweichungen. Leere Symbole: keine Blocker hinzugefügt. Gefüllte Symbole: 400 μN TEA hinzugefügt, um IRK1-Kanäle zu blockieren.
  • Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform
  • Im Allgemeinen sind die hier verwendete Nomenklatur und viele der nachfolgend beschriebenen Fluoreszenz-, Computer-, Nachweis-, Chemie- und Laborverfahren in diesem Fachbereich bekannt und werden allgemein angewendet. Für chemische Synthese, Fluoreszenz, Optik, Molekularbiologie, Computersoftware und Integration werden gewöhnlich Standardverfahren verwendet. Im Allgemeinen werden chemische Reaktionen, Zellassays und enzymatische Reaktionen, wenn angemessen, entsprechend den Spezifikationen des Herstellers durchgeführt. Die Techniken und Verfahren werden im Allgemeinen gemäß üblichen Verfahren des Fachgebiets und verschiedenen allgemeinen Referenzen, einschließlich der unten angeführten, durchgeführt.
    • Lakowicz, J.R. Topics in Fluorescence Spectroscopy, (3 Bände) New York: Plenum Press (1991), und Lakowicz, J.R. Emerging applications of fluorescence spectroscopy to cellular imaging: lifetime imaging, metalligand probes, multi-photon excitation and light quenching.
    • Scanning Microsc Suppl Vol. 10 (1996), Seiten 213-14 über Fluoreszenz-Verfahren. Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., über Verfahren der Molekularbiologie.
    • Cells: A Laboratory Manual, 1st edition (1998) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., über Verfahren der Zellbiologie.
    • Optics Guide 5 Melles Griot® Irvine CA, Optical Waveguide Theory, Snyder & Love herausgegeben von Chapman & Hall über allgemeine optische Verfahren.
    • Hille, B. Ionic Channels of Excitable membranes, Second Edition (1992) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, Mass. über allgemeine elektrophysiologische Verfahren und Eigenschaften von Ionenkanälen.
    • Norowitz and Hill, The Art of Electronics, Second Edition (1989), Cambridge University Press, Cambridge, U.K., über elektronische Schaltkreise.
  • Die folgenden Definitionen werden dargelegt, um die Bedeutung und Reichweite der verschiedenen Begriffe, die hier verwendet werden, um die Erfindung zu beschreiben, darzustellen und zu definieren.
  • Der Begriff „Aktivierung" bezieht sich auf den Übergang von einem Ruhezustand (nicht leitenden) Zustand eines Ionenkanals in einen aktiven (leitenden) Zustand.
  • Der Begriff „Aktivierungsschwelle" bezieht sich auf das niedrigste Potential, über dem eine messbare Öffnung des Kanals erfolgt.
  • Der Begriff „Anode" bezieht sich auf eine Elektrode, die durch eine externe Quelle auf ein positives Potential gegenüber Masse gebracht wird.
  • Der Begriff „Zellstimulationsbereich" bezeichnet den Bereich, der durch zwei Elektroden definiert wird, der signifikante Elektrostimulation (typischerweise 5 V/cm oder darüber) erfährt, in dem sich die Zellen von Interesse befinden. Typischerweise ist der Zellstimulationsbereich größer als oder gleich dem Beobachtungsbereich. Bei Messungen, die auf Standard-96-Well-Platten basieren, ist der Zellstimulationsbereich typischerweise etwa 16 mm2.
  • Der Begriff „Beobachtungsbereich" bezeichnet den Teil des Systems, über dem eine Messung durchgeführt wird. Der Beobachtungsbereich ist bei Messungen, die auf Multiwell-Platten basieren, typischerweise ein Bereich von mindestens 0,5 mm2.
  • Der Begriff „biolumineszierendes Protein" bezieht sich auf ein Protein mit der Fähigkeit, die Emission von Licht durch die Katalyse einer chemischen Reaktion zu bewirken. Der Begriff beinhaltet Proteine, die biolumineszierende oder chemolumineszierende Reaktionen katalysieren, wie z.B. die Proteine, die die Oxidation von Luziferinen bewirken. Der Begriff „biolumineszierendes Protein" beinhaltet nicht nur biolumineszierende Proteine, die natürlich vorkommen, sondern auch Mutanten, die veränderte spektrale oder physikalische Eigenschaften aufweisen.
  • Der Begriff „biphasisch" bezieht sich auf einen Puls mit zwei Teilen, wovon jeder eine gegensätzliche Polarität aufweist.
  • Der Begriff „Boltzman-Funktion" bezieht sich auf die sigmoidale (d.h. stufenähnliche) Reaktionsfunktion
    Figure 00110001
    worin: y die unabhängige Variable ist
    y0 ein einstellbarer Parameter gleich dem Grenzwert der Funktion wie x → ∞ ist
    A ein veränderbarer Parameter gleich der Stufengröße ist
    x50 ein veränderbarer Parameter ist, der mit dem Mittelpunkt der Stufe zusammenhängt
    Δx ein einstellbarer Parameter ist, der die Breite der Stufe beschreibt.
  • Der Begriff „Kathode" bezieht sich auf eine Elektrode, die durch eine externe Quelle auf ein negatives Potential gegenüber Masse gebracht wird.
  • Der Begriff „Depolarisieren" bedeutet, dass bewirkt wird, dass das Transmembranpotential einer Zelle sich dem Wert Null nähert. Im Fall der Zellen, die normalerweise negative Ruhepotentiale aufweisen, bedeutet dieser Begriff, dass sich das Transmembranpotential in eine positive Richtung ändert.
  • Der Begriff „effektive Konzentration (50 %)" oder „EC50" bezieht sich auf die Konzentration, bei der eine pharmakologische Verbindung die halbe Wirksamkeit, verglichen mit der maximalen Wirksamkeit bei hohen Konzentrationen der Verbindung, aufweist.
  • Der Begriff „elektrisch erregbar" bezieht sich auf eine Zelle oder ein Gewebe, die/das auf eine elektrische Stimulation über der Schwelle reagiert, indem sie/es ein Aktionspotential generiert. Elektrisch erregbare Zellen enthalten mindestens eine spannungsabhängige Art von Ionenkanal, der einen Strom nach innen generiert und mindestens eine Art von Ionenkanal, der einen Strom nach außen generiert.
  • Der Begriff „Elektrostimulation" bezeichnet die Initiierung einer Spannungsänderung bei Zellen unter Verwendung eines extrazellulären Strompulses.
  • Der Begriff „Elektrode" bezeichnet eine steuerbare leitende Schnittstelle zwischen einem Instrument und einem Testsystem.
  • Der Begriff „Elektropermeabilisierung" bezieht sich auf leichte Elektroporation, bei der die hydratisierten Poren, die durch die Membran gebildet werden, nur groß genug sind, um Wassermoleküle und kleine Ionen aus einem Atom passieren zu lassen.
  • Der Begriff „Elektroporation" bezieht sich auf ein Phänomen, bei dem die Applizierung eines großen elektrischen Potentials über die Membran einer Zelle zu einem dielektrischen Durchschlagen der Membran und der Bildung hydratisierter Pfade durch die Membran führt.
  • Der Begriff „fluoreszierende Komponente" bezieht sich auf eine Komponente, die in der Lage ist, Licht zu absorbieren und dann wenigstens einen Teil dieser Energie über eine Zeit als Licht wieder abzugeben. Der Begriff beinhaltet einzelne Verbindungen, Moleküle, natürlich fluores zierende Proteine und makromolekulare Komplexe oder Zusammensetzungen aus fluoreszierenden und nicht fluoreszierenden Verbindungen oder Molekülen. Der Begriff „fluoreszierende Komponente" beinhaltet auch Komponenten, die einen lang anhaltenden Fluoreszenz-Abfall aufweisen, wie zum Beispiel Lanthanid-Ionen und Lanthanidkomplexe mit organischen Liganden-Sensibilisatoren, die Licht absorbieren und die Energie dann über Millisekunden wieder abgeben.
  • Der Begriff „FRET" (FRET = fluorescence resonance energy transfer) bezieht sich auf die Fluoreszenz-Resonanz-Energieübertragung. Für die Zwecke dieser Erfindung beinhaltet FRET Energieübertragungsprozesse, die zwischen zwei fluoreszierenden Komponenten stattfinden, einer fluoreszierenden Komponente und einer nicht fluoreszierenden Komponente, einer lumineszierenden und einer fluoreszierenden Komponente und einer lumineszierenden Komponente mit einer nicht fluoreszierenden Komponente.
  • Der Begriff „Gen-Knockout", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf eine gezielte Zerstörung eines Gens in vivo mit vollständigem Funktionsverlust, der durch ein beliebiges, dem Fachmann bekanntes transgenes Verfahren erreicht wurde. In einer Ausführungsform sind transgene Tiere mit Gen-Knockouts solche, bei denen das Zielgen funktionslos gemacht wird, indem eine auf das Gen gerichtete Einbringung durch homologe Rekombination funktionslos gemacht werden soll.
  • Der Begriff „Hill-Funktion" bezieht sich auf die sigmoidale (d.h. stufenähnliche) Reaktionsfunktion
    Figure 00130001
    worin: y die unabhängige Variable ist
    y0 ein einstellbarer Parameter gleich dem Grenzwert der Funktion wie x → ∞ ist
    A ein einstellbarer Parameter gleich der Stufengröße ist
    x50 ein einstellbarer Parameter ist, der mit dem Mittelpunkt der Stufe zusammenhängt
    Δx ein einstellbarer Parameter ist, der die Steilheit der Stufe beschreibt.
  • Der Begriff „Hill-Koeffizient" bezieht sich auf den Parameter n in der Hill-Funktion.
  • Der Begriff „Treffer" bezieht sich auf eine Testverbindung, die die gewünschten Eigenschaften in einem Assay zeigt.
  • Der Begriff „homolog" bezieht sich auf zwei Sequenzen oder Teile davon, die zu mehr als oder zu 75 % identisch sind, wenn sie optimal unter Verwendung des Programms „ALIGN" ausgerichtet werden. Die Homologie oder Sequenzidentität bezieht sich auf folgende Punkte. Zwei Aminosäuresequenzen sind homolog, wenn ihre Sequenzen teilweise oder vollständig identisch sind. Eine Homologie von 85 % bedeutet zum Beispiel, dass 85 % der Aminosäuren identisch sind, wenn die beiden Sequenzen für maximales Matching ausgerichtet werden. Lücken bzw. Gaps (in jeder der beiden Sequenzen, die gematcht werden) sind beim Maximierungs-Matching erlaubt, Gap-Längen von 5 oder weniger werden bevorzugt, wobei 2 oder weniger noch bevorzugter sind. Alternativ und vorzugsweise sind zwei Proteinsequenzen (oder Polypeptidsequenzen, die aus diesen gewonnen wurden, mit einer Länge von mindestens 30 Aminosäuren) dann homolog, wie dieser Begriff hier verwendet wird, wenn sie einen Alinierungswert von über 5 (in Standardabweichungs-Einheiten) aufweisen, unter Verwendung des Programms ALIGN mit der Mutationsdatenmatrix und einer Gap-Penalty von 6 oder höher. Siehe Dayhoff, M.O., in Atlas of Protein Sequence and Structure, 1972, Band 5, National Biomedical Research Foundation, S. 101-110, und Ergänzung 2 zu diesem Band, S. 1-10.
  • Der Begriff „hyperpolarisieren" bedeutet, dass bewirkt wird, dass das Transmembranpotential einer Zelle sich vom Wert Null weiter entfernt. Im Fall von Zellen, die normalerweise negative Ruhepotentiale aufweisen, bedeutet dieser Begriff, dass sich das Transmembranpotential in eine negative Richtung ändert.
  • Der Begriff „Inaktivierung" bedeutet, dass ein Ionenkanal sich in den inaktivierten Zustand begibt.
  • Der Begriff „inaktiviert" bezieht sich auf einen spannungsabhängigen Ionenkanal in einem bestimmten nicht leitenden konformativen Zustand. Übergänge in den und aus dem inaktivierten Zustand sind im All gemeinen langsam, verglichen mit Übergängen zwischen anderen konformativen Zuständen. Der inaktivierte Zustand ist normalerweise der bevorzugte Zustand bei erhöhten Transmembranpotentialen. Bei niedrigen Transmembranpotentialen ist der inaktivierte Zustand instabil und begibt sich in den Ruhezustand.
  • Der Begriff „Kern" bezeichnet eine mathematische Funktion mit dem Ziel, mit einer oder mehreren anderen zeitvariablen Funktionen verknüpft zu werden. Theoretisch kann der Kern jede Funktion sein, die zu Null tendiert, wenn die unabhängige Variable zu ±∞ tendiert. In der Praxis kann der Kern jede Wellenform sein, die in einem Generator anwenderdefinierter Wellenformen programmiert werden kann oder die durch einen computergesteuerten Digital-Analog-Wandler generiert werden kann.
  • Der Begriff „lumineszierende Komponente" bezieht sich auf eine Komponente, die in der Lage ist, Energie, z.B. elektrische Energie (z.B. Elektrolumineszenz), chemische Energie (z.B. Chemolumineszenz) oder akustische Energie zu absorbieren und dann wenigstens einen Teil dieser Energie mit der Zeit als Licht wieder abzugeben. Der Begriff „Komponente" beinhaltet einzelne Verbindungen, Moleküle, biolumineszierende Proteine und makromolekulare Komplexe oder Zusammensetzungen aus lumineszierenden und nicht lumineszierenden Verbindungen oder Molekülen, die so wirken, dass sie die Emission von Licht bewirken.
  • Der Begriff „Transmembranpotential-Modulator" bezieht sich auf Komponenten, die in der Lage sind, das Ruhepotential oder das stimulierte Transmembranpotential eines zellulären oder subzellulären Kompartiments zu verändern. Der Begriff beinhaltet einzelne Verbindungen, Ionenkanäle, Rezeptoren, porenbildende Proteine sowie alle Kombinationen dieser Komponenten.
  • Der Begriff „Membranzeitkonstante oder τM bezeichnet das Produkt des Membranwiderstands (RM) und der Membrankapazität (CM).
  • Der Begriff „monophasisch" bezieht sich auf einen Puls, dessen Polarität sich nicht zur gegensätzlichen Polarität ändert.
  • Der Begriff „natürlich fluoreszierendes Protein" bezieht sich auf ein Protein, das in der Lage ist, ein stark fluoreszierendes, spezifisches Chromophor zu bilden, entweder durch Zyklisierung und Oxidation interner Aminosäuren innerhalb des Proteins oder über das enzymatische Hin zufügen eines fluoreszierenden Kofaktors. Der Begriff beinhaltet Wildtyp fluoreszierende Proteine und gentechnisch manipulierte Mutanten, die veränderte spektrale oder physikalische Eigenschaften aufweisen. Der Begriff beinhaltet nicht Proteine, die nur durch den Fluoreszenzbeitrag nicht modifizierter Tyrosin-, Tryptophan-, Histidin- und Phenylalaningruppen innerhalb des Proteins eine schwache Fluoreszenz aufweisen.
  • Der Begriff „natürlich vorkommend" bezieht sich auf eine Komponente, die von Zellen in Abwesenheit von künstlichen genetischen oder anderen Modifikationen dieser Zellen produziert wird.
  • Der Begriff „Multiwell-Platte" bezieht sich auf einen zweidimensionalen Array adressierbarer Wells, die sich auf einer im Wesentlichen flachen Oberfläche befinden. Multiwell-Platten können jede Anzahl einzelner, adressierbarer Wells enthalten und können adressierbare Wells jeder Breite oder Tiefe enthalten. Gängige Beispiele für Multiwell-Platten enthalten 96-Well-Platten, 384-Well-Platten und 3456-Well-NanoplattenTM.
  • Der Begriff „funktionsmäßig verbunden" bezieht sich auf eine Anordnung nebeneinander, wobei die so beschriebenen Komponenten in einer Beziehung stehen, die erlaubt, dass sie in der geplanten Weise funktionieren. Eine Kontrollsequenz, die mit einer kodierenden Sequenz funktionsmäßig verbunden ist, ist so verknüpft, dass die Expression der kodierenden Sequenz unter Bedingungen erfolgt, die mit denen der Kontrollsequenz kompatibel sind.
  • Der Begriff „polarisierte Zelle" bezeichnet eine Zelle mit einer elektrischen Potentialdifferenz an deren Zellmembran.
  • Der Begriff „Gleichrichtung" bedeutet, dass die Leitfähigkeit nicht linear ist, mit einer bevorzugten Richtung.
  • Der Begriff „Aufhebung der Inaktivierung" bezieht sich auf die Umwandlung eines inaktivierten geschlossenen Kanals zu einem geschlossenen Kanal im Ruhezustand, der nun geöffnet werden kann.
  • Der Begriff „wiederholt" bedeutet eine mindestens zweimalige Wiederholung.
  • Der Begriff „repolarisieren" bedeutet, zu bewirken, dass das Transmembranpotential einer Zelle sich dem Ruhepotential nähert.
  • Der Begriff „ruhend" oder „Ruhezustand" bezieht sich auf einen spannungsabhängigen Ionenkanal, der geschlossen ist, aber frei von Inaktivierung.
  • Der Begriff „Ruhepotential" für eine Zelle bezeichnet das Gleichgewichts-Transmembranpotential einer Zelle, wenn sie keinen externen Einflüssen ausgesetzt ist.
  • Der Begriff „Umkehrpotential" für ein bestimmtes Ion bezieht sich auf das Transmembranpotential, dem die Einwärts- und Auswärts-Ströme dieses Ions gleich sind.
  • Der Begriff „im Wesentlichen parallel" bedeutet, dass der Abstand zwischen den Oberflächen von zwei Objekten, die sich einander gegenüber befinden, um weniger als 10 % variiert, vorzugsweise weniger als 5 %, wenn er an jedem Punkt der relevanten Oberfläche jedes Objekts gemessen wird.
  • Der Begriff „zielbar" bezieht sich auf eine Komponente, die in der Lage ist, an einer spezifischen Position unter bestimmten Bedingungen lokalisiert zu werden. Zum Beispiel ist ein Protein, das an zwei oder mehreren Positionen existieren kann, das in der Lage ist, unter einer oder mehreren bestimmten Bedingungen) zu einer bestimmen Position zu tranlozieren, zielbar für diese Position. Gängige Beispiele beinhalten die Translokation der Proteinkinase C zur Plasmamembran bei zellulärer Aktivierung, und das Binden von Proteinen, die SH2-Bereiche enthalten, an phosphorylierte Tyrosinreste. Der Begriff beinhaltet Komponenten, die unter den meisten Bedingungen ständig mit einer spezifischen Position oder einem spezifischen Ort verbunden sind.
  • Der Begriff „Schwellen-Elektroporationspotential" bezieht sich auf die Stärke des extern angelegten Feldes, über der eine nachweisbare Elektroporation einer lebenden Zelle erfolgt.
  • Der Begriff „Testverbindung" bezieht sich auf einen chemischen Stoff, der durch ein oder mehrere Screening-Verfahren der Erfindung als mutmaßlicher Modulator getestet wird. Eine Testverbindung kann jeder chemische Stoff sein, wie z.B. ein anorganischer chemischer Stoff, ein organischer chemischer Stoff, ein Protein, ein Peptid, ein Kohlehydrat, ein Lipid oder eine Kombination aus diesen. Normalerweise werden verschiedene vorab bestimmte Konzentrationen der Testverbindungen für das Screening verwendet, wie z.B. 0,01 Mikromolar, 1 Mikromolar und 10 Mikromolar. Die Kontrollen der Testverbindungen können die Messung eines Signals in Abwesenheit der Testverbindung oder den Vergleich mit einer Verbindung, von der man weiß, dass sie das Ziel verändert, enthalten.
  • Der Begriff „transformiert" bezieht sich auf eine Zelle, in die (oder in einen ihrer Vorläufer) durch ein rekombinantes Nucleinsäureverfahren ein heterologes Nucleinsäuremolekül eingebracht wurde.
  • Der Begriff „transgen" wird verwendet, um einen Organismus zu beschreiben, der exogenes genetisches Material in all seinen Zellen enthält. Der Begriff beinhaltet alle Organismen, deren Genome durch In-Vitro-Manipulation des frühen Embryo oder befruchteten Eis oder durch irgendein transgenes Verfahren verändert wurden, um ein spezifisches Gen-Knockout zu induzieren.
  • Der Begriff „Transgen" bezieht sich auf jedes Stück DNA, das künstlich in eine Zelle eingebracht wird und Teil des Genoms des Organismus wird (d.h. entweder ein stabil integriertes oder als ein stabiles extrachromosomales Element), der sich aus dieser Zelle entwickelt. Ein solches Transgen kann ein Gen enthalten, das zu dem transgenen Organismus teilweise oder vollständig heterolog (d.h. fremd) ist oder kann ein Gen darstellen, das zu einem endogenen Gen des Organismus homolog ist. In diese Definition eingeschlossen ist ein Transgen, das gebildet wird durch das Bereitstellen einer RNA-Sequenz, die in DNA transkribiert wird und dann in das Genom eingebaut wird. Die Transgene der Erfindung beinhalten DNA-Sequenzen, die das fluoreszierende oder biolumineszierende Protein kodieren, das in einem transgenen nicht-menschlichen Tier exprimiert werden kann.
  • Der Begriff „Transistor-Transistor-Logik" oder „TLL" bezieht sich auf ein elektronisches Logiksystem, in dem eine Spannung von etwa +5 V WAHR ist und eine Spannung von etwa 0 V FALSCH ist.
  • Ein „einheitliches elektrisches Feld" bedeutet, dass das elektrische Feld um nicht mehr als 15 % der mittleren Intensität im Beobachtungsbereich zu jeder Zeit variiert.
  • Der Begriff „Spannungssensor" beinhaltet auf FRET basierende Spannungssensoren, elektrochromische Transmembranpotential-Farbstoffe, Transmembranpotential-Umverteilungs-Farbstoffe, extrazelluläre Elektroden, Feldeffekttransistoren, radioaktive Ionen, ion-sensitive fluoreszierende oder lumineszierende Farbstoffe und ion-sensitive fluoreszierende oder lumineszierende Proteine, die in der Lage sind, das Transmembranpotential anzuzeigen.
  • Die folgenden Begriffe werden verwendet, um die Sequenzbeziehungen zwischen zwei oder mehreren Polynucleotiden zu beschreiben: Bezugssequenz, Vergleichsfenster, Sequenzidentität, Prozentsatz der Identität mit einer Sequenz und wesentliche Identität. Eine Bezugssequenz ist eine definierte Sequenz, die als Basis für einen Sequenzvergleich verwendet wird; eine Bezugssequenz kann eine Untergruppe einer größeren Sequenz sein, z.B. ein Segment einer cDNA voller Länge oder Gensequenz oder kann eine vollständige cDNA oder Gensequenz enthalten. Im Allgemeinen ist eine Bezugssequenz mindestens 20 Nucleotide lang, häufig mindestens 25 Nucleotide lang und oft mindestens 50 Nucleotide lang. Da von zwei Polynucleotiden jedes (1) eine Sequenz enthalten kann (d.h. einen Teil der vollständigen Polynucleotidsequenz), die bei beiden Polynucleotiden ähnlich ist und (2) darüber hinaus eine Sequenz enthalten kann, die bei den beiden Polynucleotiden verschieden ist, werden Sequenzvergleiche zwischen zwei (oder mehr) Polynucleotiden typischerweise durchgeführt, indem Sequenzen der beiden Polynucleotide über ein Vergleichsfenster verglichen werden, um örtliche Bereiche der Sequenz-Ähnlichkeit zu identifizieren und zu vergleichen. Ein Vergleichsfenster, wie es hier verwendet wird, bezieht sich auf ein konzeptionelles Segment von mindestens 20 benachbarten Nucleotidpositionen, wobei eine Polynucleotidsequenz mit einer Bezugssequenz von mindestens 20 benachbarten Nucleotiden verglichen werden kann und wobei der Teil der Polynucleotidsequenz im Vergleichsfenster für die optimale Alinierung der beiden Sequenzen Additionen oder Deletionen (d.h. Gaps) von 20 Prozent oder darunter, verglichen mit der Bezugssequenz (die keine Additionen oder Deletionen enthält) enthalten kann. Die optimale Alinierung von Sequenzen zur Alinierung eines Vergleichsfensters kann durch den lokalen Homologie-Algorithmus von Smith und Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482, durch den Homologie-Alinierungs-Algorithmus von Needleman und Wunsch (1970)). Mol. Biol. 48: 443, durch das Verfahren zur Suche nach Ähnlichkeiten von Person und Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85: 2444, durch Computer-Implementierungen dieser Algorithmen (GAP, BESTFIT, FASTA und TFASTA im Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) oder durch Inspektion erfolgen und die beste Alinierung (d.h. die über das Vergleichsfenster den höchsten Homologie-Prozentwert ergibt), die durch die verschiedenen Verfahren erzielt wird, wird ausgewählt. Der Begriff „Sequenzidentität" bedeutet, dass zwei Polynucleotidsequenzen über das Vergleichsfenster identisch sind (d.h. auf der Basis von einem Nucleotid zum nächsten). Der Begriff „Prozentwert, der mit einer Sequenz identisch ist" wird berechnet, indem zwei optimal alinierte Sequenzen über das Vergleichsfenster verglichen werden, wobei die Anzahl der Positionen bestimmt wird, an denen die identische Nucleinsäurebase (z.B. A, T, C, G, U oder I) in beiden Sequenzen vorkommt, um die Zahl der gematchten Positionen zu ergeben. Dann wird die Zahl der gematchten Positionen durch die Gesamtzahl der Positionen im Vergleichsfenster (d.h. die Fenstergröße) geteilt und das Ergebnis mit 100 multipliziert, um den Prozentwert der Sequenzidentität zu erhalten. Der Begriff „wesentliche Identität", wie er hier verwendet wird, bezeichnet eine Eigenschaft einer Polynucleotidsequenz, wobei das Polynucleotid eine Sequenz mit einer Sequenzidentität von mindestens 30 Prozent enthält, vorzugsweise mit einer Sequenzidentität von mindestens 50 bis 60 Prozent, häufiger mit einer Sequenzidentität von mindestens 60 Prozent verglichen mit einer Bezugssequenz über ein Vergleichsfenster von mindestens 20 Nucleotidpositionen, häufiger über ein Fenster von mindestens 25-50 Nucleotiden, wobei der Prozentwert der Sequenzidentität berechnet wird, indem die Bezugssequenz mit der Polynucleotidsequenz verglichen wird, die Deletionen und Additionen enthalten kann, die insgesamt 20 Prozent oder weniger der Bezugssequenz über das Vergleichsfenster betragen.
  • Angewandt auf Polypeptide bedeutet der Begriff „wesentliche Identität" dass zwei Peptidsequenzen, wenn sie optimal aliniert sind, wie durch die Programme GAP oder BESTFIT unter Verwendung der Standard-Gap-Gewichtungen, eine Sequenzidentität von mindestens 30 Prozent haben, vorzugsweise eine Sequenzidentität von mindestens 40 Prozent, noch bevorzugter eine Sequenzidentität von 50 % und am bevorzugtesten eine Sequenzidentität von mindestens 60 Prozent. Vorzugsweise unter scheiden sich Restpositionen, die nicht identisch sind, durch konservative Aminosäure-Substitutionen. Konservative Aminosäuresubstitutionen beziehen sich auf die Austauschbarkeit von Resten, die ähnliche Seitenketten haben. Zum Beispiel besteht eine Gruppe von Aminosäuren mit Aliphat-Seitenketten aus Glyzin, Alanin, Valin, Leukin und Iosleukin; eine Gruppe von Aminosäuren mit Aliphat-Hydroxyl-Seitenketten besteht aus Serin und Threonin, eine Gruppe von Aminosäuren mit Seitenketten, die Amid enthalten, besteht aus Asparagin und Glutamin; eine Gruppe von Aminosäuren mit aromatischen Seitenketten besteht aus Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan; eine Gruppe von Aminosäuren mit basischen Seitenketten besteht aus Lysin, Arginin und Histidin, und eine Gruppe von Aminosäuren mit Seitenketten, die Schwefel enthalten, besteht aus Cystein und Methionin. Bevorzugte konservative Aminosäuresubstitutionsgruppen sind: Valin-Leukin-Isoleukin, Phenylalanin-Tyrosin, Lysin-Arginin, Alanin-Valin, Glutamin-Aspargin und Aspargin-Glutamin.
  • Da die Liste technischer und wissenschaftlicher Begriffe nicht all-umfassend sein kann, sollen alle nicht definierten Begriffen so aufgefasst werden, dass sie die gleiche Bedeutung haben, wie sie allgemein von einem Fachmann auf dem Fachbereich aufgefasst wird, zu dem diese Erfindung gehört. Darüber hinaus schließen die Singular-Formen ein/eine/einer und der/die/das die Pluralformen mit ein, wenn aus dem Kontext nicht eindeutig etwas anderes hervorgeht. Zum Beispiel kann der Bezug zu einem Restriktionsenzym oder einem High-Fidelity-Enzym Mischungen solcher Enzyme und aller anderen Enzyme, die die angegebenen Kriterien erfüllen, enthalten, oder Bezüge zum Verfahren enthalten die Bezüge zu einem oder mehreren Verfahren für das Erlangen von cDNA-Sequenzen, die dem Fachmann bekannt sind oder beim Lesen dieser Spezifikation bekannt werden.
  • I. Einführung
  • Die vorliegende Erfindung erkennt erstmalig, dass die Transmembranpotentiale intakter lebender Zellen, die mindestens einen spannungsregulierten Ionenkanal enthalten, über eine Applizierung wiederholter elektrischer Stimulationspulse auf die Flüssigkeit, in der sich die Zellen befinden, präzise moduliert werden können. Die vorliegende Erfindung beinhaltet die Instrumentierung und Verfahren, die die genaue und zuver lässige Regulierung des Transmembranpotentials intakter lebender Zellen ermöglichen, ohne deren natürliche zelluläre Integrität signifikant zu unterbrechen.
  • Als nicht einschränkende Einführung in die Breite der Erfindung beinhaltet die Erfindung sieben allgemeine und nützliche Aspekte, einschließlich:
    • 1) Instrumentierung einschließlich Elektroden und Elektrodenarrays für die zuverlässige Generierung einheitlicher elektrischer Felder in Kulturen lebender Zellen in wässriger Lösung.
    • 2) Multiwell-Platten, die Oberflächenelektroden für einen hohen Durchsatz und eine miniaturisierte Stimulation und Analyse der Aktivitäten von Ionenkanälen oder Zellen enthalten.
    • 3) Systeme für Analysen der Aktivitäten von Ionenkanälen und Zellen mit hohem Durchsatz und für die Verwendung bei der Entdeckung, der Analyse, dem Screening und der Profilierung von Medikamenten.
    • 4) Verfahren zur Modulierung des Transmembranpotentials einer lebenden Zelle unter Verwendung wiederholter Elektrostimulationen.
    • 5) Verfahren für das Screening der Wirkungen von Testverbindungen auf die Aktivitäten spannungsregulierter und nicht spannungsregulierter Ionenkanäle, Transportmechanismen und Leckströme. Einschließlich der Bestimmung der zustandsabhängigen pharmakologischen Aktivität von Verbindungen gegen Ionenkanal- und Transportproteine.
    • 6) Verfahren zur Profilierung und Auswahl von Zellen oder Klonen basierend auf ihrer Reaktion auf die Elektrostimulation.
    • 7) Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Zell- und Ionenkanalparametern mit hohem Durchsatz, und zur Quantifizierung der pharmakologischen Wirkungen von Verbindungen auf diese Parameter.
    • 8) Verfahren zum Einbringen exogener Verbindungen in die Intrazellulärräume von Zellen.
    • 9) Verfahren zur Regulierung des Transmembranpotentials intrazellulärer Organellen und zum Screening von Testverbindungen gegen Ionenkanäle in diesen Organellen.
    • 10) Verfahren zur Charakterisierung der physiologischen Wirkung des Transmembranpotentials auf die Funktion und Regulierung der phy siologischen und biochemischen Reaktionen, einschließlich Genexpression, Enzymfunktion, Proteinaktivität und Ligandenbindung.
    • 11) Verfahren zum Programmieren oder Trainieren von adaptiven neuronalen Netzwerken oder Biocomputern für spezifische funktionelle oder logische Reaktionen.
    • 12) Verfahren zur Bereitstellung effizienter neuronaler Schnittstellen für prothetische Geräte, die in ein Tier, einschließlich Menschen, implantiert werden.
  • Diese Aspekte der Erfindung und andere hier beschriebene Aspekte, können durch die Verwendung der hier beschriebenen Verfahren und Instrumentierung erreicht werden. Um die Reichweite der Erfindung in vollem Umfang würdigen zu können, wird weiter erkannt werden, dass verschiedene Aspekte der Erfindung kombiniert werden können, um wünschenswerte Ausführungsformen der Erfindung zu ergeben. Solche Kombinationen führen zu besonders nützlichen und stabilen Ausführungsformen der Erfindung.
  • II. Elektroden und Elektrodenarrays
  • In einer Ausführungsform beinhaltet die vorliegende Erfindung Elektroden und Elektrodenarrays zur Erzeugung elektrischer Felder über dem Beobachtungsbereich. Typischerweise wird dies über die Verwendung eines Paars elektrisch leitender Elektroden erreicht. Ein wichtiges Design-Merkmal ist, dass die Elektrodenpaare eindeutig definierte elektrische Felder erzeugen. Bevorzugte Elektrodendesigns beinhalten Elektrodenkonfigurationen, die die Homogenität des elektrischen Feldes, dem die beobachteten Zellen ausgesetzt sind, maximieren.
  • Die Generierung einheitlicher elektrischer Felder über dem Beobachtungsbereich ist aus verschiedenen Gründen für die Elektrostimulation wichtig. Erstens, weil die Zellreaktion empfindlich auf die Stärke des lokalen elektrischen Feldes ist; nicht einheitliche Felder führen typischerweise zu nicht einheitlichen Reaktionen in verschiedenen Bereichen, die zu einer erhöhten Streuung bei den Ergebnissen führen. Zweitens ist die Schwelle für die Elektropermeabilisierung typischerweise nur ein Faktor, der um 2-5 höher ist als die Transmembranpotentiale, die für die elektrisch stimulierte Membran erforderlich sind (siehe Teissie and Rols, 1993, Biophys. J. 65:409-413). Somit ist es, wenn das elektrische Feld zu un einheitlich ist, eventuell nicht möglich, alle Zellen im Beobachtungsbereich zu stimulieren, ohne einige von ihnen auch zu elektropermeabilisieren.
  • Die Feld-Einheitlichkeit über einen festgelegten Bereich kann auf zwei Arten beschrieben werden: (1) die Standardabweichung der Feldstärke geteilt durch die durchschnittliche Feldstärke in dem Bereich und (2) der Unterschied zwischen der höchsten und niedrigsten Feldstärke, angepasst an die durchschnittliche Feldstärke in dem Bereich.
  • a) Elektrodendesign
  • Der einfachste Weg, ein einheitliches elektrisches Feld in einem leitenden Medium zu generieren, ist die Verwendung zweier identischer, flacher Elektroden mit Oberflächen, die im Wesentlichen parallel zueinander angeordnet sind. Im Allgemeinen gilt: je näher sich die Elektroden relativ zu ihrer Breite in der Querrichtung sind, umso größer ist die Einheitlichkeit des Feldes. Typische runde Multiwell-Platten beschränken jedoch die Breite der Elektroden, die in die Wells eingebracht werden können und bringen auch zwei andere Effekte mit sich, die die Einheitlichkeit des Feldes verringern.
  • Die runde Form der Wells stellt eine Herausforderung dabei dar, ein einheitliches, in eine Richtung gerichtetes Feld mit zwei Elektroden zu erzeugen, da die Breite der leitenden Salzlösung zwischen den Elektroden sich ständig verändert. Darüber hinaus führt die hohe Oberflächenspannung von Wasser zu Schwankungen der Tiefe der Salzlösung im Well, wenn Tauchelektroden eingebracht werden. Die gekrümmte Fläche, oder der Meniskus, kann das elektrische Feld über das Volumen des Wells beeinträchtigen. Die Tiefe von 100 μL Salzlösung in einer 96-Well-Platte liegt normalerweise bei etwa 3,0 mm Tiefe im Zentrum und 2,9 mm Tiefe an den Rändern des Wells. Wenn zwei parallele Plattenelektroden aus rostfreiem Stahl eingebracht werden, wird Salzlösung zwischen den Elektroden und den Wänden des Wells nach oben gezogen, was zu Schwankungen der Tiefe im Beobachtungsbereich führt, die nahe legen, dass die Strompfade durch das Volumen der Salzlösung um das Zentrum zirkulieren und zu einem nicht einheitlichen elektrischen Feld führen.
  • In einem Aspekt beinhaltet die vorliegende Erfindung verbesserte Elektrodendesigns und Systeme zur Elektrostimulation, die diese Themen angehen, um im Wesentlichen einheitliche elektrische Felder über dem Beobachtungsbereich zu erzeugen.
  • In einer Ausführungsform (9A) umfasst das Elektrodenpaar zwei im Wesentlichen parallele Elektroden, die einen elektrischen Isolator enthalten, der an dem Elektrodenpaar befestigt ist, um den Stromfluss in einem definierten Bereich einzuschränken, wodurch ein sehr einheitliches elektrisches Feld erzeugt wird.
  • In einer weiteren Ausführungsform (9B) umfasst das Elektrodenpaar zusätzlich Satellitenelektroden, um ein einheitlicheres elektrisches Feld zu erzeugen.
  • In einer weiteren Ausführungsform (9D) wird das Elektrodenpaar in verschiedene Teile unterteilt, die durch dünne, isolierende Abtrennungen voneinander getrennt sind. In diesem Fall kann das Potential, das an jede Elektrode angelegt wird, ausgedrückt als ein Bruchteil des Potentials, das an dem zentralsten Teil angelegt wird, individuell angepasst werden, um die Einheitlichkeit des Feldes im Beobachtungsbereich zu maximieren.
  • In einem weiteren Aspekt beinhaltet die vorliegende Erfindung verbesserte Elektrodendesigns (9C), die durch die Eliminierung oder Reduzierung des Meniskus-Effekts eine verbesserte Einheitlichkeit des Feldes über dem Beobachtungsbereich bieten.
  • In einem weiteren Aspekt können multiple Sensoren für das elektrische Potential in die Oberfläche oder Wände der Wells in einer Multiwell-Platte eingearbeitet werden oder in Arrays an der Tauchelektrodenanordnung angebracht werden. Diese Sensoren können überwacht werden, um manuell oder automatisch die einzelnen Elektroden anzupassen, um die Einheitlichkeit des Feldes zu maximieren. Diese Anordnung ist dahingehend nützlich, zu ermöglichen, dass ein stimulierender Elektrodenarray Schwankungen und Imperfektionen bei der Form der Wells, dem Volumen der Salzlösung, Schwankungen beim Herstellungsprozess der Elektroden sowie Schäden an der Elektrodenanordnung, etc. kompensieren kann.
  • b) Platzierung der Elektroden innerhalb der Wells
  • Für Tauchelektroden ist die ideale Platzierung (hinsichtlich der Erzeugung eines einheitlichen elektrischen Feldes) so, dass die Unterseiten der Elektroden den Boden des Wells berühren. Somit kommt es nicht zu Randfeldern (fringing fields) oder zu einer Nicht-Einheitlichkeit von Feldern, die mit vertikalen Stromwegen zusammenhängen. Bei einer entfernbaren Struktur ist es jedoch nicht wünschenswert, dass sich die Elektroden in Kontakt mit der Oberfläche befinden müssen. Kleine Abweichungen der Plattengeometrie können dazu führen, dass sich einige Elektroden in die Oberfläche drücken, was zu Schäden entweder an der Platte, den Zellen oder den Elektroden führt. Außerdem besteht die Möglichkeit, dass die Elektroden in einigen Wells nicht ganz bis zur Oberfläche reichen. Aus diesen Gründen kann es wünschenswert sein, eine kleine Lücke zwischen der Unterseite der Elektrode und dem Boden des Wells zu entwerfen.
  • Dementsprechend beinhaltet die vorliegende Erfindung in einem Aspekt Multiwell-Platten, in denen der Beobachtungsbereich in der Mitte des Wells im Vergleich zum Umfangsbereich des Wells, wo die Elektroden platziert würden, erhöht ist.
  • Die Randfelder werden zu einer Nicht-Einheitlichkeit über eine Distanz zwischen den Elektroden führen, die ungefähr gleich dem Abstand zwischen der Unterseite der Elektrode und dem Boden des Wells ist. Deshalb sollte dieser Abstand so klein wie es praktisch ist, gehalten werden, vorzugsweise in einem Bereich zwischen 0,1 und 0,5 mm, und der Beobachtungsbereich sollte typischerweise keinen Teil des Wells innerhalb dieser Distanz von den Elektroden enthalten.
  • c) Herstellung von Elektroden
  • Jedes elektrisch leitende Material kann als Elektrode verwendet werden. Bevorzugte Elektrodenmaterialien haben viele der folgenden Eigenschaften: (1) sie korrodieren nicht in Salzlösung, (2) weder produzieren sie toxische Ionen noch setzen sie diese frei, (3) sie sind flexibel und stabil/fest (4) sie sind relativ günstig herzustellen, (5) sie sind nicht porös, und (6) sie können leicht gereinigt werden. Bevorzugte Materialien umfassen Edelmetalle (einschließlich Gold, Platin und Palladium), feuerfeste Metalle (einschließlich Titan, Wolfram, Molybdän und Iridium), korrosionsbeständige Legierungen (einschließlich rostfreier Stahl) und Kohlenstoff oder andere organische Leiter (einschließlich Graphit und Polypyrrol). Für viele Ausführungsformen stellt rostfreier Stahl ein bevorzugtes Elektrodenmaterial dar. Dieses Material ist kostengünstig, leicht zu bearbeiten und in Salzlösung sehr reaktionsträge. Rostfreier Stahl oxi diert langsam zu Eisenoxid, wenn er Strom in die Salzlösung leitet, dies scheint die Leistung des Systems jedoch nicht zu beeinflussen. Eisenoxid hat eine sehr geringe Löslichkeit in Wasser und es scheinen keine toxischen Mengen von Eisen freigesetzt zu werden. Darüber hinaus können alle Eisenoxidablagerungen leicht entfernt werden, indem die Elektroden zwei Stunden lang in Wasser mit 10% Salpetersäure gelegt und dann sorgfältig mit destilliertem Wasser gespült werden.
  • Massive Kupfer- und Silberelektroden können für manche Anwendungen verwendet werden, werden für Routineanwendungen jedoch weniger bevorzugt, da sie in Salzlösung schnell korrodieren. Vergoldete Kupferelektroden sind relativ reaktionsträge, scheinen aber ihre Vergoldung während längerer Elektrostimulation zu verlieren.
  • Elektrolyseprodukte können eingelagert oder eliminiert werden, indem die Oberflächen der Elektroden mit Schutzschichten überzogen werden, wie z.B. Gelatine, Polyacrylamid oder Agarose-Gele. Ein weiteres potentiell nützliches Elektrodenmaterial ist eine elektrochemische Halbzelle, wie z.B. eine Silber/Silberchloridelektrode.
  • d) Elektrodenarrays
  • Tauchelektroden bestehen typischerweise aus einem oder mehreren Paaren von Elektroden, die in einem Array angeordnet sind, der einziehbar in ein oder mehrere Wells einer Multiwell-Platte und auch wieder aus diesen heraus bewegt werden kann. Tauchelektroden können in Arrays angeordnet werden, die dem Plattenformat und der Plattendichte entsprechen, können aber auch in Arrays jedweder Konfiguration oder Orientierung angeordnet sein. Zum Beispiel enthalten bei einer standardgemäße 96-Well-Platte eine Reihe von Elektrodenkonfigurationen möglicherweise Elektrodenarrayanordnungen, um selektiv eine oder mehrere Säulen oder Reihen gleichzeitig zu erregen.
  • Ein Beispiel für eine Ausführungsform eines Elektrodenarrays dieser Art ist in 1 gezeigt. In diesem Beispiel wird ein Array von 12 × 8 Elektrodenpaaren so formatiert, dass er in eine standardgemäße 96-Multiwell-Platte passt. In diesem Fall sind die Elektroden (10) ungefähr 4 mm breit, 1 cm lang und 0,2 mm dick und gehen von einem leitenden Kamm (50) aus, der durch einen Schalter mit einer Seite der Ausgangsstufe eines Hochleistungsfunktionsgenerators verbunden ist. Die Elektro den sind parallel zueinander angebracht, mit einem Abstand von 4 mm, wobei sich zwischen den Elektroden ein nicht leitender Nylon-Abstandshalter (20) befindet. In diesem Fall ermöglicht der Schalter (330), dass jeweils eine Säule der 96-Well-Platte selektiv stimuliert wird, jedoch aufgrund der angemessenen Konfiguration der Schaltung, Verdrahtung und des Stromfunktionsgenerators jede zeitliche oder räumliche Kombination von Stimulationsprotokollen potentiell möglich ist.
  • Die gesamte Elektrodenanordnung wird durch ein starres, nicht leitendes Element (30) in korrekter Lagegenauigkeit gehalten, das dafür sorgt, dass jedes Elektrodenpaar den korrekten Abstand hat, um genau zu dem Layout einer standardgemäßen 96-Well-Platte zu passen. Das nicht leitende Element (30) ermöglicht, dass sich die Elektroden nach oben oder unten bewegen, während sie ihre Lagegenauigkeit innerhalb der Multiwell-Platte präzise beibehalten.
  • Um eine korrekte Lagegenauigkeit des Elektrodenarrays innerhalb einer Multiwell-Platte zu ermöglichen, kann die Elektrodenanordnung optional einen äußeren Rand oder Flansch (40) enthalten, der eine standardgemäße 96-Well-Platte aufnehmen kann und eine exakte Lagegenauigkeit der Platte ermöglicht. In einigen Ausführungsformen kann der Rand (40) darüber hinaus eine Kerbe oder Vertiefung (80) für die Lagegenauigkeit enthalten, um eine eindeutige Lagegenauigkeit der Platte zu ermöglichen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform (ebenfalls in 1A gezeigt) enthält der Elektrodenarray darüber hinaus Mittel zum einziehbaren Einbringen des Elektrodenarrays in die Wells der Multiwell-Platte. In einer Ausführungsform dieser Konfiguration umfasst der Elektrodenarray darüber hinaus ein oberes, bewegliches Stützelement (90), an dem die Elektroden (10) befestigt sind. Das bewegliche Stützelement (90) ist in der Lage, sich relativ zu dem nicht leitenden Element (30) nach oben und unten zu bewegen, indem es auf vier Passstiften (70) gleitet. In diesen Figuren nicht dargestellt ist eine Feder, die es ermöglicht, dass die bewegliche Stützschicht (90) automatisch in die obere Position zurückkehrt, wenn die nach unten gerichtete Kraft nicht mehr angelegt ist. Ein Abstandshalter (60) schafft die Möglichkeit, die bewegliche Stützschicht (90) und die Elektroden (10) in der vollen unteren Ausrichtung zu fixie ren. Dieses Element ermöglicht die Verwendung des Elektrostimulators in manuellen und/oder Roboter-Screening-Modi.
  • III. Multiwell-Platten zur Elektrostimulation
  • Die Multiwell-Platten der vorliegenden Erfindung wurden vorwiegend entworfen, um die effiziente Elektrostimulation von Zellen zu ermöglichen, während sie gleichzeitig die optische Analyse von Änderungen des Transmembranpotentials möglich machen. Um dies zu erreichen, können leitende Oberflächenelektroden in oder auf den Wänden, Böden oder Abdeckungen der Multiwell-Platten angebracht werden.
  • Im Allgemeinen kann die Fläche solcher Multiwell-Platten jede Form oder Größe haben, wie z.B. quadratisch, rechteckig, rund, länglich, dreieckig, nierenförmig oder andere geometrische oder nicht geometrische Formen. Die Fläche kann eine Form haben, die im Wesentlichen ähnlich der Form bestehender Multiwell-Platten ist, wie z.B. der standardgemäßen 96-Well-Mikrotiter-Platte, deren Fläche ungefähr 85,5 mm Breite × 127,75 mm Länge ist oder andere Größen, die einen aktuellen oder zukünftigen Industriestandard darstellen (siehe T. Astle, Standards in Robotics and Instrumentation, J. of Biomolecular Screening, Bd. 1, Seiten 163-168, 1996). Multiwell-Platten der vorliegenden Erfindung, die diese Fläche haben, können kompatibel mit Robotertechnik und Instrumentierungen sein, wie z.B. Multiwell-Platten-Translokatoren und -Lesern, wie sie dem Fachmann bekannt sind.
  • Typischerweise werden Wells in zweidimensionalen linearen Arrays auf der Multiwell-Platte angeordnet. Die Wells können jedoch in jeder Art von Array zur Verfügung gestellt werden, wie z.B. als geometrische oder nicht geometrische Arrays. Die Multiwell-Platte kann jede Anzahl von Wells umfassen. Größere Anzahlen von Wells oder erhöhte Well-Dichten können auch leicht untergebracht werden, indem die Verfahren der beanspruchten Erfindung verwendet werden. Allgemein verwendete Anzahlen von Wells beinhalten: 6, 12, 96, 384, 1536, 3456 und 9600.
  • Die Well-Volumen können typischerweise abhängig von der Well-Tiefe und dem Querschnitt variieren. Das Well-Volumen liegt vorzugsweise zwischen etwa 0,1 Mikroliter und 500 Mikroliter.
  • Wells können mit jeder Querschnitts-Form (in der Draufsicht) hergestellt werden, einschließlich quadratisch, rund, hexagonal oder geomet rische oder nicht geometrische Formen und Kombinationen (im Well und zwischen den Wells) aus diesen. Bevorzugt sind quadratische oder runde Wells, mit flachen Böden.
  • Die Wände können abgeschrägt werden (z.B. durch eine Entformungsschräge). Vorzugsweise beträgt der Winkel zwischen etwa 1 und 10 Grad, bevorzugter zwischen etwa 2 und 8 Grad und am bevorzugtesten zwischen etwa 3 und 5 Grad.
  • Die Wells können in einer Konfiguration so platziert werden, dass der Abstand von Well-Zentrum zu Well-Zentrum zwischen etwa 0,5 Millimeter und etwa 100 Millimeter liegen kann. Die Wells können in jeder Konfiguration platziert werden, wie z.B. als Linear-Linear-Array oder in geometrischen Mustern wie etwa hexagonalen Mustern. Der Abstand von Well zu Well kann bei einer 96-Well-Platte etwa 9 mm betragen. Kleinere Abstände von Well-Zentrum zu Well-Zentrum werden bei kleineren Volumen bevorzugt.
  • Die Wells können zwischen etwa 0,5 und 100 Millimeter tief sein. Vorzugsweise sind die Wells zwischen etwa 1 Millimeter und 100 Millimeter tief, noch bevorzugter wird eine Tiefe zwischen etwa 2 Millimeter und 50 Millimeter, am bevorzugtesten ist eine Tiefe zwischen etwa 3 Millimeter und 20 Millimeter.
  • Die Wells können einen Durchmesser (wenn die Wells rund sind) oder einen maximalen diagonalen Abstand (wenn die Wells nicht rund sind) zwischen etwa 0,2 und 100 Millimeter haben. Vorzugsweise liegt der Durchmesser der Wells zwischen etwa 0,5 und 100 Millimeter, bevorzugter ist ein Durchmesser zwischen etwa 1 und 50 Millimeter, am bevorzugtesten zwischen etwa 2 und 20 Millimeter.
  • Die Multiwell-Platte besteht im Allgemeinen aus einem elektrisch nicht leitenden Material und kann ein optisch opakes Material enthalten, das die Übertragung von Strahlung, wie z.B. Licht, durch die Wand eines Wells oder den Boden eines Wells, beeinträchtigen kann. Solche optisch opaken Materialien können den mit optischen Nachweisverfahren verbundenen Hintergrund reduzieren. Die optisch opaken Materialen können alle dem Fachmann bekannten oder später entwickelten Materialien sein, wie z.B. Farbstoffe, Pigmente oder Ruß. Die optisch opaken Materialien können verhindern, dass die Strahlung von einem Well in das andere über geht, um einen Austausch zwischen den Wells zu verhindern, so dass die Empfindlichkeit und Genauigkeit des Assays erhöht sind. Das optisch opake Material kann auch reflektierend sein, wie z.B. die dem Fachmann bekannten Materialien wie dünne Metallschichten, Spiegelbeläge oder Polierspiegel. Alle Oberflächen der Multiwell-Platte können mit optisch opaken Materialien beschichtet werden oder diese können bei der Herstellung in die Platte oder den Boden integriert werden. Optisch opakes Material kann die Transmission von zwischen etwa 100 % bis zu etwa 50 % von einfallendem Licht verhindern, vorzugsweise zwischen etwa 80 % und über 95 %, noch bevorzugter zu mehr als 99 %.
  • Da es bei den meisten Messungen typischerweise nicht erforderlich ist, dass Licht durch die Wand des Wells strahlt, können Materialien wie z.B. Polymere Pigmente beinhalten, um die Wände des Wells zu verdunkeln oder Licht zu absorbieren. Diese Verwendung von Pigmenten trägt dazu bei, die Hintergrundfluoreszenz zu verringern. Pigmente können durch alle dem Fachmann bekannte Mittel eingebracht werden, wie z.B. durch Beschichtung oder Mischung während der Herstellung des Materials oder der Multiwell-Platte. Die Auswahl der Pigmente kann auf einer Mischung von Pigmenten basieren, um alle in dem Polymer enthaltenen Hintergründe zu dämpfen oder einem einzelnen Pigment oder einer Reihe von Pigmenten, die ausgewählt werden, um Licht bei der gewünschten Wellenlänge zu filtern oder zu absorbieren. Pigmente können Ruß einschließen.
  • Oberflächenelektroden können in die Wand in einer Vielzahl von Formaten und Anordnungen eingebettet oder auf andere Weise an der Wand angebracht werden, z. B als mehrere schmale vertikale Elektrodenstreifen. Durch eine angemessene Anpassung des relativen Potentials jedes Streifens können im Beobachtungsbereich einheitliche elektrische Felder erzeugt werden. Darüber hinaus können durch die Verwendung eines runden Einschubs oder durch Einbetten vertikaler Streifenelektroden um das ganze Well einheitliche elektrische Felder in jede Richtung über das Well erzeugt werden. Es wäre auch möglich, ein einheitliches Feld in eine Richtung zu erzeugen, gefolgt von einem einheitlichen Feld in eine andere Richtung. Dies könnte nützlich sein bei Zellarten, deren elektri sche Eigenschaften anisotrop sind, wie z.B. Nerven- oder Muskelzellen oder bei Zellarten mit großen Aspektverhältnissen.
  • Jedes Well enthält auch einen Boden mit einem Anteil mit hoher Lichtdurchlässigkeit und mit einer geringeren Fluoreszenz als ein Polystyrol-Boden mit mindestens 90 % der Dicke des Bodens. Diese Eigenschaft kann bestimmt werden, indem die Fluoreszenz eines passenden Kontrollbodenmaterials mit der Fluoreszenz eines Testmaterials verglichen wird. Dieses Vorgehen kann unter Verwendung hinlänglich bekannter Verfahren erfolgen. Vorzugsweise ist der Boden eine Platte oder ein Film, so wie diese Begriffe dem Fachmann bekannt sind. Die Dicke des Bodens kann abhängig von den Gesamteigenschaften, die für den Plattenboden erforderlich sind und für eine bestimmte Anwendung vorgeschrieben sein können, variieren. Diese Eigenschaften beinhalten das Ausmaß der Eigenfluoreszenz, Steifigkeit, Bruchfestigkeit und Herstellungsanforderungen hinsichtlich des Materials, das für die Platte verwendet wird. Well-Bodenschichten haben typischerweise eine Dicke zwischen etwa 10 Mikrometer und etwa 1000 Mikrometer. Vorzugsweise hat der Well-Boden eine Dicke zwischen etwa 10 Mikrometer und 450 Mikrometer, noch bevorzugter ist eine Dicke zwischen etwa 15 Mikrometer und 300 Mikrometer, und am bevorzugtesten ist eine Dicke zwischen etwa 20 Mikrometer und 100 Mikrometer.
  • Der Boden eines Wells kann einen Abschnitt mit hoher Lichtdurchlässigkeit haben, was typischerweise bedeutet, dass entweder der ganze Boden oder ein Teil des Bodens eines Wells lichtdurchlässig ist. Der Boden kann einen optisch opaken Anteil und einen Anteil mit hoher Lichtdurchlässigkeit in jeder Form haben, wie z.B. rund, quadratisch, rechteckig, nierenförmig, polygonal oder andere geometrische oder nicht geometrische Formen oder Kombinationen aus diesen.
  • Vorzugsweise kann der Boden der Multiwell-Platte im Wesentlichen flach sein, d.h. mit einer Oberflächentextur zwischen etwa 0,001 mm und 2 mm, vorzugsweise zwischen etwa 0,01 mm und 0,1 mm (siehe Surface Roughness, Waviness, and Lay, Am. Soc. of Mech. Eng. #ANSI ASME B46.1-2985 (1986)). Wenn der Boden nicht im Wesentlichen flach ist, kann sich die optische Qualität des Bodens und der Wells aufgrund von veränderten optischen und physikalischen Eigenschaften von Boden und/oder Well verschlechtern.
  • Für Ausführungsformen mit Oberflächenelektroden enthält der Boden vorzugsweise Streifen aus elektrisch leitendem Material oder Beschichtungen, die den Rand der Wells der Multiwell-Platte überlappen und in elektrischem Kontakt mit dem Inhalt der Wells stehen. Die elektrisch leitenden Streifen enden typischerweise an elektrischen Verbindungsteilen, um eine einfache Befestigung an der Ausgangsstufe eines Hochleistungsfunktionsgenerators, wie bereits beschrieben, zu ermöglichen. Die elektrisch leitenden Streifen sollten einen Widerstand haben, der niedrig genug ist, so dass sie die stimulierenden Ströme ohne übermäßigen Spannungsverlust über ihre Länge leiten können. Der Widerstand vom Ende des Verbindungsteils bis zum am weitesten entfernten Well-Ende sollte niedriger als 10 Ω sein, noch bevorzugter ist ein Widerstand unter 1 Ω und am bevorzugtesten ist ein Widerstand unter 0,1 Ω. Die Querschnittsfläche der elektrisch leitenden Streifen sollte groß genug sein, um die Widerstandsanforderungen zu erfüllen. Für allgemein verwendete elektrische Leiter sollte diese Querschnittsfläche mindestens 10-4 mm2 betragen, bevorzugter sind mindestens 10-3 mm2.
  • In der Praxis kann jedes leitende Material verwendet werden, solange es mit einem leitenden Material überzogen ist, das in Salzlösung reaktionsträge ist. Solche Materialen beinhalten die Edelmetalle (einschließlich Gold, Platin und Palladium) und die feuerfesten Metalle (einschließlich Chrom, Molybdän, Iridium, Wolfram, Tantal und Titan) sowie Legierungen aus diesen. Bevorzugte Materialien für das leitende Material für Oberflächenelektroden beinhalten Kombinationen aus Chrom, Kupfer, Gold und Indium-Zinn-Oxid, die einfach in oder auf die transparente Bodenschicht eingebettet oder elektroplattiert werden können. Elektrolyseprodukte können umschlossen oder eliminiert werden, indem die Oberflächen der Elektroden mit schützenden Beschichtungen überzogen werden, wie z.B. Gelatine, Polyacrylimid oder Agarose-Gele.
  • Ein weiteres potentiell nützliches Elektrodenmaterial ist eine elektrochemische Halbzelle, wie z.B. eine Silber/Silberchloridelektrode.
  • Die Beschichtungen des elektrische leitenden Materials oder Oberflächenveränderungen können mit Hilfe jedes geeigneten, dem Fachmann bekannten Verfahrens in den Boden eingebracht werden, einschließlich Vakuumbedampfen, Elektroplattierung, Drucken, Sprühen, Strahlungsenergie, Ionisierungsverfahren oder Tauchen. Oberflächenveränderungen können ebenfalls durch geeignete Ableitung eines Polymers oder anderen Materials eingebracht werden, wie z.B. Glas oder Quarz, und zwar bevor, während oder nachdem die Multiwell-Platte hergestellt wird, und durch Einschluss eines geeigneten abgeleiteten Polymers oder anderen Materials in die Bodenschicht. Dann kann man das abgeleitete Polymer oder andere Material mit einem chemischen Anteil reagieren lassen, der in einer Anwendung der Platte verwendet wird. Vor der Reaktion mit einem chemischen Anteil kann ein solches Polymer oder anderes Material dann entweder kovalente oder nicht kovalente Bindungsstellen auf dem Polymer oder anderen Material zur Verfügung stellen. Diese Stellen in oder auf der Oberfläche des Polymers oder anderen Materials können verwendet werden, um leitende Schichten auf den Platten anzubringen. Beispiele für abgeleitete Polymere oder andere Materialen beinhalten die im US-Patent 5,583,211 (Coassin et al.) beschriebenen und andere dem Fachmann bekannte oder später entwickelte Materialen.
  • Materialien und Herstellung
  • Die Materialien für die Herstellung der Multiwell-Platte sind typischerweise Polymere, da diese Materialien sich für Verfahren der Massenproduktion eignen. Zur Herstellung des Bodens einer Multiwell-Platte können jedoch auch andere Materialien wie z.B. Glas oder Quarz verwendet werden. Der Boden kann aus dem gleichen oder anderen Materialien bestehen, und der Boden kann Polystyrol oder andere Materialien enthalten. Vorzugsweise werden Polymere gewählt, die eine niedrige Fluoreszenz und hohe Lichtdurchlässigkeit aufweisen. Polymere Materialien können insbesondere die Herstellung von Platten durch Gießverfahren, die dem Fachmann bekannt sind und solche, die in Zukunft entwickelt werden, erleichtern, wie z.B. Einsatzformen oder Spritzgießen.
  • Die Multiwell-Platte der vorliegenden Erfindung kann aus einem oder mehreren Stücken hergestellt werden. Zum Beispiel können die Platte und der Boden aus einem einzigen Stück hergestellt werden. Alternativ kann die Platte ein einziges Stück sein und der Boden kann ein zweites einziges Stück sein, die kombiniert werden, um eine Multiwell-Platte zu bilden. In diesem Fall können die Platte und der Boden durch Verbindungsmittel miteinander verbunden werden, wie z.B. Klebstoffe, oder mittels Schallschweißen, Wärmeschweißen, Schmelzen, Einsatz-Spritzgießen oder anderer Mittel, die dem Fachmann bekannt sind oder später entwickelt werden. Die Platte und der Boden können aus dem gleichen Material oder aus verschiedenen Materialien hergestellt werden. Zum Beispiel kann die Platte aus einem Polymer hergestellt werden und der Boden aus Polystyrol, Cyclo-Olefin, Aclar, Glas oder Quarz.
  • Miniaturisierte Oberflächenelektrodendesigns sind sowohl in standardgemäßen Plattenformaten (96, 384, 1536) als auch mit Plattendichten von 3456 und höher machbar. Der Durchsatz eines solchen Systems ist potentiell extrem hoch. Geht man zum Beispiel davon aus, dass 3456 Wells pro Platte mit einer Rate von 30 Platten pro Stunde gescreent werden, entspricht dies einem Gesamtdurchsatz von ungefähr 800.000 Wells pro 8-Stunden-Tag, was, wenn man von gleichen Plattenauslesezeiten ausgeht, ungefähr 8 Mal schneller ist als derzeit möglich.
  • Ein Beispiel einer Ausführungsform einer Multiwell-Platte mit Oberflächenelektroden ist in 2A gezeigt. In diesem Beispiel sind Paare leitender Streifen (200) parallel an einer optisch transparenten Bodenschicht (210), wie z.B. Glas oder Kunststoff wie COC (siehe US-Patent Nummer 5,910,287, erteilt am 8. Juni 1999) in einem 96-Well-Plattenformat angebracht. Bei diesem Beispiel sind die Streifen aus leitendem Material (200) annähernd 2 mm breit, 10 μm dick und durch einen Abstand von annähernd 4 mm getrennt, um die optische Analyse der Zellen, die sich in den Wells (220) zwischen den Elektroden befinden, durch die optisch transparente Bodenschicht (210) zu ermöglichen. In weiteren Ausführungsformen können die Streifen aus leitendem Material Drähte aus rostfreiem Stahl umfassen (mit einem Durchmesser von etwa 0,001 bis zu etwa 0,010). Die optisch transparente Bodenschicht (210) ist an einem 96-Well-Multiwell-Plattenarray (230) befestigt und ersetzt den normalen Plattenboden. Die Streifen aus elektrisch leitendem Material (200) überlappen den Rand der Wells (220) der 96-Well-Multiwell-Platte und stehen in elektrischem Kontakt mit dem Inhalt der Wells. Die elektrisch leitenden Streifen (200) enden an elektrischen Kontakten (240), um eine einfache Befestigung an der Ausgangsstufe eines Hoch leistungsfunktionsgenerators zu ermöglichen, wie bereits beschrieben. In diesem Beispiel gibt es zwei Elektrodenkontakte pro Säule mit acht Wells im ersten Well der Säule. Dies ermöglicht die Verwendung von standardgemäßen 96-Well-Platten-Layouts für eine einfachere Handhabung während des Arbeitens mit der Zellkultur. In diese Wells werden keine Zellen und keine Salzlösung eingebracht. Das Design ermöglicht die gleichzeitige Stimulation von sieben Wells in einer einzigen Säule. Während des Assays wird der Bediener oder ein Roboter temporär Drähte mit den Kontakten verbinden, zum Beispiel mit Steckstift-Testelektroden.
  • Eine weitere Ausführungsform einer Multiwell-Platte mit Oberflächenelektroden ist in 2B gezeigt. In dieser Ausführungsform erstreckt sich die transparente Bodenschicht (210) über den Rand der Multiwell-Platte (230) hinaus. In dieser Konfiguration bleiben alle Wells für die Verwendung mit Zellen oder Verbindungen verfügbar. Darüber hinaus ist die Anbringung externer Drähte an die Kontakte (240) vereinfacht. Steckstiftkontakte, Leiterplattenrandverbindungsstücke oder ZIF-Sockel (ZIF = zero insertion force) können verwendet werden, um den Kontakt mit den Elektroden herzustellen. Die erweiterte Bodenschicht (210) kann dazu führen, dass die Platten bei der Routineverwendung weniger praktisch zu handhaben sind. Dem kann abgeholfen werden, indem die Elektrodenspuren (200) beim Herstellungsprozess auf der anderen Seite der Bodenschicht (210) angebracht werden. Dies kann durch verschiedene Verfahren erreicht werden. Zum Beispiel können durch eine beidseitige Bearbeitung der Platten zur Bildung von Kontaktbereichen Durchgangslöcher geschaffen und plattiert werden, oder leitende Spuren können um den Rand der Bodenschicht gelegt werden. Als weiteres Beispiel kann die Bodenschicht aus einem flexiblen isolierenden Material bestehen. Dann kann, nachdem die Struktur wie in 2B gezeigt hergestellt wurde, der Teil der Bodenschicht, der über den Rand der Platte hinaus geht, gefaltet und an der Unterseite der Platte befestigt werden.
  • Eine weitere Ausführungsform einer Multiwell-Platte mit Oberflächenelektroden ist in 2C gezeigt. In dieser Ausführungsform sind die Elektroden (200) mit schmalen Durchkontaktierungsdrähten (205) an den Kontaktflecken (240) befestigt. Dies ermöglicht die Verwendung von standardgemäßen 96-Well-Plattenlayouts, zur vereinfachten Handhabung während des Arbeitens mit einer Zellkultur. In dieser Ausführungsform sind alle Elektroden einer Polarität miteinander kurzgeschlossen. Die Auswahl einer einzelnen Säule erfolgt, indem die Strompulse an nur eine Elektrode der anderen Polarität gegeben werden. In dieser Ausführungsform werden in die letzte Säule, in der sich die Kontaktflecken befinden, keine Zellen, Salzlösung oder Verbindungen eingebracht. Während des Assays wird der Bediener oder ein Roboter temporär Drähte mit den Kontakten verbinden, zum Beispiel mit Steckstift-Testelektroden.
  • Eine weitere Ausführungsform einer Multiwell-Platte mit Oberflächenelektroden ist in 2D gezeigt. In dieser Ausführungsform sind die Elektroden (200) parallel zu der längeren Abmessung der 96-Well-Platte ausgerichtet. Dieses Design ist im Wesentlich ähnlich dem in 2A dargestellten Design, mit der Ausnahme, dass elf Wells in einer Reihe gleichzeitig stimuliert werden.
  • Bevorzugte Materialien für das leitende Material für Oberflächenelektroden beinhalten Kombinationen aus Chrom, Kupfer, Gold und Indium-Zinn-Oxid, die leicht in die transparente Bodenschicht eingebettet, an dieser angebracht oder in dieser galvanisiert werden können. In der Praxis kann jedes leitende Material verwendet werden, solange es mit einem leitenden Material beschichtet ist, das in Salzlösung reaktionsträge ist. Solche reaktionsträgen Materialien beinhalten die Edelmetalle (einschließlich Gold, Platin und Palladium), die feuerfesten Metalle (einschließlich Chrom, Molybdän, Iridium, Wolfram, Tantal und Titan), korrosionsbeständige Legierungen (einschließlich rostfreier Stahl) und Kohlenstoff oder andere organische Leiter (einschließlich Graphit und Polypyrrol) sowie Kombinationen oder Legierungen aus diesen Materialien.
  • IV. Systeme zur Elektrostimulation und zur spektroskopischen Messung
  • Die vorliegende Erfindung beinhaltet Systeme zur automatischen Elektrostimulation und zur spektroskopischen Messung; diese umfassen mindestens eine Elektrodenanordnung, ein Mittel zur Elektrostimulation, einen optischen Detektor und Computersteuermittel, um die Erzeugung elektrischer Stimuli, die Sammlung von Daten und Bewegungen der Multiwell-Platten zu koordinieren. Das System kann darüber hinaus Mittel für die Zugabe von Flüssigkeit enthalten. In einem Aspekt wurden diese Systeme entworfen zur Regulierung, Charakterisierung und zum Testen der Aktivität von Ionenkanälen, Transportern, Leckströmen, die in oder auf der Oberfläche von lebenden Zellen auftreten, und zum schnellen Screening nach Wirkungen von Testverbindungen auf die Wirkungen von Kanal- oder Zellaktivitäten. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf der vorliegenden Erfindung zuzuordnende chemische Elemente und Informationen (z.B. Modulatoren oder chemische oder biologische Aktivitäten von chemischen Stoffen), die durch die Arbeit an einem Arbeitsplatz generiert oder entdeckt wurden.
  • 3 zeigt ein Blockdiagramm der wichtigsten elektrischen und optischen Komponenten für eine Ausführungsform eines Systems zur automatischen Elektrostimulation und zur spektroskopischen Messung. Bei diesem Beispiel wurde ein 96-Well-Multiwell-Platten Tauchelektrodenarray (1) für die Elektrostimulation verwendet. Zusätzlich zu dem Stimulations-Elektroden-Array hat das System einige zusätzliche elektrische, optische und mechanische Komponenten, wie im Einzelnen im gemeinsam genutzten US-Patent mit der Anmeldenr. 09/118,728, eingereicht am 24. Juli 1998, beschrieben ist.
  • In dieser Ausführungsform wird eine digitale PC DIO 24 I/O-Karte von National Instruments (Austin, TX) auf dem Computer (300) verwendet, um den richtigen Kanal auf einem 1-12-Schalter (330) (National Instruments ER-16) einzustellen. Der Computer, der den fluoreszierenden Plattenleser (300) steuert, sendet auch ein TTL-Signal aus, um den Funktionsgenerator (310) zu aktivieren, wenn programmiert wurde, dass die Stimulation beginnt. Stimulationssignale werden von zwei Generatoren anwenderdefinierter Wellenformen (310) erzeugt. Die Funktionsgeneratoren sind von Tektronix (Beaverton, OR), Modell Nr. AFG310. Der erste löst eine Reihe von TTL-Pulsen an den zweiten aus, der mit der individuellen Stimulations-Wellenform programmiert ist. Komplexere Wellenform-Folgen können erzeugt werden, indem mehrere Wellenformgeneratoren in Folge und/oder parallel geschaltet werden. Diese Wellenformgeneratoren werden entweder durch den computergenerierten TTL-Puls oder durch den jeweils anderen aktiviert. Alternativ kann ein D/A-Wandler oder eine Soundkarte auf dem Computer verwendet werden, um eine Folge von Stimuli zu erzeugen. In diesem Fall könnte eine handelsübliche oder Indivi dualsoftware verwendet werden, um die Wellenform-Folge zu programmieren oder die Wellenform während der Folge zu verändern.
  • Die Folge von Stimuli wird durch einen Hochleistungsverstärker (320), durch den Schalter (330) und in den Stimulationskopf (370) geleitet. In diesem Fall wurde der Verstärker unter Verwendung des APEX PA93-Chip (Apex Microtechnology Corp, Tucscon, AZ) gebaut, wobei man sich nach einer vom Hersteller zur Verfügung gestellten Schaltung gerichtet hat. Bevorzugte Verstärker für die vorliegende Erfindung halten typischerweise nachfolgende Spezifikationen ein oder übersteigen diese: ±100 V Gleichstrom am Eingang, 100 GΩ Eingangsimpedanz, 20-fache Spannungsverstärkung, ±90 V am Ausgang, ±3 A am Ausgang, 10 Ω Ausgangsimpedanz.
  • Der Großteil des Stroms fließt durch die Salzlösung zwischen den Elektroden, typischerweise jeweils in einer einzigen Acht-Well-Säule der Mikrotiter-Platte (350). Erregungslicht mit 400 ± 7,5 nm beleuchtet die eingefärbten Zellen von unten und das abgegebene fluoreszierende Licht wird mit zwei Wellenlängen über das Detektormodul (340) gemessen, blau bei 460 +/- 20 nm und orange bei 580 +/- 30 nm; (siehe González et. al., Drug Discovery Today 4: 431-439, 1999). Sobald eine Säule von Zellen stimulierte wurde, aktiviert der Computer (300) den Motor (360), um die Multiwell-Platte (350) an eine neue Position zu bringen, wo sie für die nächste Stimulation bereitsteht.
  • Bei einer typischen 96-Well-Multiwell-Platte sind die Elektroden 4 mm breit mit einem Abstand (g) von 4 mm. Die Stimulation erfolgt normalerweise in einem Volumen von 100 μL physiologischer Kochsalzlösung im Well. Mit diesem Volumen an Salzlösung liegt die Tiefe im Durchschnitt bei annähernd 3,0 mm (diese Tiefe variiert aufgrund des Meniskus-Effekts im Well um bis zu 20 %.). Die Elektroden liegen annähernd 0,5 mm vom Boden der Wells entfernt. Das elektrische Feld (E), das über die Zellen angelegt wird, wird geschätzt als die Spannung über die Elektroden (V0) geteilt durch die Elektrodenlücke (g), E = V0/g. Dies ist eine Überschätzung des tatsächlichen Feldes, aufgrund des Einflusses elektrochemischer Reaktionen an jeder Elektrode, die annähernd 1,5 V verbrauchen. In den typischen Spannungsbereichen, die für die Stimulation verwendet werden (10 bis 60 V/cm), liegt diese Überschätzung in der Größenordnung von annähernd 10 %. Genaue Messungen und Kalibrierungen des Feldes können durch Mapping des elektrischen Potentials in dem Well durchgeführt werden, wenn Strom fließt.
  • Die vorliegende Erfindung beinhaltet auch automatisierte Arbeitsplätze, die programmierbar gesteuert werden, um die Bearbeitungszeiten an jedem Arbeitsplatz zu minimieren, und die integriert werden können, um die Bearbeitungszeit der flüssigen Proben für Elektrostimulation und Analyse zu minimieren.
  • Typischerweise enthält ein System der vorliegenden Erfindung eine oder mehrere der folgenden Komponenten: A) ein Speicher- und Wiederabrufmodul, umfassend Speicherorte für die Speicherung einer Vielzahl von chemischen Stoffen in Lösung in adressierbaren Wells für chemische Stoffe, ein Wiederabrufmodul für Wells für chemische Stoffe zum programmierbaren Auswählen und Wiederabrufen des adressierbaren Wells für chemische Stoffe mit einer Speicherkapazität von mindestens 100.000 adressierbaren Wells, B) ein Probenverteilungsmodul, umfassend einen Flüssigkeitsmanipulator, um Lösungen aus ausgewählten adressierbaren Wells für chemische Stoffe anzusaugen oder abzugeben, wobei das Verteilungsmodul für chemische Stoffe eine programmierbare Auswahl von den ausgewählten adressierbaren Wells für chemische Stoffe sowie das Aussaugen dieser Wells, und eine programmierbare Abgabe in ausgewählte Probenwells bereitstellt (einschließlich Abgabe in Arrays von adressierbaren Wells mit verschiedenen Dichten von adressierbaren Wells pro Quadratzentimeter), C) einen Probentransportmechanismus, um die ausgewählten adressierbaren Wells für chemische Stoffe zum Probenverteilungsmodul zu transportieren und optional eine programmierbare Steuerung des Transports der ausgewählten adressierbaren Wells für chemische Stoffe (einschließlich adaptiven Routings und paralleler Verarbeitung), D) ein System für das automatisierte Waschen, Färben und die zeitgesteuerte Inkubation von Zellen in Multiwell-Platten, E) ein System für den automatisierten Transport von Zellplatten und Testverbindungs-Platten zwischen den einzelnen Arbeitsplätzen, F) ein System für die automatisierte Elektrostimulation und spektroskopische Messung, und ein Datenverarbeitungs- und Integrationsmodul, G) ein Master-Steuerungssystem, das die Aktivitäten aller oben genannter Untersystem koordiniert.
  • Das Speicher- und Wiederabrufmodul, das Probenverteilungsmodul und das System für die automatisierte Elektrostimulation und die spektroskopische Messung werden durch das Datenverarbeitungs- und Integrationsmodul integriert und programmierbar gesteuert. Das Speicher- und Wiederabrufmodul, das Probenverteilungsmodul, der Probentransportmechanismus, das System für die automatisierte Elektrostimulation und die spektroskopische Messung und das Datenverarbeitungs- und Integrationsmodul sind funktionsmäßig verbunden, um eine schnelle Bearbeitung der adressierbaren Proben-Wells zu ermöglichen. Typischerweise können die Geräte der Erfindung mindestens 100.000 adressierbare Wells in 24 Stunden bearbeiten. Diese Art von System ist im US-Patent Nr. 5,985,214, erteilt am 16.11.1999, beschrieben.
  • Mikrofluidik-Systeme
  • Die vorliegende Erfindung beinhaltet auch die Verwendung von Elektroden, die in Mikrofluidik-Chips integriert sind und eine hochgradig miniaturisierte Elektrostimulation und Analyse ermöglichen. Diese Systeme umfassen zum Beispiel die im US-Patent Nr. 5,800,690, erteilt am 1. September 1998 an Chow et al., die in der Europäischen Patentanmeldung EP 0 810 438 A2 , eingereicht am 5. Mai 1997 von Pelc et. al., und die in der PCT-Anmeldung WO 98/00231, eingereicht am 24. Juni 1997 von Parce et al., beschriebenen Systeme. Diese Systeme verwenden typischerweise die elektrogene Flüssigkeitsbewegung, um kleine Flüssigkeitsvolumen innerhalb von Mikrokapillaren auf Glas- oder Silikonchips zu manipulieren. Diese auf Mikrodfluidik-Chips basierenden Analysesysteme können stark parallele miniaturisierte Analysen ermöglichen. Solche Systeme sind bevorzugte Systeme für spektroskopische Messungen in einigen Fällen, die eine miniaturisierte Analyse erforderlich machen.
  • Der von Fu et al. (Nature Biotechnology 17: 1109-11, 1999) beschriebene, in Mikroherstellung produzierte fluoreszenz-aktivierte Zellsortierer könnte zum Beispiel leicht so modifiziert werden, dass ein Paar von Elektroden am optischen Abfragebereich in dessen Nähe platziert sind. Unter Verwendung der hier beschriebenen Verfahren, könnten einzelne Zellen elektrisch stimuliert und basierend auf ihrer Reaktion auf die Stimulation einzeln sortiert werden. Dieses Verfahren würde den Prozess, mit dem man stabile Klone erhält, die die gewünschte Expression von Ka nälen enthalten, deutlich vereinfachen. In einem weiteren Aspekt könnte das Screening von Testverbindungen an einzelnen Zellen mit einem Mikrofluidik-Gerät durchgeführt werden, das mit einem oder mehreren zusätzlichen Flüssigkeitseinspritzkanälen und einem oder mehreren eingebetteten Elektrostimulationsgeräten ausgestattet ist, die basierend auf den hier beschriebenen Verfahren gebaut und betrieben werden.
  • V. Elektrostimulationsverfahren
  • a) Einführung
  • Ohne an irgendeinen Aktionsmechanismus gebunden zu sein, stellen die vorliegenden Erfinder die folgende Beschreibung der Wirkung der Elektrostimulation auf zelluläre Transmembranpotentiale zur Verfügung.
  • Typische spannungsabhängige Ionenkanäle haben eine Vielzahl leitender und nicht leitender Zustände, die durch das lokale relative Transmembranpotential der Zelle reguliert werden. Durch die adäquate Applizierung externer elektrischer Felder auf die Zellen, können Teile der Zellmembran in jedes gewünschte Transmembranpotential versetzt werden, womit die Regulierung der leitenden Zustände der spannungsabhängigen Ionenkanäle, die in der Zelle vorhanden sind, ermöglicht wird. Wenn das angelegte elektrische Feld adäquat verändert wird, ist es möglich, eine Reihe von Leitfähigkeits-Zuständen der meisten Ionenkanäle zu abzutasten, wodurch sie zwischen Ruhezuständen, aktiven und inaktivierten Zuständen wechseln.
  • Abhängig von dem entsprechenden Ionenkanal kann die Aktivierung des Ionenkanals zur Freigabe von Ionen oder zur Aufnahme von Ionen in die Zellen führen, was zu allgemeinen Änderungen des Transmembranpotentials in der Zelle führen kann. Durch die Applizierung einer wiederholten Folge von elektrischen Stimuli, die durch ein Zeitintervall getrennt sind, das kleiner ist als die Membranzeitkonstante, können über eine stufenweise Akkumulierung oder einen stufenweisen Verlust von Ionen hohe anhaltende Spannungsänderungen der Membran erzeugt werden. Dieser Prozess ermöglicht die direkte Messung vieler Ionenkanäle und stellt ein einfaches Verfahren zur Verfügung, mit dem das Transmembranpotential der Zelle extern gesteuert werden kann. Dieser Lösungsansatz stellt somit verbesserte Verfahren zum Auffinden von Medikamenten zur Verfügung, die mit Screening mit hohem Durchsatz kompatibel sind.
  • b) Überblick über ein typisches Stimulationsprotokoll
  • Der simulierte Einfluss eines typischen biphasischen Elektrostimulationsprotokolls auf eine Zelllinie, die einen spannungsaktivierten Natriumkanal exprimiert, ist nachfolgend in vereinfachter Form dargestellt. Die folgende Beschreibung geht davon aus, dass die Zelllinie keine signifikante Expression anderer Ionenkanäle aufweist und dass das Transmembranruhepotential der Zelle über der Schwelle für die Inaktivierung des entsprechenden Natriumkanals liegt. In 4 zeigt das obere Feld den Zeitverlauf des angelegten elektrischen Feldes (E), das mittlere Feld zeigt die simulierten Einwärts-Natriumströme (INa) als Reaktion auf das angelegte elektrische Feld und das untere Feld zeigt das idealisierte durchschnittliche Transmembranpotential der Zelle (Vm). Bei diesem Beispiel beziehen sich die Aufzeichnungen auf die Veränderungen dieser Parameter, die von einer einzelnen Zelle, die im Mittelpunkt des angelegten elektrischen Feldes platziert wird, typischerweise während einer Elektrostimulationswellenfolge erwartet werden.
  • In Bezug auf den ersten Puls verursacht der Aufbau des ersten elektrischen Feldes einen Potentialabfall über die Zelle, der im Hinblick auf das Transmembranruhepotential der Zelle, an den Rändern der Zelle, die den Elektroden am nächsten sind, maximal ist (siehe Hibino et al., Biophysical Journal 64:1789-1800, 1993; Gross et al. 1986, Biophys. J. 50:339-348). Die Stärke der durch das elektrische Feld induzierten Änderung des Transmembranpotentials ΔVm an einem bestimmten Punkt der Membran in einer idealisierten kugelförmigen Zelle kann mit folgender Formel (Ehrenberg et al., Biophys. J. 51:833-837, 1987) beschrieben werden:
    Figure 00430001
  • In Gleichung 1 ist f ein Faktor, der von der von der Leitfähigkeit der Membran abhängig ist, g ist ein geometrischer Faktor der Ordnung 1, r ist der halbe Durchmesser der Zelle parallel zum elektrischen Feld, E ist die lokale Stärke des elektrischen Feldes und Θ ist der Winkel zwischen der lokalen Ausrichtung des Feldes und einer Linie gezogen vom Mittel punkt der Zelle zu dem Punkt der betreffenden Oberfläche. Bei den meisten intakten Säugetierzellen, bei denen die Membranleitfähigkeit verglichen mit der Leitfähigkeit der Lösung, in der sich die Zellen befinden, relativ gering ist, ist der Faktor f ≈ 1. In der Praxis sind Zellen nur selten kugelförmig, wenn sie sich auf einem Substrat befinden, und eine genaue Schätzung der tatsächlichen Stärke der durch das elektrische Feld induzierten Änderungen des Transmembranpotentials kann empirisch bestimmt werden.
  • Als Ergebnis des angelegten elektrischen Feldes wird die Membran an der Seite, die der Anode am nächsten ist, negativ, während die Membran an der Seite, die der Kathode am nächsten ist, positiv wird. Bei Zellen, bei denen ein Rand ausreichend negativ wird, um das Transmembranpotential lokal unter das Schwellenpotential für die Aufhebung der Inaktivierung des betreffenden Ionenkanals zu senken, verursacht das angelegte elektrische Feld, dass sich die Natriumkanäle, die sich an diesem Rand befinden, in den Ruhezustand begeben. Auf der anderen Seite der Zelle wird das Transmembranpotential hinsichtlich des Ruhepotentials positiv. Da man annimmt, dass das Transmembranruhepotential der Zelle über der Schwelle für die Inaktivierung liegt, bleiben die Natriumkanäle auf dieser Seite der Zelle inaktiviert und leiten keinen Strom. Läge das Transmembranruhepotential stattdessen unter der Inaktivierungsschwelle, würden Kanäle auf dieser Seite der Zelle aktiviert und würden Strom leiten.
  • Wenn das angelegte Feld umgekehrt wird, kehrt sich auch das Profil der Änderungen des Transmembranpotentials um. Die Änderungen des Transmembranpotentials, die durch das elektrische Feld auf den Membran-Patches an den äußeren Enden der Zellen induziert werden, wechseln die Polarität. Die Kanäle auf der Seite, die während der ersten Stimulationsphase zu negativ verändert wurde, werden nun zu positiv verändert. Wenn die Stimulationsparameter korrekt ausgewählt werden, werden diese Kanäle nun zu Werten über dem Aktivierungspotential verändert und beginnen, das Einströmen von Natriumionen zu ermöglichen. Dies ist in 4 als die erste kleinere Spitze des Natrium-Einstroms in die Zelle gezeigt. Nach einer charakteristischen Zeit werden die Natriumkanäle schnell inaktiviert. In der Zwischenzeit wird das Transmembranpo tential auf der anderen Seite der Zelle zu negativ verändert, so dass die Inaktivierung der Natriumkanäle aufgehoben wird und diese sich in den Ruhezustand begeben.
  • Wenn die zweite Stimulationsphase endet, begeben sich alle Teile der Membran schnell wieder in ein neues durchschnittliches Transmembranpotential. Wenn das durchschnittliche Transmembranpotential nun über dem Aktivierungspotential der Natriumkanäle liegt, werden die Kanäle auf der Seite der Zelle, die während der zweiten Phase der Stimulation zu negativ bewegt wurden, aktiviert und beginnen, den Einstrom von Natriumionen zu ermöglichen. Dies ist in 4 als die zweite größere Spitze des Natrium-Einstroms in die Zelle gezeigt. Die Natriumkanäle werden nach einer charakteristischen Zeit schnell wieder inaktiviert. In diesem Fall ist der Natrium-Einstrom typischerweise von der zweiten Seite aus höher als von der ersten Seite, da die Antriebskraft für den Natrium-Einstrom größer ist, wenn dieser Teil der Membran durch ein elektrisches Feld noch mehr zu positiv bewegt wird.
  • Jeder Puls des Natriumkanal-Einstroms erhöht das durchschnittliche Transmembranpotential der Zelle (4, unteres Feld). Dieser Anstieg des Transmembranpotentials kann durch alle hier beschriebenen Verfahren nachgewiesen werden, wird jedoch zweckmäßigerweise über die Änderungen des Fluoreszenzemissionsverhältnisses eines auf FRET basierenden spannungsabhängigen Farbstoffs gemessen. Aufgrund von Leckströmen, die in allen Zellen vorhanden sind, fällt diese Verschiebung des durchschnittlichen Transmembranpotentials exponential zum ursprünglichen Transmembranruhepotential ab. Die Zeitabhängigkeit dieser Reaktion, die Membranzeitkonstante (τm), hängt von der Membrankapazität und dem Membranwiderstand ab und ist von einem Zelltyp zum anderen höchst veränderlich. Zeitkonstanten können, je nach Zellart, zum Beispiel von 100 μs bis zu über eine Sekunde variieren. Die Membranzeitkonstante liegt bei den meisten gentechnisch manipulierten Zelllinien typischerweise bei etwa 100 ms.
  • Um eine Netto-Akkumulation des Natriumeinstroms zu ermöglichen, wird der Stimulationspuls wiederholt, bevor das Transmembranpotential Zeit hat, bis zum Transmembranruhepotential abzufallen. Während nachfolgender Runden der Elektrostimulation, wird in der Zelle kontinuierlich positive Ladung akkumuliert, wodurch das durchschnittliche Transmembranpotential mit jeder Wiederholung der Elektrostimulation in einer annähernd stufenartigen Weise erhöht wird. Nach jedem Puls der Elektrostimulation wird das Ausmaß des Einströmens von Natriumionen kontinuierlich geringer, während das durchschnittliche Transmembranpotential sich dem umgekehrten Natriumionenpotential nähert. Schließlich stellt sich ein Gleichgewichts-Transmembranpotential ein, in dem das Abströmen von Strom aus der Zelle dem Einströmen von Strom aufgrund der Elektrostimulation entspricht.
  • c) Regelbare Parameter für die Stimulations-Wellenformen
  • Die vorliegende Erfindung beinhaltet die Verwendung aller Wellenformkerne mit jeglichem Wiederholungsvermögen, die in der Lage sind, Ionenkanäle in lebenden Zellen selektiv zu aktivieren. Der Kern ist die wiederholbare Struktur, die die Basis der Stimulationsfolge bildet. In 4 ist der Kern ein biphasischer Rechteckpuls, er könnte aber prinzipiell jede zeitbeschränkte Wellenfunktion sein. Die Zeitdauer des Kerns legt die maximale Rate, mit der er wiederholt werden kann, fest. Das Wiederholungsverfahren bestimmt, wie und wann der Kern der Probe präsentiert wird. In 4 ist die Wiederholungsrate festgelegt und bleibt für insgesamt zehn Zyklen gleich. Die Wiederholungsrate muss jedoch nicht festgelegt werden.
  • Darüber hinaus kann der Kern während der Stimulationsfolge verändert werden, so dass jedes Mal, wenn das Wiederholungsverfahren einen Stimulationspuls erforderlich macht, eine andere Wellenfunktion verwendet werden könnte. Darüber hinaus könnte ein Feedback-Mechanismus verwendet werden, um den Kern und/oder das Wiederholungsverfahren basierend auf der gemessenen Reaktion des Systems zu verändern.
  • Die Verwendung eines Generators anwenderdefinierter Wellenformen zur Erzeugung der Stimulationskerne und -folgen ermöglicht eine praktisch unbegrenzte Variation der Wellenform, um die elektrische Stimulation auf eine bestimmte Zellart oder einen spezifischen Ionenkanal abzustimmen. Die Pulsfolge kann leicht über die Veränderung einer Reihe einzeln steuerbarer Komponenten reguliert werden.
  • 1. Die Form der einzelnen Pulse.
  • Der Wellenformkern, der während der Stimulationsfolge wiederholt wird, kann mit nahezu endlosen Permutationen unter Verwendung eines digitalen Generators anwenderdefinierter Wellenformen, wie z.B. Tektronix AFG 310, verändert werden. 5 zeigt eine schematische Darstellung einer biphasischen Rechteck-Wellenform, um einige der Variablen, die reguliert werden können, darzustellen. In 5 besteht die Pulsfolge aus einem Startfeld E1 (400), das eine Zeit t1 dauert, einem schnellen Anstieg des Potentials (410), der eine Zeit t2 dauert, bis er ein erstes Stimulationsfeld E2 (420) erreicht, das eine Zeit t3 dauert, einer schnellen Verringerung des Potentials (430), die eine Zeit t4 dauert, bis sie ein zweites Stimulationsfeld (440) E3 erreicht, das eine Zeit t5 dauert, einem schnellen Anstieg des Potentials (460), der eine Zeit t6 dauert, bis er das Endfeld (470) E4 erreicht, dass eine Zeit t7 dauert, bis der Zyklus wiederholt wird. Die Stärke und Polarität der elektrischen Felder E1 bis E4 sind einzeln steuerbar und können wie nachfolgend beschrieben sowohl statisch als auch dynamisch verändert werden. Die Zeiten, über die die elektrischen Potentiale an den Zellen angelegt werden, sprich die Zeiten t1, t3, t5 und t7, sind ebenfalls einzeln steuerbar und können, wie nachfolgend beschrieben, sowohl statisch als auch dynamisch zwischen 0 und 10 s während einer Wellenfolge verändert werden. Schließlich können die Änderungen des Potentials, die über die Zeiten t2, t4 und t6 erfolgen, über variable Zeitspannen zwischen 0 und 100 ms erfolgen und können entweder linear oder nicht linear sein, um Wellenformen variabler Formen zu erzeugen.
  • Einige Beispiele dieser Arten von Variierung der Wellenform sind in 6 gezeigt. (a) Biphasische Wellenform, wie in 5 gezeigt, wiederholt mit einer Rate f. (b) Eine modifizierte biphasische Wellenform.
  • Ein kurzes Intervall wurde zwischen den Stimulationsphasen der Wellenfolge eingefügt. Dies ermöglicht, dass Strom durch die Kanäle fließt, deren Inaktivierung während des ersten Pulses aufgehoben wurde. (c) Monophasische Wellenform. Nur die Inaktivierung von Kanälen auf der Seite der Zelle, die gegenüber der Anode liegt, wird aufgehoben. (d) Eine rampenartige Wellenform. Die Inaktivierung der der Anode gegenüber liegenden Kanäle wird durch die quadratische Welle aufgehoben. Die Kanäle werden aktiviert und lassen während des rampenartigen Verlaufs Strom hindurch fließen. Der Anstieg ermöglicht, dass die Kanäle sich öffnen und Strom bei negativeren lokalen Potentialen fließen lassen, so dass, sogar wenn die Zelle nahe dem Umkehrpotential für Natriumionen ist, noch immer große Ströme fließen können. Der Punkt entlang des rampenartigen Verlaufs, an dem die Kanäle sich öffnen, variiert. (e) Eine biphasische Dreiecks- oder Sägezahn-Wellenform. Der rampenartige Verlauf kann ermöglichen, dass die spannungsabhängigen Übergänge zwischen Zuständen einheitlicher ablaufen als die allgemeinen Änderungen des Membranpotentials. Auch monophasische dreieckige Wellenformen sind möglich. (f) Eine sinusoidale Wellenform. Diese Art von Wellenform kann elektrisches Rauschen während der Stimulation mit hohen Frequenzen verringern. (g) Ein kurzer Impulsstoß sinusartiger Wellenformen. (h) Impulsstöße sinusartiger Wellenformen, jeder mit verschiedenen Grundfrequenzen. Diese Art von Stimulation kann sich für das Erforschen von Plastizitäts-Wirkungen als nützlich erweisen. Der erste Impulsstoß bzw. die ersten Impulsstöße werden verwendet, um das System zu trainieren oder einen Prozess zu beginnen, während der/die nachfolgende(n) Impulsstoß/Impulsstöße verwendet wird/werden, um das System zu testen.
  • Variationen der Wellenform-Form können nützlich sein, um feste Stimulationskonditionen während der Pulsfolge beizubehalten. Zum Beispiel werden die Abweichungen des Transmembranpotentials, die eine hoch polarisierte Zelle erfährt, variieren, wenn sich ihr durchschnittliches Transmembranpotential von etwa -90 mV zu Beginn des Stimulationszyklus auf etwa +60 mV nach mehreren wiederholten Stimulationszyklen verändert. Als Folge variiert das angelegte elektrische Feld, das erforderlich ist, um die Inaktivierung eines Ionenkanals effizient aufzuheben, so, wie das durchschnittliche Potential der Zelle im Verlauf mehrerer Stimulationszyklen variiert. Um diesen Effekt zu berücksichtigen, kann es unter bestimmten Umständen nützlich sein, das relative Gleichgewicht zwischen den positiven (E2) und negativen (E3) Stimulationsphasen mit Fortschreiten der Wellenfolge zu verändern.
  • Einige Zelllinien, zum Beispiel HEK-293, haben ein durchschnittliches Transmembranruhepotential unter der Aktivierungsschwelle einiger spannungsaktivierter Natriumkanäle. In diesen Zellen können sich, während das Transmembranpotential während der Stimulation infolge des Einstroms von Natriumionen ansteigt, die Natriumkanäle unabhängig von der angelegten Elektrostimulation öffnen. Dies kann durch Verwendung eines steilen Strompulses (d.h. durch Erhöhung von t2 und t4) verbessert werden. Dann können die Kanäle für eine definierte Zeit Strom leiten, der gerade über der Aktivierungsspannung liegt, unabhängig vom durchschnittlichen Transmembranpotential der Zelle.
  • 2. Die Gesamtamplitude der einzelnen Pulse (E2 und E3)
  • Die Stärke und Polarität der Pulsamplitude steuert die Abweichungen des relativen Transmembranpotentials, die die Zelle während eines Stimulationspulses erfährt. Die Pulsamplituden können für die ganze Folge verändert werden oder für die einzelnen Pulse, um verschiedene Kanäle und Zellarten aufzunehmen, wie nachfolgend im Einzelnen erläutert werden wird. Im Allgemeinen werden die Stärken von E2 und E3 so ausgewählt, dass sichergestellt ist, dass der Ionenkanal von Interesse wirksam aktiviert wird und dessen Inaktivierung während jedes Stimulationszyklus aufgehoben wird, während die Stärke gleichzeitig nicht groß genug ist, um eine irreversible Elektroporation der Zellen auszulösen. Bevorzugte Pulsamplituden für E2 und E3 liegen bei den meisten Ionenkanälen typischerweise im Bereich zwischen 5 und 60 V/cm, wenn sie in nicht erregbaren Säugetierzellen mit durchschnittlichen Größen von 10 bis 25 μm exprimiert werden und können bezüglich der Masse entweder positiv oder negativ variieren. Wie weiter oben angeführt, können die Amplituden der Stimulation während der Pulsfolge verändert werden, um stabile Stimulationsbedingungen beizubehalten, wenn das durchschnittliche Transmembranpotential sich ändert. Bevorzugte Pulsamplituden sind umgekehrt abhängig von der durchschnittlichen Zellgröße. Das Verfahren kann somit auch bei Zellen verwendet werden, die kleiner oder größer als 10 bis 25 μm sind, indem die Pulsamplitude verändert wird.
  • 3. Die Dauer der einzelnen Pulse (t3 und t5)
  • Viele Kanäle erfordern Änderungen des Transmembranpotentials für längere Zeiträume, um die Inaktivierung vor der Öffnung aufzuheben. Viele spannungsabhängige Natriumkanäle müssen zum Beispiel im Allgemeinen einige Millisekunden lang ein Transmembranpotential unter -90 mV erfahren, bevor die Inaktivierung aufgehoben wird. Die effiziente Verwendung des Elektrostimulationsprotokolls erfordert somit typischer weise, dass die Dauer der Pulse t3 und t5 ausreichend lang ist, um eine vollständige oder fast vollständige Aufhebung der Inaktivierung für den Ionenkanal von Interesse zu ermöglichen. In einigen Fällen kann es wünschenswert sein, die Stärke von t3 und t5 anzupassen, um in einer Zelle, die mehrere Arten von Ionenkanälen exprimiert, die selektive Aufhebung der Inaktivierung für eine Art von Ionenkanälen zu ermöglichen, jedoch nicht für eine andere Art von Ionenkanälen. In anderen Fällen kann es wünschenswert sein, t3 und t5 sehr klein zu machen, um niedrige Stufen der Aufhebung der Inaktivierung für die Kanäle zu erreichen. Typischerweise wird die bevorzugte Pulsdauer mit der charakteristischen Zeit für die Übergänge zwischen den gewünschten spannungsabhängigen Zuständen für den Ionenkanal von Interesse gematcht und diese liegen für die meisten Ionenkanäle typischerweise im Bereich von etwa 0,1 bis 100 msec.
  • Um die übermäßige Elektrolyse von Wasser und die daraus folgende Bildung von Gasblasen zu vermeiden, sollte die Dauer der Pulse t3 und t5 so kurz wie möglich gehalten werden, wobei sie immer noch die gewünschte Elektrostimulation erzeugen. Die Elektrolyse von Wasser an Metall/Wasser-Grenzflächen tritt typischerweise dann auf, wenn das Ausmaß der Spannungsdifferenz zwischen dem Metall und dem Wasser etwa 0,8 V übersteigt. In einigen Fällen führen die Stimulationsparameter, die erforderlich sind, um eine zelluläre Stimulation auszulösen, ebenfalls zur Elektrolyse von Wasser. Ein gewisses Maß an Gasbildung an den Elektroden ist typischerweise akzeptabel, solange die Ladung pro Einheitsbereich der Elektroden/Wasser-Grenzfläche, die während jeder einzelnen Polaritätsphase eines einzelnen Pulses auftritt, unter etwa 100 μC/mm2 liegt. Ein Überschreiten dieser Grenze führt typischerweise zur Entwicklung von Gas und zur Bildung von Blasen, was die Einheitlichkeit des Feldes signifikant beeinflusst. Durch das Auftreten von Blasen an den Oberflächen der Elektroden wird dieser Teil der Elektrode verdeckt und kann zu Veränderungen der Einheitlichkeit des elektrischen Feldes führen. Die Bildung großer Mengen von Gas kann auch zu oxidativen Schäden an den Zellen und den Farbstoffen im Well führen.
  • In einer 96-Well-Platte mit 100 μL physiologischer Kochsalzlösung mit einem Widerstand von 70 Ω-cm, beträgt der Widerstand der Salzlö sung zwischen zwei parallelen Plattenelektroden mit einem Abstand von 4 mm zwischen diesen, die mit einem Abstand innerhalb von 0,5 mm zum Boden des Wells in das Well eingebracht wurden, annähernd 230 Ω. Jede Elektrode hat mit der Salzlösung eine Kontaktfläche von etwa 24 mm2. Somit sollte jede Einzelpolaritätsphase des Stimulationsprotokolls nicht mehr als etwa 2,4 mC Ladung ergeben. Ein Spannungsunterschied von etwa 10 V, der zwischen den Platten angelegt wird, erzeugt ein elektrisches Feld von etwa 25 V/cm in der Salzlösung. Diese Spannung zieht etwa 43 mA Strom. Somit sollte bei dieser Elektrodenkonfiguration ein Einzelpolaritätsimpuls mit Rechteckwelle die Dauer von etwa 55 Millisekunden nicht überschreiten, um die Ladung auf unter 2,4 mC zu beschränken.
  • 4. Die Lücke zwischen aufeinander folgenden Stimuli (t1 und t7)
  • Die Veränderung der Werte t1 und t7 entweder allgemein für die Folge oder für jeden einzelnen Puls während der Folge ist nützlich für die Optimierung des Stimulationsprotokolls für spezifische Ionenkanäle. Das Verfahren ist darüber hinaus auch nützlich für die Bestimmung bestimmter Eigenschaften von Zellen und Kanälen, einschließlich der Kanalöffnungszeit sowie des Zeitverlaufs der Aktivierung und Inaktivierung von Kanälen.
  • Zum Beispiel ermöglicht bei Assays, die spannungsregulierte Natriumkanäle beinhalten, das Einfügen einer Zeitverzögerung (t1 + t7) zwischen den Pulsen, die gleich oder niedriger ist als die durchschnittliche Öffnungszeit der Natriumkanäle, eine quantitative Messung der Inaktivierungskinetik des Kanals. Die Inaktivierungskinetik steht in direktem Bezug zu der durchschnittlichen Kanalöffnungszeit. Somit ermöglichen Assays, die kurze Intervalle zwischen den Pulsen verwenden, den Nachweis von Verbindungen, deren primäre Wirkung eine Wirkung auf die Inaktivierungskinetik ist; dies stellt einen Mechanismus dar, der auf andere Weise durch die Verwendung von Verfahren mit hohem Durchsatz nicht zugänglich ist.
  • In den meisten Fällen wäre die Zeitverzögerung zwischen aufeinander folgenden Stimuli weniger als die Membranzeitkonstante, um anhaltende Anstiege des Transmembranpotentials zu erhalten. Typischerweise liegen die optimalen Stimulationsfrequenzen (f) innerhalb des Bereichs τM -1 ≤ f ≤ τb -1, wobei τM die Zeitkonstante für den Abfall der Änderungen des Transmembranpotentials und τb die durchschnittliche Kanalöffnungszeit ist. Einige Kanäle werden nicht inaktiviert und bei diesen Zellen kann die Stimulationsfrequenz empirisch bestimmt werden. Darüber hinaus kann die Stimulationsfrequenz f den Kehrwert der Zeitdauer des Stimulationskerns nicht übersteigen.
  • Darüber hinaus kann es sich bei bestimmten Zellarten als wünschenswert erweisen, mit einer niedrigeren Rate zu stimulieren. Niedrigere Stimulationsraten können zum Beispiel bei Zellen mit hohen Kanaldichten bevorzugt werden, oder bei Assays, in denen eine höhere pharmakologische Sensitivität erforderlich ist. In diesen Fällen könnte alternativ eine monopolare Stimulation verwendet werden. Diese würde nur die Inaktivierung der Natriumkanäle auf einer Seite der Zelle aufheben, aber die maximale Stimulationsfrequenz würde sich verdoppeln.
  • 5. Die Dauer der Pulsfolgen oder die Zahl von Pulsen in der Folge.
  • Die Eigenschaften von Zellen und Kanälen können sowohl im dynamischen (d.h. Anstiegs- und Abfallszeiten, Veränderungen der Reaktionsform, etc.) als auch im statischen Modus getestet werden. Beide Modi erfordern Stimulationsfolgendauern, die lang genug sind, um alle Ereignisse von Interesse zu untersuchen, jedoch nicht länger als notwendig, um den Assay abzuschließen. Typische Stimulationszeiten umfassen Pulse von 10 msec bei 25 V/cm mit einer Wiederholungsfrequenz von 20 Hz über drei Sekunden. Die Anpassung dieser Parameter macht es möglich, dass die Assay-Zeiten verringert werden, oder dass Prozesse mit sowohl schnellen als auch langsamen Zeitskalen untersucht werden können.
  • 6. Folgen mit mehreren Pulsen.
  • In einigen Fällen ist es nützlich, Pulsfolgen zu wiederholen oder die Messung der gleichen Zellen mit zwei verschiedenen Pulsfolgen durchzuführen. Ein Beispiel wäre die vollständige Charakterisierung der Eigenschaften eines Kanals durch die Messung der Reaktion als eine Funktion der Stimulationsfrequenz und -dauer unter Verwendung einer einzelnen Platte von Zellen, die mehreren Stimulationsfolgen unterzogen wird. Ein weiteres Beispiel wäre die Untersuchung der Plastizität der Reaktion (d.h. aktivitätsabhängige Änderungen der Reaktion). Eine oder mehrere Stimu lationsfolgen würden die Reaktion konditionieren, während Sätze von Messfolgen vor und nach der Konditionierung die Änderungen aufgrund der Aktivität bestimmen würden.
  • Feedback von Stimulationsparametern basierend auf dynamischen Mes sungen der Reaktion.
  • Die vorliegende Erfindung kann auch verwendet werden, um ein Voltage-Clamp-Element zu bilden, indem eine dynamische Feedbackschleife verwendet wird, um das durchschnittliche Transmembranpotential bei einem vorab festgelegten Wert konstant zu halten. Durch die Messung des Transmembranpotentials unter Verwendung eines schnell fluoreszierenden Ausgangs, wie nachfolgend beschrieben, und einer nachfolgenden Veränderung der Stimulationsparameter, um jede mögliche Änderung des Transmembranpotentials zu kompensieren, ist es möglich, das Transmembranpotential der Zellen dynamisch zu steuern. Der Strom, der erforderlich ist, um das Potential aufrecht zu erhalten, wird dann über die Computersteuerung der Stimulationsparameter bestimmt.
  • Verwendung von Hochfrequenzstimulation zur Vermeidung der Elektrolyse
  • Bei typischen Stimulationsparametern fließt ein Spitzenstrom von annähernd 50 mA durch die Lösung zwischen den Elektroden. In diesem Zeitraum kommt es zu verschiedenen elektrochemischen Reaktionen, die typischerweise toxische Produkte für die Zellen erzeugen. Vorausgehende Experimente haben gezeigt, dass die meisten Säugetierzellen bei einer Elektrostimulation unter Verwendung von Elektroden aus rostfreiem Stahl für eine Zeitspanne von ungefähr zwei Minuten normal reagieren. Eine verlängerte Stimulation über längere Zeitspannen scheint aber zu einem Verlust der Zellegesundheit und -entwicklungsfähigkeit zu führen. Bei ausreichend hohen Pulsfrequenzen, so dass die Grenzfläche zwischen Metall und Salzlösung das Potential für die Elektrolyse von Wasser nicht erreicht (ungefähr ± 1 V bei rostfreiem Stahl in Salzlösung), kann Strom kapazitiv geleitet werden, und es werden keine toxischen Produkte gebildet. Bei dem in 1 gezeigten Elektrostimulator, bei dem jede Elektrode einen Bereich von etwa 24 mm2 hat, der mit der Salzlösung in Kontakt steht, liegt die Kapazität pro Elektrode bei ungefähr 1-10 μF (Robinson, 1968, Proc. IEEE 56:1065-1071). Bei 50 mA lädt sich diese Kapazität in ungefähr 20-200 μs auf 1 V auf. Das ist an der unteren Grenze der nützlichen Pulsdauerzeiten.
  • Alternativ besteht die Möglichkeit, die Elektrostimulation durchzuführen, ohne elektrolytische Produkte zu erzeugen. Es stehen einige Verfahren zur Verfügung, die die Kapazität der Grenzfläche zwischen Metall und Salzlösung um Faktoren von 2 bis 100 erhöhen können. Diese beinhalten die Aufrauung von Oberflächen, die Plattierung mit Platinschwarz oder Goldschwarz und die Abscheidung mit und Aktivierung von Iridium/Iridiumoxid, Titan/Titannitrid oder Polypyrrolfilmen. Bei Verwendung von Stimulationsparametern, die irreversible elektrochemische Reaktionen vermeiden, degenerieren diese Oberflächenbeschichtungen nicht, wenn Strom fließt.
  • VI. Expression von Ionenkanälen
  • a) Auswahl der Zellart
  • Die vorliegende Erfindung kann mit allen Zellarten, einschließlich tierischen Zellen, Pflanzenzellen, Insektenzellen, Bakterienzellen, Hefe- und Säugetierzellen, verwendet werden. Für das Screening nach Therapeutika für den Menschen werden Säugetierzelllinien bevorzugt; diese Zelllinien beinhalten Gewebekulturzelllinien, die relativ leicht gezüchtet werden können und leicht mit hoher Effizienz transfiziert werden können. Viele Gewebezelllinien sind über die Amerikanische Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (ATCC = American Type Culture Collection), siehe (http://www.atcc.orq), sowie über die Europäische Sammlung von Zellkulturen (ECACC = European Collection of Cell Cultures) (http://www.camr.org.uk) kommerziell erhältlich.
  • Darüber hinaus werden in einigen Fällen auch Primärzelllinien oder Gewebescheiben für das Screening bevorzugt, wenn es erforderlich ist, die Reaktion des Ionenkanals von Interesse in seinem natürlichen physiologischen Umfeld zu exprimieren oder zu messen. Dieser Lösungsansatz kann entweder als primäres oder sekundäres Screening nützlich sein, um nach Spezifität, Selektivität oder Toxizität der Kandidatentherapeutika zu screenen und wird detailliert in Abschnitt X erläutert.
  • Für Assays, die mit Kultur-Zelllinien durchgeführt werden, ist das Hauptauswahlkriterium das Transmembranruhepotential der Zelllinie und das Vorhandensein endogen exprimierter Ionenkanäle. Die Auswahl pas sender Zelllinien für spezifische Ionenkanäle von Interesse hängt von den spannungsabhängigen Eigenschaften und der Ionenselektivität des Ionenkanals von Interesse ab. Diese Erwägungen werden für eine Reihe von Ionenkanälen detailliert in Abschnitt VIII, Stimulationsprotokolle, behandelt.
  • In einigen Fällen ist es wünschenswert, eine Zelllinie zu verwenden, die keine (oder eine sehr geringe) nachweisbare endogene Expression von anderen Ionenkanälen aufweist. Zellen dieser Art beinhalten CHO-K1-, CHL- und LTK(-)-Zellen. Diese Zellen haben ein inhärentes Ruhepotential in einem Bereich zwischen +10 bis -30 mV, was über den Aktivierungs- und Inaktivierungsschwellen der meisten spannungsabhängigen Kanäle liegt. Die Verwendung dieser Zelllinien hat den Vorteil, dass der Ionenkanal von Interesse der Hauptmodulator des Transmembranpotentials innerhalb der Zellen ist, so dass die Screening-Assay-Daten im Allgemeinen leicht und eindeutig interpretiert werden.
  • In einigen Fällen ist die Verwendung einer Zelllinie ohne anderer Ionenkanäle eventuell nicht sinnvoll, um einen praktikablen Assay zu bilden. Es kann zum Beispiel notwendig sein, ein spannungsreguliertes Ion bei einem stark polarisierten Transmembranpotential zu halten. In diesem Fall ist es notwendig, das Transmembranpotential über die Expression eines zweiten Ionenkanals zu steuern. Das Testen eines Natriumkanals eines Rattengehirns Typ II a im Ruhezustand erfordert, dass das Transmembranpotential unter dem Schwellenaktivierungspotential des Natriumkanals gehalten wird, in diesem Fall etwa -60 mV. Um dies zu erreichen, ist es notwendig, entweder einen Ionenkanal, wie z.B. einen Kalium-Einwärts-Gleichrichter, der das Transmembranruhepotential der Zelle bei etwa -90 mV halten kann, zu koexprimieren oder eine Zelllinie zu identifizieren, die ähnliche Ionenkanäle endogen exprimiert. Zellarten dieser Art beinhalten RLB-Zellen und HEK-293-Zellen.
  • In anderen Fällen kann es notwendig sein, die Expression eines zweiten Ionenkanals in Verbindung mit der Elektrostimulation zu verwenden, um die Zellmembran zu einem bestimmten Transmembranpotential zu bewegen, um zu ermöglichen, dass der erste Ionenkanal von Interesse getestet werden kann. Beispiele für diese Situation treten beim Testen nicht spannungsregulierter Ionenkanäle, wie zum Beispiel ligandenabhän giger Kanäle auf. Die Koexpression eines spannungsregulierten Natriumkanals kann zum Beispiel in Verbindung mit der Elektrostimulation verwendet werden, um das Transmembranpotential auf Transmembranpotentiale zwischen etwa +10 bis +60 mV einzustellen. Im Vergleich kann die Koexpression spannungsregulierter Kaliumkanäle in Verbindung mit der Elektrostimulation das Transmembranpotential auf Transmembranpotentiale zwischen etwa -90 bis -30 mV einstellen. Diese Lösungsansätze ermöglichen somit die effektive Manipulation des Transmembranpotentials über einen relativ breiten Bereich, womit die Analyse von praktisch jedem Ionenkanal ermöglicht wird.
  • Typischerweise ist es bei Verwendung dieses Koexpressionsansatzes notwendig, alle Treffer die mit der Zelllinie, die beide Ionenkanäle koexprimiert, erzielt wurden, mit der Zelllinie, die nur den Ionenkanal exprimiert, der verwendet wird, um das Transmembranpotential festzulegen, nochmals zu screenen. Dies ermöglicht die Unterscheidung von Medikamenten, die diesen zweiten Ionenkanal beeinflussen, von den Medikamenten, die tatsächlich den Ionenkanal von Interesse beeinflussen. Alternativ können selektive Toxine, wie zum Beispiel TTX verwendet werden, um eine Art von Ionenkanal selektiv zu hemmen.
  • b) Transfektion von Ionenkanälen
  • Nucleinsäuren, die verwendet werden, um Zellen mit Sequenzen, die für die Expression des Ionenkanals von Interesse kodieren, zu transfizieren, liegen typischerweise in Form eines Expressionsvektors einschließlich Expressionssteuerungssequenzen, die funktionsmäßig mit einer Nucleotidsequenz verbunden sind, die für die Expression des Kanals kodiert, vor. Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Nucleotidsequenz, die für die Expression eines Kanals kodiert", auf eine Sequenz, die nach Transkription und Translation von mRNA den Kanal erzeugt. Dieser kann Sequenzen beinhalten, die z.B. Introns enthalten. Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Expressionssteuerungssequenzen" auf Nucleinsäuresequenzen, die die Expression einer Nucleinsäuresequenz regulieren, mit der sie funktionsmäßig verbunden sind. Expressionssteuerungssequenzen sind funktionsmäßig mit einer Nucleinsäuresequenz verbunden, wenn die Expressionssteuerungssequenz die Transkription und ggf. auch die Translation der Nucleinsäuresequenz steuert und reguliert. Die Ex pressionssteuerungssequenzen können somit folgende Komponenten enthalten: adäquate Promotoren, Enhancer, Transkriptionsterminatoren, ein Startcodon (d.h. ATG) vor einem proteinkodierenden Gen, Splicing-Signale für Introns, Aufrechterhaltung des korrekten Leserahmens dieses Gens, um eine korrekte Translation der mRNA zu ermöglichen und Stoppcodons.
  • Dem Fachmann bekannte Verfahren können verwendet werden, um Expressionsvektoren zu bilden, die die Sequenz enthalten, die den Ionenkanal kodiert, die mit adäquaten Lokalisierungs- oder Zieldomänen und adäquaten Transkriptions-/Translationssteuerungssignalen funktionsmäßig gekoppelt sind. Zum Beispiel kann mit Bezug auf die Sequenzakzessionsnummern oder Referenzen in Tabelle 1 bis 3 ein durchschnittlich ausgebildeter Fachmann die Sequenzen des Ionenkanals von Interesse identifizieren. Diese Verfahren beinhalten rekombinante in vitro DNA-Verfahren, synthetische Verfahren und rekombinante/genetische in vivo Rekombination (Siehe zum Beispiel die in Maniatis, et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., 1989 beschriebenen Verfahren). Viele handelsübliche Expressionsvektoren sind über eine Vielzahl von Quellen, einschließlich Clontech (Palo Alto, CA), Stratagene (San Diego, CA) und Invitrogen (San Diego, CA) sowie über viele weitere kommerzielle Quellen erhältlich.
  • Eine in Erwägung gezogene Version des Verfahrens ist die Verwendung induzierbarer Nucleotidsteuerungssequenzen, um einen plötzlichen Anstieg der Expression des Ionenkanals von Interesse zu erzeugen, zum Beispiel durch die Induktion der Expression des Kanals. Beispiele für induzierbare Systeme beinhalten das induzierbare Tetrazyklinsystem, das zuerst von Bujard und Kollegen (Gossen and Bujard (1992) Proc. Natl. Acad. Sci USA 89 5547-5551, Gossen et al. (1995) Science 268 1766-1769) beschrieben wurde und im US-Patent Nr. 5,464,578 beschrieben ist.
  • Die Transformation einer Wirtszelle mit rekombinanter DNA kann mittels konventioneller Verfahren durchgeführt werden, die dem Fachmann hinlänglich bekannt sind. Wenn der Wirt prokaryontisch ist, wie zum Beispiel E. coli, können kompetente Zellen, die in der Lage sind, DNA aufzunehmen, aus Zellen, die nach einer exponentialen Wachstumsphase geerntet wurden, vorbereitet und nachfolgend mit dem CaCl2-Verfahren durch dem Fachmann hinlänglich bekannte Verfahren behandelt werden. Alternativ können MgCl2 oder RbCl verwendet werden. Die Transformation kann auch nach Bildung eines Protoplasten aus der Wirtszelle oder durch Elektroporation erfolgen.
  • Wenn der Wirt ein Eukaryot ist, können Verfahren zur Transfektion von DNA verwendet werden wie Ko-Präzipitate von Calciumphosphat, konventionelle mechanische Verfahren wie zum Beispiel Mikroinjektion, Elektroporation, Einbringen eines in Liposomen eingeschlossenen Plasmids oder Virusvektoren. Eukaryontische Zellen können auch mit DNA-Sequenzen, die den Ionenkanal kodieren, ko-transfiziert werden, und auch mit einem zweiten fremden DNA-Molekül, das einen wählbaren Phänotyp kodiert, wie zum Beispiel das Herpes-Simplex-Thymidinkinasegen. Ein weiteres Verfahren ist die Verwendung eines eukaryontischen viralen Vektors, wie zum Beispiel des Affenvirus 40 (SV40) oder des Rinder-Papillomavirus, um eukaryontische Zellen vorübergehend zu infizieren oder zu transformieren und den Ionenkanal zu exprimieren. (Eukaryotic Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, Gluzman ed., 1982). Vorzugsweise wird als Wirtszelle, wie hier beschrieben, ein eukaryontischer Wirt verwendet.
  • Die Auswahl stabiler Klone erfolgt typischerweise auf der Basis der erfolgreichen Expression des Ionenkanals von Interesse auf einem ausreichend hohen Niveau, um dessen einfachen Nachweis zu ermöglichen. In vielen Fällen wird diese Analyse eine funktionelle Charakterisierung einzelner Klone erforderlich machen, um diejenigen zu identifizieren, die die adäquaten elektrophysiologischen Eigenschaften aufweisen, die mit der Expression des Klons von Interesse übereinstimmen. Diese Analyse kann durch die Verwendung des Patch-Clamp-Verfahrens vervollständigt werden, oder über die Messung von Transmembranpotentialen unter Verwendung von transmembranpotential-sensitiven Farbstoffen, wie nachfolgend beschrieben. Ein Vorteil der Verwendung dieses zuletzt erwähnten Verfahrens besteht darin, dass es mit der Sortierung nach fluoreszenzaktivierten Zellen kompatibel ist und die schnelle Analyse von vielen Tausenden von einzelnen Klonen pro Sekunde ermöglicht. In einigen Fällen, in denen der Natriumkanal in der Zelle im Ruhezustand elektrisch inaktiv ist, kann die Bestätigung der Expression auch einfach durch Immunochemie erfolgen, indem Antikörper verwendet werden, die gegen die natürlichen Ionenkanäle gebildet werden, oder ein definiertes Epitop über molekulare Verfahren wie die oben Beschriebenen in den Ionenkanal eingebracht wird.
  • In Fällen, in denen Zellen mit einem ersten Ionenkanal von Interesse und einem zweiten Ionenkanal, um das Transmembranpotential festzulegen, transfiziert werden, ist die Optimierung der relativen Expression beider Ionenkanäle wichtig. Typischerweise wird die optimale relative Expression der beiden Ionenkanäle empirisch durch die Auswahl von Klonen bestimmt, die die maximale dynamische Bandbreite und die minimale statistische Abweichung ihrer Reaktion bieten.
  • VII. Messung von Transmembranpotentialen
  • Änderungen des Transmembranpotentials und die Messung der Leitfähigkeit spezifischer Ionenkanäle durch die Verwendung der vorliegenden Erfindung können mittels aller bekannten Verfahren zur Messung des Transmembranpotentials oder von Ionenbewegungen nachgewiesen werden. Diese Verfahren beinhalten zum Beispiel das Patch-Clamp-Verfahren (Hamill et al., Pfluegers Arch. 391:85-100, 1981), auf FRET basierende Spannungssensoren, elektrochromische Transmembranpotential-Farbstoffe (Cohen et al., Annual Reviews of Neuroscience 1: 171-82, 1978), Transmembranpotential-Umverteilungs-Farbstoffe (Freedman and Laris, Spectroscopic membrane probes Ch 16, 1988), extrazelluläre Elektroden (Thomas et. al., Exp. Cell Res. 74: 61-66, 1972), Feldeffekttransistoren (Fromherz et al., Science 252: 1290-1293, 1991) radioaktive Fluss-Assays, ionen-sensitive fluoreszierende oder lumineszierende Farbstoffe, ionen-sensitive fluoreszierende oder lumineszierende Proteine, die Expression endogener Proteine oder die Verwendung von Reporter-Genen oder Molekülen.
  • Bevorzugte Analyseverfahren für das Screening mit hohem Durchsatz beinhalten typischerweise die Verwendung optischer Auslesungen des Transmembranpotentials oder der Leitfähigkeit von Ionenkanälen. Diese Verfahren beinhalten die Verwendung von transmembranpotential- oder ionen-sensitiven Farbstoffen oder Molekülen, die typischerweise eine Veränderung ihrer fluoreszierenden oder lumineszierenden Eigenschaften als Ergebnis von Veränderungen der Leitfähigkeit von Ionenkanälen oder des Transmembranpotentials aufweisen.
  • Ein bevorzugtes optisches Analyseverfahren zur Verwendung mit der vorliegenden Erfindung wurde im US-Patent Nr. 5,661,035, erteilt am 26. August 1997, beschrieben. Dieser Lösungsansatz umfasst typischerweise zwei Reagenzien, die einer Energieübertragung unterzogen werden, um eine ratiometrische fluoreszierende Auslesung zu erzielen, das vom Transmembranpotential abhängig ist. Bei diesem Ansatz werden typischerweise ein spannungs-sensitiver lipophiler Farbstoff und ein nicht spannungs-sensitives Fluorohpor, das mit einer Zellmembran assoziiert ist, verwendet (siehe Gonzalez et al. Drug Discovery Today 4:431-439, 1999).
  • In einer Ausführungsform werden zwei Farbstoff-Moleküle, ein mit Cumarin verwandtes Phospholipid (CC2-DMPE) und ein Oxonol-Farbstoff wie z.B. bis-(1,2-Dibutylbarbituratsäure) Trimethinoxonol [DiSBAC4(3)] in die Plasmamembran von Zellen eingebracht. CC2-DMPE ist Teil des äußeren Blatts der Plasmamembran, wo es als fester FRET-Donor für den beweglichen, spannungs-sensitiven Oxonol-Akzeptor agiert. Zellen mit relativ negativen Potentialen in ihrem Inneren schieben das negativ geladene Oxonol zum äußeren Blatt der Plasmamembran, was zu effizientem FRET (d.h. Abfangen des Cumarin-Donors und Erregung des Oxonol-Akzeptors) führt. Die Depolarisation führt zu einer schnellen Translokation des Oxonols an die innere Oberfläche der Plasmamembran, was zu einem verringerten FRET führt. Da FRET nur über Distanzen von weniger als 100 Å erfolgen kann, führt die Erregung des Cumarins zur spezifischen Überwachung der Oxonolbewegungen innerhalb der Plasmamembran.
  • Die Reaktionszeiten für diese Assays können leicht durch Erhöhung oder Verringerung der Hydrophobie des Oxonols verändert werden. Zum Beispiel hat das hydrophobere Dibutyl-Oxonol DiSBAC4(3) eine Zeitkonstante von ungefähr 10 ms, deutlich schneller als die des weniger hydrophoben Diethyl-Oxonols DiSBAC2(3).
  • Das Einbringen der Farbstoffe erfolgt typischerweise bei Raumtemperatur vor Beginn der Messungen der Transmembranpotentiale. Typischerweise werden die Zellen der Reihe nach mit dem Cumarinlipid gefolgt von dem Oxonol eingebracht. Typischerweise liegen die Ladekon zentrationen für Cumarinlipide zwischen etwa 4 und 15 μM (Endkonzentration) und die Färbelösungen werden typischerweise in Hank's physiologischer Salzlösung mit 10 mM HEPES, 2 g/L Glukose und etwa 0,02 % Pluronic 127 bei einem pH-Wert von etwa 7,2 bis 7,4 zubereitet. Das Einbringen ist normalerweise nach einer Inkubationszeit von etwa 30 Minuten akzeptabel, danach kann überschüssiger Farbstoff entfernt werden, falls dies gewünscht wird. Oxonol-Farbstoffe werden typischerweise bei einer Konzentration zwischen 2 und 10 μM 25 Minuten lang bei Raumtemperatur eingebracht, das hydrophobere DiSBAC4(3) wird normalerweise in Anwesenheit von 2-3 μM Pluronic 127 eingebracht. Die optimalen Beschickungskonzentrationen variieren zwischen verschiedenen Zellarten und können durch Routineexperimente empirisch bestimmt werden. Typischerweise werden diese Optimierungsexperimente durchgeführt, indem die Konzentrationen des ersten Reagens systematisch titriert werden und dann für alle getesteten Konzentrationen die Konzentration des zweiten Reagens titriert wird. Dadurch ist es möglich, sowohl die optimalen Beschickungskonzentrationen für jedes Reagens als auch das optimale relative Verhältnis zum Erzielen eines maximalen Signal-Stör-Verhältnisses zu erhalten.
  • In einigen Fällen kann es bevorzugt sein, einem oder mehreren FRET-Reagenzien eine oder mehrere Licht absorbierende Substanzen hinzuzufügen oder das FRET-Reagens bzw. die FRET-Reagenzien mit einer oder mehren Licht absorbierenden Substanzen zu beschicken, um die unerwünschte Lichtemission zu reduzieren, die zum Beispiel in den gemeinsam genutzten US-Patenten Anmeldenr. 09/118,497, eingereicht am 17. Juli 1998, US-Patent Anmeldenr. 09/120,516, eingereicht am 21. Juli 1998 und US-Patent Anmeldenr. 09/122,477 eingereicht am 23. Juli 1998, beschrieben ist.
  • Auf FRET basierende Spannungssensoren können auch von der Verwendung anderer auf die Membran zielenden Fluorphore in Verbindung mit einem mobilen hydrophoben Donor oder Akzeptor abgeleitet werden. Weitere Verbindungen dieser Art sind zum Beispiel im US-Patent Anmeldenr. 09/459,956, eingereicht am 13. Dezember 1999, veröffentlicht.
  • Die geeignete Instrumentierung für die Messung von Änderungen des Transmembranpotentials mit Hilfe optischer Verfahren beinhaltet Mik roskope, Multiwell-Platten-Leser und andere Instrumente, die in der Lage sind, schnelle, sensitive ratiometrische Fluoreszenznachweise durchzuführen. Ein bevorzugtes Instrument dieser Art ist in der US-Patentanmeldung 09/118,728, eingereicht am 17. Juli 1998, beschrieben. Dieses Instrument (der Spannungs-/Ionensondenleser oder VIPRTM (Voltage/Ion Probe Reader)) ist ein integrierter Flüssigkeits-Handler und kinetischer Fluoreszenzleser für 96-Well- und größere Multiwell-Platten. Der VIPRTM-Leser enthält einen Flüssigkeits-Handler für acht Kanäle, eine Multiwell-Positionierungs-Stufe und ein faseroptisches Beleuchtungs- und Erfassungssystem. Das System ist darauf ausgelegt, die Fluoreszenz von einer Säule von acht Wells vor, während und nach dem Einbringen einer flüssigen Probe, die von einer anderen Mikrotiter-Platte oder -wanne gewonnen wurde, gleichzeitig zu messen. Der VIPRTM-Leser erregt und erfasst Emissionssignale vom Boden einer Multiwell-Platte, indem er acht dreisträngige optische Bündel (ein Bündel für jedes Well) einsetzt. Ein Schenkel der dreisträngigen Faser wird als Erregungsquelle verwendet, wobei die anderen beiden Schenkel der dreisträngigen Faser dazu verwendet werden, die Fluoreszenzemission zu erfassen. Eine Kugellinse am Ende der Faser erhöht die Effizienz der Lichterregung und -aufnahme. Die zweisträngigen Emissionsfasern ermöglichen es dem Leser, zwei Emissionssignale gleichzeitig zu erfassen und sind kompatibel mit schnellen Signalen, die von den FRET-basierenden Spannungs-Farbstoffen generiert werden. Photovervielfacherröhren erfassen dann die Emissionsfluoreszenz, womit die Erfassung von Emissionsverhältnissen unter einer Sekunde ermöglicht wird.
  • VIII. Stimulationsprotokolle
  • In einem Aspekt beinhaltet die vorliegende Erfindung Verfahren für die Modulation des Transmembranpotentials lebender Zellen über Elektrostimulation und die Verwendung dieser Verfahren für das Testen der Aktivität von praktisch jedem Ionenkanal oder Transportsystem.
  • a) Messung spezifischer Kanal-Leitfähigkeiten
  • 1. Assay von Natriumkanälen
  • Es wurde eine Vielzahl verschiedener Isoformen von spannungsabhängigen Säugetier-Natriumkanälen bestimmt; diese sind nachfolgend in Tabelle 1 zusammengefasst. Diese Kanäle können in drei Hauptgruppen eingeteilt werden (zur Nachprüfung siehe Goldin, Annals N.Y. Academy of Sciences 868:38-50, 1999).
  • Figure 00630001
  • Figure 00640001
  • Die Unterschiede zwischen den spannungsabhängigen Natriumkanälen in Tabelle 1 bezüglich ihrer Spannungsabhängigkeit und Inaktivierungs- und Aktivierungskinetik sind groß. Spannungsabhängige Natriumkanäle haben viele verschiedene Konformationen, die in drei Zustände eingeteilt werden können. (1) Der Ruhezustand, in dem der Kanal geschlossen ist und kein Strom fließen kann. Dies ist der typische Zustand, wenn ein Natriumkanal in einer Zelle mit einem Transmembranruhepotential von unter etwa -60 mV exprimiert wird. Der Kanal kann schnell durch Depolarisierung in den offenen Zustand gebracht werden, normalerweise auf ein Transmembranpotential von über etwa -50 mV. (2) Der aktivierte Zustand, in dem der Kanal offen ist und Ionen hindurchströmen können. Da die intrazelluläre Konzentration von Natrium in einer normalen Zelle im Ruhezustand niedrig ist, während die extrazelluläre Konzentration hoch ist, fließen Natriumionen in die Zelle und führen dazu, dass das Transmembranpotential positiver wird. Der offene Zustand hat eine kurze Lebensdauer, im Allgemeinen im Bereich um eine Millisekunde, nach der er wieder in den inaktivierten Zustand übergeht. (3) Der inaktivierte Zustand, in dem ein Kanal geschlossen wurde und keine Ionen durch den Kanal strömen können. Der Kanal kann, wenn er sich einmal im inaktivierten Zustand befindet, nicht direkt geöffnet werden. Er begibt sich zuerst in den Ruhezustand, was geschieht, wenn das Transmembranpotential mehrere Millisekunden lang sehr negativ gehalten wird (im Allgemeinen unter -80 mV). Die Zeitkonstanten und Schwellenpotentiale für Übergänge zwischen diesen drei Zuständen variieren deutlich zwischen Kanal-Subtypen.
  • Während dieser Experimente wird die Reaktion von Zellen mit aktiven Kanälen und von Zellen, bei denen die Kanäle pharmakologisch blockiert sind, verglichen. Wenn kein geeigneter pharmakologischer Wirkstoff verfügbar ist, kann der blockierte Zustand mit einer nicht transfizierten Zelllinie emuliert werden. Die optimalen Stimulationsparameter ergeben den kleinsten Variationskoeffizienten der Signaldifferenz der beiden Zellpopulationen.
  • i) Assays für spannungsabhängige Natriumkanäle in einem inaktivierten Zustand
  • Bevorzugte Zellen beinhalten solche mit Transmembranpotentialen über der Aktivierungsschwelle für den Ionenkanal von Interesse, bei denen keine weiteren Ionenkanäle exprimiert werden. Zellen, die diese Kriterien erfüllen, beinhalten CHL- und LTK(-)-Zellen. Nach Auswahl eines Zielionenkanals werden Zellen transfiziert und Klone werden ausgewählt, wie in Abschnitt III beschrieben ist. Alternativ könnte eine Zelllinie, die den Kanal von Interesse und in geringem Maß andere Kanäle endogen exprimiert, verwendet werden. Die CHO-K1-Zellinie exprimiert zum Beispiel einen spannungsabhängigen Natriumkanal und in sehr geringem Maß andere Ionenkanäle. Die Zellen werden, wie in Abschnitt IV beschrieben, in Multiwell-Miktrotiter-Platten plattiert, kultiviert und mit spannungssensitiven Farbstoffen eingefärbt, bevor die Elektrostimulation initiiert wird. Die anfänglichen Experimente werden typischerweise in einer 96-Well-Multiwell-Platte durchgeführt, mit der gleichen Anzahl von Zellen in jedem Well. Im Allgemeinen werden Säulen von acht Wells gleichzeitig unter identischen Bedingungen stimuliert, um statistisch signifikante Daten über die Abweichungen der Zellreaktion zu ergeben.
  • Ein optimales Elektrostimulationsprotokoll sollte einen der Teil der Plasmamembran eines Großteils der Zellen lange genug hyperpolarisieren, um die Inaktivierung der Natriumkanäle aufzuheben, bevor die Aktivierungs-Depolarisation erfolgt, ohne dass es zu Elektroporation oder einem Abtöten der Zellen kommt. Typischerweise erfordert dies, dass anhaltende Transmembranpotentiale von etwa -60 bis -80 mV für Zeiträume von etwa 0,5 bis etwa 20 ms innerhalb der Zelle generiert werden.
  • Ein bevorzugtes Stimulationsprotokoll, das diese Wirkung erzielt, ist biphasisch, so dass die Inaktivierung von Ionenkanälen an beiden äußeren Rändern der Zellen aufgehoben wird, wenn sich die Polarität der biphasischen Wellenform umkehrt. Typischerweise beginnt man bei Anfangsbedingungen unter Verwendung eines biphasischen Wellenkerns mit einer Rechteckwelle mit 5 msec pro Phase und einer Amplitude von 25 V/cm. Der Kern wird mit einer regelmäßigen Rate von etwa 20 Hz für eine gesamte Folgedauer von etwa drei Sekunden wiederholt. Man optimiert dann die Pulsamplitude (bis zu maximal etwa 60 V/cm), die Dauer (im Bereich von 0,1 bis 50 ms) und die Frequenz (im Bereich von 0 bis 1 kHz). Wenn es notwendig ist, könnten auch Änderungen der Pulsform untersucht werden, um zu bestimmen, ob diese zu einer effizienteren Elektrostimulation führten. Die optimalen Stimulationsparameter ergeben die maximale Zellstimulation (verglichen mit Zellen mit blockiertem oder nicht vorhandenem Kanal) mit dem kleinsten Abweichungskoeffizienten des Signals zwischen den verschiedenen Test-Wells, mit der geringsten Stärke des elektrischen Feldes und mit dem geringsten Tastverhältnis für den Durchtritt von Strom durch die Elektroden. Nachdem ein bestimmter Satz von Parametern gewählt wurde, sollte eine Titration der Färbekonzentrationen für den/die Spannungssensorfarbstoff(e) wie oben beschrieben durchgeführt werden, um die Signalgröße und die Abweichungskoeffizienten der Reaktionen weiter zu optimieren. Diese Vorgänge (Farbstoffkonzentrationen, Stärke des elektrischen Feldes sowie Stimulationsdauer und -frequenz) können wiederholt werden, um das Signal noch weiter zu optimieren.
  • ii) Assays für Natriumkanäle, die sich normalerweise im Ruhezustand befinden
  • Bevorzugte Zellen beinhalten die Zellen mit Transmembranpotentialen unter der Aktivierungsschwelle für den Ionenkanal von Interesse, bei denen die Expression anderer Ionenkanäle weitestgehend auf einige wenige charakterisierte Ionenkanalarten beschränkt ist. Zellen dieser Art beinhalten HEK-293- und RBL-Zellen sowie F11- und HL5-Zellen. Nach Auswahl eines Zielionenkanals werden die Zellen, wie oben beschrieben, mit dem Ionenkanal von Interesse transfiziert und Klone werden ausgewählt. Alternativ können, wie im Fall von F11- und HL5-Zellen, endogene Natriumkanäle verwendet werden. Nach Auswahl und Charakterisierung werden Zellklone in Multiwell-Miktrotiter-Platten plattiert und mit spannungssensitiven Farbstoffen eingefärbt, wie oben beschrieben. Wie vorhergehend beschrieben, werden die anfänglichen Experimente typischerweise in einer 96-Well-Multiwell-Platte durchgeführt, mit der gleichen Anzahl von Zellen in jedem Well. Im Allgemeinen werden Säulen von acht Wells gleichzeitig unter identischen Bedingungen stimuliert, um statistisch signifikante Daten über die Abweichungen der Zellreaktionen zu ergeben.
  • Eine Reihe von Assay-Verfahren hängen möglicherweise vom Expressionsgrad des Natriumkanals von Interesse in der Zelle ab. Bei großen Expressionsgraden von spannungsabhängigen Natriumkanälen kann der Natriumstrom groß genug sein, um nach einer einzigen Kanalaktivierungs-/Inaktivierungssequenz eine große Änderung des Transmembranpotentials zu erzeugen. In diesen Fällen können kleine positive Störungen des Transmembranpotentials, die mittels Elektrostimulation erzeugt werden, ausreichend sein, um genügend Natriumkanäle zu aktivieren, so dass der nachfolgende Einstrom von Natriumionen die gesamte Zelle depolarisiert und dadurch alle Natriumkanäle aktiviert. Das Stimulationsfeld sollte typischerweise lange genug angelegt werden, um die Kanäle zu aktivieren, aber nicht so lange, dass es den nachfolgenden Ionenstrom stört. Nachdem das Transmembranpotential der Zelle repolarisiert wurde, kann der Stimulationsvorgang wiederholt werden. Nachfolgende Stimulationsereignisse können gleich dem ersten sein oder variieren, um zeitabhängige Eigenschaften des Kanals zu untersuchen.
  • Typischerweise beginnt man bei Anfangsbedingungen unter Verwendung eines biphasischen Wellenkerns mit einer Rechteckwelle mit 500 μs pro Phase und einer Amplitude von 10 V/cm. Man optimiert dann die Pulsamplitude (zwischen 5 und 60 V/cm) und die Dauer (zwischen 0,1 und 1 ms). Wenn es notwendig ist, könnten auch Änderungen der Pulsform untersucht werden, um zu bestimmen, ob diese zu einer effizienteren Elektrostimulation führten. Die optimalen Stimulationsparameter ergeben die maximale Zellstimulation mit dem kleinsten Abweichungskoeffizienten des Signals zwischen den verschiedenen Test-Wells, mit der geringsten Stärke des elektrischen Feldes und mit dem geringsten Tastverhältnis für den Durchtritt von Strom durch die Elektroden. Nachdem ein bestimmter Satz von Parametern gewählt wurde, sollte eine Titration der Färbekonzentrationen für den/die Spannungssensorfarbstoff(e) wie oben beschrieben durchgeführt werden, um die Signalgröße und die Abweichungskoeffizienten der Reaktionen weiter zu optimieren. Diese Vorgänge (Farbstoffkonzentrationen, Stärke des elektrischen Feldes und Stimulationsdauer und -frequenz) können wiederholt werden, um das Signal noch weiter zu optimieren.
  • Oft wird es notwendig sein, Zellen zu verwenden, deren Expression von Natriumkanälen zu gering ist, um akzeptable Signalgrößen durch eine einzige Stimulation zu ergeben. Es kann auch wünschenswert sein, ein starkes Signal für eine längere Zeit beizubehalten. In diesen Fällen kann man die Zellen mit Pulsfolgen beaufschlagen, wie es für Kanäle, die über dem Aktivierungspotential gehalten werden, beschrieben wurde. Mit biphasischen Stimulationspulsen können die Natriumkanäle unabhängig vom anfänglichen Transmembranpotential aktiviert werden. Indem das Intervall zwischen den Pulsen kürzer gehalten wird als die Membranzeitkonstante, wird jede Stimulation Strom in die Zelle leiten, bis ein Gleichgewicht zwischen den Strömen in der Zelle und außerhalb der Zelle erreicht ist. Diese Spannungsabweichung wird beibehalten, solange die Stimulationsfolge andauert.
  • Die Stimulationsprotokolle sind in diesem Fall im Wesentlichen die gleichen wie die, die für Zellen beschrieben wurden, deren Ruhepotential über der Inaktivierungsschwelle liegt. Im Allgemeinen wird eine Reihe von Eingangsexperimenten durchgeführt, und zwar mit Hilfe eines biphasischen Wellenkerns mit einer Rechteckwelle, und mit einer regelmäßigen Rate für eine feste Folgedauer wiederholt. Die Pulsdauer variiert von etwa 1 μs bis zu etwa 1 s und bevorzugter von etwa 100 μs bis zu etwa 20 ms. Die Pulsamplitude variiert von 0 V/cm bis zu etwa 60 V/cm und bevorzugter von 10 V/cm bis 50 V/cm. Die Stimulationsfrequenz variiert zwischen 0 Hz (d.h. ein einziger Puls) und 100 kHz, und bevorzugter von 0 Hz bis etwa 1 kHz. Die Pulsfolge variiert zwischen 0 s (d.h. ein einziger Puls) und etwa 100 s, und bevorzugter zwischen 0 s und 10 s. Die optimalen Stimulationsparameter ergeben die maximalen Änderungen des Transmembranpotentials (verglichen mit Zellen mit blockiertem oder nicht vorhandenem Kanal) mit dem kleinsten Abweichungskoeffizienten des Signals zwischen den Test-Wells, bei der geringsten Stärke des elektrischen Feldes. Nachdem ein bestimmter Satz von Parametern gewählt wurde, wird eine Titration der Färbekonzentrationen für den/die Spannungssensorfarbstoff(e) typischerweise wie oben beschrieben durchgeführt, um die Signalgröße und die Abweichungskoeffizienten der Reaktionen weiter zu optimieren. Diese Vorgänge (Farbstoffkonzentrationen, Stärke des elektrischen Feldes und Stimulationsdauer und -frequenz) können wiederholt werden, um das Signal noch weiter zu optimieren.
  • b) Kaliumkanäle
  • Spannungsabhängige Kaliumkanäle repolarisieren Nerven- und Muskelzellen nach der Aktionspotential-Depolarisierung. Sie spielen auch wichtige regulierende Rollen in neuronalen, muskulären, sekretorischen und exkretorischen Systemen. Die meisten Zellen behalten aktiv eine hohe intrazelluläre Kaliumkonzentration bei, so dass das umgekehrte Transmembranpotential für Kaliumkanäle um etwa -90 mV liegt. Kalium strömt typischerweise aus der Zelle, so dass die Öffnung von mehr kalium-selektiven Kanälen dazu tendiert, das Transmembranpotential negativer werden zu lassen, im Gegensatz zu der Öffnung von Natriumkanälen, die das Transmembranpotential typischerweise positiver werden lässt.
  • Eine Zusammenfassung der zahlreichen Kalium-Subtypen ist in der nachfolgende Tabelle 2 dargestellt.
  • Figure 00690001
  • Figure 00700001
  • Figure 00710001
  • Kaliumkanäle weisen enorme Unterschiede hinsichtlich der Aktivierungs- und Deaktivierungszeitkonstanten und Spannungsabhängigkeiten auf. Im Allgemeinen weisen spannungsabhängige Kaliumkanäle ähnliche Spannungsabhängigkeiten auf wie Natriumkanäle, die bei sehr negativen Potentialen geschlossen werden und sich über einem bestimmten Schwellenwert öffnen. Kaliumkanäle können mehrere Ruhezustände, mehrere inaktivierte Zustände und typischerweise einen einzigen aktivierten Zustand aufweisen. Im Gegensatz zu spannungsabhängigen Natriumkanälen sind Übergänge zwischen den meisten Zuständen erlaubt. Diese Übergänge sind: Aktivierung (Übergang von einem Ruhezustand in den offenen Zustand), Deaktivierung (Übergang vom offenen Zustand in einen Ruhezustand), Inaktivierung (Übergang von einem Ruhezustand oder dem offenen Zustand in einen inaktivierten Zustand), Aufhebung der Inaktivierung (Übergang von einem inaktivierten Zustand in einen Ruhezustand) und Flickering (Übergang von einem inaktivierten Zustand in den offenen Zustand). Hinsichtlich der Schwellenwerte für die Übergänge und der Spannungsabhängigkeiten der Übergangsraten gibt es große Unterschiede. Die Aktivierungszeitkonstanten liegen bei Schwellenaktivierungspotentialen von -80 bis +20 mV zwischen 0,1 und 1000 ms. Die Inaktivierungszeitkonstanten liegen bei Schwellenpotentialen von -60 bis 0 mV zwischen 0,1 und unendlich (d.h. keine Inaktivierung). Die Zeitkonstanten für die Aufhebung der Inaktivierung liegen zwischen 0,5 ms und 100 ms bei Schwellenpotentialen von -70 bis 0 mV.
  • Die Stimulationsprotokolle, die notwendig sind, um messbare kanalabhängige Signale zu erhalten, hängen in gewissem Maß von den spezifischen Eigenschaften des betreffenden Kanals ab. Aufgrund der Diversität der Parameter bei spannungsabhängigen Kaliumkanälen benötigt man für die Optimierung eines Elektrostimulationsprotokolls eventuell mehrere Wiederholungen.
  • Während dieser Experimente wird die Reaktion von Zellen mit aktiven Kanälen und von Zellen, bei denen die Kanäle pharmakologisch blockiert sind, verglichen. Wenn kein geeigneter pharmakologischer Wirkstoff verfügbar ist, kann der blockierte Zustand mit einer nicht transfizierten Zelllinie emuliert werden. Die optimalen Stimulationsparameter ergeben den kleinsten Abweichungskoeffizienten der Signaldifferenz der beiden Zellpopulationen.
  • Assays unter Verwendung der direkten Stimulation des Kaliumkanals Spannungsregulierte Kaliumkanäle
  • Da Kaliumkanäle Auswärtsströme generieren, führt die Aktivierung der Kanäle zu negativen Änderungen des Transmembranpotentials. Unter physiologischen Bedingungen beträgt das Umkehrpotential für Kalium etwa -90 mV. Da Zellen, die nur einen spannungsabhängigen Kaliumkanal exprimieren, im Allgemeinen Ruhepotentiale nahe der Aktivierungsschwelle haben, sollte die direkte Stimulation bei denjenigen spannungsabhängigen Kaliumkanälen funktionieren, die Aktivierungsschwellen von über etwa -50 mV haben. Während kleine negative Abweichungen des Transmembranpotentials (unter 40 mV Änderung) zuverlässig mit Hilfe der FRET spannungs-sensitiven Farbstoffe erfasst werden können, wird es oft bevorzugt, Screenings mit hohem Durchsatz mit größeren Signalen durchzuführen.
  • Bevorzugte Zellarten beinhalten die Zellen, die andere Ionenkanäle in minimalem Umfang exprimieren, wie zum Beispiel CHO-K1, CHL und LTK(-). Die Transfektion und Auswahl von Klonen, die Ionenkanäle von Interesse exprimieren, erfolgt im Allgemeinen so, wie es bereits für die Natriumkanäle, die sich normalerweise im Ruhezustand befinden, beschrieben wurde. Alternativ könnte eine Zelllinie, die den Kanal von Interesse endogen exprimiert, verwendet werden. Die Kennzeichnung und Messung von Zellen mit Transmembranpotential-Farbstoffen wird im Allgemeinen durchgeführt, wie es für Natriumionenkanäle, die sich normalerweise im Ruhezustand befinden, beschrieben ist.
  • Gemäß dem Stimulationsprotokoll wird ein Teil der Plasmamembran lange genug vorteilhafter Weise depolarisiert, um die spannungsabhängigen Kaliumkanäle zu aktivieren. Im Gegensatz zu spannungsabhängigen Natriumkanälen leiten spannungsabhängige Kaliumkanäle typischerweise während der Depolarisierungsphase des Stimulationspulses Strom. Auf der Seite der Zelle, auf der das Transmembranpotential in eine negative Richtung bewegt wird, wird die Inaktivierung der Kaliumkanäle aufgehoben (wenn der betreffende Kanal eine spannungsabhängige Inaktivierung erfährt). Auf der Seite der Zelle, auf der das Transmembranpotential in eine positive Richtung bewegt wird, werden Kaliumkanäle aktiviert und lassen Strom nach außen fließen. Deshalb sollte die Dauer des Stimulationspulses nicht deutlich über der Inaktivierungszeit liegen. Der Kaliumstrom tendiert dazu, das durchschnittliche Transmembranpotential hinsichtlich des Ruhepotentials in Richtung negativ zu bewegen. Nach dem Stimulationspuls geht das das Transmembranpotential exponential zum Ruhepotential zurück. Durch Wiederholung der Stimulation nach einer Zeit, die kürzer ist als die Membranzeitkonstante, kann die durchschnittliche Zellmembran weiter zur negativen Seite hin bewegt werden. Durch die Verwendung einer Stimulationsfolge kann ein großes und anhaltendes Signal erzielt werden.
  • Ein bevorzugtes Stimulationsprotokoll, das diese Wirkung erzielt, ist biphasisch, so dass die Ionenkanäle, die sich an beiden äußeren Rändern der Zellen befinden, an der Freigabe der Kaliumionenbewegung teilnehmen können. Typischerweise beginnt man bei Anfangsbedingungen unter Verwendung eines biphasischen Wellenkerns mit einer Rechteckwelle mit 5 msec pro Phase und einer Amplitude von 25 V/cm. Der Kern wird mit einer regelmäßigen Rate von etwa 20 Hz für eine gesamte Folgedauer von etwa drei Sekunden wiederholt. Man optimiert dann die Pulsamplitude, die Dauer und dann die Frequenz. Wenn es notwendig ist, könnten auch Änderungen der Pulsform untersucht werden, um zu bestimmen, ob diese zu einer effizienteren Elektrostimulation führten. Die optimalen Stimulationsparameter ergeben die maximale durchschnittliche Änderung des Transmembranpotentials (verglichen mit Zellen, bei denen der Kanal blockiert oder nicht vorhanden ist) mit dem kleinsten Abweichungskoeffizienten des Signals zwischen den verschiedenen Test-Wells, mit der geringsten Stärke des elektrischen Feldes und mit dem geringsten Tastverhältnis für den Durchtritt von Strom durch die Elektroden. Nachdem ein bestimmter Satz von Parametern gewählt wurde, sollte eine Titration der Färbekonzentrationen für den/die Spannungssensorfarbstoff(e) wie oben beschrieben durchgeführt werden, um die Signalgröße und die Abweichungskoeffizienten der Reaktionen weiter zu optimieren. Diese Vorgänge (Farbstoffkonzentrationen, Stärke des elektrischen Feldes und Stimulationsdauer und -frequenz) können wiederholt werden, um das Signal noch weiter zu optimieren.
  • 2) Einwärts-Gleichrichter-Kaliumkanäle
  • Im Gegensatz zu seiner Bezeichnung besteht die Aufgabe des Einwärts-Gleichrichter-Kanals darin, kein Kalium in die Zelle einströmen zu lassen. Der Einstrom von Kalium kann nur erfolgen (1) wenn das Trans membranpotential unter die Kaliumgleichgewichtspotentiale fällt oder (2) wenn die extrazelluläre Kaliumkonzentration ansteigt. Normalerweise tritt keine dieser Situationen auf, weil (1) kein Ionenstrom das Potential negativer machen kann als das Kaliumumkehrpotential, da unter normalen physiologischen Bedingungen Kalium das Ion mit dem negativsten Umkehrpotential ist, und (2) die extrazelluläre Kaliumkonzentration streng kontrolliert wird, außer unter pathologischen Bedingungen. Unter Verwendung der Elektrostimulation können jedoch Teile der Zellmembran unter VK bewegt werden, was den Einstrom von Kaliumionen in die Zelle fördert. Dies führt netto zu einer positiven Änderung des Transmembranpotentials und kann als positives Signal erfasst werden. Zur Entwicklung und Optimierung eines Assays für Blocker des Einwärts-Gleichrichters könnte man deshalb folgender Vorgehensweise folgen:
    Bevorzugte Zellarten beinhalten die Zellen, die andere Ionenkanäle in einem minimalen Umfang exprimieren, wie zum Beispiel CHO-K1, CHL und LTK(-). Die Transfektion und Auswahl von Klonen, die Ionenkanäle von Interesse exprimieren, erfolgt im Allgemeinen so, wie es bereits für die Natriumionenkanäle, die sich normalerweise im Ruhezustand befinden, beschrieben wurde. Alternativ könnte eine Zelllinie verwendet werden, die den Kanal von Interesse endogen exprimiert. Die Kennzeichnung und Messung von Zellen mit Transmembranpotential-Farbstoffen wird im Allgemeinen so durchgeführt, wie es für Natriumionenkanäle, die sich normalerweise im Ruhezustand befinden, beschrieben ist.
  • Ein bevorzugtes Stimulationsprotokoll verwendet einen biphasischen Kern, so dass Ionenkanäle auf beiden äußeren Rändern der Zellen teilnehmen. Typischerweise beginnt man bei Anfangsbedingungen unter Verwendung eines biphasischen Wellenkerns mit einer Rechteckwelle mit 5 msec pro Phase und einer Amplitude von 25 V/cm. Der Kern wird mit einer regelmäßigen Rate von etwa 20 Hz für eine gesamte Folgedauer von etwa drei Sekunden wiederholt. Man optimiert dann die Pulsamplitude, die Dauer und dann die Frequenz. Wenn es notwendig ist, könnten auch Änderungen der Pulsform untersucht werden, um zu bestimmen, ob diese zu einer effizienteren Elektrostimulation führten. Die optimalen Stimulationsparameter ergeben die maximale Zellstimulation (verglichen mit Zellen mit blockiertem oder nicht vorhandenem Kanal) mit dem kleinsten Abwei chungskoeffizienten des Signals zwischen den verschiedenen Test-Wells, mit der geringsten Stärke des elektrischen Feldes und mit dem geringsten Tastverhältnis für den Durchtritt von Strom durch die Elektroden. Nachdem ein bestimmter Satz von Parametern gewählt wurde, sollte eine Titration der Färbekonzentrationen für den/die Spannungssensorfarbstoff(e) wie oben beschrieben durchgeführt werden, um die Signalgröße und die Abweichungskoeffizienten der Reaktionen weiter zu optimieren. Diese Vorgänge (Farbstoffkonzentrationen, Stärke des elektrischen Feldes und Stimulationsdauer und -frequenz) können wiederholt werden, um das Signal noch weiter zu optimieren.
  • iii) Assays unter Verwendung eines spannungsabhängigen Natriumgegenkanals
  • Dieses Verfahren beinhaltet die Verwendung einer Zelllinie, die den spannungsabhängigen Kaliumkanal von Interesse exprimiert und die auch einen spannungsabhängigen Natriumkanal exprimiert. Bei diesem Verfahren besteht der Ansatz darin, Elektrostimulationsprotokolle zu verwenden, die dafür entworfen sind, spezifisch den spannungsabhängigen Natriumkanal zu aktivieren. In diesem Fall führt die Elektrostimulation dazu, dass Natriumionen in die Zelle strömen, was zu einer positiven Spannungsänderung führt. Die Anwesenheit des Kaliumkanals von Interesse wird dazu tendieren, die positive Reaktion des Natriumkanals zu unterdrücken, indem ermöglicht wird, dass Kaliumionen aus der Zelle ausströmen. Der Assay nützt das Fehlen eines Auswärtsstroms, wenn ein chemischer Teststoff den Kaliumkanal blockiert, und stellt somit die hohe positive Spannungsreaktion wieder her, die normalerweise durch die Aktivierung der Natriumkanäle induziert wird. Die Optimierung des Gleichgewichts von Strömen ist bei diesem Verfahren wichtig, um sicherzustellen, dass der Assay auf die Kaliumkanalblockade empfindlich ist. Wenn der Natriumstrom hinsichtlich des Kaliumstroms zu niedrig ist, verschiebt sich die Dosis-Wirkungs-Kurve für den Kaliumkanalblocker hin zu höheren Konzentrationen. So müssten zum Beispiel in dem extremen Fall, bei dem der Kaliumstrom 100 Mal höher ist als der Natriumstrom, 99 % der Kaliumkanäle blockiert werden, um eine 50 % Reaktion von den Natriumkanälen zu erhalten.
  • Da dieses Verfahren das Ansteuern oder Betreiben eines spannungsabhängigen Natriumkanals mit wiederholten Pulsen beinhaltet, ist die Entwicklung des Protokolls im Wesentlichen die gleiche wie bereits für spannungsaktivierte Natriumkanäle in einem inaktivierten Zustand beschrieben. Typischerweise beginnt man bei Anfangsbedingungen unter Verwendung eines biphasischen Wellenkerns mit einer Rechteckwelle mit 5 msec pro Phase und einer Amplitude von 25 V/cm. Der Kern wird mit einer regelmäßigen Rate von etwa 20 Hz für eine gesamte Folgedauer von etwa drei Sekunden wiederholt. Man optimiert dann die Pulsamplitude, die Dauer und dann die Frequenz. Wenn es notwendig ist, könnten auch Änderungen der Pulsform untersucht werden, um zu bestimmen, ob diese zu einer effizienteren Elektrostimulation führten. Die optimalen Stimulationsparameter ergeben die maximale Zellstimulation (verglichen mit Zellen mit blockiertem oder nicht vorhandenem Kanal) mit dem kleinsten Abweichungskoeffizienten des Signals zwischen den verschiedenen Test-Wells, mit der geringsten Stärke des elektrischen Feldes und mit dem geringsten Tastverhältnis für den Durchtritt von Strom durch die Elektroden. Nachdem ein bestimmter Satz von Parametern gewählt wurde, sollte eine Titration der Färbekonzentrationen für den/die Spannungssensorfarbstoff(e) wie oben beschrieben durchgeführt werden, um die Signalgröße und die Abweichungskoeffizienten der Reaktionen weiter zu optimieren. Diese Vorgänge (Farbstoffkonzentrationen, Stärke des elektrischen Feldes und Stimulationsdauer und -frequenz) können wiederholt werden, um das Signal noch weiter zu optimieren.
  • Bei diesem Assay-Format gibt es im Idealfall keine (oder eine sehr geringe) Reaktion auf die Stimulation in Abwesenheit eines Kanalblockers, da der Kaliumstrom als Gegenspieler des Natriumstroms agiert. Um die Stimulationsbedingungen zu optimieren, ist es deshalb notwendig, die Reaktionen mit und ohne die Aktivität des Kaliumkanals zu vergleichen. Im Idealfall wird dies unter Verwendung eines selektiven Blockers des Kaliumkanals erreicht. In den Fällen, in denen ein solcher Blocker noch nicht bekannt ist, ist es möglich, die Zelllinie zu verwenden, die nur den Natriumgegenkanal enthält.
  • Da dieses Assay-Format zwei Ionenkanäle beinhaltet, beeinflussen die Modulatoren eines jeden Kanals die Spannungsreaktion. In diesem Fall wird durch einen Treffer (ein Kaliumkanal-Blocker) die Spannungsreaktion wiederhergestellt. Das Screening-Format ignoriert automatisch Verbindungen, die nur den Natriumkanal blockieren. Die Stimulation der Zellen in Anwesenheit von Verbindungen, die beide Kanäle blockieren, führt jedoch zu keiner Spannungsabweichung, was nahe legt, dass die Verbindung inaktiv ist. Da Verbindungen dieser Art von Interesse sein könnten, steht auch ein Verfahren zu deren Nachweis zur Verfügung. Blocker des Natriumkanals können gefunden werden, indem man das identische Verbindungs-Screening unter Verwendung der Stammzelllinie, die den Natriumkanal (aber nicht den Kaliumkanal) enthält, durchführt. Verbindungen, bei denen man feststellt, dass sie den Natriumkanal blockieren, können dann einzeln getestet werden, um herauszufinden, ob sie eine Aktivität gegen den Kaliumkanal aufweisen.
  • c) Assay von Calciumkanälen
  • Calciumkanäle findet man im Allgemeinen in vielen Zellen, in denen sie, neben anderen Funktionen, wichtige Rollen bei der Signalübermittlung spielen. Bei erregbaren Zellen stellt das intrazelluläre Calcium einen anhaltenden Einstrom für lange Depolarisierungreaktionen zu Verfügung und dient als die Verbindung zwischen der Depolarisierung und anderen intrazellulären Signalübertragungsmechanismen. Wie spannungsabhängige Natriumkanäle haben spannungsabhängige Calciumkanäle mehrere Ruhezustände, aktivierte Zustände und inaktivierte Zustände.
  • Mehrere Arten von Calciumkanälen wurden in Säugetierzellen aus verschiedenen Geweben, einschließlich Skelettmuskel, Herzmuskel, Lunge, glatter Muskulatur und Gehirn [siehe z.B. Bean, B.P. (1989) Ann. Rev. Physiol. 51:367-384 und Hess, P. (1990) Ann. Rev. Neurosci. 56:337] identifiziert. Die verschiedenen Arten von Calciumkanälen wurden allgemein in vier Klassen eingeteilt: Die L-, T-, N- und P-Typen, unterschieden durch Stromkinetik, Empfindlichkeit für das Haltepotential und Empfindlichkeit für Calciumkanalagonisten und -antagonisten. Vier Subtypen neuronaler spannungsabhängiger Calciumkanäle wurden vorgeschlagen (Swandulla, D. et al., Trends in Neuroscience 14:46, 1991).
  • Die cDNA und die entsprechenden Aminosäuresequenzen der α1-, α2-, β- und γ-Untereinheiten der Calciumkanäle der Skelettmuskulatur von Kaninchen wurden bestimmt [siehe Tanabe et al. (1987) Nature 328:313-318; Ruth et al. (1989) Science 245:1115-1118; und US-Patent Nr. 5,386,025]. Darüber hinaus wurden die cDNA und die entsprechenden Aminosäuresequenzen der α1-Untereinheiten von Calciumkanälen von Herzmuskeln [Mikami, A. et al. (1989) Nature 340:230-233] und Lunge [Biel, M. (1990) FEBS Letters 269:409-412] bestimmt. Darüber hinaus wurden cDNA-Klone, die einen Calciumkanal aus einem Kaninchen-Gehirn kodieren (als BI-Kanal bezeichnet) isoliert [Mori, Y. et al. (1991) Nature 350:398-402].
  • Partielle cDNA-Klone, die Teile von verschiedenen Subtypen, die als Rattengehirn Klasse A, B, C und D bezeichnet werden, der Untereinheit α1 des Calciumkanals kodieren, wurden aus Rattengehirn-cDNA-Bibliotheken isoliert. [Snutch, T. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3391-3395]. Vor noch kürzerer Zeit wurden Rattengehirn Klasse A [Starr, T. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5621-5625] und Klasse C [Snutch, T. et al. (1991) Neuron 7:45-57] cDNA-Klone in voller Länge isoliert. Obwohl die Aminosäuresequenz, die durch die DNA der Rattengehirn Klasse C kodiert wird, zu ungefähr 95 % mit der DNA, die die Calciumkanal-Untereinheit α1 des Kaninchen-Herzmuskels kodiert, identisch ist, hat die Aminosäuresequenz, die durch die DNA der Rattengehirn Klasse A kodiert wird, nur 33 % Sequenzidentität mit der Aminosäuresequenz, die durch die DNA, die die Kaninchen-Skelett- oder Herzmuskulatur-Untereinheit α1 kodiert, kodiert wird. Ein cDNA-Klon, der eine weitere Rattengehirn-Calciumkanal-Untereinheit α1 kodiert, wurde ebenfalls erhalten [Hui, A. et al. (1991) Neuron 7:35-44]. Die Aminosäuresequenz, die durch diesen Klon kodiert wird, ist zu ungefähr 70 % homolog zu den Proteinen, die von der DNA des Calciumkanals der Kaninchenskelett- und -herzmuskulatur kodiert werden. Es wurde ebenfalls ein cDNA-Klon isoliert, der eng verwandt ist mit der Rattengehirn-Klasse C-Untereinheit α1 kodierenden cDNA und Sequenzen partieller cDNA-Klone, die eng verwandt sind mit anderen partiellen cDNA-Klonen, die offensichtlich unterschiedliche Calciumkanal-α1-Untereinheiten kodieren. [siehe Snutch, T. et al. (1991) Neuron 7:45-57; Perez-Reyes, E. et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:20430; und Hui, A. et al. (1991) Neuron 7:35-44].
  • Bei bekannten Calciumkanälen, die charakterisiert wurden, liegen die Aktivierungszeitkonstanten bei Schwellenpotentialen von -80 bis -20 mV zwischen 0,1 und 10 ms. Die Inaktivierungszeitkonstanten liegen bei Schwellenpotentialen von -60 bis -20 mV zwischen 0,1 und ∞ (d.h. keine Inaktivierung). Die Zeitkonstanten für die Aufhebung der Inaktivierung liegen bei Schwellenpotentialen von -70 bis -40 mV zwischen 0,5 ms und 100 ms.
  • Die Auswahl der Zelllinie und die Induktion spannungsabhängiger Calciumströme werden mittels der allgemeinen Richtlinien und Ansätze, die bereits für Natriumkanäle erläutert wurden, durchgeführt.
  • Bevorzugte Zellarten beinhalten die Zellen, die andere Ionenkanäle in einem minimalen Umfang exprimieren, wie zum Beispiel CHO-K1, CHL und LTK(-). Die Transfektion und Auswahl von Klonen, die Ionenkanäle von Interesse exprimieren, erfolgt im Allgemeinen so, wie es bereits für Natriumkanäle, die sich normalerweise im Ruhezustand befinden, beschrieben wurde. Alternativ könnte eine Zelllinie verwendet werden, die den Kanal von Interesse endogen exprimiert. Die Kennzeichnung und Messung von Zellen mit Transmembranpotential-Farbstoffen wird im Allgemeinen so durchgeführt, wie es für Natriumionenkanäle, die sich normalerweise im Ruhezustand befinden, beschrieben ist. Alternativ können die Zellen mit calcium-sensitiven fluoreszierenden Farbstoffen beschickt werden, wie zum Beispiel Calciumgrün, Fluo3-AM oder Indo-1.
  • Bei Zellen mit niedrigen Hintergrundströmen können starke Einwärts-Calcium-Ströme generiert werden, indem Teile der Membran negativ genug geladen werden, um die Inaktivierung der Kanäle aufzuheben. Dann werden die Kanäle durch Umkehrung oder Freigabe des externen elektrischen Feldes Potentialen ausgesetzt, die die Kanäle aktivieren und den Calciumeinstrom in die Zelle erlauben. Das Umkehr-Calciumpotential liegt bei den meisten Zellen im Allgemeinen bei +60 bis +100 mV, wodurch große Spannungsänderungen aufgrund des Calciumeinstroms möglich sind. Wir können entweder membrangebundene spannungsabhängige Farbstoffe oder intrazelluläre Calciumfarbstoffe verwenden, um die Aktivität der Zellen zu überwachen. Aufgrund der Ähnlichkeit der Eigenschaften von Calcium- und Natriumkanälen, können die gleichen Assay-Optimierungs-Verfahren wie bereits für Natriumkanäle dargestellt, auch für Calciumkanäle angewandt werden.
  • Typischerweise beginnt man bei Anfangsbedingungen unter Verwendung eines biphasischen Wellenkerns mit einer Rechteckwelle mit 5 msec pro Phase und einer Amplitude von 25 V/cm. Der Kern wird mit einer regelmäßigen Rate von etwa 20 Hz für eine gesamte Folgedauer von etwa drei Sekunden wiederholt. Man optimiert dann die Pulsamplitude, die Dauer und dann die Frequenz. Wenn es notwendig ist, könnten auch Änderungen der Pulsform untersucht werden, um zu bestimmen, ob diese zu einer effizienteren Elektrostimulation führten. Die optimalen Stimulationsparameter die maximale Zellstimulation (verglichen mit Zellen mit blockiertem oder nicht vorhandenem Kanal) mit dem kleinsten Abweichungskoeffizienten des Signals zwischen den verschiedenen Test-Wells, mit der geringsten Stärke des elektrischen Feldes und mit dem geringsten Tastverhältnis für den Durchtritt von Strom durch die Elektroden. Nachdem ein bestimmter Satz von Parametern gewählt wurde, sollte eine Titration der Färbekonzentrationen für den/die Spannungssensorfarbstoff(e) wie oben beschrieben durchgeführt werden, um die Signalgröße und die Abweichungskoeffizienten der Reaktionen weiter zu optimieren. Diese Vorgänge (Farbstoffkonzentrationen, Stärke des elektrischen Feldes und Stimulationsdauer und -frequenz) können wiederholt werden, um das Signal noch weiter zu optimieren.
  • Während dieser Experimente wird die Reaktion von Zellen mit aktiven Kanälen und von Zellen, bei denen die Kanäle pharmakologisch blockiert sind, verglichen. Wenn kein geeigneter pharmakologischer Wirkstoff verfügbar ist, kann der blockierte Zustand mit einer nicht transfizierten Zelllinie emuliert werden. Die optimalen Stimulationsparameter ergeben den kleinsten Abweichungskoeffizienten der Signaldifferenz der beiden Zellpopulationen.
  • d) Assay von spannunasabhänaigen Chloridkanälen
  • Chloridkanäle findet man in den Plasmamembranen von praktisch jeder Zelle im Körper. Chloridkanäle vermitteln eine Vielzahl von Zellfunktionen, einschließlich der Regulierung von Transmembranpotentialen und der Absorption und Sekretion von Ionen durch Epithelmembranen. Wenn sie in den intrazellulären Membranen des Golgi-Apparats und endozyten Vesikeln vorhanden sind, können Chloridkanäle auch den ph-Wert von Or ganellen regulieren. Zur Nachprüfung siehe Greger, R. (1988) Annu. Rev. Physiol. 50:111-122.
  • Basierend auf ihrer Art der Regulierung und strukturellen Konformation ergeben sich drei unterschiedliche Klassen von Chloridkanälen, Tabelle 3. Die erste Klasse beinhaltet die GABA- und Glyzinrezeptor-Überfamilien, die zweite Klasse beinhaltet CFTR (CFTR = Cystic fibrosis Transmembrane Conductance Regulator = Zystische-Fibrose-Transmembran-Regulatorprotein), und die dritte Klasse beinhaltet die spannungsabhängigen Chloridkanäle.
  • Figure 00820001
  • Im Gegensatz zu Ionen wie Natrium und besonders Calcium, ist der elektrochemische Gradient von Chlorid über die Plasmamembran im Allgemeinen nicht weit vom Gleichgewicht entfernt. Somit wird beim Ruhepotential von Zellen die Öffnung von Chloridkanälen nicht zu großen Veränderungen der Plasmamembranspannung oder zu dramatischen Veränderungen der intrazellulären Chloridkonzentrationen führen. Da die Elektrostimulation typischerweise symmetrische Spannungsänderungen über die Zellmembran generiert, kann kein Netto-Chloridstrom generiert werden, es sei denn, die Leitfähigkeit des Kanals ist nicht linear. Für eine lineare Leck-Leitfähigkeit leitet ein einheitliches elektrisches Feld Chlorid auf einer Seite in die Zelle ein und auf einer Seite aus der Zelle aus.
  • Die direkte Elektrostimulation von Chloridkanälen, die nicht lineare Leitfähigkeitskurven (Gleichrichter) oder spannungsaktiviertes Gating haben, kann Netto-Ionenströme generieren, die wiederum zu nachweisbaren Veränderungen des Transmembranpotentials führen. In Abhängigkeit von der Spannungsabhängigkeit der Leitfähigkeit und des Gatings, kann die Veränderung des Transmembranpotentials entweder positiv oder negativ sein. Bei typischen Chloridkanälen (die sich bei erhöhten Potentialen öffnen und bei negativeren Potentialen schließen) und bei Auswärts-Gleichrichtern, fließt Chlorid in die Zelle und lässt das Transmembranpotential negativ werden. Bei Einwärts-Gleichrichtern wird Chlorid aus der Zelle getrieben und das Transmembranpotential wird positiv.
  • Aufgrund der geringen Differenz zwischen dem Chloridumkehrpotential und dem Transmembranruhepotential, kann die direkte Stimulation von spannungsabhängigen Chloridkanälen zu nicht ausreichenden Änderungen des Transmembranpotentials führen. Assays für diese Ionenkanäle können dann unter Verwendung von Koexpression und Elektrostimulation von Natrium- oder Kaliumgegenkanälen entwickelt werden, um einen Einstrom oder Ausstrom zu erzeugen. Die Anwesenheit oder Abwesenheit des Chloridstroms kann durch die Abwesenheit oder Anwesenheit von Änderungen des Transmembranpotentials bestimmt werden, wenn der Gegenkanal elektrisch stimuliert wird.
  • Bevorzugte Zellarten beinhalten die Zellen, die andere Ionenkanäle in einem minimalen Umfang exprimieren, wie zum Beispiel CHO-K1, CHL und LTK(-). Die Transfektion und Auswahl von Klonen, die die Ionenka näle von Interesse exprimieren, wird im Allgemeinen so durchgeführt, wie es oben für Natriumionenkanäle, die sich normalerweise im Ruhezustand befinden, beschrieben ist. Alternativ könnte eine Zelllinie verwendet werden, die den Kanal von Interesse (oder den Gegenkanal) endogen exprimiert. Die Kennzeichnung und Messung von Zellen mit Transmembranpotential-Farbstoffen wird im Allgemeinen durchgeführt, wie es für Natriumionenkanäle, die sich normalerweise im Ruhezustand befinden, beschrieben ist.
  • Typischerweise beginnt man bei Anfangsbedingungen unter Verwendung eines biphasischen Wellenkerns mit einer Rechteckwelle mit 5 msec pro Phase und einer Amplitude von 25 V/cm. Der Kern wird mit einer regelmäßigen Rate von etwa 20 Hz für eine gesamte Folgedauer von etwa drei Sekunden wiederholt. Man optimiert dann die Pulsamplitude, die Dauer und dann die Frequenz. Wenn es notwendig ist, könnten auch Änderungen der Pulsform untersucht werden, um zu bestimmen, ob diese zu einer effizienteren Elektrostimulation führten. Die optimalen Stimulationsparameter ergeben die maximale Zellstimulation (verglichen mit Zellen mit blockiertem oder nicht vorhandenem Kanal) mit dem kleinsten Abweichungskoeffizienten des Signals zwischen den verschiedenen Test-Wells, mit der geringsten Stärke des elektrischen Feldes und mit dem geringsten Tastverhältnis für den Durchtritt von Strom durch die Elektroden. Nachdem ein bestimmter Satz von Parametern gewählt wurde, sollte eine Titration der Färbekonzentrationen für den/die Spannungssensorfarbstoff(e) wie oben beschrieben durchgeführt werden, um die Signalgröße und die Abweichungskoeffizienten der Reaktionen weiter zu optimieren. Diese Vorgänge (Farbstoffkonzentrationen, Stärke des elektrischen Feldes und Stimulationsdauer und -frequenz) können wiederholt werden, um das Signal noch weiter zu optimieren.
  • Während dieser Experimente wird die Reaktion von Zellen mit aktiven Kanälen und von Zellen, bei denen die Kanäle pharmakologisch blockiert sind, verglichen. Wenn kein geeigneter pharmakologischer Wirkstoff verfügbar ist, kann der blockierte Zustand mit einer nicht transfizierten Zelllinie emuliert werden. Die optimalen Stimulationsparameter ergeben den kleinsten Abweichungskoeffizienten der Signaldifferenz der beiden Zellpopulationen.
  • e) Assay von ligandenabhängiaen Kanälen
  • Die Familie der ligandenabhängigen Ionenkanäle ist groß und vielfältig. Ligandenabhängige Ionenkanäle öffnen sich als Reaktion auf die Bindung eines spezifischen Moleküls. Sie vermitteln typischerweise die schnelle synaptische Übertragung zwischen Neuronen und von Neuronen an Muskelzellen. Sie vermitteln auch die langsame synaptische Übertragung und steuern eine Vielzahl von Regulierungsmechanismen. Ligandenabhängige Ionenkanäle sind im Allgemeinen nur ladungsselektiv, das heißt, sie erlauben den Strom einer Menge von entweder Anionen oder Kationen, sind aber wenig spezifisch. Sie weisen enorme Variationen hinsichtlich ihrer Aktivierungs-, Deaktivierungs-, und Desensibilisierungskinetik auf, die alle zwischen Zeitkonstanten von unter einer Millisekunde bis in den Sekundenbereich variieren können.
  • Wenn sich der Ligand an den Rezeptor des Kanals bindet, erfährt der Kanal eine oder mehrere Konformationsänderungen, um den Kanal zu aktivieren. Wenn der Ligand aus der umgebenden Salzlösung entfernt wird, dissoziieren die gebundenen Liganden und der Kanal schließt sich. Wenn der Ligand in der umgebenden Salzlösung verbleibt, werden einige Kanäle durch Zurückhalten des Liganden desensibilisiert, und gehen aber in einen anderen Konformationszustand über, in dem der Kanal geschlossen ist. Bezüglich der Gleichgewichtsverteilungen zwischen aktivierten, deaktivierten und desensibilisierten Zuständen gibt es zwischen den Kanälen große Unterschiede.
  • Bei gängigen Assayformaten wird das Transmembranpotential der Zellen während der Zugabe eines Liganden überwacht. Die plötzliche Zunahme der Leitfähigkeit, wenn sich der Kanal öffnet, bewegt das Transmembranpotential in Richtung eines neuen Umkehrpotentials. Leider liegt das neue Umkehrpotential bei vielen ligandenabhängigen Kanälen normalerweise innerhalb von 15 mV des Ruhepotentials. Diese kleine Veränderung reicht aus, um sie zur Signalübermittlung innerhalb von Zellen zu verwenden, erschwert jedoch pharmakologische Assays.
  • Bei einem Elektrostimulations-Assay für ligandenabhängige Ionenkanäle besteht ein Ansatz darin, einen spannungsabhängigen Natriumgegenkanal mit dem ligandenabhängigen Ionenkanal von Interesse zu exprimieren. Dieser Ansatz ermöglicht die Modulierung bzw. Regulierung des Transmembranpotentials mittels Elektrostimulation. Wenn die Testverbindungen während oder vor der Elektrostimulation zu den Zellen gegeben werden, ermöglicht das Verfahren eine Analyse, ob der ligandenabhängige Kanal offen oder geschlossen ist. Wenn die ligandenabhängigen Kanäle offen sind, wird die hohe Ruhe-Leitfähigkeit der Zelle die Spannungsreaktion auf die Elektrostimulation unterdrücken. Wenn die ligandenabhängigen Kanäle jedoch blockiert sind, reagieren die Zellen stark auf die Elektrostimulation. Das große Maß an Flexibilität der Elektrostimulationsparameter sollte es uns ermöglichen, Assays für eine große Bandbreite der Ruhe-Leitfähigkeit durchzuführen. Dies ist wichtig im Fall von ligandenabhängigen Kanälen, da die Ruhe-Leitfähigkeit in Anwesenheit eines Liganden sehr sensibel auf die Gleichgewichtsdesensibilisierung ist. Wenn wir die Desensibilisierung und Variationen der Kanalexpression berücksichtigen, könnten wir einen Ruhemembranwiderstand in einem Bereich irgendwo zwischen 10 MΩ bis 10GΩ haben. Mit Rattengehirn-TypIIa-Natriumkanälen als Gegenkanal können wir diesen gesamten Bereich abdecken. Es sollte auch möglich sein, sowohl nach Agonisten als auch nach Antagonisten zu screenen. Indem man die Stimulationsparameter so auswählt, dass die Reaktion halb so groß ist, reduzieren Agonisten die Reaktion, während Antagonisten sie erhöhen. Durch die Stimulation mit höheren (Agonisten-Assay) und niedrigeren (Antagonisten-Assay) Frequenzen können bessere Screening-Fenster erzielt werden. Es ist festzuhalten, dass die Modulatoren der Leitfähigkeit, Öffnungszeit, Desensibilisierung und Deaktivierung des Kanals alle nachgewiesen werden.
  • Bevorzugte Zellarten beinhalten die Zellen, die andere Ionenkanäle in einem minimalen Umfang exprimieren, wie zum Beispiel CHO-K1, CHL und LTK(-). Die Transfektion und Auswahl von Klonen, die die Ionenkanäle von Interesse exprimieren, erfolgt im Allgemeinen so, wie es bereits für Natriumionenkanäle beschrieben wurde, die sich normalerweise im Ruhezustand befinden. Alternativ könnte eine Zelllinie verwendet werden, die den Kanal von Interesse (oder den Gegenkanal) endogen exprimiert. Die Kennzeichnung und Messung von Zellen mit Transmembranpotential-Farbstoffen wird im Allgemeinen so durchgeführt, wie es für Natriumionenkanäle beschrieben wurde, die sich normalerweise im Ruhezustand befinden.
  • Typischerweise beginnt man bei Anfangsbedingungen unter Verwendung eines biphasischen Wellenkerns mit einer Rechteckwelle mit 5 msec pro Phase und einer Amplitude von 25 V/cm. Der Kern wird mit einer regelmäßigen Rate von etwa 20 Hz für eine gesamte Folgedauer von etwa drei Sekunden wiederholt. Man optimiert dann die Pulsamplitude die Dauer und dann die Frequenz. Wenn es notwendig ist, könnten auch Änderungen der Pulsform untersucht werden, um zu bestimmen, ob diese zu einer effizienteren Elektrostimulation führten. Die optimalen Stimulationsparameter ergeben die maximale Zellstimulation (verglichen mit Zellen mit blockiertem oder nicht vorhandenem ligandenabhängigen Kanal) mit dem kleinsten Abweichungskoeffizienten des Signals zwischen den verschiedenen Test-Wells, mit der geringsten Stärke des elektrischen Feldes und mit dem geringsten Tastverhältnis für den Durchtritt von Strom durch die Elektroden. Nachdem ein bestimmter Satz von Parametern gewählt wurde, sollte eine Titration der Färbekonzentrationen für den/die Spannungssensorfarbstoff(e) wie oben beschrieben durchgeführt werden, um die Signalgröße und die Abweichungskoeffizienten der Reaktionen weiter zu optimieren. Diese Vorgänge (Farbstoffkonzentrationen, Stärke des elektrischen Feldes und Stimulationsdauer und -frequenz) können wiederholt werden, um das Signal noch weiter zu optimieren.
  • Während dieser Experimente wird die Reaktion von Zellen mit aktiven Kanälen und von Zellen, bei denen die Kanäle pharmakologisch blockiert sind, verglichen. Wenn kein geeigneter pharmakologischer Wirkstoff verfügbar ist, kann der blockierte Zustand mit einer nicht transfizierten Zelllinie emuliert werden. Die optimalen Stimulationsparameter ergeben den kleinsten Abweichungskoeffizienten der Signaldifferenz der beiden Zellpopulationen.
  • f) Assay von passiven Kanälen
  • Viele Kanäle weisen langsame oder keine spannungsaktivierten Spannungsänderungen auf. Hauptbeispiele sind einige der Kanäle, die an Mukoviszidose beteiligt sind, insbesondere der Mukoviszidose-Transmembranregulator (CFTR, ein Chloridkanal), der epitheliale Natriumkanal (ENaC) und 4 TM-Mitglieder der Kaliumkanalfamilie (Wang et al. Ann N.Y. Acad. Sci 868: 286-303, 1999). Ein kleines Molekül, das als Agonist für jeden dieser Kanäle agiert, wäre ein Kandidat für ein Medikament, das Mukoviszidose lindert. Derzeit gibt es kein zweckmäßigerweise durchführbares Screening-Verfahren mit hohem Durchsatz für Kanäle dieser Art.
  • Das vorgeschlagene Assayformat für Ionenkanäle dieser Art beinhalte eine Zelle, die den Leckkanal von Interesse exprimiert in einer Zelle, die auch einen spannungsabhängigen Natriumkanal exprimiert. Der Kanal von Interesse wird in eine Zelle mit einem spannungsabhängigen Natriumkanal geklont. Die Anwesenheit des passiven Stroms wird die positive Reaktion des Natriumkanals unterdrücken, wenn die Zellen stimuliert werden. Die Blockierung des passiven Kanals wird die hohe positive Spannungsreaktion wiederherstellen. Die Optimierung der Balance der Ströme wird bei diesem Verfahren wichtig sein. Wildtyp-CHO-Zellen können für diesen Zweck nützlich sein, obwohl eine Zelle mit größeren Natriumströmen (entweder endogen oder gentechnisch manipuliert) bevorzugt wäre. Wenn der Natriumstrom relativ zum Kaliumstrom zu klein ist, wird die Dosis-Wirkungs-Kurve für den passiven Kanalblocker in Richtung höherer Konzentrationen verschoben. Beispielsweise für den extremen Fall, wo der passive Strom 100 Mal höher ist als der Natriumstrom, müssten 99% der passiven Kanäle blockiert werden, um eine 50 % Reaktion der Natriumkanäle zu erhalten.
  • Bevorzugte Zellarten beinhalten die Zellen, die andere Ionenkanäle in einem minimalen Umfang exprimieren, wie zum Beispiel CHO-K1, CHL und LTK(-). Die Transfektion und Auswahl von Klonen, die die Ionenkanäle von Interesse exprimieren, wird im Allgemeinen so durchgeführt, wie es bereits für Natriumkanäle, die sich normalerweise im Ruhezustand befinden, beschrieben wurde. Alternativ könnte eine Zelllinie verwendet werden, die den Kanal von Interesse (oder den Gegenkanal) endogen exprimiert. Die Kennzeichnung und Messung von Zellen mit Transmembranpotential-Farbstoffen wird im Allgemeinen so durchgeführt, wie es für Natriumionenkanäle, die sich normalerweise im Ruhezustand befinden, beschrieben ist.
  • Ein bevorzugtes Stimulationsprotokoll verwendet einen biphasischen Kern. Im Allgemeinen wird eine Reihe von Anfangsexperimenten mit Hilfe eines biphasischen Wellenkerns mit einer Rechteckwelle durchgeführt, der mit einer regelmäßigen Rate für eine feste Folgedauer wiederholt wird. Die Pulsdauer variiert von etwa 1 μs bis zu etwa 1 s und noch bevorzug ter von etwa 100 μs bis zu etwa 20 ms. Die Pulsamplitude variiert von 0 V/cm zu etwa 60 V/cm, und noch bevorzugter von 10 V/cm zu 50 V/cm. Die Stimulationsfrequenz variiert zwischen 0 Hz (d.h. ein einziger Puls) und 100 kHz, und noch bevorzugter von 0 Hz bis zu etwa 1 kHz. Die Pulsfolge variiert zwischen 0 s (d.h. ein einziger Puls) und etwa 100 s, und noch bevorzugter zwischen 0 s und 10 s.
  • Typischerweise beginnt man bei Anfangsbedingungen unter Verwendung eines biphasischen Wellenkerns mit einer Rechteckwelle mit 5 msec pro Phase und einer Amplitude von 25 V/cm. Der Kern wird mit einer regelmäßigen Rate von etwa 20 Hz für eine gesamte Folgedauer von etwa drei Sekunden wiederholt. Man optimiert dann die Pulsamplitude, die Dauer und dann die Frequenz. Wenn es notwendig ist, könnten auch Änderungen der Pulsform untersucht werden, um zu bestimmen, ob diese zu einer effizienteren Elektrostimulation führten. Die optimalen Stimulationsparameter ergeben die maximale Zellstimulation (verglichen mit Zellen, bei denen der ligandenabhängige Kanal blockiert oder nicht vorhanden ist) mit dem kleinsten Abweichungskoeffizienten des Signals zwischen den verschiedenen Test-Wells, mit der geringsten Stärke des elektrischen Feldes und mit dem geringsten Tastverhältnis für den Durchtritt von Strom durch die Elektroden. Nachdem ein bestimmter Satz von Parametern gewählt wurde, sollte eine Titration der Färbekonzentrationen für den/die Spannungssensorfarbstoff(e) wie oben beschrieben durchgeführt werden, um die Signalgröße und die Abweichungskoeffizienten der Reaktionen weiter zu optimieren. Diese Vorgänge (Farbstoffkonzentrationen, Stärke des elektrischen Feldes und Stimulationsdauer und -frequenz) können wiederholt werden, um das Signal noch weiter zu optimieren.
  • Es sollte möglich sein, sowohl nach Agonisten als auch nach Antagonisten zu screenen. Indem man die Stimulationsparameter so wählt, dass die Reaktion die Hälfte der maximalen Reaktion ist, reduzieren Agonisten die Reaktion, während Antagonisten sie erhöhen. Durch die Stimulation mit höheren (Agonisten-Assay) und niedrigeren (Antagonisten-Assay) Frequenzen können bessere Screening-Fenster erzielt werden.
  • Während dieser Experimente wird die Reaktion von Zellen mit aktiven Kanälen und von Zellen, bei denen die Kanäle pharmakologisch blockiert sind, verglichen. Wenn kein geeigneter pharmakologischer Wirk stoff verfügbar ist, kann der blockierte Zustand mit einer nicht transfizierten Zelllinie emuliert werden. Die optimalen Stimulationsparameter ergeben den kleinsten Abweichungskoeffizienten der Signaldifferenz der beiden Zellpopulationen.
  • Die vorliegende Erfindung beinhaltet auch Verfahren für die quantitative Bestimmung von Zell- und Ionenkanalparametern und für die Quantifizierung pharmakologischer Wirkungen von Testverbindungen auf diese Parameter unter Verwendung der Elektrostimulation.
  • b) Quantitative Messungen von Membranwiderständen
  • Nachdem die Elektrostimulation endet, begibt sich das Transmembranpotential der Zelle in ein neues Ruhepotential. Im Fall von Assays mit spannungsabhängigen Kanälen, schließen sich die Kanäle im Allgemeinen oder werden inaktiv, und das letzte Ruhegleichgewichtspotential wird das gleiche sein wie vor der Stimulation. In den meisten Fällen wird die Ladung, die sich auf der Membrankapazität aufgebaut hat, sich exponential durch die Membranspannung abbauen. Die Membranzeitkonstante ist einfach das Produkt aus der Membrankapazität und dem Membranwiderstand τm = RmCm Sie kann einfach durch die Messung der Membrankapazität und der Membranzeitkonstante bestimmt werden.
  • Die durchschnittliche Membrankapazität der Zellen, die im Allgemeinen für diese Assays verwendet werden, ist unabhängig vom exogenen Kanal und kann einfach durch Patch-Clamp-Verfahren gemessen werden. Die Membranzeitkonstante kann einfach gemessen werden, indem man die Abklingrate des Transmembranpotentials misst und diese Daten in eine exponentielle Abklingfunktion einsetzt. Somit können wir, indem wir die Membranzeitkonstante durch die durchschnittliche Membrankapazität für die bestimmte Zellart teilen, den Rest- oder Leck-Membranwiderstand quantitativ bestimmen.
  • Eine ähnliche Analyse kann erfolgen, um den Membranwiderstand quantitativ zu messen, während ein spannungsabhängiger Kanal geöffnet ist. Während der Elektrostimulation wird sich auch das Transmembranpotential ungefähr exponential in Richtung eines neuen Gleichgewichtpotentials bewegen. Somit stellt die Membranzeitkonstante der Spannungsänderung zu Beginn der Stimulation eine Messung des zeitgemittelten Membranwiderstands dar. Durch die Verwendung passender Skalierungs faktoren, um dem Teil der Zeit, die der Kanal tatsächlich offen ist, Rechnung zu tragen, können wir eine quantitative Schätzung für den Membranwiderstand des offenen Kanals abgeben.
  • c) Messung der Zeitkonstante für die Aufhebung der Inaktivierung
  • Die Öffnung eines Inaktivierungs-Ionenkanals macht es erforderlich, dass das Transmembranpotential für eine Zeit im Rahmen von einigen Millisekunden unter einer Schwelle gehalten wird. Diese Aufhebung der Inaktivierung hat wichtige physiologische Auswirkungen. Die Aufhebung der Inaktivierung erzwingt zum Beispiel eine Refraktärzeit, die die Rückübertragung von Aktionspotentialen verhindert und die maximalen Feuerraten von Neuronen beschränkt. Die pharmakologische Manipulation dieser Eigenschaft kann therapeutisch relevant sein.
  • Durch die Verwendung wiederholter Elektrostimulationen können wir die durchschnittliche Zeit für die Aufhebung der Inaktivierung schätzen. Dies kann durch die Verwendung elektrischer Feldpulse variabler Breite erfolgen. Wenn die Pulsbreite unter die Zeit für die Aufhebung der Inaktivierung fällt, werden weniger Kanäle aktiviert und der Anstieg des Transmembranpotentials als Reaktion auf die Stimulation wird abfallen.
  • d) Messung der Kanalöffnungszeit
  • Die Kanalöffnungszeit tgeöffnet ist eine Funktion der Inaktivierungseigenschaften des Kanals. Wir können die pharmakologische Manipulation dieses Parameters mit mittlerem bis zu hohem Durchsatz nachweisen, indem wir mit einer sehr hohen Frequenz stimulieren. Man betrachte zum Beispiel einen Assay für einen spannungsabhängigen Natriumkanal unter Verwendung des Verfahrens mit mehreren Stimulationen. Bei einem feststehenden monophasischen Wellenstimulationskern mit einer Rechteckwelle, der mit einer gleichmäßigen Rate wiederholt wird, erhöht sich die Spannungsreaktion mit Erhöhung der Stimulationswiederholungsrate. Dies trifft zu, weil der Natriumkanal bei einer höheren Frequenz für eine relativ längere Zeit geöffnet ist. Wenn jedoch das Intervall zwischen den Pulsen kürzer wird als die Kanalöffnungszeit, werden die aktivierten Natriumkanäle durch den nächsten Stimulationspuls negativ und dabei deaktiviert. Die Stimulationsimpulsfrequenz, bei der die Reaktion abflacht, steht in Bezug zu der Kanalöffnungszeit.
  • e) Elektrostimulation als extrazelluläres Current-Clamp-Element
  • Bei Whole-Cell-Aufzeichnung ist Current-Clamp eine Art, auf die Steuerströme in die Zelle geleitet werden können, während das Transmembranpotential aufgezeichnet wird. Obwohl die Patch-Clamp-Aufzeichnung extrem präzise ist, ist sie ein Verfahren mit sehr niedrigem Durchsatz. Das absolute Maximum, das ein hoch qualifizierter Wissenschaftler bei perfekten Bedingungen erzielen könnte, wäre die Bestimmung von Zellparametern mit einer Rate von etwa zehn Zellen pro Stunde. Oft ist die Detailgenauigkeit, die mit dem Patch-Clamp-Verfahren erzielt wird, für das Medikamentenscreening gar nicht erforderlich, aber es gibt derzeit kein Verfahren, um Detailgenauigkeit gegen Geschwindigkeit auszutauschen. Eine hohe Geschwindigkeit ist für das Screening von großen Verbindungsbibliotheken absolut entscheidend.
  • Die hier besprochenen Elektrofeld-Stimulationsverfahren ermöglichen eine neue Art der Current-Clamp-Elektrophysiologie, die wir als extrazelluläres Current-Clamp bezeichnen. Spannungsabhängige Kanäle können verwendet werden, um Steuerströme in Zellkulturen einfließen zu lassen, was die Bestimmung verschiedener Zell- und Kanaleigenschaften ermöglicht. Das extrazelluläre Current-Clamp hat einen sehr hohen Durchsatz, so dass es möglich sein wird, einen hohen Informationsinhalt der pharmakologischen Wirkung von Verbindungsbibliotheken gegen spezifische Zielionenkanäle zu erhalten. Die Pharmakologie und Physiologie eines Kanals können direkt studiert werden oder der Kanal kann als Stromgenerator für das Studium der Zellmembran selbst oder eines zweiten Ionenkanals verwendet werden.
  • Während die ultimative Präzision der mikroskopischen Parameter, die mit dem extrazellulären Current-Clamp erzielt werden kann, das Patch-Clamp-Verfahren noch nicht erreicht, sind wir nun in der Lage, Informationsinhalte für den Durchsatz auszutauschen. Das heißt, dass das Maß an Präzision, mit dem Messungen durchgeführt werden sollen, frei festgelegt werden kann. Mit einem einzigen Satz von Stimulationsparametern können große Bibliotheken nach potentiell interessanten Verbindungen gescreent werden. Ein zweites Screening mit mittlerem Durchsatz unter Verwendung der Titration von Verbindungskonzentrationen kann mit den Treffern durchgeführt werden, um deren Wirksamkeit und Spezifität zu bestimmen. Schließlich können wir solch therapeutisch relevante Ei genschaften wie Anwendungsabhängigkeit und Wirkmechanismus durch Variieren der Stimulationsparameter in Anwesenheit der Verbindungen bestimmen. Bei jeder Stufe wird automatisch der Durchschnitt der Messungen von vielen Zellen gebildet, was die Unsicherheiten, die mit den Unterschieden von Zelle zu Zelle einhergehen, deutlich reduziert.
  • Es gibt mindestens zwei zusätzliche Vorteile des extrazellulären Current-Clamp verglichen mit der Patch-Clamp-Analyse. Erstens wird die Integrität der Zellmembran während der Stimulation durch das elektrische Feld nicht verändert. Während der Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufzeichnung wird die intrazelluläre Flüssigkeit vollständig durch Pipettenlösung ersetzt. Viele Proteine innerhalb der Zelle, einschließlich Ionenkanäle, sind extrem empfindlich auf Modulatoren, intrazelluläre Botenstoffe und die Ionenumgebung. Die Komponenten des Zytoplasmas sind nur oberflächlich bekannt, somit werden die löslichen Komponenten im Intrazellulärraum immer verändert. Deshalb wird der „normale" physiologische Zustand der Zelle bei der Whole-Cell-Patch-Clamp-Analyse nur ungefähr erreicht, während er beim extrazellulären Current-Clamp intakt bleibt.
  • Zweitens kommt es bei den meisten Zellen zu dramatischen Veränderungen bezüglich Genexpression und Verhalten, wenn sie mit anderen Zellen in Kontakt sind. Da die meisten Zellen auch Gap-Junction-Verbindungen mit benachbarten Zellen eingehen, ist die Whole-Cell-Patch-Clamp-Analyse nur zuverlässig, wenn die Zellen vollständig voneinander isoliert sind. Das extrazelluläre Current-Clamp kann bei Zellen unabhängig von ihrem Konfluenzgrad verwendet werden, so dass die Zellen physiologisch relevanter sein können. Wir können extrazelluläres Current-Clamp verwenden, um herauszufinden, ob es irgendwelche Wirkungen des Kontakts zwischen Zellen auf die Elektrophysiologie des Kanals gibt. Dann können wir, in Verbindung mit der Genexpressionsanalyse diese Veränderungen den regulierenden Komponenten der Zelle zuordnen.
  • f) Elektrostimulation als Element des extrazellulären Voltage-Clamp
  • Beim Voltage-Clamp wird das Transmembranpotential der Zelle gesteuert, während der Stromfluss überwacht wird. Voltage-Clamp erfolgt im Allgemeinen, indem eine Feedback-Schleife zu einer Current-Clamp-Schaltung hinzugefügt wird. Im Fall des Whole-Cell-Verfahrens kann dies leicht erreicht werden, indem zwei Pipetten verwendet werden, die gleichzeitig an der gleichen Zelle platziert werden. Eine Pipette leitet einen Steuerstrom, während die andere die Spannung misst. Eine Feedback-Schaltung vergleicht die gemessene Spannung mit der Steuerspannung und passt den Steuerstrom entsprechend an. Im Allgemeinen kann dieselbe Pipette verwendet werden, um den Strom zu steuern und die Spannung zu messen, da der Widerstand der Zellmembran verglichen mit dem Zugriffswiderstand der Pipette groß ist. Verglichen mit Current-Clamp ist Voltage-Clamp im Allgemeinen ein leistungsfähigeres Verfahren für die elektrophysiologische Analyse. Ionenkanäle sind extrem empfindlich auf das Transmembranpotential, so dass die Datenanalyse deutlich klarer ist, wenn es sich um Strommessungen bei einer feststehenden Spannung handelt.
  • Extrazelluläres Current-Clamp kann zu einem Voltage-Clamp-Verfahren umgewandelt werden, indem eine Feedback-Schleife zwischen der Spannungsmessung (der Fluoreszenz oder dem Sensor-Farbstoff) und dem Stromgenerator (den Stimulationsparametern) hinzugefügt wird. In diesem Fall ist ein Transmembranpotential-Farbstoff mit ausreichender Geschwindigkeit erforderlich. Die Farbstoffkombination CC2-DMPE/DiSBAC6(3) hat eine Zeitkonstante von unter einer Millisekunde und sollte schnell genug sein, um alle außer den schnellsten zellulären Ereignissen zu erfassen. Basierend auf der Differenz der Steuerspannung und den Messungen des Transmembranpotentials, verändert ein Computer die Stimulationsparameter. Die Stimulationsparameter stehen in Bezug zu dem in die Zelle eingebrachten Strom, somit können wir den Zeitverlauf des Stroms als eine Funktion der Steuerspannung bestimmen. Dieses Verfahren sollte sich als nützlich für die Bestimmung des Wirkmechanismus pharmakologischer Wirkstoffe auf Zielionenkanäle erweisen.
  • g) Assays für intrazelluläre Kompartimente
  • Die hier beschriebenen Stimulationsverfahren können auch verwendet werden, um die Transmembranpotentiale von intrazellulären Organellen zu regulieren, die über Phospholipidmembrane verfügen, einschließlich der Mitochondrien und des Nucleus. Dies kann erreicht werden, indem man zuerst die Leitfähigkeit der Plasmamembran entweder durch Elektropermeabilisierung oder durch die Zugabe von Ionophoren wie zum Beispiel Valinomycin oder Gramicidin A erhöht. Dann ist der Intrazellulär raum nicht mehr vom angelegten elektrischen Feld isoliert. Dies erlaubt einem elektrischen Feld, das an die Salzlösung angelegt wird, Änderungen des Transmembranpotentials über die Membranen der intrazellulären Organellen zu generieren. Dann können, indem man die Zellen mit Farbstoffen färbt, die sensibel auf die Ionenkonzentration oder das Transmembranpotential sind, und die nur auf die spezifische Organellenmembran von Interesse zielen, die hier dargestellten Verfahren verwendet werden, um die Ionenkanäle dieser Organellen zu regulieren und zu testen. Das Zielen kann zum Beispiel unter Verwendung eines natürlich fluoreszierenden Proteins erreicht werden, das geeignete, dem Fachmann bekannte, subzelluläre Location-Signale enthält.
  • IX. Einbringen exogener Moleküle
  • Ein dielektrischer Durchbruch von Säugetierzellmembranen erfolgt, wenn das elektrische Potential an der Membran 200 mV übersteigt (Teissie and Rols, 1993 Biophys. J. 65:409-413). Wenn die Membran durchbricht, bilden sich Poren durch die Membran, die eine Brücke zwischen dem Intrazellulärraum und dem Extrazellulärraum bilden. Die Anzahl und Größe der Poren nimmt mit steigenden Transmembranpotentialen zu (Kinoshita and Tsong, 1977, Nature 268:438-441). Die Erhöhung der Stärke des elektrischen Feldes auf über etwa 60 V/cm bei typischen Säugetierzelllinien kann zu einer Elektropermeabilisierung der Zellen führen. Bei relativ schwachen Feldern werden kleine Poren in der Zellmembran gebildet, die offensichtlich groß genug sind, um kleine Ionen passieren zu lassen, aber nicht groß genug, um so große Moleküle wie DNA passieren zu lassen (Tsong, 1991, Biophys. J. 60:297-306). Diese Poren depolarisieren die Zelle vollständig, wobei das Transmembranpotential nahe Null bewegt wird. Durch die Elektropermeabilisierung von Zellen und die Überwachung der Änderung des Transmembranpotentials mit einem spannungsempfindlichen Farbstoff kann die vorliegende Erfindung verwendet werden, um das Transmembranruhepotential einer Zelle zu bestimmen. Dies ist für die Bestimmung pharmakologischer Wechselwirkungen mit Zellen oder Ionenkanälen, entweder als primäres oder sekundäres Screening, nützlich. Zum Beispiel könnte man bei einem Verbindungs-Screening gegenüber einem spannungsabhängigen Natriumkanal ein vielfaches Stimulationsprotokoll durchführen, um die Kanalaktivität zu bestimmen. Dann könnte man, in dem man ein Permeabilisierungsprotokoll folgen lässt, bestimmen, ob die Zellmembran in Anwesenheit der Verbindung ein normales Ruhepotential hatte oder nicht.
  • Darüber hinaus könnte man unter Verwendung einer stark polarisierten Zelllinie wie zum Beispiel RBL-Zellen spannungsabhängige Farbstoffe einfach durch Elektropermeabilisierung kalibrieren. Das Start-Transmembranpotential unter verschiedenen Bedingungen (zum Beispiel verschiedene Konzentrationen von extrazellulärem Kalium) und das Schluss-Transmembranpotential nach der Elektropermeabilisierung ist Null.
  • Darüber hinaus nimmt die Größe der durch die Elektropermeabilisierung gebildeten Poren als eine Funktion des angelegten elektrischen Feldes zu. Unter 50 V/cm werden keine Poren gebildet. Zwischen etwa 60 V/cm und 100 V/cm werden Poren gebildet, die groß genug sind, um monovalente Ionen passieren zu lassen. Über etwa 600 V/cm werden Poren gebildet, die groß genug sind, um DNA passieren zu lassen (Tsong, 1991, Biophys. J. 60:297-306). Somit kann diese Erfindung verwendet werden, um Poren von definierter Größe in den Zellmembranen mit hohem Durchsatz zu bilden. Dies könnte für viele Anwendungen nützlich sein, einschließlich des Einbringens von impermeablen Ionen, impermeablen Testverbindungen oder anderen Modulatoren, DNA oder RNA in die Intrazellulärräume zum Zweck der vorübergehenden oder stabilen Transfektion, und von fluoreszierenden oder anderen Indikator-Farbstoffen.
  • X. Auffinden von Medikamenten und Screening
  • a) Medikamenten-Screening
  • Die vorliegende Erfindung ermöglicht den verlässlichen Nachweis von Testverbindungen, die die Funktion von Ionenkanälen regulieren. Sie ist deutlich vielseitiger und stabiler als ältere Assay-Systeme. Bedeutenderweise stellt die vorliegende Erfindung die Möglichkeit zur Verfügung, das Transmembranpotential in intakten Zellen zu regulieren, ohne dass dafür pharmakologische Wirkstoffe oder die Zerstörung der Membran und der Verlust der intrazellulären Inhalte, wie beim Patch Clamp, erforderlich sind. Indem die vorliegende Erfindung möglich macht, das Transmembranpotential lebender Zellen extern zu regulieren, ermöglicht sie das Testen einer großen Zahl von Ionenkanälen.
  • Darüber hinaus bietet diese Fähigkeit, den spannungsabhängigen Zustand eines Ionenkanals präzise zu regulieren, wichtige Vorteile beim Auffinden von Medikamenten, wo es die Möglichkeit bietet, nach Verbindungen zu screenen, die vorzugsweise mit einem Zustand interagieren (d.h. anwendungsspezifische Blocker). Zum Beispiel weiß man von einigen bekannten, therapeutisch nützlichen Medikamenten (einschließlich Antiarrhythmika, Antispasmodika und Lokalanästhetika), dass sie als anwendungsspezifische Blocker von spannungsabhängigen Natrium- und/oder Calciumkanälen funktionieren. In jedem Fall würde die vollständige Blockierung des Zielkanals typischerweise zum Tod führen. Bestimmte Zustände wie chronische Schmerzen, Arrhythmien und Konvulsionen treten auf, wenn die Zellen überaktiv werden. Diese Zustände können gelindert oder eliminiert werden, indem die Kanäle blockiert werden, wenn sie beginnen, sich zu oft zu öffnen. Verbindungen, die in der Lage sind, den Kanal zu blockieren, die sich aber lieber an den/die aktivierten oder inaktivierten Zustand bzw. Zustände binden, als an den Ruhezustand bzw. die Ruhezustände, können die Erregbarkeit von Muskeln und Neuronen verringern. Diese Medikament sind wirksam, weil sie den Kanal unter normalen Bedingungen nicht beeinflussen, ihn jedoch nur blockieren, wenn es notwendig ist, die Übererregbarkeit zur verhindern. Bestehende Analyseverfahren, die mit Hochleistungs-Screening kompatibel sind, bieten jedoch nicht die Möglichkeit, den Aktivierungszustand des Ionenkanals routinemäßig in Echtzeit zu steuern.
  • Insbesondere bietet die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Screening der Wirkung einer Testverbindung auf einen Ionenkanal in einem definierten funktionellen Zustand innerhalb einer Zelle. Das Verfahren beinhaltet die Regulierung des Transmembranpotentials der Zelle über die Verwendung wiederholter Elektrostimulationen, um den Ionenkanal von Interesse durch seinen Aktivierungszyklus laufen zu lassen und das Transmembranpotential auf einen gewünschten Wert einzustellen, der für einen spezifischen Aktivierungszustand oder den Übergang zwischen Zuständen geeignet ist. Dann wird der Zelle während oder nach diesem Prozess eine Testverbindung zugefügt und das Transmembranpotential gemessen.
  • Typischerweise werden die Ergebnisse, die in Anwesenheit der Testverbindung erzielt werden, mit einer Kontrollprobe verglichen, die in Abwesenheit der Testverbindung inkubiert wurde. Die Kontrollmessungen erfolgen normalerweise mit einer Probe, die alle Komponenten enthält, und unter den gleichen Stimulationsbedingungen wie bei der Testprobe, mit Ausnahme des putativen Medikaments. Es können zusätzliche Kontrollstudien mit dem Ionenkanal in einem anderen spannungsabhängigen Zustand durchgeführt werden, um spezifisch zustandsspezifische Testverbindungen zu identifizieren. Der Nachweis einer Änderung des Transmembranpotentials in Anwesenheit des Testwirkstoffs im Vergleich zum Kontrollstoff zeigt an, dass der Testwirkstoff aktiv und spezifisch für den Ionenkanal in diesem Zustand oder während des Übergangs von einem Zustand in den anderen ist.
  • Transmembranpotentiale können auch in Anwesenheit oder Abwesenheit eines pharmakologischen Wirkstoffs mit bekannter Aktivität (d.h. einem Standardwirkstoff) oder putativer Aktivität (d.h. einem Testwirkstoff) bestimmt werden. Ein Unterschied der Transmembranpotentiale, wie er durch die hier veröffentlichten Verfahren nachgewiesen wird, ermöglicht den Vergleich der Aktivität des Testwirkstoffs mit der des Standardwirkstoffs. Man wird erkennen, dass dem Fachmann viele Kombinationen und Permutationen von Medikamenten-Screening-Protokollen bekannt sind, und dass sie leicht an die Verwendung mit der vorliegenden Erfindung, die hier dargestellt wird, angepasst werden können, um Wirkstoffe zu identifizieren, die Ionenkanäle und/oder Transmembranpotentiale beeinflussen. Die Verwendung der vorliegenden Erfindung in Kombination mit sämtlichen solcher Verfahren ist in dieser Erfindung vorgesehen.
  • In einem weiteren Aspekt beinhaltet die vorliegende Erfindung die Verwendung eines zweiten Ionenkanals in Verbindung mit den hier beschriebenen Elektrostimulationsverfahren, um das Ruhe- oder stimulierte Transmembranpotential auf einen vordefinierten Wert festzulegen, womit die Möglichkeit geschaffen wird, einen ersten Ionenkanal von Interesse zu testen. In einer Ausführungsform ist der zweite Ionenkanal ein spannungsregulierter Natrium- oder Calciumkanal, was die Generierung anhaltender positiver Transmembranpotentiale ermöglicht. In einer weiteren Ausführungsform ist der zweite Ionenkanal ein spannungsregulierter Kali umkanal, was die Generierung negativer Transmembranpotentiale ermöglicht. Die Verwendung dieses zweiten Ionenkanals ermöglicht die Verwendung des Elektrostimulationsverfahrens, um das Transmembranpotential auf praktisch alle vordefinierten Werte festzulegen.
  • Da dieses Assay-Format zwei Ionenkanäle beinhaltet, beeinflussen die Modulatoren eines jeden Kanals die Spannungsreaktion. In diesem Fall können zusätzliche Kontrollstudien mit der Stammzelllinie, die nur den zweiten Ionenkanal exprimiert, durchgeführt werden, um das Transmembranpotential festzulegen. Verbindungen, die den ersten Ionenkanal blockieren, können dann nochmals einzeln getestet werden, um herauszufinden, ob sie eine Aktivität gegen den zweiten Ionenkanal aufweisen.
  • Typischerweise werden die gescreenten Testverbindungen in Bibliotheken verwandter oder unterschiedlicher Verbindungen vorhanden sein. Die Bibliothek kann einzelne Elemente haben, die einzeln oder kombiniert getestet werden, oder die Bibliothek kann eine Kombination einzelner Elemente sein. Diese Bibliotheken können mindestens zwei Elemente haben, vorzugsweise über etwa 100 Elemente oder über etwa 1.000 Elemente, noch bevorzugter über etwa 10.000 Elemente und am bevorzugtesten über etwa 100.000 oder 1.000.000 Elemente.
  • b) Selektivität und Toxikologie von Kandidatenmodulatoren
  • Sobald sie identifiziert sind, können Kandidatenmodulatoren unter Verwendung bekannter Verfahren (siehe Lu, Basic Toxicology, Fundamentals, Target Organs, and Risk Assessment, Hemisphere Publishing Corp., Wahington (1985); US-Patent Nr. 5,196,313 an Culbreth (erteilt am 23. März 1993) und US-Patent Nr. 5,567,952 an Benet (erteilt am 22. Oktober 1996) hinsichtlich Selektivität und toxikologischer Wirkungen evaluiert werden.
  • Zum Beispiel können primäre Zelllinien oder Gewebescheiben verwendet werden, um nach der Wirkung des Kandidatenmodulators oder der Reaktion des Ionenkanals von Interesse in seinem natürlichen physiologischen Umfeld zu screenen. Zum Beispiel kann es für das Screening nach Medikamenten, die spezifische und/oder selektive Wirkungen auf Herzzellen haben, bevorzugt sein, Myozyten oder andere In-vitro-Zellkultur-Modellzelllinien zu verwenden. In diesem Fall kann ein erstes Screening in einer von Myozyten abgeleiteten Zelllinie abgeschlossen werden, um Verbindungen zu identifizieren, die elektrisch induzierte Aktionspotentiale entweder verkürzen, verlängern oder blockieren.
  • Das zweite Screening ist dann dazu ausgelegt, Verbindungen zu identifizieren, die potentiell negative Wirkungen auf den Körper haben. Dies kann zum Beispiel erreicht werden, indem man nach den Wirkungen des Kandidatenmedikaments auf elektrisch erregbare Gewebe wie zum Beispiel Herz- oder neuronale Gewebe oder immortalisierte Zellkulturen, die von diesen Geweben abgeleitet sind, screent. Diese Gewebe spielen entscheidende Rollen innerhalb eines Organismus und jede unerwünschte Wirkung des Kandidatenmedikaments auf die Fähigkeit dieser Gewebe, elektrisch stimuliert zu werden, würde voraussichtlich zu ernsten potentiellen Nebenwirkungen führen, wenn es verabreicht würde. Als Konsequenz daraus könnten aktive Wirkstoffe, die auch die Funktionsfähigkeit dieser Gewebe beeinträchtigten, zu einem frühen Zeitpunkt aus der Reihe der als Medikamentenkandidaten in Frage kommenden Wirkstoffe eliminiert werden oder könnten medizinisch-chemischen Verfahren unterzogen werden, um die Nebenwirkungen zu verringern.
  • Zusätzliche toxikologische Analysen der Kandidatenmodulatoren können durchgeführt werden, indem die in vitro Toxizität für eine Zelllinie bestimmt wird, wie zum Beispiel Säugetier- (vorzugsweise menschliche) Zelllinien. Kandidatenmodulatoren können zum Beispiel mit Gewebeextrakten, wie zum Beispiel Zubereitungen aus Leber, wie zum Beispiel mikrosomalen Zubereitungen behandelt werden, um die erhöhten oder verringerten toxikologischen Eigenschaften des chemischen Stoffes zu bestimmen, nachdem er von einem ganzen Organismus verstoffwechselt wurde oder über seine Fähigkeit über Cytochrom P450-Systeme, wie in den gemeinsam genutzten US-Patentanmeldungen Nr. 09/301,525, eingereicht am 28. April 1999, Nr. 09/301,395, eingereicht am 28. April 1999 und Nr. 09/458,927, eingereicht am 10. Dezember 1999 beschrieben, abgebaut zu werden. Die Ergebnisse dieser Arten von Studien sagen oft toxikologische Eigenschaften von chemischen Stoffen bei Tieren, wie zum Beispiel Säugetieren, einschließlich Menschen, voraus.
  • Die toxikologische Aktivität kann unter Verwendung von Reportergenen gemessen werden, die während der toxikologischen Aktivität oder durch Zelllyse aktiviert werden (siehe WO 98/13353, veröffentlicht am 2.4.1998). Bevorzugte Reportergene produzieren ein fluoreszierendes oder lumineszierendes Translationsprodukt (wie zum Beispiel ein grünfluoreszierendes Protein (siehe, zum Beispiel US-Patent Nr. 5,625,048 an Tsien et al., veröffentlicht am 29.04.1998; US-Patent Nr. 5,777,079 an Tsien et al., veröffentlicht am 07.07.1998, WO 96/23810 an Tsien, veröffentlicht am 08.08.1996; WO 97/28261, veröffentlicht am 07.08.1997; PCT/US97/12410, eingereicht am 16.07.1997; PCT/US97/14595, eingereicht am 15.08.1997) oder ein Translationsprodukt, das ein fluoreszierendes oder lumineszierendes Produkt produzieren kann (wie zum Beispiel Beta-Lactamase (siehe zum Beispiel US-Patent Nr. 5,741,657 an Tsien, erteilt am 21.04.1998 und WO 96/30540, veröffentlicht am 03.10.1996)), wie zum Beispiel ein enzymatisches Abbauprodukt. Die Zelllyse kann in der vorliegenden Erfindung als eine Verringerung eines Fluoreszenzsignals von mindestens einem photonenproduzierenden Wirkstoff innerhalb einer Zelle in Anwesenheit von mindestens einem photonenreduzierenden Wirkstoff nachgewiesen werden. Solche toxikologischen Bestimmungen können unter Verwendung prokaryontischer oder eukaryontischer Zellen erfolgen, optional unter Verwendung einer toxikologischen Profilierung, wie in PCT/US94/00583, eingereicht am 21.01.1994 (WO 94/17208), im Deutschen Patent Nr. 69406772.5-08, erteilt am 25.11.1997, EPC 0680517, erteilt am 12.11.1994, US-Patent Nr. 5,589,337, erteilt am 31.12.1996, EPO 651282, erteilt am 14.01.1998 und US-Patent Nr. 5,585,232, erteilt am 17.12.1996, beschrieben ist.
  • Alternativ oder zusätzlich zu diesen In-vitro-Studien können die Bioverfügbarkeit und toxikologischen Eigenschaften eines Kandidatenmodulators unter Verwendung etablierter Verfahren in einem Tierversuchsmodell wie z.B. mit Mäusen, Ratten, Kaninchen oder Affen, bestimmt werden (siehe Lu, supra (1985); und Creasey, Drug Disposition in Numans, The Basis of Clinical Pharmacology, Oxford University Press, Oxford (1979), Osweiler, Toxicology. Williams and Wilkins, Baltimore, MD (1995), Yang, Toxicology of Chemical Mixtures; Case Studies, Mechanisms and Novel Approaches, Academic Press, Inc., San Diego, CA (1994), Burrell et al., Toxicology of the Immune System; A Human Approach, Van Nostrand Reinhld, Co. (1997), Niesink et al., Toxicology; Principles and Applications, CRC Press Boca Raton, FL (1996). Je nach der Toxizität, Zielorgan, Gewebe, Ort und mutmaßlichem Mechanismus des Kandidatenmodulators wäre es für den geübten Fachmann keine Schwierigkeit, die geeigneten Dosen, LD50-Werte, Verabreichungswege und Systeme zu bestimmen, die angemessen wären, um die toxikologischen Eigenschaften des Kandidatenmodulators zu bestimmen. Zusätzlich zu Tierversuchsmodellen können klinische Studien an Menschen durchgeführt werden, die etablierten Abläufen folgen, wie zum Beispiel den von der United States Food and Drug Administration (USFDA = die dem US-Gesundheitsministerium unterstellte Arzneimittelzulassungsbehörde der USA) festgelegten Abläufen oder äquivalenten, von anderen Regierungen festgelegten Abläufen. Diese Toxizitätsstudien bilden die Basis für die Bestimmung des therapeutischen Nutzens eines Kandidatenmodulators in vivo.
  • c) Wirksamkeit von Kandidatenmodulatoren
  • Die Wirksamkeit eines Kandidatenmodulators kann unter Verwendung verschiedener, in Fachkreisen anerkannter Verfahren, wie zum Beispiel In-vitro-Verfahren, Tierversuchsmodellen oder klinischen Studien an Menschen (siehe Creasey, supra (1979)), etabliert werden. Für viele Erkrankungen oder Zustände gibt es anerkannte In-vitro-Modelle. Zum Beispiel wird die Fähigkeit eines chemischen Stoffes, die Lebensdauer einer HIV-infizierten Zelle in vitro zu verlängern, als ein akzeptables Modell anerkannt, um chemische Stoffe zu identifizieren, von denen man erwartet, dass sie für die Behandlung von HIV-Infektionen oder AIDS wirksam sind (siehe Daluge et al., Antimicro. Agents Chemother. 41:1082-1093 (1995)). Darüber hinaus wurde die Fähigkeit von Cyclosporin A (CsA), die Proliferation von T-Zellen in vitro zu verhindern, als ein akzeptables Modell für die Identifizierung von chemischen Stoffen etabliert, von denen man erwartet, dass sie als Immunsuppressiva wirksam sind (siehe Suthanthiran et al., supra, (1996)). Für nahezu alle Arten von Therapeutika, Erkrankungen oder Zuständen steht ein akzeptables In-vitro- oder Tierversuchsmodell zur Verfügung. Diese Modelle gibt es zum Beispiel für gastrointestinale Störungen, Krebs, Kardiologie, Neurobiologie und Immunologie. Darüber können bei diesen In-vitro-Verfahren Gewebeextrakte verwendet werden, wie zum Beispiel Zubereitungen aus Leber, wie zum Beispiel mikrosomale Zubereitungen, um eine verlässliche Indikation für die Wirkungen des Stoffwechsels auf den Kandidatenmodulator zur Verfü gung zu stellen. Ähnlich können akzeptable Tierversuchsmodelle verwendet werden, um die Wirksamkeit von chemischen Stoffen bei der Behandlung verschiedener Erkrankungen oder Zustände zu etablieren. Das Knie eines Kaninchens ist zum Beispiel ein akzeptiertes Modell für das Testen von chemischen Stoffen auf die Wirksamkeit bei der Behandlung von Arthritis (siehe Shaw and Lacy, J. Bone Joint Surg. (Br) 55:197-205 (1973)). Hydrocortison, das für die Behandlung der Arthritis beim Menschen zugelassen ist, ist in diesem Modell wirksam, was die Gültigkeit dieses Modells bestätigt (siehe McDonough, Phys. Ther. 62:835-839 (1982)). Bei der Auswahl eines passenden Modells zur Bestimmung der Wirksamkeit eines Kandidatenmodulators kann sich der erfahrene Fachmann vom Stand der Technik leiten lassen, um das passende Modell, die passende Dosis, den passenden Verabreichungsweg, das passende System und den Zielpunkt auszuwählen und wäre als solcher nicht unnötig stark belastet.
  • Zusätzlich zu Tierversuchsmodellen können klinische Studien am Menschen verwendet werden, um die Wirksamkeit eines Kandidatenmodulators am Menschen zu bestimmen. Die USFDA oder äquivalente Regierungsbehörden haben Abläufe für diese Studien festgelegt (siehe www.fda.gov).
  • d) Selektivität von Kandidatenmodulatoren
  • Die bereits beschriebenen In-vitro- und In-vivo-Verfahren etablieren auch die Selektivität eines Kandidatenmodulators. Die vorliegende Erfindung stellt ein schnelles Verfahren zur Verfügung, um die Spezifität des Kandidatenmodulators zu bestimmen. Zum Beispiel können Zelllinien, die Mitglieder verwandter Ionenkanalfamilien enthalten, verwendet werden, um die Selektivität eines chemischen Teststoffs im Hinblick sowohl auf dessen Fähigkeit, verwandte Ionenkanäle zu hemmen als auch seine relative Fähigkeit, verschiedene spannungsabhängige Zustände von Ionenkanälen zu regulieren, schnell zu profilieren. Ein solches System bietet zum ersten Mal die Möglichkeit, große Mengen von chemischen Teststoffen schnell zu profilieren, um die Ionenkanalselektivität eines Kandidatenmodulators systematisch auf eine einfache, miniaturisierte Weise mit hohem Durchsatz zu evaluieren.
  • e) Ein identifizierte chemischer Stoff, ein identifizierter Modulator, ein identifiziertes Therapeutikum oder eine identifizierte Verbindung
  • Die Erfindung beinhaltet Zusammensetzungen, wie zum Beispiel neue chemische Stoffe und Therapeutika, die durch mindestens ein Verfahren der vorliegenden Erfindung als aktiv bei Verwendung der hier beschriebenen Verfahren, Systeme oder Komponenten identifiziert wurden. Der Begriff „neue chemische Stoffe", so wie er hier verwendet wird, beinhaltet keine chemischen Stoffe, die dem Fachmann ab dem Einreichungsdatum dieser Anmeldung allgemein bekannt waren. Typischerweise wird ein chemischer Stoff durch Verwendung der Erfindung als aktiv identifiziert und anschließend seine Struktur aus einer Eigenschafts-Datenbank chemischer Strukturen gewonnen oder durch analytische Techniken wie z.B. Massenspektroskopie bestimmt.
  • Eine Ausführungsform der Erfindung ist ein chemischer Stoff mit nützlicher Aktivität, der einen chemischen Stoff enthält, der durch das oben beschriebene Verfahren identifiziert wurde. Diese Zusammensetzungen enthalten kleine organische Moleküle, Nucleinsäuren, Peptide und andere Moleküle, die leicht durch in Fachkreisen verfügbare Techniken synthetisiert und in Zukunft entwickelt werden können. Zum Beispiel sind die folgenden kombinatorischen Verbindungen für das Screening geeignet: Peptoide (PCT Veröffentlichung Nr. WO 91/19735, 26. Dez. 1991), kodierte Peptide (PCT Veröffentlichung Nr. WO 93/20242, 14. Okt. 1993), randomisierte Bio-Oligomere (PCT Veröffentlichung WO 92/00091, 9. Jan. 1992), Benzodiazepine (US-Patent Nr. 5,288,514), Diversomere wie zum Beispiel Hydantoine, Benzodiazepine und Dipeptide (Hobbs DeWitt, S. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90:6906-6913 (1992)), auf Vinyl basierende Polypeptide (Hagihara et al., J. Amer. Chem. Soc. 114:6568 (1992)) nicht-peptide Peptidomimetika mit einem Beta-D-Glukose-Gerüst (Hirschmann, R. et al., J. Amer. Chem. Soc. 114: 9217-9218 (1992)), analoge organische Synthesen kleiner Verbindungsbibliotheken (Chen, C. et al., J. Amer. Chem. Soc. 116:2661 (1994)), Oligocarbamate (Cho, C.Y. et al., Science 261:1303 (1993)), und/oder Peptidylphosphonate (Campbell, D.A. et al. J. Org. Chem. 59:658 (1994)). Siehe allgemein Gordon, E.M. et al., J. Med Chem. 37:1385 (1994).
  • Die vorliegende Erfindung umfasst auch die identifizierten Zusammensetzungen in einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die einen pharmazeutisch akzeptablen Trägerstoff enthält, der für die Speicherung und darauffolgende Verabreichung vorbereitet ist, die eine pharmazeutisch wirksame Menge der vorstehend offenbarten Produkte in einem pharmazeutisch akzeptablen Trägerstoff oder Verdünnungsmittel enthalten. Akzeptable Trägerstoffe oder Verdünnungsmittel für die therapeutische Verwendung sind in pharmazeutischen Fachkreisen hinreichend bekannt und werden zum Beispiel in „Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro edit. 1985) beschrieben. Konservierungsstoffe, Stabilisatoren, Farbstoffe und sogar Geschmacksstoffe können in der pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verfügung gestellt werden. Zum Beispiel können Natriumbenzoate, Ascorbinsäure und Ester von p-Hydroxybenzoesäure als Konservierungsmittel hinzugefügt werden. Zusätzlich können Antioxidanzien und Suspensionsmittel verwendet werden.
  • Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindungen können formuliert und als Tabletten, Kapseln oder Elixiere für die orale Verabreichung; als Suppositorien für die rektale Verabreichung, als sterile Lösungen, Suspensionsmittel für die Verabreichung durch Injektion und dgl. verwendet werden. Injektionen können in herkömmlichen Formen als flüssige Lösungen oder Suspensionen, in festen Formen, die für die Auflösung oder Suspension in Flüssigkeiten vor der Injektion geeignet sind, oder als Emulsionen zubereitet werden. Geeignete Arzneiträger sind zum Beispiel Wasser, Salzlösung, Dextrose, Mannitol, Laktose, Lecithin, Albumin, Natriumglutamat, Cysteinhydrochlorid und dgl. Zusätzlich können die injizierbaren pharmazeutischen Zusammensetzungen, falls dies gewünscht wird, geringe Mengen nicht-toxischer Hilfsstoffe enthalten, wie zum Beispiel Feuchthaltemittel, ph-Puffermittel und ähnliche Mittel. Wenn dies gewünscht wird, können Zubereitungen, die die Absorption verbessern (z.B. Liposome), verwendet werden.
  • Die pharmazeutisch wirksame Menge der Zusammensetzung, die als eine Dosis erforderlich ist, hängt vom Verabreichungsweg, der Art des behandelten Tiers und den physischen Eigenschaften des spezifischen Tiers im jeweils vorliegenden Fall ab. Die Dosis kann eingestellt werden, um eine gewünschte Wirkung zu erzielen, hängt aber von Faktoren wie Gewicht, Ernährung, gleichzeitig verabreichten Medikamenten und anderen Faktoren ab, die der Fachmann erkennen wird. Bei der Anwendung der Verfahren der Erfindung können die Produkte oder Zusammensetzungen alleine oder miteinander kombiniert, oder mit anderen Therapeutika oder diagnostischen Wirkstoffen kombiniert, verwendet werden. Diese Produkte können in vivo, gewöhnlich an einem Säugetier, vorzugsweise einem Menschen, oder in vitro angewandt werden. Bei der Anwendung in vivo können die Produkte oder Zusammensetzungen dem Säugetier auf eine Vielzahl von Wegen verabreicht werden, einschließlich parenteraler, intravenöser, subkutaner, intramuskulärer, colonaler (über den Dickdarm), rektaler, nasaler oder intraperitonealer Verabreichung, wobei eine Vielzahl von Dosierungsformen verwendet wird. Diese Verfahren können auch zum Testen chemischer Aktivität in vivo verwendet werden.
  • Wie dem Fachmann schnell klar sein wird, variieren die nützliche In-vivo-Dosis, die verabreicht werden soll und die bestimmte Verabreichungsart je nach Alter, Gewicht, behandelter Säugetierspezies, den bestimmten Verbindungen, die eingesetzt werden, und der spezifischen Verwendung, für die diese Verbindungen eingesetzt werden. Die Bestimmung wirksamer Dosismengen, das heißt, der Dosismengen, die notwendig sind, um das gewünschte Ergebnis zu erzielen, kann durch einen Fachmann unter Verwendung von routinemäßigen pharmakologischen Verfahren erreicht werden. Typischerweise beginnt man bei klinischen Verabreichungen von Produkten an Menschen mit niedrigeren Dosismengen, wobei die Dosismengen erhöht werden, bis die gewünschte Wirkung erzielt wird. Alternativ können akzeptable In-vitro-Studien verwendet werden, um nützliche Dosierungen und Verabreichungswege der durch die vorliegenden Verfahren identifizierten Zusammensetzungen unter Verwendung etablierter pharmakologischer Verfahren festzulegen.
  • In Studien, die an Tieren und nicht an Menschen durchgeführt werden, beginnt die Verabreichung potentieller Produkte mit höheren Dosismengen, wobei die Dosis verringert wird, bis die gewünschte Wirkung nicht mehr erzielt wird oder unerwünschte Nebenwirkungen verschwinden. Die Dosierung der Produkte der vorliegenden Erfindung kann sich in einem breiten Rahmen bewegen, je nach den gewünschten Wirkungen und der therapeutischen Indikation. Typischerweise können Dosen zwischen etwa 10 μg/kg und 100 mg/kg Körpergewicht liegen und vorzugsweise zwischen etwa 100 μg/kg und 10 mg/kg Körpergewicht. Die Verabreichung erfolgt vorzugsweise oral und täglich.
  • Die exakte Formulierung, der exakte Verabreichungsweg und die exakte Dosis können durch den einzelnen Arzt im Hinblick auf den Zustand des Patienten gewählt werden. (Siehe z.B. Fingl et al., in The Pharmacological Basis of Therapeutics, 1975). Es wäre festzuhalten, dass der behandelnde Arzt weiß, wie und wann die Verabreichung aus Toxizitätsgründen oder aufgrund von Organdysfunktionen zu beenden, zu unterbrechen oder anzupassen ist. Umgekehrt weiß der behandelnde Arzt auch, wie die Behandlung auf höhere Mengen angepasst werden könnte, wenn die klinische Reaktion nicht adäquat ist (unter Ausschließen der Toxizität). Die Höhe einer verabreichten Dosis bei der Behandlung der Störung von Interesse variiert je nach Schwere des zu behandelnden Zustands und Verabreichungsweg. Die Schwere des Zustands kann zum Beispiel teilweise durch standardmäßige prognostische Evaluierungsverfahren beurteilt werden. Darüber hinaus werden die Dosis und vielleicht die Dosishäufigkeit ebenfalls je nach Alter, Körpergewicht und Reaktion des einzelnen Patienten variieren. Ein Programm, das mit dem bereits erläuterten Programm vergleichbar ist, kann in der Veterinärmedizin verwendet werden.
  • Je nach den spezifischen zu behandelnden Zuständen, können solche Wirkstoffe formuliert und systemisch oder lokal verabreicht werden. Techniken für die Formulierung und Verabreichung findet man in „Remington's Pharmaceutical Sciences", 18. Ausgabe, Mack Publishing Co., Easton, PA (1990). Geeignete Verabreichungswege können die orale, rektale, transdermale, vaginale, transmukosale oder intestinale Verabreichung beinhalten; die parenterale Verabreichung, einschließlich intramuskulärer, subkutaner, intramedullärer Injektionen sowie intrathekaler, direkter intraventrikulärer, intravenöser, intraperitonealer, intranasaler oder intraokularer Injektionen.
  • Für die Injektion können die Wirkstoffe der Erfindung in wässrigen Lösungen formuliert werden, vorzugsweise in physiologisch kompatiblen Puffern, wie zum Beispiel Hank's Salzlösung, Ringerlösung oder einem Puffer aus physiologischer Kochsalzlösung. Für diese transmukosale Verabreichung werden in der Formulierung Durchdringungsmittel verwendet, die für die zu durchdringende Barriere angemessen sind. Diese Durchdringungsmittel sind auf diesem Fachgebiet allgemein bekannt. Die Verwendung pharmazeutisch akzeptabler Trägerstoffe, um die hier veröffentlichten Verbindungen für die Praktizierung der Erfindung in Dosierungen zu formulieren, die für die systemische Verabreichung geeignet sind, liegt im Rahmen der Erfindung. Bei korrekter Auswahl des Trägerstoffs und der geeigneten Herstellungsart können die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung, insbesondere die, die als Lösungen formuliert werden, parenteral verabreicht werden, wie zum Beispiel durch intravenöse Injektion. Die Verbindungen können leicht formuliert werden, indem pharmazeutisch akzeptable Trägerstoffe, die auf diesem Fachgebiet bekannt sind, in Dosierungen, die für die orale Verabreichung geeignet sind, verwendet werden. Diese Trägerstoffe ermöglichen, dass die Verbindungen der Erfindung als Tabletten, Pillen, Kapseln, Flüssigkeiten, Gels, Sirups, dünne Breie, Suspensionen und Ähnliches für die orale Aufnahme durch einen zu behandelnden Patienten formuliert werden können.
  • Wirkstoffe, die dafür gedacht sind, intrazellulär verabreicht zu werden, können verabreicht werden, indem man Techniken verwendet, die dem durchschnittlich ausgebildeten Fachmann bekannt sind. Zum Beispiel können solche Wirkstoffe in Liposome eingekapselt werden und dann wie oben beschrieben verabreicht werden. Alle Moleküle, die zum Zeitpunkt der Liposombildung in einer wässrigen Lösung vorhanden sind, werden in das wässrige Innere eingeschlossen. Die liposomalen Inhalte werden sowohl von der externen Mikro-Umgebung geschützt als auch, da Liposome mit Zellmembranen verschmelzen, effizient in das Zellzytoplasma eingeführt. Darüber hinaus können kleine organische Moleküle aufgrund ihrer Hydrophobie direkt intrazellulär verabreicht werden.
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen, die für die Verwendung mit der vorliegenden Erfindung geeignet sind, beinhalten Zusammensetzungen, in denen die aktiven Bestandteile in einer wirksamen Menge enthalten sind, um den gewünschten Zweck zu erreichen. Die Bestimmung der wirksamen Mengen liegt deutlich innerhalb der Fähigkeiten der Fachleute, insbesondere angesichts der detaillierten Veröffentlichung, die hier zur Verfügung gestellt wird. Zusätzlich zu den aktiven Bestandteilen können diese pharmazeutischen Zusammensetzungen auch geeignete pharmazeu tisch akzeptable Trägerstoffe enthalten, die Arzneiträger und Hilfsstoffe umfassen, die die Verarbeitung des aktiven Wirkstoffs zu Zubereitungen, die pharmazeutisch verwendet werden können, erleichtern. Die Zubereitungen, die für die orale Verabreichung formuliert werden, können in Form von Tabletten, Dragees, Kapseln oder Lösungen vorliegen. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können auf eine Weise hergestellt werden, die an sich bekannt ist, zum Beispiel durch konventionelle Verfahren wie Mischen, Auflösen, der Herstellung von Dragees und Granulat, Levitation, Emulieren, der Herstellung von Kapseln, Wirkstoffeinlagerung oder Lyophilisierung.
  • Pharmazeutische Formulierungen für die parenterale Verabreichung beinhalten wässrige Lösungen des aktiven Wirkstoffs in wasserlöslicher Form. Darüber hinaus können Suspensionen der aktiven Wirkstoffe als adäquate ölige Injektions-Suspensionen zubereitet werden. Geeignete lipophile Lösungsmittel oder Vehikel beinhalten fettige Öle, wie zum Beispiel Sesamöl, oder synthetische Fettsäureester, wie zum Beispiel Ethyloleat oder Triglyzeride oder Liposome. Wässrige Injektions-Suspensionen können Substanzen beinhalten, die die Viskosität der Suspension erhöhen, wie zum Beispiel Natriumcarboxymethylzellulose, Sorbitol oder Dextran. Optional können die Suspensionen auch geeignete Stabilisatoren oder Wirkstoffe, die die Löslichkeit der Verbindungen erhöhen, um die Zubereitung hochkonzentrierter Lösungen zu ermöglichen, enthalten.
  • Pharmazeutische Zubereitungen für die orale Verwendung können erhalten werden, indem man die aktiven Wirkstoffe mit festen Arzneiträgern kombiniert, optional die entstehende Zusammensetzung vermahlt und das Gemisch aus Körnchen, ggf. nach Zugabe geeigneter Hilfsstoffe, verarbeitet, um Tabletten- oder Drageekerne zu erhalten. Geeignete Arzneiträger sind insbesondere Füllstoffe wie Zucker, einschließlich Laktose, Saccharose, Mannitol oder Sorbitol; Zellulosezubereitungen wie zum Beispiel Maisstärke, Weizenstärke, Reisstärke, Kartoffelstärke, Gelatine, Tragantgummi, Methylzellulose, Hydroxypropylmethylzellulose, Natriumcarboxymethylzellulose und/oder Polyvinylpyrrolidon (PVP). Wenn gewünscht, können Zersetzungswirkstoffe hinzugefügt werden, wie zum Beispiel vernetztes Polyvinylpyrrolidon, Agar oder Alginsäure oder ein Salz daraus, wie zum Beispiel Natriumalginat. Drageekerne erhalten geeignete Überzüge. Für diesen Zweck können konzentrierte Zuckerlösungen verwendet werden, die optional Gummiarabikum, Talkum, Polyvinylpyrrolidon, Carbopolgel, Polyethylenglykol und/oder Titandioxid, Lacklösungen und geeignete organische Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemische enthalten können. Den Tabletten- oder Drageeüberzügen können Farbstoffe oder Pigmente zur Identifizierung oder zur Charakterisierung der verschiedenen Kombinationen von Dosierungen aktiver Verbindungen hinzugefügt werden. Für diesen Zweck können konzentrierte Zuckerlösungen verwendet werden, die optional Gummiarabikum, Talkum, Polyvinylpyrrolidon, Carbopolgel, Polyethylenglykol und/oder Titandioxid, Lacklösungen und geeignete organische Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemische enthalten können. Den Tabletten- oder Drageeüberzügen können Farbstoffe oder Pigmente zur Identifizierung oder zur Charakterisierung der verschiedenen Kombinationen von Dosierungen aktiver Verbindungen hinzugefügt werden. Diese Formulierungen können unter Verwendung von in der Technik bekannten Verfahren hergestellt werden (siehe, zum Beispiel US-Patente Nummern 5,733,888 (injectable compositions); 5,726,181 (poorly water soluble compounds); 5,707,641 (therapeutically active proteins or peptides); 5,667,809 (lipophile agents); 5,576,012 (solubilizing polymeric agents); 5,707,615 (anti-viral formulations); 5,683,676 (particulate medicaments); 5,654,286 (topical formulations); 5,688,529 (oral suspensions); 5,445,829 (extended release formulations); 5,653,987 (liquid formulations); 5,641,515 (controlled release formulations) und 5,601,845 (spheroid formulations).
  • BEISPIELE
  • Die Erfindung kann mit Bezug auf die beiliegenden Beispiele besser verstanden werden. Diese dienen ausschließlich Zwecken der Erläuterung und sollten nicht so verstanden werden, dass sie den Umfang der Erfindung, wie er in den Ansprüchen im Anhang definiert ist, in irgendeiner Weise einschränken.
  • Beispiel 1: Analyse der Einheitlichkeit elektrischer Felder bei parallelen Plattenelektroden in standardmäßigen runden Wells
  • Zur Analyse der Wirkung verschiedener Elektroden und Well-Designs, wurden eine Reihe zweidimensionaler numerischer Simulationen der elektrischen Felder unter Verwendung des Software-Analyse-Paketes QuickfieIdTM 4.1 (Studentenversion, Tera Analysis, http://www.teraanalysis.com) durchgeführt. Dieses Softwarepaket erzeugt grobkörnige, netzartige Intensitätskarten elektrischer Felder, indem es die Poisson-Gleichung mit einem Finite-Elemente-Analyseverfahren in zwei Dimensionen löst. Für die Zwecke dieser Analyse werden die Randbildungseffekte aufgrund der Lücke zwischen der Unterseite der Elektrode und dem Boden des Wells ignoriert und die Spannungsabfälle von den Elektroden zur Salzlösung werden ebenfalls als vernachlässigbar betrachtet. Die räumliche Auflösung der modellhaften Nachbildung liegt bei ungefähr 0,5 mm.
  • 7A zeigt die Ergebnisse der Simulation bei Verwendung von 4 mm breiten parallelen Plattenelektroden (710) mit einem Abstand von 4 mm und einer Standarddifferenz des elektrischen Potentials von 2 V, in einem runden normgerechten 96er Well. In dieser Figur entspricht der äußere Kreis (700) dem Rand des Wells, die beiden vertikalen Linien (710) entsprechen den Elektroden und der gestrichelte Kreis in der Mitte (720) entspricht dem Beobachtungsbereich. Der graue Bereich (740) entspricht dem Bereich, in dem das elektrische Feld innerhalb von ± 10 % des gemittelten Feldes im Beobachtungsbereich bleibt. Im weißen Bereich (730) beträgt das Feld weniger als 10 % des gemittelten Feldes und im schwarzen Bereich (750) liegt das Feld mehr als 10 % über dem gemittelten Feld. Innerhalb des Beobachtungsbereichs liegt die Standardabweichung der Feldstärke bei 2 % des gemittelten Feldes und die Differenz zwischen dem maximalen und minimalen Feld liegt bei 10 % des gemittelten Feldes. Somit erfüllt diese Geometrie die festgelegten Anforderungen für die Feldeinheitlichkeit für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung.
  • Beispiel 2: Analyse der Einheitlichkeit elektrischen Felder von Stiftelektroden in runden Standard-Wells
  • Um die vorhergesagte Gleichheit des elektrischen Feldes für zwei runde Stiftelektroden mit einem Durchmesser von 1,0 mm, die in einem Standard-Well mit einem Durchmesser von 6,2 mm, getrennt durch einen Abstand von 4,0 mm platziert werden, zu bestimmen, wurden Simulationen mit den gleichen Bedingungen und Annahmen wie in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt.
  • In 7B entspricht der äußere durchgezogene Kreis (705) dem Rand des Well, die beiden kleineren Kreise (715) entsprechen den Elektroden und der gestrichelte Kreis in der Mitte entspricht dem Beobachtungsbereich. Der graue Bereich (745) entspricht dem Bereich, in dem das elektrische Feld innerhalb von ±10 % des gemittelten Feldes im Beobachtungsbereich bleibt. Im weißen Bereich (735) liegt das Feld bei weniger als 10 % des gemittelten Feldes und im schwarzen Bereich (755) liegt das Feld mehr als 10 % über dem gemittelten Feld. Innerhalb des Beobachtungsbereichs (725) liegt die Standardabweichung der Feldstärke bei 15 % des gemittelten Feldes und die Differenz zwischen dem maximalen und minimalen Feld liegt bei 87 % des gemittelten Feldes. Somit erzeugt diese Geometrie keine einheitlichen elektrischen Felder und ist deshalb nicht für die Verwendung mit der vorliegenden Erfindung geeignet.
  • Beispiel 3: Analyse der Einheitlichkeit elektrischer Felder bei parallelen Plattenelektroden in quadratischen Wells
  • 8A zeigt eine Simulation des Feldprofils mit zwei 6 mm breiten parallelen Plattenelektroden mit einem Abstand von 4 mm in einem quadratischen Well mit 6,2 mm. In dieser Figur entspricht das äußere Quadrat (800) dem Rand des Wells. Die beiden vertikalen Linien (810) entsprechen den Elektroden. Der gestrichelte Kreis in der Mitte (820) entspricht dem Beobachtungsbereich. Es ist besonders zu beachten, dass die Skala für elektrische Felder für 8 verglichen mit 7 stark erweitert wurde, um eine Vergleichsmöglichkeit für die Variationen der Intensität der elektrischen Felder zu bieten. Der graue Bereich (840) entspricht dem Bereich, in dem das elektrische Feld innerhalb von ±1 % des gemittelten Feldes im Beobachtungsbereich bleibt. Im weißen Bereich (830) beträgt das Feld weniger als 1 % des gemittelten Feldes. Bei dieser Simulation liegt das Feld zu keinem Zeitpunkt mehr als 1 % über dem gemittelten Feld. Innerhalb des Beobachtungsbereichs liegt die Standardabweichung der Feldstärke bei 0,02 % des gemittelten Feldes und die Differenz zwischen dem maximalen und minimalen Feld liegt bei 0,12 % des gemittelten Feldes. Somit verbessert diese Geometrie die Feldeinheitlichkeit in großem Maß.
  • Die Ergebnisse der Simulation zeigen, dass die primäre Quelle der Nicht-Einheitlichkeit von Feldern im System mit parallelen Plattenelektroden, das in 7A gezeigt ist, sich von den abgerundeten Wänden des Wells ableitet. In einem Standard-Well mit einem runden Querschnitt, breitet sich die Stromdichte aus und zieht sich dann zusammen, wenn sie von einer Elektrode auf die andere übergeht, und dieses Ausbreiten führt zu einer Nicht-Einheitlichkeit. Dies kann korrigiert werden, indem man Multiwell-Platten mit quadratischen Wells verwendet.
  • Beispiel 4: Analyse der Wirkung des Hinzufügens von Isolierelementen, um abgerundete Bereiche der Wells auszublenden
  • 8B zeigt eine Simulation des Feldprofils mit zwei 4 mm breiten parallelen Plattenelektroden mit einem Abstand von 4 mm in einem runden Well mit einen Durchmesser von 6,2 mm unter Verwendung der Standardbedingungen und -analyseverfahren wie in Beispiel 1 beschrieben. Isolierelemente werden an den Elektroden angebracht, um die abgerundeten Bereiche des Wells zwischen den Elektroden, wie in 9A gezeigt, auszublenden. In 8B entspricht der äußere Kreis (802) dem Rand des Wells. Die beiden vertikalen Linien (812) entsprechen den Elektroden. Der gestrichelte Kreis in der Mitte (822) entspricht dem Beobachtungsbereich. Die durch gekreuzte Schraffur markierten Bereiche (862) entsprechen den an den Elektroden angebrachten Isolierelementen. Der graue Bereich (842) entspricht dem Bereich, in dem das elektrische Feld innerhalb von ±1 % des gemittelten Feldes im Beobachtungsbereich bleibt. Im weißen Bereich (832) beträgt das Feld weniger als 1 % des gemittelten Feldes. Bei dieser Simulation liegt das Feld zu keinem Zeitpunkt bei mehr als 1 % über dem gemittelten Feld. Innerhalb des Beobachtungsbereichs liegt die Standardabweichung der Feldstärke bei 0,2 % des gemittelten Feldes und die Differenz zwischen dem maximalen und minimalen Feld liegt bei 1,0 % des gemittelten Feldes. Somit verbessert diese Geometrie die Feldeinheitlichkeit in großem Maß im Vergleich zu dem Fall, in dem kein Isolierelement verwendet wird, aber nicht in so großem Maß wie bei der Verwendung quadratischer Wells.
  • Die Ergebnisse zeigen, dass die Feldeinheitlichkeit in runden Standard-Well-Platten deutlich erhöht werden kann, indem der Bereich außerhalb des durch die Elektroden definierten Bereichs mit einem isolierenden Material gefüllt wird. In der Praxis können reaktionsträge Kunststoffe, wie zum Beispiel Nylon, Tetrafluorethylen, Polycarbonat oder jedes andere nicht poröse Polymer oder Glas als isolierendes Material verwendet werden, mit der Maßgabe, dass diese in wässrigen Lösungen relativ stabil sind, dass sie leicht herzustellen sind und vorzugsweise nicht fluoreszieren. Das Isolierelement wird typischerweise an der Elektrode angebracht und verdunkelt keinen der durch die Elektroden definierten Bereiche.
  • Beispiel 5: Analyse der Wirkung von Satellitenelektroden auf die Einheitlichkeit elektrischer Felder
  • Um zu testen, ob es möglich ist, den Stromverlust in den gekrümmten Rand des Wells über die Verwendung von Satellitenelektroden zu kompensieren, wurden Simulationen mit einer Vielzahl von Elektrodengeometrien durchgeführt. 9B zeigt eine mögliche Ausführungsform dieses Konzepts und 8C zeigt das Profil des elektrischen Feldes, wenn diese Geometrie unter Verwendung von QuickfieldTM, wie in Beispiel 1 beschrieben, analysiert wird. Bei diesem Beispiel wurden zwei zusätzliche Paare von 0,7 mm breiten parallelen Plattenelektroden mit einem Abstand von 2 mm platziert. Diese Elektroden befinden sich außerhalb des Beobachtungsbereichs und werden auf dem halben Potential ihrer Hauptelektroden gehalten.
  • In 8C entspricht der äußere durchgezogene Kreis (804) dem Rand des Wells. Die beiden langen durchgezogenen vertikalen Linien (814) entsprechen den Hauptelektroden und die vier kürzeren durchgezogenen vertikalen Linien (816) entsprechen den Satellitenelektroden. Der gestrichelte Kreis in der Mitte (824) entspricht dem Beobachtungsbereich. Der graue Bereich (844) entspricht dem Bereich, in dem das elektrische Feld innerhalb von ±1 % des gemittelten Feldes im Beobachtungsbereich bleibt. Im weißen Bereich (834) beträgt das Feld weniger als 1 % des gemittelten Feldes und im schwarzen Bereich (854) liegt das Feld mehr als 1 % über dem gemittelten Feld. Innerhalb des Beobachtungsbereichs liegt die Standardabweichung der Feldstärke bei 0,2 % des gemittelten Feldes und die Differenz zwischen dem maximalen und minimalen Feld liegt bei 1,2 % des gemittelten Feldes. Somit verbessert diese Geometrie die Feldeinheitlichkeit in großem Maß im Vergleich zu dem Fall, bei dem kein Isolierelement verwendet wird, aber nicht in so großem Maß wie bei der Verwendung quadratischer Wells.
  • Dieses Beispiel zeigte die Verwendung von vier Satellitenelektroden in einer spezifischen Konfiguration. Durch das Hinzufügen von mehr Satellitenelektroden außerhalb des Beobachtungsbereichs und durch geeignete Zuordnung ihrer Potentiale in Abhängigkeit der Potentiale, die an den Hauptelektroden angelegt werden, kann die Einheitlichkeit der elektrischen Felder im Prinzip bis zu jeder gewünschten Präzision verbessert werden.
  • In einer Konfiguration mit runden Wells kann die Einheitlichkeit der elektrischen Felder im Mittelpunkt des Beobachtungsbereichs zum Beispiel verbessert werden, indem die parallelen Plattenelektroden in mehrere Teile unterteilt werden, die durch dünne isolierende Trennelemente voneinander getrennt werden, wie in 9D dargestellt. Das Potential, das an jeder Elektrode angelegt wird (ausgedrückt als ein Teil des Potentials, das auf das zentralste Teil angelegt wird) kann individuell angepasst werden, um die Einheitlichkeit des Feldes im Beobachtungsbereich zu maximieren.
  • Dieses Konzept kann auf die Verwendung nicht paralleler Tauchelektroden, die mehrere vertikale leitende Streifen aufweisen, von denen jeder unabhängig gesteuert wird, erweitert werden.
  • Beispiel 6: Analyse der Wirkung des Meniskus auf die Einheitlichkeit elektrischer Felder
  • Der Meniskus, der von Tauchelektroden erzeugt wird, wenn diese in ein Well getaucht werden, führt zu Abweichungen bezüglich der Tiefe der Salzlösung von etwa 10 % im Beobachtungsbereich. Dies wiederum erzeugt Abweichungen im elektrischen Feld von etwa 10 % im Beobachtungsbereich. Diese Abweichungen bestehen selbst dann, wenn bei dem Elektrodendesign davon ausgegangen wird, dass es eine perfekte Einheitlichkeit des elektrischen Feldes erzeugt. Somit wird die Eliminierung des Meniskus-Effektes die tatsächliche Einheitlichkeit des elektrischen Feldes verbessern. Ein mögliches Verfahren, um dies zu erreichen, ist das Hinzufügen einer isolierenden Barriere zwischen den Elektroden. 9C zeigt eine solche Ausführungsform, in der die isolierende Barriere verwendet wird, um eine flache obere Oberfläche der Flüssigkeit im Well zu erzeu gen. Die Unterseite dieser Barriere ist so gestaltet, dass sie, wenn die Elektroden in das Well eingebracht sind, ungefähr 2,5 cm über dem Boden des Wells liegt. Somit ist die Barriere teilweise in Salzlösung eingetaucht und ihre untere Oberfläche gibt vor, dass die Oberseite der leitenden Kammer flach ist und senkrecht zur Elektrodenoberfläche steht. Somit würde das elektrische Feld nicht durch Unregelmäßigkeiten der Oberflächen des leitenden Volumens beeinträchtigt.
  • Beispiel 7: Herstellung eines Tauchelektroden-Elektrostimulators
  • In einer Ausführungsform des Elektrostimulators besteht das Element aus einem sich selbst platzierenden Rahmen, der die Tauchelektroden in der Anordnung von Wells in einem 96-Well-Multiwell-Plattenformat positioniert (1). 1 stellt die eingetauchte Position des Elektroden-Arrays dar. Bei diesem Beispiel kann das Elektrostimulationselement aus drei funktionellen Teilen zusammengebaut werden. Das erste Teil ist der Positionierrahmen (40), der das Element relativ zu den Plattenwells anordnet. Dieser Rahmen besteht aus Metall und passt genau in die Multiwell-Platte. Dieser Rahmen dient als die Positionierungsbasis für das zweite funktionelle Teil des Systems, den Einzugsmechanismus.
  • Das Einzugssystem besteht aus Ansatzbolzen (70) und Rückholfedern (nicht sichtbar). Die Federn sind um die Ansatzbolzen gewunden und drücken gegen den Positionierrahmen (40) und den Boden der Isolierabdeckung (90). Die Rückholfedern halten die Elektrodenanordnung in der eingezogenen Position, bis die Elektroden in die Plattenwells abgesenkt werden. Der Einzugsmechanismus positioniert das dritte funktionelle Teil des Systems, die Elektrodenanordnung.
  • Das dritte funktionelle Teil des Systems ist die Elektrodenanordnung. Die Elektrodenanordnung besteht aus acht Paaren von identischen Elektrodenkämmen (10). Die Elektrodenkämme bestehen aus rostfreiem Stahl und sind präzise mittel Laser geschnitten, um Verzug zu verhindern. Jeder Kamm hat acht Ansätze mit ausreichender Breite, um fast den Durchmesser der Multiwell-Platten-Wells zu umfassen. Die Rückseite des Kamms bildet die elektrische Verbindung zu den Ansätzen (50). Zwei dieser Kämme bilden die Elektrodenpaare, die in eine Säule mit acht Wells eingebracht werden. Die Kämme werden durch eine isolierende präzisionsgebohrte Platte (30), die die Elektroden relativ zum Positionierrahmen positioniert, zueinander in Position gehalten. Isolierende Abstandshalter (20) erhalten die Trennung der Elektroden aufrecht und ordnen die Kämme mit Hilfe einer verstifteten Schnittstelle auf der gebohrten Platte positionsgerecht an. Ein zweiter Satz Abstandshalter (25) garantiert die präzise Positionierung der Elektroden (10) relativ zur Platte (30). Ausrichtungsachsen (15) werden zur zusätzlichen Stabilität durch Ausrichtungsbohrungen in den Abstandshaltern (20) und den Elektrodenkämmen (10) eingeführt. Die Kämme und Abstandshalter werden gegen die gebohrte Platte durch eine Isolierabdeckung (90) an ihrem Platz gehalten.
  • Das Element kann manuell verwendet werden, indem es auf der Multiwell-Platte platziert wird und auf die Elektrodenanordnung nach unten gedrückt wird, um die Elektroden in die Wells zu tauchen. Wenn die Elektroden voll ausgefahren sind, wird ein Paar von Riegeln (60) eingeführt, um die Elektroden ausgefahren in den Wells zu halten. Alternativ kann die Elektrodenanordnung automatisch über standardmäßige mechanische oder Robotersteuersysteme in die Wells eingetaucht werden und wieder zurückgeholt werden.
  • 3 zeigt ein Blockdiagramm der wichtigsten elektrischen und optischen Komponenten. Die elektrischen Stimuli wurden über einen Hochleistungsverstärker (320) generiert, der durch ein Paar digitale Funktionsgeneratoren (380 und 310) angesteuert wird. In einer Ausführungsform war der Schalter (330) ein ER-16 von National Instruments (Austin, TX), gesteuert durch eine digitale Ein-/Ausgabekarte PC-DIO 24 auf dem VIPRTM-Leser-Steuerungscomputer (300). Der Schalter (330) erlaubte die Elektrostimulation definierter Wells in einer 96-Well-Platte innerhalb jedes vorgegebenen Zeitprotokolls. In diesem Fall wurde eine einzige Säule von acht Wells gleichzeitig stimuliert. Der Verstärker (320) wurde unter Verwendung des APEX PA93-Chips (Apex Microtechnology Corp, Tucson, AZ) nach einer vom Hersteller zur Verfügung gestellten Schaltung gebaut. Der Verstärker hatte die folgenden Spezifikationen: ±100 V Gleichstrom am Eingang, 100 GΩ Eingangsimpedanz, 20-fache Spannungsverstärkung, ±90 V am Ausgang, ±3 A am Ausgang, 10 Ω Ausgangsimpedanz. Die Funktionsgeneratoren waren von Tektronix (Beaverton, OR), Modell AFG 310. Der erste Funktionsgenerator (380) wurde durch die VIPRTM-Lesersoftware aktiviert, wenn erforderlich war, dass die Stimulationspulsfolge beginnt und produzierte eine Folge von TTL-Pulsen, um den zweiten Funktionsgenerator (310) zu aktivieren. Der zweite Funktionsgenerator wurde mit dem Stimulations-Wellenform-Kern programmiert.
  • Beispiel 8: Spannungsabhängigkeit der Elektrostimulation
  • Wildtyp-Zellen aus den Ovarien chinesischer Hamster (CHO-Zellen), exprimieren einen spannungsabhängigen Natriumkanal endogen und können bequem verwendet werden, um Elektrostimulationsparameter zu validieren und zu optimieren. Neben diesem Natriumkanal scheinen diese Zellen Gap-Junction-Verbindungen zwischen benachbarten Zellen und einen sehr kleinen (~20 pA) spannungsabhängigen Auswärtsstrom aufzuweisen.
  • Der spannungsabhängige Natriumkanal in diesen Zellen (nachfolgend als NaV1 bezeichnet) hat elektrophysiologische Eigenschaften, die denen von Natriumkanälen eines Rattengehirns Typ IIa ähnlich sind. Die Analyse der Strom-/Spannungseigenschaften dieses Kanals über Standardelektrophysiologie zeigt, dass typische Wildtyp-CHO-Zellen einen durchschnittlichen Spitzenstrom von 100 pA pro Zelle bei -20 mV aufweisen. Dies entspricht einem Membranwiderstand (R Na) von etwa 800 MΩ. Geht man von einer Einzelkanal-Leitfähigkeit von 10 pS aus, legt dies nahe, dass es nur ~125 Natriumkanäle pro Zelle gibt. In unseren Versuchen zeigen CHO-Zellen typischerweise ein Transmembranruhepotential (Rm) von etwa -35 mV, einen Ruhemembranwiderstand von > 10 GΩ und eine Zellmembrankapazität (Cm) von 15 pF.
  • Um die Spannungsabhängigkeit der Elektrostimulation zu testen, wurden Wildtyp-CHO-Zellen in 96-Well-Mikrotiter-Platten eingebracht und in Wachstumsmedium für 24-48 Stunden inkubiert. Sie wurden dann mit Badlösung 1 gespült und jeweils 30 Minuten lang mit 10 μM CC2-DMPE (Cumarin) und dann mit 3 μM DiSBAC2(3) (Ethyloxonol wie in Anhang A1 beschrieben) eingefärbt. Eine Stimulationsanordnung mit 96 Paar Elektroden aus rostfreiem Stahl (4 mm breit, 4 mm Abstand) wurde oben auf der Assay-Platte platziert, wie in Beispiel 7 beschrieben. Die Elektroden wurden in die Salzlösung, die die Zellen bedeckt, getaucht und blieben 0,5 mm vom Boden des Wells entfernt. Während der Elektrostimulation wurden mit Hilfe eines VIPRTM-Lesers, wie oben beschrieben, ratiometrische Fluoreszenzmessungen durchgeführt und die Daten wurden gemäß den Vorgehensweisen in Anhang A2 analysiert. Es wurde jeweils nur eine Säule von acht Wells auf einmal getestet; die verbleibenden Wells erhielten kein Erregungslicht und keine Elektrostimulation. Nachdem jede Platte getestet wurde, wurden die Elektroden gründlich mit destilliertem Wasser gespült und mit Druckluft getrocknet, um eine gegenseitige Verschmutzung zwischen den Platten zu verhindern.
  • Um die Änderungen des Transmembranpotentials, die in den Zellen als Ergebnis der Elektrostimulation auftreten, zu bestimmen, wurden Multiwell-Platten, die die Zellen enthielten, in einem VIPRTM-Leser analysiert. Die Zellen, die einem Beobachtungsbereich mit einem Durchmesser von 3 mm mittig zwischen den Elektroden positioniert waren, wurden mit Licht bei 400 ± 7,5 nm erregt. Das Licht wurde von einer 300 W Xenon Bogelampe erzeugt und durch ein Paar dielektrischer Störungs-Bandpassfilter geleitet, um die korrekte Wellenlänge für die Erregung zu wählen. Licht wurde über ein dreisträngiges faseroptisches Kabel zu den Zellen hin und von diesen weg geleitet, wobei ein Kabel für das Erregungslicht diente und zwei für die Fluoreszenzemission. Gleichzeitige Messungen von blauen (460 ± 20 nm) und orangen (580 ± 30 nm) Signalen wurden von jedem Well mit 50 Hz aufgenommen, digitalisiert und auf einem Computer gespeichert. Die ersten Assays dauerten 15 Sekunden und bestanden aus einer 6-sekündigen Stimulation mit wiederholten (90 Hz Wiederholungsrate) biphasischen (5 ms pro Phase) Stimulationen mit Rechteckwellen, die bei 2 Sekunden mit den gezeigten elektrischen Amplituden begannen. Zwei Sekunden vor und sieben Sekunden nach dem Stimulationsimpulsstoß floss kein Strom durch die Elektroden. 10 zeigt die ratiometrischen Reaktionen bei verschiedenen Feldstärken von bis zu 32 V/cm. In diesem Fall wird die offensichtliche Anstiegszeit der aufgezeichneten Reaktion durch die Reaktionszeit des DiSBAC2(3) beschränkt, das eine Reaktionszeitkonstante von etwa 1 Sekunde aufweist. Unter Pulsamplituden von 10 V/cm ist keine Reaktion nachweisbar. Über 20 V/cm ist die Reaktion stabil und nimmt nur leicht zu, während die Spannung weiter bis auf 32 V/cm erhöht wird. Wie in 11 gezeigt ist, zeigt die Spitzenreaktion bei einer höheren Spannung (gemessen nach etwa 5 Sekunden) nur weitere kleine Zunahmen der Reaktion. Die Daten in 11 können an eine Boltzman-Funktion angepasst werden, die einen Mittelpunkt bei 18,0 V/cm mit einer Breite von 2,0 V/cm hat. Die Steilheit des Erstverlaufs und die Flachheit der Reaktion bei starken Feldern sprechen deutlich für ein Schwellenphänomen. Das elektrische Feld, bei dem die Reaktion die Hälfte des Maximums ist (18 V/cm), entspricht ungefähr ± 30 mV Abweichungen des Transmembranpotentials an den äußersten Rändern der Zellen unter Verwendung bereits veröffentlichter Formeln (Gleichung 1, siehe auch Tsong, 1991, Biophys. J. 60:297-306; und mit einem angenommenen durchschnittlichen Durchmesser der Zellen von 30 μm). Es stimmt deshalb mit dem bereits für spannungsabhängige Natriumkanäle, die sich normalerweise im inaktivierten Zustand befinden, beschriebenen Stimulationsmechanismus quantitativ überein.
  • Elektrische Felder mit hoher Intensität können zur Elektroporation der Zellmembranen führen, was zu großen relativ unspezifischen Änderungen des Transmembranpotentials führen kann (Tsong, 1991, Biophys. J. 60:297-306). Um zu ermitteln, ob dies auch ein wichtiger Faktor bei den Reaktionen von Zellen auf niedrigere Intensitäten der hier verwendeten elektrischen Felder ist oder nicht, wurden Experimente mit dem natriumkanalspezifischen Toxin Tetrodotoxin (TTX) durchgeführt. Wenn die Wirkungen der Elektrostimulation durch das Toxin blockiert werden können, würde dies nahe legen, dass die Wirkung der Elektrostimulation primär durch die Aktivierung von Natriumkanälen vermittelt wird. Die Ergebnisse dieses Experiments sind in 12 gezeigt. Die Daten wurden mit einer Stärke des elektrischen Feldes von 33 V/cm erhalten und zeigen, dass TTX in der Lage war, die Wirkung der Elektrostimulation vollständig zu blockieren, wobei die typischen pharmakologischen Eigenschaften mit der Blockierung von Natriumkanälen übereinstimmen. Der EC50 der Anpassung an diese Daten liegt bei 9 nM, ähnlich dem berichteten Wert für TTX bei Rattengehirn Typ IIa (8 nM, West et al., 1992, Neuron 8:59-70). Die Tatsache, dass dieses Signal durch TTX mit normaler Pharmakologie blockiert wird, ist ein starker Hinweis darauf, dass das über Elektrostimulation generierte Signal fast vollständig auf NaV1 beruht.
  • Beispiel 9: Variation der Zellreaktion auf Veränderungen der Stimulationspulsbreite und -frequenz
  • Um das Verhalten der Zellreaktion bei sich verändernder Stimulationspulsbreite und -frequenz zu untersuchen, wurden Experimente unter Verwendung von Wildtyp-CHO-Zellen, wie in Beispiel 8 beschrieben, mit einer konstanten Feldstärke von 25 V/cm durchgeführt, wobei die Pulsdauer und -frequenz verändert wurden.
  • Die Ergebnisse sind in 13 dargestellt. Jeder Datenpunkt stellt den Durchschnitt aus acht Wells, die gleichzeitig stimuliert wurden, aus Experimenten, die von fünf verschiedenen Platten mit Wildtyp-CHO-Zellen abgeleitet wurden, dar. Die Ergebnisse zeigen im Allgemeinen, dass mit zunehmender Stimulationsfrequenz die Größe der Reaktion zunimmt. Man könnte davon ausgehen, dass diese Wirkung sich letztendlich sättigen würde, wenn das Transmembranpotential in Richtung des Natriumumkehrpotentials (VNa) bewegt wird. In diesem Fall geschieht dies nicht, da die Natriumkanaldichte zu gering ist.
  • Die Erhöhung der Pulsdauer führt zu höheren relativen Elektrostimulationswerten bei niedrigeren Stimulationsfrequenzen von bis zu 10 ms, über denen weitere Anstiege weniger ausgeprägt sind. Sehr kleine Pulsdauern (unter 1 ms) begrenzen ebenfalls die Reaktion, offensichtlich, weil die Inaktivierung der Kanäle nicht effektiv aufgehoben wird. Um große Zellereaktionen effizient zu induzieren, sind die besten Stimulationsparameter typischerweise im dem Rahmen, in dem die Pulsdauer größer oder gleich der Zeitkonstante für die Erholung von der Inaktivierung ist und ausreichend kurz, so dass die Stimulationsfrequenz höher ist als die Membranzeitkonstante. Darüber hinaus ist die optimale Stimulationsfrequenz typischerweise geringer als der reziproke Wert der durchschnittlichen Kanalöffnungszeit.
  • Diese Experimente zeigen, dass die Elektrostimulation sogar bei Zellen erfolgreich verwendet werden kann, die sogar relativ geringe Mengen von spannungsabhängigen Kanälen exprimieren und unter Bedingungen, die nicht zu bedeutender Elektroporation oder Zelltod führen, erfolgreich abgeschlossen werden kann. Diese Experimente zeigen auch Verfahren, durch die die Stimulationspulsdauer und Wiederholungsfrequenz optimiert werden können, um Reaktionen einer gewünschten Größe zu erhalten.
  • Beispiel 10: Analyse von CHO-Zellen, die einen exogenen Natriumkanal exprimieren
  • Wie in Abschnitt VI beschrieben, wurden Ovarialzellen chinesischer Hamster mit einem Plasmid, das einen spannungsabhängigen Natriumkanal (hier nachfolgend als NaV2 bezeichnet) kodiert, stabil transfiziert. Die Whole-Cell-Patch-Clamp-Analyse wurde verwendet, um die elektrophysiologischen und pharmakologischen Eigenschaften dieses Kanals vor der Analyse über Elektrostimulation zu bestimmen. Der vorübergehende Natriumspitzenstrom wurde bei -20 mV mit 600 ± 300 pA (N = 5) gemessen, mit einer durchschnittlichen Zellmembrankapazität von 15 ± 5 pF. Der Zellmembranruhewiderstand war zu groß, um ihn genau zu messen (RL > 10 GΩ). Das Transmembranruhepotential betrug -31 ± 3 mV.
  • Um das elektrische Schwellenfeld für die Stimulation zu bestimmen, wurden Zellen, die den Natriumkanal stabil exprimieren, in 96-Well-Platten plattiert und entsprechend dem Protokoll in Anhang A1 eingefärbt. Das Elektrostimulationsprotokoll beinhaltet einen Impulsstoß mit 20 Hz über 3 Sekunden einer biphasischen (5 ms pro Phase) Stimulation mit variabler Feldstärke unter Verwendung des in Beispiel 7 beschriebenen Elektrostimulators.
  • 14 zeigt repräsentative Zeitspuren bei verschiedenen Feldstärken (jede Kurve entspricht dem Durchschnitt von acht Wells). Bei niedrigen Feldstärken gibt es keine nachweisbare Zellreaktion, was nahe legt, dass die durchschnittlichen Änderungen des Transmembranpotentials unter etwa 1 mV betragen. Zwischen 35 und 90 V/cm ist die Reaktion stereotyp, mit einer festen Form und Amplitude. Über 90 V/cm bleibt die Spitzenreaktion relativ konstant, aber die Reaktionsabfallzeit nachdem die Stimulation beendet wird, verlängert sich deutlich.
  • Gemäß den in Beispiel 8 gezeigten Experimenten, konnte die Reaktion, die durch elektrische Feldstärken von bis zu 85 V/cm induziert wurde, durch TTX gehemmt werden, wobei die Reaktion von Zellen, die über 90 V/cm stimuliert wurden, nicht gehemmt werden konnte (Daten nicht dargestellt). Deshalb schließen wir daraus, dass die schnelle Reaktion auf dem oben dargestellten Natriumkanal-Öffnungsmechanismus beruht, während die langsam Reaktion vor allem durch die Elektropermeabilisierung der Membran durch das elektrische Feld verursacht wird.
  • Diese Wirkung ist leichter zu erkennen, wenn man das Verhalten der schnellen Reaktion (4 Sekunden nach der Stimulation) und der lang samen Reaktion (zehn Sekunden nach der Stimulation) bei zunehmender Feldstärke vergleicht. Diese Daten sind in 15 gezeigt. Passt man die schnelle Reaktion an eine Boltzman-Funktion an, war der Mittelpunkt der frühen Reaktion bei E50 = 26 V/cm, mit einer Breite von ΔE = 3,5 V/cm. Die Reaktion war unabhängig von der Feldstärke zwischen 40 und 80 V/cm, mit einer leichten Zunahme, wenn die Elektropermeabilisierung über 90 V/cm einsetzt.
  • Die langsamere Reaktion aufgrund der Permeabilisierung war erstmals bei 90 V/cm nachweisbar und ist an sich bei einigen Anwendungen von potentiellem Nutzen. Die Permeabilisierung kann zum Beispiel verwendet werden, um das Transmembranpotential wieder auf Null zu setzen, oder, wenn die Permeabilisierung für ein spezifisches Ion selektiv ist, um das Transmembranpotential auf den Gleichgewichtswert für dieses Ion festzusetzen. Dies könnte zum Beispiel in Assays für einen Kanal, der das Transmembranpotential festsetzt, von Nutzen sein. Beispiele beinhalten Kalium- und Chlorid-Leckkanäle, Kalium-Einwärts-Gleichrichter und durch niedrige Spannung aktivierte spannungsabhängige Kaliumkanäle.
  • Diese Ergebnisse stimmen mit veröffentlichten Studien überein, bei denen die Elektropermeabilisierung bei einem Schwellen-Transmembranpotential von etwa ± 200 mV unabhängig von der Zellart beginnt (Teissie and Rols, 1993, Biophys. J. 65:409-413). Basierend auf in diesem Artikel erwähnten und in der Literatur breit akzeptierten Schemata, erfahren CHO-Zellen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 30 μm Änderungen des Transmembranpotentials von ± 200 mV, wenn sie einem extrazellulären elektrischen Feld von 90 V/cm ausgesetzt werden.
  • Beispiel 11: Bestimmung der effektiven Dauer der Aufhebung der Inaktivierung und der effektiven Natriumleitfähigkeit der offenen Kanäle
  • Um quantitative Schätzungen der Dauer der effektiven Aufhebung der Aktivierung und der Leitfähigkeit der offenen Kanäle machen zu können, ohne jedoch an irgendeinen spezifischen Aktionsmechanismus gebunden zu sein, wurde die folgende Theorie zur Verifizierung der Experimente entwickelt.
  • Nach dem Öffnen werden die Natriumkanäle mit einer spannungsabhängigen Zeitkonstante im Bereich von 1 Millisekunde inaktiviert. Da der Strom, der durch die offenen Natriumkanäle geleitet wird, stark span nungs- und zeitabhängig ist, ist es nicht möglich, einfach einen analytischen Ausdruck für die Spannungsänderung nach einer einzigen Stimulation zu finden. Indem wir jedoch einige vereinfachende Schätzungen verwenden, können wir durchschnittliche idealisierte Reaktionen modellhaft bilden, um eine testbare Theorie aufzustellen. Für die Zwecke hier nehmen wir an, dass die Natriumkanäle sich beim Öffnen als eine lineare Leitfähigkeit über Vt = -40mV mit einem Umkehrpotential bei ENa = +60mV verhalten. Die Leitfähigkeit gNa wird bestimmt als der maximale Strom, der bei -20 mV in einem Whole-Cell-Patch-Clamp-Experiment erhalten wird. Die Zeitabhängigkeit der Natriumkanalleitfähigkeit wird vereinfacht, indem man annimmt, dass, wenn der Kanal aktiviert wird, er eine feststehende Leitfähigkeit gNa = 1/RNa für eine feststehende Zeit τNa = 1,0 ms hat, nach der der Kanal inaktiviert wird.
  • Unter Verwendung eines biphasischen Wellenstimulationskerns mit einer Rechteckwelle (jede Phase hat eine Zeit t1 und wird mit einer Frequenz von f = 1/T wiederholt) beträgt der gesamte Strom, der während T in die Zelle fließt:
    Figure 01240001
  • Hier ist τNa die Zeit, über die die Natriumkanäle geöffnet sind. RNa = 1/gNa ist der Membranwiderstand, wenn die Natriumkanäle geöffnet sind. RL ist der normale (Leck-) Membranwiderstand. VL ist das Leck-Umkehrpotential (d.h. das Membranruhepotential). VNa ist das Natriumumkehrpotential. τr ist die Zeitkonstante für die Erholung von der Inaktivierung; diese ist tatsächlich eine Funktion der Hyperpolarisierungs-Spannung, die während des Pulses erreicht wird, hier gehen wir jedoch davon aus, dass es sich um eine Konstante handelt.
  • In Wirklichkeit erfahren Natriumkanäle aus verschiedenen Teilen der Zelle verschiedene Änderungen des Membranpotentials und die Para meter τNa, τr und RNa hängen stark vom Membranpotential ab. Das ganze Modell würde die Zellmorphologie, eine randomisierte Verteilung der Zellausrichtungen und die Potential- und Zeitabhängigkeit dieser Parameter berücksichtigen. Es wäre dann möglich, diese Abhängigkeiten zu verbinden, um effektive Werte für diese Parameter zu schaffen. Diese Vorgehensweisen sind für die Diskussion hier zu komplex. Wir erkennen stattdessen, dass die Werte, die aus Anpassungen an diese Gleichungen entnommen wurden, komplizierte Durchschnitte der zugrunde liegenden Kanaleigenschaften darstellen.
  • Die Lösung von Gleichung (2) für die Änderung des Transmembranpotentials während der Stimulation (V-VL) ergibt:
    Figure 01250001
  • Wenn die Stimulation lange genug durchgeführt wird, so dass ein neues Transmembranpotentials erreicht wird, ist die Steady-State-Gleichung:
    Figure 01250002
  • Um die effektive Dauer der Aufhebung der Inaktivierung und die Leitfähigkeit der offenen Kanäle zu bestimmen, wurden Experimente, wie in Beispiel 8 beschrieben, unter Verwendung eines biphasischen Wellenkerns mit einer Rechteckwelle mit einer konstanten Amplitude von 43 V/cm mit variierenden Frequenzen und Pulsdauern von 20 ms, 10 ms, 5 ms, 2 ms und 0,3 ms durchgeführt. Die in 16 dargestellten Ergebnisse zeigen die Reaktion als eine Funktion der Stimulationsfrequenz für mehrere Pulsdauern. Wie vorhergesagt, sättigt sich die Reaktion bei hohen Frequenzen wenn sich das Transmembranpotential offensichtlich dem Natriumumkehrpotential nähert. Um die effektive Dauer der Aufhebung der Inaktivierung und die Kanalöffnungszeit zu bestimmen, wurde die Reaktion R an die unten dargestellte modifizierte Hill-Funktion angepasst.
  • Figure 01260001
  • Gleichung (5) kann von Gleichung (4) abgeleitet werden, indem man erkennt, dass die ratiometrische Reaktion für keine Änderung des Transmembranpotentials R = 1 ist, und in der Änderung des Transmembranpotentials linear ist mit einer unkalibrierten Proportionalitätskonstante A.
  • In Gleichung (5) sind A und f0 veränderbare Parameter. Die Anpassung erfolgte unter Verwendung einer nicht linearen Least-Square-Analyse unter Verwendung der Software Origin 6.0 (Microcal, Northampton, MA).
  • Die Parameter T0 = 1/f0 aus oben dargestellter Gleichung (5) wurden aus diesen Anpassungen entnommen und über der Pulsdauer aufgetragen; sie sind in 17 gezeigt. Die Linie in dieser Figur ist eine Anpassung an einen exponentialen Abfall und aus dieser Anpassung extrahieren wir die Zeitkonstante für die Aufhebung der Inaktivierung (τr) τr = 5,7 ms und RLτNa/RNa = 0,314.
  • Wenn man davon ausgeht, dass τNa = 1 ms und RL = 45 GΩ ist, dann ist RNa = 140 MΩ. Dies wiederum bedeutet, dass die Spitzennatriumleitfähigkeit 100 mV/140 MΩ= 700 pA wäre. Dies stimmt hervorragend mit dem durch Whole-Cell-Patch-Clamp gemessenen Wert überein.
  • Beispiel 12: Analyse eines exogenen Natriumkanals in einer Zelllinie mit anderen endogenen Ionenkanälen
  • Wildtyp-HEK-293-Zellen exprimieren typischerweise eine Vielzahl endogener Kalium- und Chloridströme (Zhu et al., 1998, J. Neurosci. Meth. 81:73-83), so dass der Membranruhewiderstand bei diesen Zellen 5-10 GΩ beträgt. Als eine Folge daraus ist die Membranzeitkonstante für diese Zellen entsprechend kleiner; somit würde man für die optimale Stimulation dieser Zellen vorhersagen, dass das Elektrostimulationsprotokoll mit relativ höheren Frequenzen verglichen mit Zellen ohne endogene Ka liumkanäle wiederholt werden sollte, um vergleichbare Signale zu generieren.
  • Um zu testen, dass ein spannungsregulierter Natriumkanal unter Verwendung der vorliegenden Erfindung effizient elektrisch stimuliert werden kann, wurden HEK-293-Zellen in diesem zellulären Hintergrund stabil mit einem spannungsabhängigen Natriumkanal transfiziert, der nachfolgend als NaV3 bezeichnet wird. Die Zellen wurden wie in Abschnitt VI beschrieben transfiziert und ausgewählt und mit FRET-Farbstoffen wie in Beispiel 8 beschrieben gekennzeichnet. Die Zellen wurden plattiert und mit 15 μM CC2-DMPE und 2 μM DisBAC6(3) beschickt und dann einer biphasischen Stimulationsfolge mit 25 V/cm ausgesetzt, die mit einer Frequenz von 90 Hz und einer Pulsdauer von 5 ms pro Phase wiederholt wurde. Die Stimulationspulsfolge erfolgte über eine Gesamtdauer von 3 Sekunden und die Digitalisierungsrate für die Datenerhebung betrug 50 Hz.
  • Die Reaktion als eine Funktion der Zeit (18) zeigt eine schnelle (< 20 ms Anstiegszeit) Anfangsphase, die mit einer Zeitkonstante von etwa 40 ms auf ein stabiles Plateau abfällt. Es tritt auch eine kleine Abschwung-Änderung des Potentials zwischen der Spitze und dem Plateau auf. Wir interpretieren dieses Verhalten als Konsequenz aus der Aktivierung endogener spannungsabhängiger Kaliumkanäle (KV), die nach dem ersten Stimulationspuls auftritt. Von der Aktivierung dieser endogenen Kaliumkanäle würde erwartet, dass sie gemäß den Daten der Experimente zu einer Verringerung des Transmembranpotentials führt, wenn das Kalium die Zelle verlässt. Während die Elektrostimulation fortgeführt wird, erreicht das Transmembranpotential ein neues Gleichgewicht, das durch das Gleichgewicht aus Natriumeinstrom in die Zelle und Kaliumausstrom aus der Zelle entsteht. Am Ende der Stimulation beträgt die Abfall-Zeitkonstante etwa 143 ms; dies entspricht einem Leck-Widerstand von etwa 9 GΩ.
  • Um zu bestimmen, ob diese insgesamt kleinere Reaktion zuverlässig zum Aufspüren von Medikamenten verwendet werden kann, wurde durchgeführt, um zu bestimmen, ob die Wirkungen von TTX oder Tetracain genau charakterisiert werden können. Die in 19 gezeigten Ergebnisse zeigen, dass die pharmakologischen Inhibitionsprofile dieser Medikamente bei Verwendung der vorliegenden Erfindung mit dem bekannten Verhalten der NAV3-Natriumkanäle mit diesen Wirkstoffen übereinstimmen. Die Dosis-Wirkungs-Kurve für TTX könnte an eine Hill-Funktion mit einem EC50 = 25 nM und Hill-Koeffizienten von 1,1 angepasst werden. Die Dosis-Wirkungs-Kurve für Tetracain könnten an eine Kurve mit einem EC50 = 11 μM und Hill-Koeffizienten von 0,97 angepasst werden. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Reaktion durch die Aktivität der Natriumkanäle verursacht wird und dass pharmakologische Informationen über bekannte und unbekannte Verbindungen unter Verwendung dieses Verfahrens erfasst werden können.
  • Beispiel 13: Analyse von HEK-293-Zellen, die den NaV4-Natriumkanal exprimieren
  • Um zu bestimmen, ob das vorliegende Verfahren allgemein auf eine breite Bandbreite von verschiedenen Natriumkanälen angewendet werden kann, werden HEK-293-Zellen stabil mit einem anderen spannungsabhängigen Natriumkanal transfiziert, der nachfolgend als NaV4 bezeichnet wird. Diese Zellen werden transfiziert, ausgewählt und, wie in Abschnitt VI und Beispiel 8 beschrieben, mit FRET-Farbstoffen beschickt. Die Ergebnisse einer Dosis-Wirkungs-Kurve für Tetracain bei diesem Kanal sind in 20 gezeigt. Hier entsprechen die Datenpunkte Durchschnitten und Standardabweichungen von acht Wells und die durchgezogene schwarze Linie entspricht einer Anpassung an eine Hill-Funktion mit einem geschätzten EC50 = 35 μM und Hill-Koeffizienten von 1,35. Diese Ergebnisse stimmen mit der bekannten Pharmakologie dieses Ionenkanals überein und zeigen wieder, dass die Zellreaktion primär durch die Aktivität der Natriumkanäle verursacht wird.
  • Beispiel 14: Analyse von HEK-293-Zellen, die eine Mischung aus spannungsaktivierten Chlorid- und Kaliumkanälen exprimieren
  • Es wurde eine Demonstration der direkten Stimulation von spannungsabhängigen Chlorid- und Kaliumkanäle unter Verwendung von Wildtyp-HEK-293-Zellen durchgeführt, die eine Mischung aus verschiedenen spannungsaktivierten Chlorid- und Kaliumkanälen (Zhu, Zhang et al. 1998) endogen exprimieren. Wildtypzellen wurden in 96-Well-Mikrotiter-Platten gezüchtet und unter Konfluenz getestet, nachdem sie entsprechend dem Protokoll in Anhang A1 mit den FRET-Farbstoffen eingefärbt worden waren. Die Anfangsstimulationsparameter beinhalteten eine 3 Se kunden lange Elektrostimulation bei 20 Hz mit einem biphasischen Stimulationskern mit Rechteckwelle mit einer Pulsdauer von etwa 5 ms pro Phase. Die Stimulationen erfolgten mit variierenden elektrischen Feldstärken, um die Schwellenfeldstärke für eine messbare Zellreaktion zu bestimmen und in Anwesenheit oder Abwesenheit von Kaliumkanalblockern.
  • 21 zeigt die zelluläre Spannungsreaktion, die während dieses Experiments erfasst wurde. In dieser Figur enthält jedes Feld die zehn Sekunden lange Zeitspur der Reaktion für ein einziges Well. Die Felder sind so ausgelegt, dass mit ihren relativen Positionen auf der Platte übereinstimmen. Die vertikale Achse in jedem Feld ist das subtrahierte, normalisierte Hintergrund-Fluoreszenzverhältnis der spannungs-sensitiven FRET-Farbkombination CC2-DMPE/DiSBAC2(3), Veränderungen dieser Menge sind ungefähr proportional zu Änderungen des Membranpotentials. Jede Säule hat identische Stimulationsbedingungen, mit zunehmender Stärke des elektrischen Feldes von links nach rechts über die Platte. Die zwölfte Säule der 96-Well-Platte (nicht dargestellt) enthielt keine Zellen und wurde zur Hintergrund-Subtraktion verwendet. Reihen 6-8 enthielten 10 nM TEA, um die spannungsabhängigen Kaliumkanäle zu blockieren. Bei der geringsten getesteten Feldstärke gab es keine nachweisbare Reaktion. Bei gemittelten elektrischen Feldern kann eine negative Spannungsreaktion erkannt werden, die schnell abfällt, wenn die Stimulation beendet wird. Bei dem stärksten Feld wird eine starke positive Reaktion ausgelöst. Dieses Verhalten setzt über 50 V/cm ein, ähnlich der Elektropermeabilisierungsschwelle, die bei CHO-Zellen, die NaV1 exprimieren (Beispiel 8) beobachtet wurde.
  • 22 zeigt die durchschnittliche Reaktion zwischen 4,5 und 5,0 Sekunden Stimulation als eine Funktion der Intensität des elektrischen Feldes. Die starken positiven Reaktionen über 60 V/cm wurden ausgeschlossen, um die kanalabhängigen negativen Reaktionen zu zeigen. Der Abweichungskoeffizient der Reaktion ist im Allgemeinen extrem klein, was zu außergewöhnlich großen Screening-Fenstern führt (siehe Anhang A3). Bei den nicht blockierten Daten für 20-40 V/cm beträgt die Differenz zwischen stimulierten und unstimulierten Wells über 20 Standardabweichungen.
  • Tetraethylammonium (TEA), ein bekannter Kaliumkanalblocker (Hille, 1992, Ionic Channels of Excitable Membranes) wurde in den Reihen 6, 7 und 8 mit einer vollen Blockierungskonzentration von 10 mM hinzugegeben. Diese Behandlung blockiert die Reaktion teilweise. Dieses Ergebnis stimmt überein mit dem Vorhandensein sowohl von Kaliumkanälen (blockiert durch TEA) als auch Chloridkanälen (von TEA nicht beeinflusst) in den Zellen, die auf Elektrostimulation ansprechen. Die Wirkung der Kaliumkanäle kann isoliert werden, indem die Chloridkanäle mit 4.4'Diisothiocyanostilben-2,2'-Disulfonsäure (DIDS) oder 4-Acetamido-4-Isothiocyanostilben-2,2'-Disulfonsäure (SITS; siehe Hille, 1992, Ionic Channels of Excitable Membranes) blockiert werden. Dann könnte die gleiche Zelllinie verwendet werden, um zwei Arten von Kanälen zu screenen.
  • Beispiel 15: Identifikation von zustandsabhängigen Blockern
  • Jedes vorgeschlagene Screeningsystem sollte vorzugsweise in der Lage sein, die Pharmakologie bekannter Verbindungen, wie sie durch akzeptierte Verfahren bestimmt wurden, zu reproduzieren. Um zu verifizieren, dass dies für die vorliegende Erfindung der Fall war, wurde eine Reihe von Testverbindungen definierter Aktivität unter Verwendung einer CHO-Zelllinie, die den NaV2-Kanal exprimiert, analysiert. Um dies zu erreichen, wurden Zellen in 96-Well-Platten kultiviert und, wie in Anhang A1 beschrieben, mit spannungs-sensitiven Farbstoffen eingefärbt. Testverbindungen wurden zu den Zellen mit dem Oxonol-Beschickungspuffer gegeben. Wenn nichts anderes angegeben ist, wurden die Verbindungen wie in Wiederholungen von 8, mit 1/3 Lösungen über elf Säulen der Assay-Platte getestet.
  • 23 zeigt die Zeitspuren für ausgewählte Konzentrationen der Natriumkanalblocker Tetrodotoxin (TTX) und Tetracain.
  • Tetrodotoxin ist ein wirksamer, reversibler, nicht zustandsspezifischer Natriumkanalantagonist. Im Vergleich dazu ist Tetracain ein anwendungsspezifischer Natriumkanalblocker, der verschiedene Affinitäten für verschiedene Natriumkanalzustände aufweist.
  • Die Ergebnisse zeigen, dass die vorliegende Erfindung hochgradig reproduzierbare Ergebnisse mit relativ geringen Abweichungen sowohl zwischen den Proben als auch zwischen den Platten zur Verfügung stellt. In 23 kann die Wirkung von TTX als zunehmende Verringerung der Reaktion beobachtet werden, ohne deutliche Änderungen der Form der Reaktion. Im Vergleich mit Tetracain nimmt die Reaktion nicht nur ab, sondert verändert mit variierender Konzentration auch die Form. Die C.V. für diese Experimente waren 10 % (TTX) und 9 % (Tetracain), verglichen mit typischen CV's, die die gleichen Spannungs-Farbstoffe verwenden, aber die üblichen Zugaben von Flüssigkeit betrugen 16 % (TTX) und 18 % (Tetracain).
  • Es ist wichtig, dass die Ergebnisse auch zeigen, dass die vorliegende Erfindung die zustandsabhängige Blockierung des Natriumkanals durch Tetracain identifizieren kann. Die anwendungsspezifische Blockierung durch Tetracain wird in den in 24 gezeigten Dosis-Wirkungs-Kurven deutlicher. Bei TTX ist die Blockierung des Kanals unabhängig vom Zeitfenster, das für die Berechung der Reaktion verwendet wird. Bei Tetracain ist die Blockade jedoch bei einer Größenordnung von 3 Sekunden stärker als bei 1 Sekunde. Bei den gleichen Stimulationsbedingungen zeigten andere anwendungsspezifische Blocker (Lidocain und Bupivacain) eine kleinere Verschiebung in den Dosis-Wirkungs-Kurven. Die EC50-Werte, die durch das Elektrostimulationsprotokoll für Lidocain erhalten wurden, waren den Hochfrequenzwerten ähnlich, über die in der Literatur berichtet wird (siehe Tabelle 4); dies legt nahe, dass die Anwendungsspezifität von Lidocain und Bupivacain schnell genug ist, um bei der hier verwendeten Stimulation von 20 Hz voll gesättigt zu werden. Dies legt wiederum nahe, dass wir die anwendungsspezifischen Eigenschaften von Lokalanästhetika durch die Änderung der Stimulationsfrequenz untersuchen können.
  • Tabelle 4 zeigt die Blockierungskonzentrationen für mehrere Natriumkanalantagonisten. Die erwähnten Literaturwerte wurden allen unter Verwendung von Whole-Cell-Patch-Clamping gemessen und basieren deshalb auf den direkten Messungen des Natriumkanalstroms.
  • Figure 01310001
  • Figure 01320001
  • Quellen
    • a Ragsdale et al., 1996 Proceedings of the National Academy of Sciences, U.S.A. 93:9270-9275
    • b Wanner et al., 1999 Biochemistry 38:11137-11146
    • c West et al., 1992, Neuron 8: 59-70
    • d Ragsdale et al. al., 1991, Molecular Pharmacology 40:756-65
  • Die Einträge in Tabelle 4 sind EC50-Werte (in Mikromolar) für Anpassungen an die Dosis-Wirkungs-Kurven eines jeden Assay. Jedes Experiment wurde zwei Mal durchgeführt, mit vier Wells pro Medikamentenkonzentration pro Experiment. Bei jedem Experiment wurden elf Konzentrationen verwendet, die fünf Konzentrationsgrößenordnungen umfassten. Die angegebenen Werte stellen den Durchschnitt aus den berechneten EC50 aus jedem Experiment dar. In den Fällen anwendungsspezifischer Blocker sind die niedrigsten aufgezeichneten Werte angegeben.
  • WIN-17317 und TTX sind wirkungsvolle Tonic-Blocker einer Vielzahl von Natriumkanälen. Diese Verbindungen können unter Verwendung des Elektrostimulationsformates, das Blockierungskräfte nahe den Literaturwerten ergibt, nachgewiesen werden.
  • Die ersten vier Medikamente (Lidocain, Bupivacain, Tetracain und Phenytoin) sind anwendungsspezifische Blocker. Das heißt, sie haben unterschiedliche Affinitäten zu den verschiedenen Zuständen des Kanals. Sie sind von großer therapeutischer Relevanz, da sie bei korrekter Konzentration das schädliche wiederholte Auftreten von Impulsen von Neuronen und Muskelzellen blockieren können, während sie die normale Aktivität bei niedriger Frequenz nicht beeinflussen. In allen Fällen ist die mit Elektrostimulation gemessene Blockierungskonzentration, nahe dem angegebenen Literaturwert. Das Elektrostimulations-Assayformat ist das einzi ge zuverlässige Verfahren mit hohem Durchsatz zum Nachweis aller Modulatoren von Natriumkanälen, einschließlich Agonisten, Antagonisten und anwendungsspezifischer Blocker.
  • Beispiel 16: Anwendbarkeit für Screening mit hohem Durchsatz
  • Für Zwecke des Screening mit hohem Durchsatz sollte die Reaktion zuverlässig genug sein, um den Unterschied zwischen aktiven und inaktiven Verbindungen zuverlässig feststellen zu können. Dies kann durch die Untersuchung der Verteilung der erhaltenen Reaktionen unter identischen Stimulationsbedingungen quantifiziert werden, wobei natürliche Kanäle mit vollständig blockierten Kanälen verglichen werden. Aufgrund von experimentellern Unsicherheiten und Rauschen im System, kann bei den Reaktionen eine Streuung auftreten. Wir möchten in der Lage sein, diese Streuung statistisch zu quantifizieren, und sie zu verwenden, um die Wahrscheinlichkeit der falschen Identifikation von Reaktionen als entweder falsch positiv oder falsch negativ vorherzusagen.
  • Um dies zu erreichen, wurde eine Platte von Zellen, die den spannungsabhängigen NaV2-Natriumkanal exprimieren, mit den FRET-Farbstoffen geladen. Ein Well pro Säule wurde „randomisiert" mit 1 μM TTX beimpft, was ungefähr 200 Mal der halben Blockierungskonzentration entspricht. Die Zellen wurden mit einer biphasischen Stimulation von 5 ms pro Phase mit einem 3 Sekunden langen Impulsstoß mit 20 Hz und 25 V/cm getestet. Die Ergebnisse sind in 25 gezeigt. Die mit TTX beimpften Wells könne leicht mit dem Auge als die Wells mit geringer oder nicht wahrnehmbarer Reaktion unterschieden werden.
  • Die ratiometrische Reaktion zwei Sekunden nach Beginn der Stimulation ist in 26 gezeigt. Die beiden Populationen (blockiert und nicht blockiert) können leicht unterschieden werden. Die durchschnittliche blockierte Reaktion war 1,011 ± 0,004, während die durchschnittliche nicht blockierte Reaktion 2,67 ± 0,21 war. Der Abweichungskoeffizient für die nicht blockierte Reaktion beträgt 13 %. Das Screening-Fenster (d.h. die Differenz zwischen den bezüglich der Standardabweichungen normalisierten Populationen, siehe Anhang A3) beträgt 7,8(σ1 + σ2), wobei σ1 = 0,21 die Standardabweichung der nicht blockierten Reaktion ist und σ2 = 0,004 die Standardabweichung der blockierten Reaktion ist. Wenn wir den Trennpunkt verwenden, um Blocker von Nicht-Blockern in der Mitte zwischen den Populationen (bei 1,042) zu unterscheiden, dann beträgt die Rate statistisch falsch negativer und falsch positiver (ausgehend von einer normalen Verteilung) Ergebnisse 1-prob(7,75) = 10-14. Dies legt nahe, dass während eines Screenings einer großen Verbindungsbibliothek (108 Verbindungen) die Wahrscheinlichkeit, ein einziges falsch positives oder falsch negatives Ergebnis zu finden, während des ganzen Screenings bei nur eins zu einer Million liegt. Wenn als Vergleich die Differenz zwischen den Populationen nur 3 wäre und der Trennpunkt optimal platziert wäre, wäre die Rate für falsch positive/negative Ergebnisse bei 0,3 %, ein um 1011 höherer Faktor. Für ein tatsächliches Screening, bei dem wir als Trefferverbindungen alle Verbindungen einschließen möchten, die nicht vollständig blockieren, besteht ein Kompromiss zwischen dem Nachweis schwacher pharmakologischer Aktivität und der Rate falsch positiver Ergebnisse. Wenn wir zum Beispiel eine Rate der falsch positiven Ergebnisse von 0,1 % wünschen, können wir bei diesem Screening den Screening-Trennpunkt bei 3,3 Standardabweichung unter dem Mittelwert der nicht blockierten Reaktion setzen oder bei 1,97. In diesem Fall liegt die Rate der falsch negativen Ergebnisse effektiv bei Null und Verbindungen, die nur 50 % der Reaktion blockieren, werden als Treffer identifiziert.
  • Mathematisch gibt es zwei Gründe dafür, dass sich blockierte und nicht blockierte Populationen so wenig überschneiden. Erstens ist der Abweichungskoeffizient der nicht blockierten Reaktion relativ klein. Das heißt, jede Reaktion ist fast identisch mit jeder zweiten Reaktion. Zweitens, und vielleicht noch wichtiger, gibt es absolut keine nachweisbare Reaktion von den blockierten Wells. Die Streuung von blockierten Wells ist demnach extrem klein, so dass wir die Grenze für die Unterscheidung der Populationen sehr niedrig ansetzen können.
  • Bei Assays, die unter Verwendung von Stimulationsprotokollen für die Zugabe von Flüssigkeiten durchgeführt werden, geben zusätzliche Artfakte im Allgemeinen eine kleine Reaktion mit einer entsprechenden Streuung. Die Streuung der blockierten Reaktion reduziert das Screening-Fenster, erhöht die Wahrscheinlichkeit von falsch positiven und falsch negativen Ergebnissen begrenzt die Fähigkeit der Screening-Einheit, Teil-Blocker zu identifizieren.
  • Beispiel 17: Screening in komplexen Zelllinien
  • Die Durchführbarkeit der Elektrostimulation von Zellen, die mehrere Kanäle exprimieren, wurde unter Verwendung von Kulturen der HL5-Zelllinie gezeigt. Diese Zellen wurden durch Immortalisierung von Herzmuskelzellen (Claycomb et al., 1998, PNAS 95:2979-84) generiert. Sie enthalten mehrere spannungsaktivierte Natrium-, Calcium- und Kaliumkanäle, sowie einen starken Einwärts-Gleichrichter-Kaliumstrom und Kalium- und Chlorid-Leckströme. Die Zellen wurden in 96-Well-Mikrotiter-Pltten gezüchtet und bei Konfluenz getestet. Sie wurden entsprechend dem Protokoll in Anhang A1 eingefärbt. Ratiometrische Fluoreszenzmessungen wurden währen der Elektrostimulation unter Verwendung eines VIPRTM wie oben beschrieben durchgeführt und die Daten wurden entsprechend der Vorgehensweisen in Anhang A2 analysiert. Die Stimulationsparameter wurden frei wie folgt festgelegt: 3 Sekunden langer Impulsstoß bei 10 Hz mit einem biphasischen Stimulationskern mit Rechteckwelle mit einer Pulsdauer von 5 ms pro Phase. Die Stimulation erfolgte mit variierenden elektrischen Feldern, um das Schwellenfeld zu bestimmen. Zwei Reihen von Wells enthielten 10 μM TTX, um den Herz-Natriumkanal teilweise zu blockieren und zwei Reihen enthielten 10 mM TEA, um die spannungsabhängigen Kaliumkanäle zu blockieren. 27 zeigt die normalisierten Reaktionen eines jeden Well. Im Allgemeinen erhöht sich die Zellreaktion, wenn die Stärke des elektrischen Feldes steigt. Die letzen drei Säulen zeigen Zeichen von Elektropermeabilisierung, wenn die Spannung weiter ansteigt. In den Säulen 6,7 und 8 geht das Verhältnis tatsächlich unter das Ausgangsverhältnis zurück, was eine Nach-Hyperpolarisation nahe legt (ein Phänomen, das durch das langsame Schließen von spannungsabhängigen Kaliumkanälen verursacht wird).
  • Die Rate der Zellreaktion ist extrem schnell und kann offensichtlich durch die Fähigkeit des Ethyl-Oxonols eingeschränkt werden, sich schnell innerhalb der Membran zu verteilen. Die schnelle Reaktion stimmt überein mit einer hohen Ruheleitfähigkeit der Zelle aufgrund von Leckströmen und der Expression von Kalium-Einwärts-Gleichrichter-Kanälen. TTX blockiert die positive Reaktion teilweise, was darauf hinweist, dass diese zumindest teilweise auf dem spannungsabhängigen Natriumstrom beruht.
  • 28 zeigt die Reaktion der unbehandelten Zellen (Reihen 1-4) als eine Funktion des angelegten elektrischen Feldes. Die Reaktion steigt sigmoidal mit dem elektrischen Feld. Über 50 V/cm gibt es ein anhaltendes Signal, das von TTX nicht beeinflusst wird. Wie bereits besprochen, stimmt dieses Verhalten mit der Elektropermeabilisierung der Zellmembran bei großen Stärken des elektrischen Feldes überein. In 28 ist auch das Screening-Fenster (siehe Anhang A3) als eine Funktion des Stimulationsfeldes gezeigt.
  • Diese Ergebnisse zeigen, dass HL5-Zellen effektiv unter Verwendung des Elektrostimulationsverfahrens getestet werden können. Verbindungen, von denen bekannt ist, dass sie verschiedene Ionenkanäle verändern, verursachen nachweisbare Veränderungen der Reaktion. Da diese Ionenkanäle mit den vom Herzen exprimierten Ionenkanälen identisch sind, wäre ein solcher Assay als zweites Screening nützlich, um die Verbindungen, die die normale Herzfunktion beeinträchtigen könnten, zu eliminieren oder für eine Modifikation zu kennzeichnen. Er könnte auch als ein primäres Screening nützlich sein, um Verbindungen zu entdecken, die wünschenswerte Wirkungen auf jeden Herzionenkanal (oder eine Kombination von) Herzionenkanälen haben könnten.
  • Beispiel 18: Elektrostimulation von Zellkulturen unter Verwendung von Oberflächenelektroden
  • An der Oberfläche angebrachte Elektroden wurden auf Glas-Deckgläsern, die mit Chrom (als Haftschicht) und Gold (als leitende Schicht) beschichtet waren, vorbereitet. Die metallisierten Deckgläser wurden durch Thin Film Devices, Inc. (Anaheim, CA) speziell angefertigt. Die Deckgläser bestanden Corning 7059 Glas mit einem Quadratzoll und einer Dicke von 0,17 mm. Die Metallisierung erfolgte durch Vakuum-Kathodenzerstäubungs-Abscheidung. Die Chromschicht war ungefähr 1000 Å dick und diente als Haftschicht. Die Goldschicht war ungefähr 5000 Å dick und diente als leitende Schicht. Der Widerstand des Beschichtungs-Metalls war unter 0,1 Ω/Quadrat. Ein Abstand von 4 mm wurde durch das Metall geätzt, indem die Metalloberfläche mit einem chemisch resistenten Polymer per Hand maskiert wurde (S1400-27, Shipley Co., Marlborough MA), dann wurde für fünf Minuten Gold-Ätzmittel TFA durch die Metallschichten geätzt, gefolgt von fünf Minuten Chrom-Ätzmittel TFD (Transe ne Co., Danvers MA). Die Deckgläser wurden an den Böden von 96-Well-Platten mit einem Silikonelastomer (Sylgard 184 (Corning), befestigt, 90 Minuten bei 70° vernetzt). Nach 30-minütiger Sterilisation mit 365 nm UV-Strahlung und Beschichtung mit dem Zellhaftmolekül Poly-D-Lysin (Molekulargewicht 300.000, 1 mg/mL in phosphatgepufferter Dulbecco-Salzlösung für 30 Minuten, dann 3 Mal mit destilliertem Wasser gespült) konnten lebende Zellen erfolgreich auf Elektrodenoberflächen gezüchtet und kultiviert werden.
  • Um den Oberflächenelektrodenstimulator zu validieren, wurden CHO-Zellen mit einer anfänglichen Dichte von ungefähr 1000 Zellen/mm2 in die Wells der 96-Well-Platte plattiert und für 16 Stunden belassen, damit sie sich anlagern konnten. Diese Zellen wurden transfiziert, um einen Kaliumkanal, der das Transmembranpotential auf etwa -80mV setzte und den NaV3-Natriumkanal zu exprimieren. Nach Erreichen der Konfluenz wurden die Zellen mit der spannungs-sensitiven FRET-Farbstoffkombinaton aus CC2-DMPE und DiSBAC2(3) wie in Anhang A1 beschrieben beschickt. Die Metalloberflächenelektroden wurden mit dem Ausgang eines Pulsgenerators verbunden, der in diesem Fall ein Exponential-Abkling-Elektroporator (Gene Pulser II, Bio-Rad Corp., Hercules CA) war. Das ratiometrische Fluoreszenz-Imaging erfolgte auf einem Zeiss Axiovert TV Mikroskop, das mit einer 75 W Xenon Bogenlampe als Lichtquelle ausgestattet war. Das Erregungslicht wurde unter Verwendung eines 40510 nm dielektrischen Interferenzfilters und eines 445 DXCR Dichrom-Spiegels gefiltert. Das Emissionslicht wurde mit einem zweiten 525XR Dichromspiegel aufgespalten und mit einem Paar von Hamamatsu HC124 Photovervielfacherröhren (PMTs) gemessen. Eine PMT hatte einen 475 ± 40 nm dielektrischen Interferenzfilter davor, um das blaue Fluoreszenzsignal zu überwachen. Die zweite PMT hatte einen 58035 nm dielektrischen Interferenzfilter davor, um das orange Fluoreszenzsignal zu überwachen. Die optischen Filter und Dichrom-Spiegel wurden von Chroma Technology Corp., Battleboro, VT, bezogen. Das ratiometrische Fluoreszenz-Imaging wurde auf Feldern durchgeführt, die ungefähr 100 Zellen enthielten. Die Korrektur für Hintergrundfluoreszenz wurde durchgeführt, indem die blauen und orangen Signale in einem Feld ohne Zellen gemessen wurden und diese dann von den von den Zellen erhaltenen Signal abgezogen wurden. Dann wurde das ratiometrische Signal, wie in Anhang A2 beschrieben, proportional zu den Änderungen des Transmembranpotentials berechnet.
  • Das Stimulationsprotokoll verwendete einzelne, monophasische elektrische Feldpulse mit variabler Amplitude. Die Pulse waren Exponential-Abkling-Wellenformen mit einer Abklingzeitkonstante von 4,3 ms. Die Amplitude zu Beginn des Pulses variierte von Null bis 56 V/cm.
  • Eine typische Spannungsreaktion für CHO-Zellen, die einen Kaliumkanal und den NaV3-Natriumkanal exprimieren, nach drei getrennten Stimulationsreaktionen von 45 V/cm, ist in 29 für das gleiche Feld von Zellen dargestellt, was die Wiederholbarkeit der Reaktion zeigt. Die Geschwindigkeit der Reaktion ist in diesem Fall vor allem durch die Reaktionszeit des beweglichen hydrophoben Farbstoffs eingeschränkt, die für das verwendete Ethyloxonol bei etwa 0,5 Sekunden liegt.
  • Die durchschnittliche ratiometrische Reaktion einer Zellpopulation, die in einer 96-Well-Multiwell-Platte gezüchtet und mit monophasischen Stimuli von variierender Feldstärke stimuliert wird, ist in 30 gezeigt. Die Punkte in dieser Kurve sind die durchschnittlichen Spitzenreaktionen von 4 Stimulationen der gleichen Kultur. Wie von einer aktionspotentialartigen Kurve zu erwarten ist, gibt es unter etwa 18 V/cm keine nachweisbare Reaktion. Der Schwellenbereich ist relativ schmal. Zwischen etwa 20 und 40 V/cm nehmen die Reaktionen mit zunehmender Feldstärke zu. Über 40 V/cm bleibt die Reaktion auf einem Plateau.
  • Beispiel 19: Analyse von Wildtyp-RBL-Zellen, die IRK1 exprimieren
  • Basophile Rattenleukämiezellen (RBL)-Zellen exprimieren den Kalium-Einwärts-Gleichrichterkanal IRK1 endogen (Wischmeyer et al, Pflugers Arch. 429:809-819, 1995). Dieser Kanal leitet selektiv Kaliumionen mit einer hohen, nicht-linearen Leitfähigkeitskennlinie. Die Leitfähigkeit ist unter dem Kalium-Umkehr-Potential VK nahezu linear und fällt schnell auf nahezu Null, ausgehend von etwa 10 mV positiv von VK. Zellen, die große Mengen von Einwärts-Gleichrichter-Kanälen exprimieren, tendieren dazu, Transmembranruhepotentiale innerhalb weniger Millivolt von VK zu haben.
  • Auf der Seite der Zelle, auf der das Transmembranpotential durch ein externes elektrisches Feld, das an die Zellen, die IRK1 und wenige andere Ionenkanäle exprimieren angelegt wird, positiv wird, schließen sich die IRK1-Kanäle schnell und hören auf, leitend zu sein. Auf der Seite der Zelle, auf der das Transmembranpotential negativ wird, öffnen sich die IRK1-Kanäel und lassen Kaliumstrom fließen. Wenn diese Seite der Zelle negativ genug ist, so dass das lokale Transmembranpotential negativer als VK ist, existiert ein Netto-Einwärts-Kaliumstrom. Dieser Strom führt zu einer positiven allgemeinen Änderung des Transmembranpotentials. Da der IRKl-Kanal nicht inaktiv wird, sollte dieser Strom so lange aufrechterhalten werden, wie das elektrische Feld angelegt wird.
  • Aneinanderhängende RBL-Zellen wurden in 96-Well-Platten gesät und mit FRET-Farbstoffen beschickt, wie in Anhang A1 beschrieben. Drei Reihen von Wells enthielten 400 μM Bariumchlorid, um den IRK1-Kanal zu blockieren. Die Platten wurden unter Verwendung eines VIPRTM-Lesers analysiert, während sie elektrisch mit einer biphasischen Stimulationsfolge stimuliert wurden, die mit einer Frequenz von 50 Hz und einer Pulsdauer von 5 ms pro Phase wiederholt wurde. Die Stimulationspulsfolge erfolgte über eine Gesamtdauer von 5 Sekunden und die Digitalisierungsrate für die Datenerhebung war 50 Hz. Das angelegte elektrische Feld stand für jede Säule von acht Wells fest und variierte von 7,2 bis 72 V/cm. Die Daten wurden gemäß den Vorgehensweisen in Anhang A2 analysiert. Das normalisierte Verhältnis nach drei Sekunden Stimulation wurde berechnet, der Durchschnitt für die beiden Populationen von Wells (mit und ohne Barium-Blocker) genommen und in Abhängigkeit des angelegten Feldes in 31 aufgetragen. Die Fehlerbalken sind Standardabweichungen der Reaktionen. Leere Quadrate sind die Reaktionen ohne Bariumblocker, volle Kreise sind die Reaktionen mit Barium-Blocker. Die Daten der Wells mit Bariumblocker zeigen, dass es keine nachweisbare Spannungsänderung während der Stimulation gibt, bis das Feld 80 V/cm erreicht, wobei es an diesem Punkt zu einer geringen Elektropermeabilisierung kommen kann. Die nicht blockierten Wells zeigten über einer Schwelle von etwa 20 V/cm nahezu lineare Reaktionen. Dieses Beispiel zeigt deutlich, dass die vorliegende Erfindung verwendet werden kann, um das Transmembranpotential entweder in eine positive oder negative Richtung zu regulieren, je nach den Stimulationsparametern und den Eigenschaften des von der Zelle exprimierten Ionenkanals.
  • Die vorliegende Erfindung dehnt die Anwendbarkeit der Elektrostimulation aus auf den Einschluss nicht-erregbarer Zellen, indem sie Instrumente und Verfahren zur Verfügung stellt, die die effektive stufenweise Steuerung des Membranpotentials ohne daraus entstehende signifikante Elektroporation ermöglichen. Die vorliegende Erfindung kommt zu diesem Ergebnis über die Verwendung von sehr einheitlichen, wiederholten Pulsen von Elektrostimulation, die an das die Zelle umgebende Medium angelegt werden. Die angelegten elektrischen Felder verändern das durchschnittliche Transmembranpotential der Zelle typischerweise nicht direkt, sondern führen stattdessen zu symmetrischen positiven und negativen Änderungen des Transmembranpotentials auf den Seiten der Zelle, die der Kathode bzw. der Anode zugewandt sind.
  • Das Verfahren nutzt die Ionenselektivität und das nicht lineare Gating und die Leitfähigkeitscharakteristika von spannungsabhängigen Ionenkanälen. Das Verfahren nutzt auch die Tatsache, dass typische intakte Zellen lange Zeitkonstanten für den Abfall der Änderungen des Transmembranpotentials aufweisen. Sogar in den Fällen, in denen die durch einen einzigen Stimulationspuls in die Zelle injizierte Ladung zu gering ist, um zuverlässig nachgewiesen zu werden, können korrekt angelegte mehrfache Stimulationspulse große Nettoabweichungen des Transmembranpotentials aufbauen. Durch Variation der Zahl, Dauer und der Form und Amplitude der Pulse ist es möglich, das Transmembranpotential lebender Zellen künstlich einzustellen oder zu verändern, auf eine Art, die dem Patch-Clamping ähnlich ist. Andere Kanäle, Leckströme oder Transporter, die nicht klassisch als spannungsabhängig betrachtet werden, können auch durch das Induzieren von Änderungen des Transmembranpotentials getestet werden, unter Verwendung eines zweiten, spannungsabhängigen Kanals und dem Nachweis des Stromflusses oder Veränderungen des Transmembranpotentials als Ergebnis der Aktivierung des Zielkanals oder Transporters.
  • Das vorliegende Verfahren ist stabil, mit optischen Nachweisverfahren kompatibel und kann leicht auf eine breite Spanne von potentiellen Anwendungen angepasst werden, einschließlich des Screenings mit hohem Durchsatz für die Verwendung zum Auffinden von Medikamenten. Bei vielen Assay-Formaten vermeidet die direkte Elektrostimulation die Erforder nis eines flüssigen Zusatzes, was den Assay vereinfacht. Komplexe Manipulationen des Transmembranpotentials können leicht erreicht werden, indem Variationen des Stimulationsprotokolls verwendet werden. Somit kann praktisch jeder spannungs-sensitive Kanal veranlasst werden, sich zu öffnen, unabhängig von Zustand der Inaktivierung oder der Spannungsabhängigkeit. Zum Auffinden von Medikamenten mit hohem Durchsatz erleichtert dies die Anforderungen für spezialisierte Zellearten und ermöglicht eine schnelle Durchführung von Assays mit leicht verfügbaren Zelllinien.
  • A1. Färbeprotokoll von Spannungs-FRET-Farbstoffen
  • Reagentien:
    • Assay-Puffer # 1: 140 mM NaCl 4,5 mM KCl 2 mM CaCl2 1 mM MgCl2 10 mM HEPES 10 mM Glukose ph 7,40, 330 mOs/kg
    • Pluronic-Bestand (1000X): 100 mg/mL Pluronic 127 in trockenem DMSO
    • Oxonol-Bestand (3333X): 10 mM DiSBAC2(3) in trockenem DMSO
    • Cumarin-Bestand (1000X): 10 mM CC2-DMPE in trockenem DMSO
    • ESS-CY4-Bestand (400X): 200 mM ESS-CY4 in Wasser
  • Beschickungs- und Assay-Protokoll
    • 1. Zubereitung des CC2-DMPE Beschickungspuffers. Normalerweise wird für eine 96-Well-Platte, 10 mL Färbelösung pro Platte vorbereitet. i) Mischen gleicher Mengen (10 μL) von Cumarin-Bestand und Pluronic-Bestand in einem Röhrchen. ii) Zugabe von 10 mL Assay-Puffer#1 unter leichtem Rühren in das Röhrchen. Beschickungskonzentration: 10μM CC2-DMPE und 0,1 μg/ml Pluronic.
    • 2. Zubereitung des Oxonol-Beschickungspuffers: i) Mischen gleicher Mengen (3,3 μL) von Oxonol-Bestand und Pluronic-Bestand in einem Röhrchen. ii) Zugabe von 10 mL Assay-Puffer#1 unter leichtem Rühren in das Röhrchen. iii) Zugabe von 25 μL ESS-CY4 unter Rühren. Beschickungskonzentration: 3 μM DiSBAC2(3), 0,2 μg/ml Pluronic, und 0,5 mM ESS-CY4 . iv) Falls erforderlich, Kombination der Testverbindungen mit dem Beschickungspuffer an diesem Punkt.
    • 3. Spülen der Zellen zwei Mal mit Assay-Puffer#1 und jeweiliges Entfernen der gesamten Flüssigkeit aus jedem Well.
    • 4. Zugabe von 100 μL CC2-DMPE Beschickungspuffer in jedes Well. 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, dabei helles Licht vermeiden.
    • 5. Zweimaliges Spülen der Zellen mit Asssay-Puffer#1, und jeweiliges Entfernen der gesamten Flüssigkeit aus jedem Well.
    • 6. Zugabe von 100 μL Oxonol-Beschickungspuffer in jedes Well.
    • 7. 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, dabei helles Licht vermeiden. Unverzüglich verwenden.
  • A2. Analyse der VIPRTM-Leserdaten
  • Die Daten wurden als angepasste Intensitätsverhältnisse in den 460 nm und 580 nm Kanälen analysiert und wiedergegeben. Der Prozess der Berechnung dieser Verhältnisse wurde wie folgt durchgeführt: In allen Platten enthielt Säule 12 Assay-Puffer#1 mit den gleichen DiSBAC2(3) und ESS-CY4-Konzentrationen, die in den Zellplatten verwendet wurden, in Säule 12 befanden sich jedoch keine Zellen. Der Durchschnitt der Intensi tätswerte bei jeder Wellenlänge wurden in Anfangsfenstern (vor der Stimulation) und Endfenstern (während der Stimulation) gebildet. Diese Durchschnittswerte wurden von durchschnittlichen Intensitätswerten über die gleichen Zeiträume in allen Assay-Wells subtrahiert. Die von Proben in den Anfangs- (Ri) und Endfenstern (Rf) erhaltenen Verhältnisse werden wie folgt definiert:
    Figure 01430001
  • Die Enddaten werden an das Startverhältnis jedes Well angepasst und als Rf/Ri wiedergegeben.
  • A3. Screening-Fenster
  • Das Screening-Fenster W für eine Reaktion wird wie folgt definiert: Daten aus mehreren Wells mit identischen Stimulationsbedingungen sind erforderlich. Die Kontrollwells können entweder pharmakologisch blockierte Zellen oder nicht transfizierte Zellen enthalten, die mit dem vollen elektrischen Feld stimuliert werden. Alternativ könnte man transfizierte Zellen ohne Applizierung einer Stimulation verwenden. Die Reaktionen der Experiments- und Kontrollwells werden gemessen. Die Durchschnitts- und Standardabweichungen der Reaktionen in den Experiment- (R + ΔR) und Kontroll- (C + ΔC) Wells werden berechnet. Das Screening-Fenster ist definiert als der Unterschied zwischen den Experiments- und Kontrollsignalen, die auf die Summe der Standardabweichungen angepasst wurden.
  • Figure 01430002
  • Eine allgemeine Faustregel für ein akzeptables Screening-Fenster ist W > 3. Dies erlaubt, eine Trennlinie in der Mitte zwischen den Kontroll- und Experimentreaktionen zu wählen, die eine Rate der falsch negativen/positiven Ergebnisse unter 1 % garantiert. Geht man von einer normalen Verteilung aus, ist die Rate der falsch positiven/negativen Ergebnisse als eine Funktion des Screening-Fensters W:
    Figure 01440001
  • Tabelle A3.1 Die Rate der falsch positiven/negativen Ergebnisse P(W) als eine Funktion des Screening-Fensters W, wie in Gleichung A3.1 definiert. Diese Berechnung geht davon aus, dass der Trennpunkt für die Identifizierung eines Treffers eine gleiche Zahl von Standardabweichungen entfernt von den positiven und negativen Vergleichsreaktionen positioniert ist.
  • Figure 01440002

Claims (27)

  1. Verfahren zur Charakterisierung der biologischen Aktivität einer Kandidaten-Verbindung umfassend: Aussetzen einer oder mehrerer Zellen zu der Verbindung; Wiederholtes Aussetzen der einen oder mehreren Zellen zu einer Vielzahl von biphasischen elektrischen Feldpulsen, wobei die Pulse eine Maximalamplitude von weniger als annährend 90 V/cm haben, wobei die Pulse mit einer Rate von mindestens etwa 1 pro Sekunde appliziert werden, und wobei die Gesamtdauer eines jeden Pulses mindestens etwa 1 Millisekunde ist, um eine kontrollierte Änderung des Transmembranpotentials der einen oder mehreren Zellen zu bewirken; und Überwachen der Änderungen des Transmembranpotentials der einen oder mehreren Zellen ohne Verwendung eines Patch-Clamp.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Überwachen das Nachweisen der Fluoreszenzemission aus einem Beobachtungsbereich umfasst, der die eine oder mehreren Zellen enthält.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, zusätzlich umfassend das Beschränken der räumlichen Variation der elektrischen Feldstärke, um irreversible Zellelektroporation zu minimieren.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die elektrischen Feldpulse bewirken, dass ein Ionenkanal von Interesse zwischen unterschiedlichen spannungsabhängigen Zuständen wechselt, insbesondere, dass der Ionenkanal von Interesse geöffnet oder die Inaktivierung aufgehoben wird.
  5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die eine oder mehreren Zellen einen Spannungssensor umfassen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem FRET-basierenden Spannungssensor, einem elektrochromischen Transmembranpotential- Farbstoff, einem Transmembranpotential-umverteilungsfarbstoff, einem ion-sensitiven fluoreszierenden oder lumineszierenden Molekül und einem radioaktiven Ion.
  6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die eine oder mehreren Zellen einen spannungsregulierten Ionenkanal umfassen, insbesondere, wobei der spannungsregulierte Ionenkanal im speziellen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Kaliumkanal, einem Calciumkanal, einem Chloridkanal und einem Natriumkanal.
  7. Verfahren nach Anspruch 1, wobeid die elektrischen Feldpulse eine begrenzte räumliche Variation ihrer Intensität im Beobachtungsbereich zeigen, die weniger als etwa 25 % einer mittleren Intensität in dem Bereich ist.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die elektrischen Feldpulse über einen Beobachtungsbereich mit nicht mehr als etwa 15 %, vorzugsweise mit nicht mehr als etwa 5 % vom mittleren elektrischen Feld zu irgendeiner Zeit variieren.
  9. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die elektrischen Feldpulse die Stimulation mit entweder einer quadratischen Wellenform, einer sinusoidalen Wellenform oder einer Sägezahnwellenform umfassen.
  10. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das eine oder die mehreren elektrischen Felder eine Amplitude im Bereich von etwa 10 V/cm bis etwa 90 V/cm, vorzugsweise im Bereich von etwa 20 V/cm bis etwa 80 V/cm haben.
  11. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die elektrischen Feldpulse mit einer Stimulationsfrequenz wiederholt werden, die größer oder gleich ist zu dem Kehrwert der Transmembranzeitkonstante der einen oder mehreren Zellen, vorzugsweise mit einer Stimulationsfrequenz im Bereich von 1 Hz bis 1 kHz.
  12. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die elektrischen Feldpulse eine Pulsdauer im Bereich von etwa 1 Millisekunde bis etwa 20 Millisekunden haben.
  13. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Transmembranpotential über die Plasmamembran der einen oder mehreren Zellen entwickelt ist.
  14. Verfahren zum Testen der biochemischen Aktivität einer Verbindung gegen einen Zielionenkanal, umfassend: Auswählen einer Zelllinie mit einem normalen Transmembranruhepotential entsprechend einem ausgewählten spannungsabhängigen Zustand des Zielionenkanals; Exprimieren des Zielionenkanals in einer Zellpopulation der ausgewählten Zelllinie; Aussetzen der Zellpopulation zu der Verbindung; Wiederholtes Aussetzen der Zellpopulation zu einer Vielzahl von biphasischen elektrischen Feldpulsen, wobei die Pulse eine Maximalamplitude von weniger als annährend 90 V/cm haben, wobei die Pulse mit einer Rate von mindestens etwa 1 pro Sekunde appliziert werden, und wobei die Gesamtdauer eines jeden Pulses mindestens etwa 1 Millisekunde ist, um eine kontrollierte Änderung des Transmembranpotentials der einen oder mehreren Zellen zu bewirken; und Überwachen der Änderungen des Transmembranpotentials der einen oder mehreren Zellen.
  15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei der Zielionenkanal exogen in der Zelllinie exprimiert wird.
  16. Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Zelllinie mit einer Nucleinsäure transfiziert ist, die den Zielionenkanal codiert, insbesondere, wobei die Zelllinie im speziellen unerhebliche Mengen eines anderen Ionenkanals exprimiert, und wobei die Zelllinie vorzugsweise ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus CHL, LTK(-) und CHO-K1.
  17. Verfahren nach Anspruch 14, wobei der Zielionenkanal ein Natriumkanal ist, und wobei die Zellpopulation ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus CHL-Zellen, LTK(-)-Zellen und CHO-K1-Zellen, oder aus der Gruppe bestehend aus HEK-293-Zellen, RBL-Zellen, F11-Zellen und HL5-Zellen.
  18. Verfahren nach Anspruch 14, wobei der Zielionenkanal ein Kalium- oder Calcium-Kanal ist, und wobei die Zellpopulation ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus CHL-Zellen, LTK(-)-Zellen und CHO-K1-Zellen.
  19. Verfahren zum Testen von Ionenkanalaktivität, umfassend: Aussetzen mindestens einer Zelle u einer Vielzahl von biphasischen elektrischen Feldpulsen, wobei die Pulse eine Maximalamplitude von weniger als annährend 90 V/cm haben, wobei die Pulse mit einer Rate von mindestens etwa 1 pro Sekunde appliziert werden, und wobei die Gesamtdauer eines jeden Pulses mindestens etwa 1 Millisekunde ist, um eine kontrollierte Änderung des Transmembranpotentials zu erzeugen, und um einem Ionenkanal von Interesse zu aktivieren; und Nachweisen der Ionenkanalaktivität durch Nachweis einer oder mehrerer Änderungen des Transmembranpotentials ohne Verwendung eines Patch-Clamp.
  20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei die mindestens eine Zelle einen Spannungssensor umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem FRET-basierenden Spannungssensor, einem elektrochromischen Transmembranpotential-Farbstoff, einem Transmembranpotential-umverteilungsfarbstoff, einem ion-sensitiven fluoreszierenden oder lumineszierenden Molekül und einem radioaktiven Ion.
  21. Verfahren nach Anspruch 20, wobei der Spannungssensor einen FRET-basierenden Spannungssensor umfasst.
  22. Verfahren nach Anspruch 19, wobei der Ionenkanal von Interesse ein spannungsregulierter Ionenkanal ist.
  23. Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Vielzahl der elektrischen Feldpulse bewirkt, dass der Ionenkanal von Interesse zwischen unterschiedlichen spannungsabhängigen Zuständen wechselt.
  24. Verfahren nach Anspruch 19, wobei die mindestens eine Zelle eine eukaryontische Zelle, eine nicht-erregbare Zelle, eine prokaryontische Zelle, eine Gewebekulturzelle, eine Primärzelllinie und/oder Teil eines intakten Lebewesens ist.
  25. Verfahren zum Testen von Ionenkanalaktivität umfassend: Exprimieren eines ausgewählten Testionenkanals in mindestens einer Zelle; Exprimieren eines ausgewählten Gegenionenkanals in der mindestens einen Zelle; Aussetzen der mindestens einen Zelle zu einer Vielzahl von biphasischen elektrischen Feldpulsen, wobei die Pulse eine Maximalamplitude von weniger als annährend 90 V/cm haben, wobei die Pulse mit einer Rate von mindestens etwa 1 pro Sekunde appliziert werden, und wobei die Gesamtdauer eines jeden Pulses mindestens etwa 1 Millisekunde ist, um eine kontrollierte Änderung des Transmembranpotentials zu bewirken, und um den Gegenionenkanal zu aktivieren; und Überwachen des Transmembranpotentials der mindestens einen Zelle.
  26. Verfahren nach Anspruch 25, wobei eine Änderung des Transmembranpotentials nachgewiesen wird, wenn derr Ionenkanal von Interesse blockiert ist, insbesondere, wobei der Ionenkanal von Interesse im speziellen einen ligandenabhängigen Ionenkanal umfasst, und wobei der Gegenkanal vorzugsweise einen Natriumkanal umfasst.
  27. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Maximalamplitude annährend 20 bis 40 V/cm ist, under/oder wobei die Pulsdauer annährend 2 bis 10 Millisekunden pro Phase ist, und/oder wobei die Pulse mit einer Rate von annährend 20 bis 100 Pulsen pro Sekunde appliziert werden.
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