JP5588914B2 - イオンチャネルアッセイ方法 - Google Patents
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Description
動物の細胞および植物の細胞の内部はその外部に対して電気的に負であることが、ずっと以前から知られていた。この電位差の大きさは、一般に、5mVと90mVの間であって、電位のほとんどは細胞膜の両側の間で発生している。所与の細胞の膜内外電位は、電気化学的勾配を形成および維持するイオン輸送体とチャネルの活性のバランス、およびイオンが原形質膜を通過できるようにするイオンチャネル、受動拡散や他の要因の活性度によって決まる。
いくつかの実施形態では、候補化合物の生物学的活性度を特徴付ける方法は、細胞の集団をサンプルウェルの観察エリア内に設置する工程と、細胞の集団を化合物に曝露する工程と、細胞の集団を電界に曝露して細胞の集団の膜内外電位の変化の制御を生じさせる工程であり、電界は第1のパルスの連続と第2のパルスの連続との間には一時停止がある第1のパルスの連続および第2のパルスの連続を含んでいる工程と、第1のパルスの連続および第2のパルスの連続の少なくとも一部の間に細胞の集団の膜内外電位の変化をモニタリングする工程とを含む。いくつかの有利な実施形態では、モニタリングは細胞の集団を含む観察エリアからのFRETベースの電圧センサの蛍光放出を検出することによるなどの光学的モニタリングを含む。いくつかの有利な実施形態では、さらに第1のパルスの連続から収集されたデータと第2のパルスの連続から収集されたデータとを比較する工程を含む。いくつかの有利な実施形態では、膜内外電位の変化は化合物による遮断からのイオンチャネル回復を表すものである。いくつかの実施形態では、一時停止は第1のパルスの連続における任意の2つのパルス間の時間間隔の少なくとも2倍長い持続時間を有する。
図1はディッパー電極アレイの一実施形態を示す。図2は表面電極を備えているマルチウェルプレートのいくつかの実施形態を示す。図3は電気刺激装置の一実施形態のブロック図を示す。図4は電圧に依存するナトリウムチャネルを発現する細胞上での繰り返し外部電界のシミュレートされた効果を示す。上側のパネルは加えられた電界を示し、中間のパネルは細胞内へのシミュレートされたナトリウム電流を示し、下側のパネルはシミュレートされた平均膜内外電位差を示す。
一般に、本明細書で使用する用語、および以下に記述する蛍光、コンピュータ、検出、化学および実験室手法の多くは、この技術分野において周知のものであって、一般的に採用されているものである。標準的な技術が、化学合成、蛍光、光学、分子生物学、コンピュータソフトウェアおよび統合化において、一般に用いられている。一般に、化学反応と細胞測定と酵素反応とは、適切な場合には、製造者の仕様に従って実行される。技術および手順は、一般に、本明細書に援用した、当該分野、および下記のものを含めた種々の一般的な参考文献における通常の方法に従って行われる。
「活性化」という用語は、イオンチャネルの休止している(非導通)状態から活性化された(導通)状態への遷移を指す。
「活性化閾値」という用語は、それより上ではチャネルの測定可能な開通が起きるような最低電位を指す。
「アノード」という用語は、外部電源によりアースに対して正電位へ駆動されたときの電極を指す。
「細胞刺激領域」という用語は、対象とする細胞がその中に置かれているような、大きな電気刺激(通常、5V/cm以上高い)を受けている2個の電極により画定される領域を意味する。通常、細胞刺激領域は観察領域よりも大きいか、または等しい。標準の96ウェルをベースとする測定のためには、細胞刺激領域は、通常、約16mm2である。
「生物発光タンパク質」という用語は、化学反応の触媒作用によって光を生じさせることができるタンパク質を指す。この用語は、ルシフェリンを酸化させるなどの生物発光反応または化学発光反応を触媒するタンパク質を包含する。生物発光タンパク質という用語は、天然に存在する生物発光タンパク質のみでなく、変更されたスペクトルまたは物理的特性を示す突然変異体も含む。
「二相的」(biphasic)という用語は、各々逆の極性を有する2つの部分を有するパルスを指す。
「ボルツマン関数」という用語は、S字形(sigmoidal)(すなわち、階段様(step-like))反応関数をいう。
yは独立変数、
y0はx→∞となったときの関数の極限に等しい調整可能なパラメータ、
Aはステップサイズ(step size)に等しい調整可能なパラメータ、
x50はステップの中点に関連する調整可能なパラメータ、
Δxはステップの幅を記述する調整可能なパラメータである。
「有効濃度(50%)」または「EC50」とは、ある薬理学的化合物のその高い濃度における最大効果と比較して、その化合物が半分の効果を持つような濃度を指す。
「電気的に励起可能である」という用語は、活動電位を発生することによるある閾値を超える電気刺激に対して反応する細胞または組織を指す。電気的に励起可能な細胞は、内向きの電流を発生する少なくとも1つの電圧依存イオンチャネル型と、外向きの電流を発生する少なくとも1つの依存イオンチャネル型とを含む。
「電気刺激」という用語は、細胞外の電流パルスを用いて細胞中に電圧変化を開始させることを意味する。
「電極」という用語は、機器と試験システムとの間の制御可能な伝導性インターフェースを指す。
「電気的透過」という用語は、膜に形成されている水和した孔(hydrated pore)が、水分子および小さい単原子イオンを通すのにだけ十分な大きさであるような、適度なエレクトロポレーションを指す。
「エレクトロポレーション」という用語は、細胞の膜に大きな電位を印加するとその膜が絶縁破壊して、水和した通路が膜に形成される現象を指す。
「蛍光成分」という用語は、光を吸収し、その後でそのエネルギーの少なくともある割合をある時間にわたって光として再放出することができる成分を指す。この用語は個別化合物、分子、天然の蛍光タンパク質および高分子錯体、または、蛍光および非蛍光化合物または分子の混合物を含む。「蛍光成分」という用語は、光を吸収して、その後で何ミリ秒にもわたってエネルギーを再放出する、有機配位子増感体を添加されたランタニドイオンおよびランタニド錯体などの、減衰時間が長い蛍光を示す化合物も含む。
「FRET」という用語は、蛍光共鳴エネルギー伝達を指す。本発明の目的のために、FRETは、2つの蛍光成分の間、蛍光成分と非蛍光成分の間、ルミネッセント成分と蛍光成分の間およびルミネッセント成分と非蛍光成分の間で起きるエネルギー伝達過程を含む。
「ヒル関数」という用語は、S字形(すなわち、階段様)反応関数をいう。
yは独立変数、
y0はx→∞での関数の極限に等しい調整可能なパラメータ、
Aはステップサイズに等しい調整可能なパラメータ、
x0はステップの中点に関連する調整可能なパラメータ、
nはステップの鋭さ(steepness)を記述する調整可能なパラメータである。
「ヒット」という用語は、アッセイにおいて所望の特性を示す試験化合物を指す。
「整流」という用語は、コンダクタンスが非直線的であって、好適な向きを持つことを意味する。
「不活性からの解放」という用語は、不活性にされている閉じられているチャネルの、今や開くことができる休止して閉じられているチャネルへの転換を指す。
「繰り返し」という用語は、最低2回繰り返すことを意味する。
「再分極」という用語は、細胞の膜内外電位差をそれの休止電位に接近させることを意味する。
「休止」または「休止状態」という用語は、電位依存イオンチャネルが閉じられているが、不活性ではないことを指す。
細胞に対する「休止電位」という用語は、外部からの影響を受けていないときの細胞の平衡膜内外電位差を指す。
「実質的に平行である」という用語は、相互に面している2つの物体の表面の間の距離が、各物体の関連する表面上のあらゆる点において測定されたときに、10%より小さく、好適には5%より小さいだけ異なることを意味する。
「目標にできる」という用語は、ある条件の下で特定の場所に局在化される能力を持つ成分を指す。例えば、2カ所以上の場所に存在でき、ある条件の下で定められている場所に転移することができる能力を有するタンパク質は、その場所を目標にできる。一般的な例は、細胞の活性化の際のプロテインキナーゼCの原形質膜への転移や、タンパク質を含んでいるSH2ドメインのホスホリル化されているチロシン残基への結合を含む。この用語は、ほとんどの条件の下では、1つの特定の場所すなわちサイトに永続的に関連付けられている成分を含む。
「試験化合物」という用語は、推定上のモジュレーターとして本発明の1つまたは複数のスクリーニング法によって試験すべき化学物質を指す。試験化合物は、無機化合物、有機化合物、タンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質またはそれらの混合物などの任意の化学物質とすることができる。通常は、スクリーニングのために、0.01マイクロモル、1マイクロモル、10マイクロモルなどの、種々の所定の濃度の試験化合物が使用される。試験化合物の対照群にはは、試験化合物が存在しないときの信号の測定、またはターゲットを変調することが知られている化合物との比較を含むことができる。
「転換された」という用語は、組み換え核酸技術により、異型核酸分子が中に入れられているような細胞(またはそれの子孫)を指す。
「一様な電界」とは、任意の時刻に、観察領域内の平均強さからの電界の変動が15%を超えないような電界を意味する。
「電圧センサ」という用語は、膜内外電位差を指示できる、FRETをベースとする電圧センサ、エレクトロクロミック膜内外電位差染料、膜内外電位差再分配染料、細胞外電極、電界効果トランジスタ、放射性イオン、イオン感応性蛍光染料またはイオン感応性ルミネッセント染料、およびイオン感応性蛍光タンパク質またはイオン感応性ルミネッセントタンパク質を含む。
本発明は、少なくとも1つの電圧が規制されたイオンチャネルを含んでいる無損傷の生態細胞の膜内外電位差が、それらの細胞を浸している流体に電気刺激パルスを繰り返し加えることによって、精密に変調できることを最初に認識した。本発明は、無損傷の生態細胞の本来の完全性を大きく乱すことなく、それらの細胞の膜内外電位差の正確かつ確実な変調をもたらすための装置および方法を含む。
1)水溶液中の生態細胞の培養基に一様な電界を確実に発生するための電極と、電極アレイを含んでいる装置。
2)高いスループットおよび小型化された刺激のための、イオンチャネルまたは細胞の活性度の分析のための表面電極を有しているマルチウェルプレート。
3)イオンチャネルおよび細胞の活性度の高スループット分析のための、および薬剤発見、分析、スクリーニングおよびプロファイリングのためのシステム。
4)繰り返し電気刺激の使用による、生態細胞の膜内外電位差を変調する方法。
5)電圧が規制されているまたは電圧が規制されていないイオンチャネルの活性度、トランスポーターおよび漏れ電流に対する試験化合物の作用をスクリーニングする方法。イオンチャネルおよびトランスポータータンパク質に対する化合物の状態に依存する薬理学的活性の決定を含む。
6)電気刺激に対する細胞またはクローンの反応に基づく、それら細胞またはクローンをプロファイルリングし選別する方法。
7)細胞およびイオンチャネルパラメータを高いスループット態様で定量的に決定し、それらのパラメータに対する化合物の薬理学的作用を定量化する方法。
8)細胞の細胞間空間中への外因性化合物(exogeneous)の導入方法。
9)細胞内オルガネラの膜内外電位差を変調し、それらのオルガネラにおけるイオンチャネルに対して試験化合物をスクリーニングする方法。
10)遺伝子発現、酵素機能、タンパク質活性およびリガンド結合を含めた、生理学的および生化学的反応の機能および調整に対する膜内外電位差の生理学的作用を特徴付けする方法。
11)特定の機能または論理的反応のための適応ニューロネットワークまたはバイオコンピュータをプログラミングし、あるいは訓練する方法。
12)ヒトを含めた動物に埋め込まれた補綴装置のための効率的な神経インターフェースを提供する方法。
一実施形態では、本発明は、観察領域にわたって電界を発生するために、電極および電極アレイを含む。通常は、これは1対の導電性電極を使用することによって達成される。重要な設計上の特徴は、電極対が良く特定された電界を生ずることである。好適な電極の設計は、観察下の細胞が受ける電界の一様性を最大にする電極配置を含む。
導電性媒体内に一様な電界を発生する最も簡単なやり方は、相互にほぼ平行に整列されている表面を持つ2つの同一の平らな電極を使用することである。一般的には、電極がそれの横方向の幅に対して互いにより接近するにつれて、電界の一様性はより大きくなる。しかし、典型的な円形マルチウェルプレートのウェルは、ウェル内に挿入できる電極の幅を制限するとともに、かつ電界の一様性を減ずる2つの他の作用ももたらす。
ディッパー電極については、(一様な電界の形成の点で)理想的な状況は、電極の底をウェルの底に接触させることである。このやり方では、垂直電流路に関連する縁部電界または電界の不均一はない。しかし、取り外し可能な構造の場合には、電極が表面に接触することを求めることは望ましくない。プレートの形状の小さいずれが、ある電極を表面に押し付けて、プレート、細胞または電極に損傷を及ぼすことがある。また、あるウェルでは、電極は表面まで延びないことがある。これらの理由から、電極の底とウェルの底との間に小さい隙間を設けることが望ましいことがある。
任意の導電性物質を電極として使用できる。好適な電極材料は、次の特性の多くを有する。(1)それらは塩化ナトリウム水溶液で腐食されない、(2)それらは有毒なイオンを発生または放出しない、(3)それらは可撓性で強い、(4)それらは比較的安価に製作される、(5)それらは多孔質でない、(6)それらは容易に清浄にされる。好適な材料には、貴金属(金、白金およびパラジウムを含む)、耐熱金属(チタン、タングステン、モリブデンおよびイリジウムを含む)、耐食性合金(ステンレス鋼を含む)および炭素その他の有機導電体(黒鉛およびポリピロールを含む)が含まれる。多くの実施形態ではステンレス鋼が好適な電極材料である。この材料は、安価で、機械加工が容易であり、かつ塩化ナトリウム水溶液中で非常に不活性である。ステンレス鋼は、塩化ナトリウム水溶液中で電流が流れたときに徐々に酸化して酸化鉄を生ずるが、これは装置の性能に影響を及ぼすようにはみえない。酸化鉄は水中での溶解度が非常に低く、毒性レベルの鉄が放出されるようには見えない。また、どのような酸化鉄堆積物も、10%硝酸水溶液中に2時間浸し、その後で蒸留水で完全に水洗いすることによって、容易に除去できる。
ディッパー電極は、通常、マルチウェルプレートの1つまたは複数のウェルの中に、かつそれから、抜き出し可能に動かすことができるアレイ中に配置されている1つまたは複数の電極対で構成される。ディッパー電極は、プレートの様式および密度に合致するアレイに合わせることができるが、任意の形状または向きのアレイにできる。例えば、標準の96個ウェルプレートでは、1つまたは複数の行または列を同時に選択的に励起するための電極アレイ構成をおそらく含む、何種類かの電極形状が可能である。
本発明のマルチウェルプレートは、細胞の効率的な電気刺激を行うと同時に、膜内外電位差変化の光学的分析を可能にするように主として設計されている。これを行うために、導電性表面電極をマルチウェルプレートの壁、底またはふたの中または上に配向させることができる。
2、より好適には少なくとも10-3mm2でなければならない。
イトは、導電層をプレートに取り付けるために使用できる。誘導されたポリマーまたはその他の材料の例には、米国特許第5583211号(Coassinら)に記載されたもの、この技術分野で知られている他のもの、または今後開発されるものが含まれる。
マルチウェルプレートを製作する材料は、通常、ポリマー材料である。その理由は、これらの材料が大量生産技術に向いているからである。しかしながら、ガラスや石英などのその他の材料も、マルチウェルプレートの底を製作するために使用できる。底は、同じ材料または異なる材料で製作でき、かつ底は、ポリスチレンまたはその他の材料を含むことができる。好ましくは、低い蛍光性と高い透過率を持つポリマーを選択する。ポリマー材料は、インサート成型や射出成型などの、この技術分野で知られている成型法および将来開発される成型法によって、プレート製作を特に容易にできる。
本発明は、少なくとも1つの電極組立体と、電気刺激のための手段と、光検出器と、電気刺激の発生、データの収集およびマルチウェルプレートの動きを調整するコンピュータ制御手段とを備えている、自動化された電気刺激および分光測定装置を含む。この装置は、流体添加のための手段も有する。1つの態様では、それらの装置は、生態細胞の表面の内部または上部に存在するイオンチャネル、トランスポーター、漏れ電流の活性度を変調し、特徴付けし、かつ測定し、チャネルまたは細胞の活性度に対する試験化合物の効果を迅速にスクリーニングするように、設計されている。本発明は、また、本発明のワークステーションの動作によって発生または発見された化学的実体および情報(例えば、モジュレーター、あるいは化学薬品の化学的または生物学的活性度)にも向けられている。
本発明は、各ワークステーションにおける処理時間を最短にするためにプログラム可能に制御され、電気刺激および分析のために液体試料の処理時間を最短にするために統合できる、自動化されたワークステーションも含む。
本発明は、微小流体チップに組み込まれて、高度に微小化された電気刺激および分析のために設けられている電極の使用も含む。そのような装置は、例えば、Chowらへの1998年9月1日に発行された米国特許第5800690号、Percらによって1997年5月5日に出願されたヨーロッパ特許出願第0810438A2号、およびParceらによって1997年6月24日に出願されたPCT出願第98/00231号に記載されているものを含む。それらの装置は、通常、ガラスまたはシリコンチップに存在する微小毛管内の小さい流体体積を取り扱うために、起電性の流体運動を使用する。これらの微小流体チップをベースとする分析装置は、微小化された分析を多数並列に行うことができる。そのような装置は、微小化された分析を要するいくつかの場合における好適な分光測定装置である。
a.諸言
本発明者らは、どのような作用機序にも結び付けられることなしに、細胞の膜内外電位差に対する電気刺激の作用についての下記の説明を行う。
電圧で活性化するナトリウムチャネルを発現するある細胞系統への典型的な二相電気刺激プロトコルのシミュレーションによる作用を、以下に簡略化した形式で示す。以下の説明は、細胞系統が他のイオンチャネルの大きい発現を持たないこと、および細胞の休止膜内外電位差が、問題としているナトリウムチャネルの不活性化のための閾値より上であることを仮定している。図4において、上のパネルは、加えられた電界(E)の時間的経過を示し、中間のパネルは加えられた電界に反応するシミュレーションされた内向きナトリウム電流(INa)を示し、下のパネルは、細胞の理想化した平均膜内外電位差(Vm)を示す。この例では、それらの記録は、加えられた電界の中央に置かれている単細胞が、通常、電気刺激波列中に経験することを予測されるそれらのパラメータの変化に関連する。
本発明は、生きている細胞中のイオンチャネルを選択的に活性化できる任意の繰り返し手順を有する任意の波形カーネルの使用を含む。カーネルは、刺激列の基礎を形成する繰り返し可能な構造である。図4において、カーネルは二相方形パルスであるが、原則的には、時間が限定された任意の波関数である。カーネルの持続時間は、それが繰り返すことができる最高速度を設定する。繰り返し手順は、カーネルがどのようにして、かついつ試料に提示されるかを支配する。図4において、繰り返し速度は固定され、全部で10サイクル継続する。しかしながら、繰り返し速度は固定される必要はない。
刺激列中に繰り返される波形カーネルは、Tektronix AFG310などの任意のデジタル波形発生器を用いて、ほぼ無限の順列で変化できる。図5は、変調できる変数のいくつかを示すための二相方形波形の概略図を示している。図5においてパルス列は、時間t1の間持続する出発電界E1(400)と、時間t3の間持続する第1の刺激電界E2(420)に達するまでの、時間t2を要する電位の急速な上昇(410)と、時間t5の間持続する第2の刺激電界E3(440)に達するまでの、時間t4を要する電位の急速な降下(430)と、サイクルが繰り返されるまで時間t7の間持続する終了電界E4(470)に達するまでの、時間t6を要する電位の急速な上昇(460)とで構成されている。電界E1〜E4の大きさと極性は別々に制御可能であり、下記のように、静的および動的に変化できる。電位が細胞に加えられる時間すなわち時間t1、t3、t5およびt7も別々に制御可能であり、波形列中において0と10秒の間に下記のように静的および動的に変化できる。最後に、時間t2、t4およびt6にわたって生ずる電位の変化は、0と100ミリ秒の間の可変の時間期間にわたって起きることがあり、かつ可変形の波形を生ずるために、直線形または非直線形のことがある。
(a)図5に示されているように、速度fで繰り返される二相波形。
(b)変更された二相波形。その波形列の刺激段階の間に短いインターバルが付加されている。これによって、第1のパルス中に不活性から解放されたチャネルを通じて電流が流れるようにされる。
(c)単相波形。細胞のアノードに面している側にあるチャネルのみが不活性から解放される。
(d)ランプ波形(ramped waveform)。アノードに面しているチャネルが方形波により不活性から解放される。それらのチャネルは活性化して傾斜中に電流を流す。傾斜部によってより負の局部電位においてチャネルは開いて、電流を流すことができるようにされるので、細胞がナトリウムイオンに対する反転電位に近いときでさえも、大きい電流が依然として流れることができる。チャネルが開く点である傾斜部に沿う点は変化する。
(e)二相三角波形または鋸歯状波形。傾斜によって状態間の電位依存遷移が、全体的な膜電位が変化するにつれて、より一様に起きるようにすることができる。単相三角波形も可能である。
(f)正弦波形。この種の波形は、高周波刺激中に電気的ノイズを減少させることができる。
(g)正弦波形の短いバースト。
(h)おのおの異なる基本周波数を持つ、正弦波形のバースト。この種の刺激は可塑性効果(plasticity effect)を研究するために有用であることが判明することがある。第1のバーストは、装置を訓練するためまたはプロセスを開始するために用いられ、以後のバーストは装置をアッセイするために用いられる。
パルス振幅の大きさと極性は、刺激パルス中に細胞が経験する相対的な膜内外電位差行程を制御する。下でより詳細に説明するように、種々のチャネルと細胞タイプとに適応できるようにするために、パルス振幅は全体の列に対して、または個々のパルスに対して変更できる。一般に、E2とE3の大きさは、各刺激サイクル中において、対象とするイオンチャネルが効率的に活性化され、不活性から解放されることを確実にするように、同時に、細胞の不可逆的エレクトロポレーションを引き起こすほどの大きさでないことを確実にするように、選択される。E2とE3の好適なパルス振幅は、通常、平均寸法が10〜25μmである励起できない哺乳動物の細胞で発現されるときは、ほとんどのイオンチャネルに対して5〜60V/cmの範囲にあり、アースに対して正または負に変化することがある。上記のように、刺激の振幅は、平均膜内外電位差が変化しても安定な刺激条件を維持するために、パルス列中で変化することができる。好適なパルス振幅は、平均細胞寸法に逆依存する。したがって、パルス振幅を変化することによって、10〜25μmより小さいか大きい細胞に対して、この技術を使用することもできる。
多くのチャネルは、開通する前に、不活性からそれらを解放するために、膜内外電位差を延長された時間期間の間変更することを求める。例えば、多くの電位依存ナトリウムチャネルは、一般に、それらが不活性から解放される前に、−90mVより低い膜内外電位差を何ミリ秒間か経験することを必要とする。したがって、電気刺激プロトコルの効率的な使用は、通常、パルスの持続時間t3とt5が、対象とするイオンチャネルに対して不活性からの完全なまたはほとんど完全な解放を可能にするために十分であることを要求する。ある場合には、いくつかのイオンチャネル型を発現する細胞における1つのクラスの不活性化からの選択的解放を可能にするが他のクラスのイオンチャネルではそうではないように、t3とt5の大きさを調整することが必要なことがある。他の場合には、チャネルの
不活性からの解放のレベルが低くなるように、t3とt5を非常に小さくすることが望ましいことがある。通常は、好適なパルス持続時間は、対象とするイオンチャネルの所望の電位依存状態の間の遷移のための特性時間に合致させられ、それらは、通常は、ほとんどのイオンチャネルに対しては約0.1または100ミリ秒の範囲にある。
の発生は、ウェル内の細胞および染料に酸化性の損傷を与えることもある。
列に対してt1とt7の値を全体的に変えること、または列中の個々の各パルスに対してそれを調整することは、特定のイオンチャネルに対する刺激プロトコルを最適にするために有用である。またこのやり方は、チャネル開放時間とチャネルの活性化および不活性化の時間的経過を含めた、ある細胞特性およびあるチャネル特性を決定するために有用でもある。
細胞およびチャネルの特性は、動的モード(すなわち、立上りおよび立下り時間、反応形状における変化など)および静的モードでアッセイできる。両方のモードは、対象とするすべての事象を調べるために十分長いが、アッセイを終了するために必要なものよりも長くない、刺激列持続時間を必要とする。典型的な刺激時間は、20Hzの周波数で3秒間にわたって繰り返される、25V/cmで10msecのパルスを有する。これらのパラメータを調整することによりアッセイ時間を短縮でき、または高速および低速時間スケールでプロセスを調べることができるようにされる。
ある場合には、パルス列を繰り返すこと、または同じ細胞に対して2つの異なるパルス列を用いて測定することが、有用である。1つの例は、多数の刺激列を受ける細胞の単一プレートを用いて、刺激周波数および持続時間の関数としての反応を測定することにより、チャネルの諸特性を完全に特徴付けすることである。他の例は、反応の柔軟性(すなわち、反応の活性依存する変化)を調べることである。1つまたは複数の刺激列が反応を整え、一方、整える前または後の測定列の組が、活性に起因する変化を決定する。
本発明は、平均膜内外電位差を予め設定されている値に維持するために動的帰還ループを用いることにより、電圧クランプ装置を形成するためにも使用することができる。下で説明するように、高速蛍光出力を用いて膜内外電位差を測定し、その後で膜内外電位差のいかなる変化も補償するように刺激パラメータを変化することにより、細胞の膜内外電位差を動的に制御することが可能である。そして、その電位を維持するために必要な電流は、刺激パラメータのコンピュータ制御によって決定される。
典型的な刺激パラメータ中、約50mAのピーク電流が、電極の間の溶液中を流れる。この時間中、種々の電気化学的反応が起こり、それらの電気化学的反応は、通常、細胞にとって有毒な化学種を発生する。予備実験によって、ほとんどの哺乳動物の細胞が、通常は、ステンレス鋼電極を使用しての約2分間の電気刺激に対して正常に反応することが示されている。しかし、より長い時間にわたる延長された刺激は、細胞の健全さと生存能力を損なうことをもたらすようである。十分に高いパルス周波数では、金属−食塩水界面が水の電気分解のための電位(食塩水中のステンレス鋼に対しては約±1V)に達しないように、電流を容量的に流すことができ、それにより有毒な生成物は発生しないだろう。各電極の食塩水に接触している面積が約24mm2である、図1に示されている電気刺激器では、電極当たりの容量は約1〜10μFである(Robinson、1968、Proc.IEEE、56:1065−1071)。50mAでは、この容量は、約20〜200マイクロ秒で1Vまで充電する。これは、有用なパルス持続時間の下限である。
a.細胞タイプの選択
本発明は、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、バクテリア細胞、酵母および哺乳動物細胞を含めて、任意のタイプの細胞で使用できる。ヒトの治療のためのスクリーニングには、哺乳類の細胞系統が好ましく、そのような細胞系統は、比較的容易に成長でき、かつ高い効率で容易にトランスフェクションできる組織培養細胞系統を含む。多くの組織細胞系統は、American type culture collection(ATCC)(http://www.atcc.orgを参照)、およびEuropean collection of cell cultures(ECACC)(http://www.camr.org.ukを参照)を通じて商業的に入手できる。
対象とするイオンチャネルの発現のために配列符号で細胞をトランスフェクトするために用いられる核酸は、通常、チャネルの発現のためのヌクレオチド配列からなるコーディング領域に作動的(機能的)にリンクされている発現制御配列を含めた発現ベクターの形態である。使用されているように、「チャネルの発現のためのヌクレオチド配列コーディング領域」という用語は、mRNAの転写および翻訳により、チャネルを生ずる配列を指す。これは、例えばイントロンを包含している配列を含んでいる。ここで使用しているように、「発現制御配列」という用語は、それが作動的にリンクされている核酸配列の発現を規制する核酸配列を指す。発現制御配列は、発現制御配列が核酸配列の転写と適切であれば翻訳とを制御および規制するときに、核酸配列に作動的にリンクされる。したがって、発現制御配列は、適切なプロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、タンパク質をコードする遺伝子の前の出発コドン(すなわちATG)、イントロンのための切り継ぎ信号、mRNAの適切な翻訳を許すためのその遺伝子の正確な読出しフレームの維持、および終止コドンを含むことができる。
old Spring Harbor Laboratory、Gluzman ed.、1982)。好ましくは、真核生物宿主はここで説明するように宿主細胞として利用する。
本発明の使用による膜内外電位差変化と特定のイオンチャネルのコンダクタンスの測定とは、膜内外電位差またはイオンの運動の既知の測定手段のいずれかを用いて検出できる。それらの方法は、例えば、パッチクランピング(Hamilleら、Pfluegers Arch.、391:85−100、1981)、FRETをベースとする電圧センサ、エレクトロクロミック・膜内外電位差染料(Cohenら、Annul Reviews of Neuroscience、1:171−82、1978)、膜内外電位差再分配染料(Freedom and Laris、Spectroscopic membrane probes Ch 16、1968)、細胞外電極(Thomasら、Exp.Cell Res.、74:61−66、1972)、電界効果トランジスタ(Fromherzら、Science、252:1290−1293、1991)、放射性フラックスアッセイ、イオン感応性蛍光またはルミネッセント染料、イオン感応性蛍光またはルミネッセントタンパク質、内生タンパク質の発現またはリポーター遺伝子または分子の使用を含む。
1つの様相では、本発明は、生きている細胞の膜内外電位差を電気刺激を通じて変調する方法と、ほぼ任意のイオンチャネルまたはトランスポーターシステムの活性度をアッセイするためにそれらの方法を使用することを含む。
i.ナトリウムチャネルのアッセイ
哺乳類の電位依存ナトリウムチャネルの各種のアイソフォーム(isoform)が特定され、下の表1に要約されている。これらのチャネルは3つの主な群に分類できる(総説として、Goldwin、Annals N.Y.Academy of Sciences 868:38−50、1999を参照)。
(2)活性化された状態。この状態ではチャネルは開き、イオンは通ることができる。ナトリウムの細胞内濃度は、正常な休止している細胞では低く、細胞外濃度は高いので、ナトリウムイオンは細胞内に流れ込み、膜内外電位差をより一層正に駆動する。開放状態の寿命は短く、一般に1ミリ秒のオーダーである。その後でそれは不活性状態に入る。
(3)不活性状態。この状態ではチャネルは閉じられていてイオンはチャネル
を通ることができない。チャネルはひとたび不活性状態になると、直接は開くことはできない。それはまず休止状態になる。これは、膜内外電位差が数ミリ秒の間、非常に負(一般に−80mVより下)に保持されると起きる。それら3つの状態の間の遷移のための時定数と閾値電位とは、チャネルのサブタイプの間で非常に大きく変化する。
好適な細胞は、対象とするイオンチャネルの活性閾値より上の休止膜内外電位差を持つものを含み、そのような細胞では、他のイオンチャネルは発現されない。これらの基準に合致する細胞は、CHL細胞とLTK(−)細胞を含む。目標イオンチャネルを選択した後で、細胞は、トランスフェクトされクローンがIII節で説明したように選択される。あるいは、対象とするチャネルと低レベルでの他のチャネルとを内生的に発現する細胞系統を使用できる。例えば、CHO−K1細胞系統は電圧ゲートナトリウムチャネルと、非常に低いレベルの他のチャネルとを発現する。細胞は、IV節に説明されているように、電気刺激を開始する前に、マルチウェル微量滴定プレートに付着され、培養され、電圧感応性染料で染色される。最初の実験は、通常、各ウェル内に等しい数の細胞を有する96ウェルマルチウェルプレートで行われる。一般に、8個のウェルの行が同一の条件の下に同時に電気的に刺激されて、細胞の反応の変化について統計的に重要なデータを提供する。
好適な細胞は、対象とするイオンチャネルの活性化閾値より下の休止膜内外電位差を持つものを含み、その細胞では、他のイオンチャネルの発現は少数の特徴付けされているイオンチャネルタイプに大きく限られる。このタイプの細胞は、HEK−293細胞およびRBL細胞と、F11細胞とHL5細胞を含む。目標とするイオンチャネルの選択の後、上述したように、細胞は、対象とするイオンチャネルでトランスフェクトされ、クローンが選択される。あるいは、F11細胞とHL5細胞の場合におけるように、内生的なナトリウムチャネルを使用できる。選択および特徴付けの後で、上記のように細胞クローンがマルチウェル微量滴定プレートに付着され、電圧感応性染料で染色される。前のように、最初の実験は、典型的には、各ウェルに等しい数の細胞がある、96ウェルマルチウェル
プレートで行われる。一般に、8つのウェルの行が同一の条件の下で同時に刺激されて、細胞の反応の変化についての統計的に重要なデータを提供する。
電位依存カリウムチャネルは、動作電位消極の後で、神経細胞および筋肉細胞を再び分極する。それらは、神経、筋肉、分泌器官および排出器官においても重要な調整役割を演じる。ほとんどの細胞は、高い細胞内カリウム濃度を積極的に維持するので、カリウムに対する反転膜内外電位差は、およそ−90mVである。カリウムは、通常、細胞から流れ出るので、よりカリウム選択性のチャネルを開くと、膜内外電位差を一層正へと通常は駆動するナトリウムチャネルの開放と対照的に、膜内外電位差を一層負へと駆動しようとする。
(i)電圧規制されたカリウムチャネル
カリウムチャネルは外向き電流を生ずるので、チャネルの活性化は、負の膜内外電位差変化を生じる。生理学的諸条件の下では、カリウムの反転電位は−90mVくらいである。電位依存カリウムチャネルのみを発現している細胞は、活性化閾値に近い休止電位を一般に有するので、直接刺激は、約−50mVより上の活性化閾値を持つそれらの電位依存カリウムチャネルに対して働きかけねばならない。膜内外電位差の小さな負の偏移(40mVの変化より小さい)をFRET電圧感応性染料を用いて確実に検出できるが、より大きい信号で高いスループットのスクリーニングを行うことがしばしば好ましい。
にして、一般に、実行される。
それの名称とは反対に、内向きレクチファイヤチャネルの機能は、カリウムを細胞内に入れないようにすることである。カリウムの内向きの流れは、(1)膜内外電位差がカリウム平衡電位より下に降下したとき、または(2)細胞外部のカリウム濃度が上昇するとき、にのみ生ずることができる。いずれの状況も通常は起きない。その理由は、(1)正常な生理学的諸条件の下では、カリウムは最も負の反転電位を持つイオンであるので、どのイオン電流も電位をカリウム反転電位よりも一層負に駆動できず、(2)病理学的諸条件下を除いて、細胞外部のカリウム濃度は厳しく制御される、からである。しかし、電気刺激を用いると、細胞膜の部分をVKより下に駆動できて、カリウムイオンの細胞内への入り込みを促進する。これによって膜内外電位差は正味の正変化を起こさせられ、それは正信号として検出できる。内向きレクチファイヤのブロッカーについてのアッセイを行いかつ最適にするために、したがって、下記の手順に従うことができる。
この方法は、対象とする電位依存カリウムチャネルを発現し、かつ電位依存ナトリウムチャネルも発現する細胞系統の使用を含む。この方法では、やり方は、電位依存ナトリウムチャネルを特に活性化するために構成されている電気刺激プロトコルを使用することである。この場合には、電気刺激は、ナトリウムイオンを細胞内に入らせて、正電圧変化を起こさせる。対象とするカリウムチャネルが存在することにより、カリウムイオンが細胞を離れることができるようにすることによって、ナトリウムチャネルの正の反応が抑制される傾向が生じる。アッセイは、試験化学薬品がカリウムチャネルをブロックするときに外向き電流が存在しないことを利用することにより、ナトリウムチャネルの活性化により通常引き起こされる大きな正電圧反応を回復する。電流の平衡の最適化は、アッセイがカリウムチャネルの閉塞に敏感であることを確保するために、この方法では重要である。ナトリウム電流がカリウム電流に対して小さすぎるとすると、カリウムチャネルブロッカーについての服量反応曲線は、より高い濃度へ向かってシフトする。例えば、カリウム電流がナトリウム電流より100倍大きいという極端な場合には、ナトリウム電流から50%の反応を得るためには、カリウムシャネルの99%をもブロックしなければならない。
カルシウムチャネルは、多くの細胞内で一般に見出され、その細胞内では、他の機能のうちで、信号形質導入という重要な役割を演ずる。励起可能な細胞では、細胞内のカルシウムは、長い消極反応のために維持された内向き電流を供給し、消極機構とその他の細胞内部信号形質導入機構との間のリンクとして作用する。電圧ゲートナトリウムチャネルのように、電圧ゲートカルシウムチャネルは、多数の休止、活性および不活性状態を有する。
Nature 350:398−402]。
塩化物チャネルは、体内のほぼあらゆる細胞の原形質膜中で見出される。塩化物チャネルは、膜内外電位差の規制と、上皮膜を横切るイオンの吸収および分泌を含めた、各種の細胞機能を仲介する。ゴルジ装置および細胞内分裂小嚢の細胞内膜中に存在するときは、塩化物チャネルは、細胞小器官pHの調整もする。総説として、Greger,R.(1988)Annu.Rev.Physiol.50:111−122を参照。
配位子依存イオンチャネルファミリーは大きくて多様である。配位子依存イオンチャネルは、特定の分子の結合に反応して開く。それらは、典型的には、ニューロンの間と、ニューロンから筋肉細胞へとの高速シナプス伝達を仲介する。それらは低速シナプス伝達も仲介し、種々の調整機構を制御する。配位子ゲートイオンチャネルは、一般に、電荷選択的なだけである。すなわち、それらはある範囲のアニオンまたはカチオンの流れを許すが特異性は持たない。それらは活性、脱活性、および感度低下キネティクスにおいて数多くの変形を有し、それらのすべてはミリ秒以下から秒までの時定数まで変化できる。
多くのチャネルは、遅い、または電圧で活性化されないコンダクタンス変化を有する。主要な例は、包嚢繊維症に関連させられているチャネルのいくらか、特に包嚢繊維症トランスメンブレンレギュレーター(CFTR、塩素チャネル)、上皮ナトリウムチャネル(ENaC)および4TMカリウムチャネルファミリーメンバー(Wangら、Ann.N.Y.Acad.Sci.868:286−303、1999)である。それらのチャネルのいずれかにアゴニストとして作用する小さい分子は、包嚢繊維症を緩和する薬品の候補である。現在、この型のチャネルに対する便利に動作できる高スループットのスクリーニング法はない。
b.膜抵抗値の定量的測定
電気刺激が終わった後で、細胞の膜内外電位差は新しい休止電位に緩和する。電位依存チャネルのアッセイでは、チャネルは、一般に、閉じているか不活性であり、最終的な休止平衡電位は、刺激前と同じである。ほとんどの場合には、膜容量に蓄積される電荷は、膜の抵抗値を通じて指数関数的に散逸する。膜の時定数は、簡単にいえば、膜の容量と膜の抵抗値との積、すなわちτm=RmCmである。それは、膜の容量と膜の時定数を測定することにより容易に決定できる。
不活性イオンチャネルを開くには、膜内外電位差を閾値より下に数ミリ秒のオーダーの時間、保持することを要する。この不活性からの解放は、重要な生理学的意味を持つ。例えば、不活性からの解放は、動作電位の後戻り伝播を阻止する御し難い期間を強制して、ニューロンの最高興奮率を制限する。この性質の薬理学的取扱いは治療的に関連する。
開放チャネル時間τopenは、チャネルの不活性特性の関数である。非常に高い周波数で刺激することにより、このパラメータの薬理学的取扱いを、中から高程度のスループットモードで検出できる。例えば、多重刺激法を用いる電位依存ナトリウムチャネルのアッセイについて考えることにする。定常レートで繰り返される固定した単相方形波刺激カーネルでは、電圧反応は、刺激繰り返し率が高くなるにつれて増加する。その理由は、より高い周波数では、ナトリウムチャネルが、開放している時間をより多く過ごすからである。しかし、パルス同士の間隔がチャネル開放時間よりも短くなるとすると、活性化されたナトリウムチャネルは負へ駆動されるので、以後の刺激パルスによって不活性にされる。反応が平坦になる刺激バースト周波数はチャネル開放時間に関連する。
全細胞記録において、電流クランプは、膜内外電位差を記録している間に指令電流を細胞内へ駆動できるようにするモードである。パッチクランプ記録は極めて正確ではあるが、スループットが非常に小さい技術である。完全な条件の下における絶対最大数で、高度に訓練された科学者は、細胞のパラメータを1時間当たり細胞10個の率で決定できる。しばしば、パッチクランプ技術で得られる詳細のレベルは、薬品のスクリーニングのためには必要ではないが、その詳細さを速さと置き換える方法は現在のところない。大規模な化合物ライブラリをスクリーニングするためには、高い速度は絶対に重要である。
電圧クランプでは、細胞の膜内外電位差は、電流の流れをモニタしている間に制御される。電圧クランプは、フィードバックループを電流クランプ回路に加えることによって、一般に達成される。全細胞法の場合には、これは、同じ細胞に同時に取り付けられている2つのピペットを用いて容易に達成できる。1つのピペットは指令電流を通し、他方は電圧を検出する。フィードバック回路が測定電圧を指令電圧と比較し、それに従って指令電流を調整する。一般に、細胞膜抵抗値はピペットのアクセス抵抗値と比較して高いので、同じピペットを用いて電流を指令し、電圧を測定できる。電流クランプと比較して、電圧クランプは、一般に、電気生理学的分析のためのより強力な方法である。イオンチャネルは膜内外電位差に極めて敏感であるので、データの分析は、固定されている電圧での電流測定を取り扱うときには、はるかに直接的である。
ここで説明している刺激法は、ミトコンドリアおよび核を含めて、リン脂質膜を有する細胞内オルガネラの膜内外電位差を変調するために使用することもできる。これは、電気的透過性により、またはバリノマイシンあるいはグラミシヂンAなどのイオン透過担体を加えることにより、まず原形質膜のコンダクタンスを上昇させることにより達成できる。そうすると、細胞内空間が、もはや、加えられている電界から分離されない。これによって、食塩水に加えられた電界は、細胞内オルガネラの膜を横切って膜内外電位差の変化を生じさせることができるようになる。その後で、イオン濃度または膜内外電位差に敏感で、対象とする特定のオルガネラ膜にのみターゲットにされている染料で細胞を染色することにより、ここに提示した方法を用いて、それらのオルガネラのイオンチャネルを変調およびアッセイできる。ターゲットにすることは、例えば、この技術で知られている適切な細胞下位置信号を含んでいる天然の蛍光タンパク質の使用を通じて達成できる。
哺乳類の細胞膜の絶縁破壊は、膜の両側の電位が約200mVを超えると起きる(Teissie and Rols、1993、Biophys.J.65:409−413)。膜が絶縁破壊すると、膜を通じて孔が形成されて、細胞内部空間と細胞外部空間を結び付ける。孔の数と大きさは膜内外電位差の上昇とともに増大する(Kinoshita and Tsong、1977、Nature 268:438−441)。典型的な哺乳類の細胞系統に加えられる電界の強さが約60V/cmより強くなると、細胞は電気的に透過できることになる。比較的低い電界では、小さいイオンを通すのに明らかに十分大きいが、DNAほどの大きさの分子を通すには十分大きくない、小さな穴が細胞膜に形成される(Tsong、1991、Biophys.J.60:297−306)。これらの孔は、細胞を全面的に消極して、膜内外電位差をゼロ近くに駆動する。細胞を電気的に透過できるようにし、電圧感応性染料で膜内外電位差の変化をモニタすることによって、本発明は、細胞の休止膜内外電位差を決定するために使用できる。これは、一次スクリーニングまたは二次スクリーニングとして、細胞またはイオンチャネルとの薬理学的相互作用を決定するのに有用である。例えば、電位依存ナトリウムチャネルに対する化合物スクリーニングにおいて、チャネルの活性度を決定するために、多数の刺激プロトコルを実行できる。その後で、透過プロトコルで従うことによって、細胞膜が化合物が存在する中で正常な休止電位を持っていたか否かを決定できる。
a.薬品スクリーニング
本発明は、従来のアッセイ装置よりもはるかに多用途でロバストな、イオンチャネル機能を変調する試験化合物の確実な検出を行う。重要なことに、本発明は、パッチングクランピングにおけるような、薬理学的試薬、または膜の破壊、および細胞内内容物の喪失の要求なしに、損なわれていない細胞内の膜内外電位差を変調する性能を提供する。生きている細胞の膜内外電位差を外部で変調する性能を提供することにより、本発明は広範囲なイオンチャネルのアッセイを可能にする。
である。
ひとたび特定されると、候補モジュレーターは、選択性および毒性作用を既知の方法を用いて評価されることができる(Lu、Basic Toxicology,Fundamentals,Target Organs,and Risk Assessment,Hemisphere Publishing Corp.、Washington(1985);Culbrethに付与された米国特許第5196313号(1993年3月23日発行)およびBenetに付与された米国特許第5567952号(1996年10月22日発行)を参照)。
法を有する。
候補モジュレーターの有効性は、生体外(in vitro)法、動物モデルまたはヒトの臨床試験などのこの分野で認識されているいくつかの方法を用いて確立できる(Creasey、前掲(1979)を参照)。認識されている生体外モデルは、いくつかの疾患すなわち異常に対して存在する。例えば、HIVに感染している生体外の細胞の寿命を延長するための化学薬品の効能は、HIV感染すなわちエイズを治療するために効果があると予測される化学薬品を特定するための許容できるモデルとして認識されている(Dalugeら、Antimicro.Agents Chemother.41:1082−1093(1995)を参照)。さらに、生体外のT細胞の増殖を阻止するためのシクロスポリンA(CsA)の効能は、免疫抑制剤として効果があることが予測される化学薬品を特定するために許容できるモデルとして確立されている。(Sauthanthiranら、前掲(1996)を参照)。ほとんどあらゆる種類の治療、疾患または症状に対して、許容できる生体外モデルまたは動物モデルを利用できる。それらのモデルは、例えば、胃腸の異常、癌、心臓学、神経生物学、および免疫学のために存在する。また、それらの生体外法は、候補モジュレーターに対する代謝の影響の確実な指標を与えるために、ミクロソーム標本などの肝臓の標本などの、組織抽出物を使用できる。同様に、許容できる動物モデルを種々の疾患および症状を治療する化学薬品の有効性を確立するために使用できる。例えば、ラビットの膝は、関節炎の治療に有効な化学薬品を試験するための受け入れられるモデルである(Shaw and Lacy、J.Bone Joint S
urg.、(Br)55:197−205(1973)を参照)。関節炎の治療のためにヒトに使用することが承認されているヒドロコルチゾンは、このモデルの有効性を裏付けるこのモデルにおいて有効である(McDonough、Phys.Ther.62:835−839(1982)を参照)。候補モジュレーターの有効性を判定するために適切なモデルを選択する場合は、当業者は、適切なモデル、用量、投与経路、養生法および終点を選択するために、技術の現状を頼りにすることができ、したがって、過度に負担が掛かることはない。
上記のin vitro法およびin vivo法は、候補モジュレーターの選択性をも定める。本発明は、候補モジュレーターの特効性を判定する迅速な方法を提供するものである。例えば、関連するイオンチャネルファミリーメンバーを含んでいる細胞系統を用いて、関連するイオンチャネルを阻害する効能と、イオンチャネルの異なる電位依存状態を変調する相対的な性能との両方に関して、試験化学薬品の選択性を迅速にプロファイリングすることができる。そのような装置は、最初に、簡単で微小化された高スループット態様で、候補モジュレーターのイオンチャネル選択性を系統的に評価するために、多数の試験化学薬品を迅速にプロファイルする性能を提供する。
本発明は、新規な化学物質などの組成品と、ここで説明している方法、装置または成分の実施による活性を有するものとして本発明の少なくとも1つの方法により特定される治療とを含む。新規な化学物質は、ここで使用されているように、この出願の出願日における技術で既に公然と知られている化学物質は含まない。通常は、化学物質は、本発明を使用することから活性を有することが示され、その後で化学構造の専用のあるデータベースからその構造が明らかにされ、または質量分光分析などの分析技術からその構造が決定される。
ビニルロガスポリペプチド(Hagiharaら、J.Amer.Chem.Soc.114:6568(1992))、β−D−グルコースのスカフォールディングを有するノンペプチダルペプチドミメチック(Hirschmann,R.ら、J.Amer.Chem.Soc.114:9217−9218(1992))、小規模な化合物ライブラリの類縁有機合成(Chen,C.ら、J.Amer.Chem.Soc.116:2661(1994))、オリゴカルバメイト(Cho,C.Y.ら、Science 261:1303(1993))および/またはペプチジルホスホナート(Campbell,D.A.ら、J.Org.Chem.59:658(1994))。一般に、Gordon,E.M.ら、J.Med.Chem.、37:1385(1994)を参照されたい。前記公開公報のすべての内容は参照により本明細書に組み込まれている。
る。糖衣錠のコアには適切な被覆が設けられる。このために、濃縮された砂糖溶液を使用できる。その砂糖溶液は、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル、ポリエチレングリコールおよび/または二酸化チタンと、ラッカー溶液、および適切な有機溶剤または溶剤混合物とを所望により含む。活性化合物用量の種々の組合せの特定または特徴付けのために、染料または顔料を錠剤や糖衣錠の被覆に添加できる。このために濃縮砂糖溶液を使用できる。濃縮砂糖溶液は、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル、ポリエチレングリコールおよび/または二酸化チタンと、ラッカー溶液、および適切な有機溶剤または溶剤混合物を所望により含む。活性化合物用量の種々の組合せの特定または特徴付けのために、染料または顔料を錠剤や糖衣錠の被覆に添加できる。そのような調合は、この技術で知られている方法を用いて行うことができる(例えば、米国特許第5733888号(注射できる組成物)、第5726181号(貧水溶性化合物)、第5707641号(治療に活性なタンパク質またはペプチド)、第5667809号(親油性の物質)、第5576012号(可溶性ポリマー物質)、第5707615号(抗ウィルス製剤)、第5683676号(微粒子状薬物)、第5654286号(局所剤)、第5688529号(経口懸濁液)、第5445829号(徐放性製剤)、第5653,987号(液体製剤)、第5641515号(放散が制御された製剤)および第5601845号(球状製剤)参照)。
本発明は添付した実施例を参照すると一層良く理解できる。それらの実施例は示すことだけを目的とするものであって、ここに添付されている特許請求の範囲で定められている本発明の範囲を限定するものとは、いかなる意味においても解してはならない。
種々の電極とウェルの設計との作用を解析するために、電界の一連の二次元数値シミュレーションを、ソフトウェア解析パッケージQuickfield(商標)4.1(Student’s Version、Tera Analysis、http://www.tera−anaiysis.com)を用いて生成した。このソフトウェアパッケージは、二次元での有限要素解析法でポアソンの方程式を解くことによって目の粗い網型の電界強度マップを生ずる。この解析のために、電界の底とウェルの底の間の間隙に起因する端効果は無視し、電極から食塩水までの電圧降下も無視できるものと仮定した。モデルの空間分解度は約0.5mmである。
標準の直径6.2mmのウェル内部に置かれて、4.0mmの距離で隔てられている、直径1.0mmの2本の丸ピン電極について予測される電界の一様性を決定するために、実施例1において説明したのと同じ条件および同じ仮定でシミュレーションを行った。
図8Aは、6.2mmの正方形ウェル内部の4mmの間隙を持つ2枚の6mm幅の平行プレート電極の電界プロファイルのシミュレーションを示す。この図で、外側の正方形(800)はウェルの縁部である。2本の垂直線(810)は電極である。中間の破線の円(820)は観察領域である。特に注目すべきことは、電界の強さの変化に対比を付けるために、図8の電界のスケールが、図7と比較して非常に大きくされていることである。灰色の領域(840)は電界が観察領域内の平均電界の±1%以内に維持される領域である。白い領域(830)では、電界は平均の1%よりも小さい。このシミュレーションでは、平均電界の1%よりも大きい電界のある点はない。観察領域内では、電界の強さの標準偏差は平均の0.02%であり、最大電界と最小電界の間の差は平均の0.12%である。したがって、この構成は電界の一様性を極めて大きく改善する。
図8Bは、図1において説明した標準の状態と解析手順を用いて、6.2mmの直径の円形ウェル内部の4mmの間隙を持つ2枚の4mm幅の平行プレート電極の電界プロファイルのシミュレーションを示す。図9Aに示されているように、絶縁体が電極に取り付けられて、電極の間のウェルの丸くされている領域を覆い隠す。図8Bで、外側の円(802)はウェルの縁部である。2本の垂直線(812)は電極である。中間の破線の円(822)は観察領域である。クロスハッチされている領域(862)は電極に取り付けられている絶縁体である。灰色の領域(842)は、電界が観察領域内の平均電界の±1%以内に維持されている領域である。白い領域(832)内では、電界は平均の1%よりも小さい。このシミュレーションでは、平均電界の1%よりも大きい電界のある点はない。観察領域内では、電界の強さの標準偏差は平均の0.2%であり、最大電界と最小電界の間の差は平均の1.0%である。したがって、この構成は、絶縁体が使用されていない場合よりも電界の一様性を極めて大きく改善するが、正方形ウェルの場合におけるほど大きくはない。
ウェルの湾曲している縁部内への電流の損失をサテライト電極の使用によって補償することが可能かどうかを試験するために、各種の電極構成でシミュレーションを行った。図9Bはこの概念の1つの可能な実施形態を示し、図8Cはこの構成が、実施例1で説明したQuickfield(商標)を用いて解析されたときの電界プロファイルを示す。この実施例では、余分の0.7mm幅の平行平板電極の2対を2mm間隙をおいて設けた。それらの電極は観察領域の外部にあって、それの親電極の電位の半分に保たれていた。
ウェル内に挿入されたときにディッパー電極により形成されるメニスカスは、観察領域にわたってほぼ10%の生理的食塩水の深さを変化させる。そうすると観察領域にわたってほぼ10%の電界変化が生ずる。それらの変化は、電極の設計が完全な電界一様性を生ずると予測されていたとしても存在する。したがって、メニスカス効果を解消すると実際の電界一様性が改善される。これを行う1つの可能な方法は、電極の間に絶縁バリアを付加することである。図9Cは、1つのそのような実施形態を示すものであって、絶縁バリアが、ウェル内の液体に対して平らな上表面を形成するために用いられている。このバリアの底が、電極がウェル内に挿入されたときに、ウェルの底の約2.5mm上に位置するように設計されている。したがって、バリアは、生理食塩水中に部分的に浸され、それの底面が、導電性の室の上部を平らに、かつ電極表面に垂直に画定する。このようにして電界は、導電性容積の表面の凹凸によって乱されることはない。
電気刺激器の一実施形態では、装置は、ディッパー電極を96ウェルマルチウェルプレート形態におけるウェルのアレイ中に配置する自己位置決めフレームで構成されている(図1)。図1は電極アレイの挿入された位置を示す。この例では、電気刺激装置は、3つの機能部品から製作できる。第1の部品は、装置をプレートウェルに対して配置する位置決めフレーム(40)である。このフレームは金属で製作され、マルチウェルプレートにぴったりはめ込まれる。このフレームは、装置の第2の機能部品すなわち引き込み機構の位置決め基準として機能する。
野生型のチャイニーズハムスターの卵巣細胞(CHO細胞)は、電位依存ナトリウムチャネルを内生的に発現し、電気刺激パラメータの妥当性検証と最適化のために便宜に使用できる。このナトリウムチャネル以外に、それらの細胞は、付近の細胞との間の間隙接合接続と、非常に小さい(〜20pA)電位依存外向き電流を有するように見える。
刺激パルスの幅と周波数が変えられた際の細胞反応の挙動を調べるために、上で実施例8において説明したように野生型CHO細胞を用いて、一定の電界強さ25V/cmで、パルスの持続時間と周波数を変化させて実験を行った。
VI節で説明したように、電位依存ナトリウムチャネル(以後、NaV2と呼ぶ)をコードするプラスミドでチャイニーズハムスターの卵巣細胞を安定にトランスフェクトした。電気刺激による分析前に、このチャネルの電気生理学的特性および薬学的特性を確認するために、細胞全体のパッチクランプ分析を用いた。−20mVにおけるピーク過渡ナトリウム電流は、600±300pA(N=5)で、平均細胞膜容量は15±5pFであると測定された。静止細胞膜抵抗値は、高すぎて正確に測定することができなかった(RL>10GΩ)。休止膜内外電位差は−31±3mVであった。
ナトリウムコンダクイタンス
いかなる特定の作用機構にもしばられることなく、不活性からの解放の実効的な時間および開放チャネルコンダクタンスの定量的な評価を行うために、実験的検証のために下記の理論を発展させた。
野生型HEK−293細胞は、通常、種々の内因性のカリウム電流および塩化物電流を発現するので(Zhuら、1998、J.Neurosci.Meth.81:73−83)、それらの細胞の休止膜抵抗は5〜10GΩである。その結果、それらの細胞の膜時定数は、対応してより小さいために、細胞を最適に刺激するためには、匹敵する信号を発生するために、内因性カリウムチャネルのない細胞と比較して、電気刺激プロトコルを比較的より高い周波数で繰り返すべきであることが予測される。
この方法を広い範囲の種々のナトリウムチャネルに一般に適用できるかどうかを判定するために、HEK−293細胞を別の電位依存ナトリウムチャネル、以後NAV4と呼ぶ、で安定にトランスフェクトした。それらの細胞をVI節および実施例8で説明したように、トランスフェクトし、選択し、FRET染料でロードした。このチャネルでのテトラカインについての用量反応曲線の結果を図20に示す。ここでは、データ点は、8つのウェルでの平均と標準偏差であり、実線は、見積もられたEC50=35μMおよびヒル係数1.35でのヒル関数へのフィッティングである。それらの結果は、このイオンチャネルの既知の薬理学と矛盾せず、細胞反応が主としてナトリウムチャネルの活性により引き起こされることを再度示している。
電位依存塩化物チャネルと電位依存カリウムチャネルの直接刺激の実証を野生型HEK−293細胞を用いて行った。それらの細胞は、いくつかの電圧で活性化された塩化物チャネルおよびカリウムチャネルの混合したものを内生的に発現する(Zhu,Zhangら、1998)。野生型細胞は、96ウェル微小滴定プレート内で成長させられ、付録A1におけるプロトコルに従って、FRET染料で染色された後、コンフルエンスで(at confluence)でアッセイされた。最初の刺激パラメータは、20Hzでの、パルス持続時間が約5ms/相の二相方形波刺激電気カーネルでの3秒の長さの電気刺激を含んでいた。刺激は、変化する電界強度で行って、カリウムチャネルブロッカーが存在する間または存在しない間に、測定可能な細胞反応についての閾値電界強さを決定した。
図21は、この実験中に得られた細胞電圧反応を示す。この図では、各パネルは、単一のウェルについての反応の10秒時間トレースを含む。パネルは、プレート上でのそれらの相対位置に合致するように配置されている。各パネルの垂直軸は、FRET電圧感応性染料の組合せCC2−DMPE/DiSBAC2(3)の、バックグラウンドを除去して正規化した蛍光比である。この量の変化は、膜電位の変化にほぼ比例する。各列は、同一の刺激条件を有し、プレートを横切って左から右へ電界の強さが増大している。96ウェルプレートの12列目(示されていない)は細胞を含んでおらず、バックグラウンド除去のために使用された。行6〜8は、電位依存カリウムチャネルをブロックするために、10mMのTEAを含んでいた。試験した最小の電界強さでは、検出可能な反応はなかった。中間の電界では、刺激が除去されたときに、迅速に減衰する負電圧反応を見ることができる。最高電界では、大きな正の反応が顕在化している。この挙動は、50V/cmより上で始まる。これは、NaV1を発現するCHO細胞で見られる電気透過化閾値(実施例8)に類似する。
提案されているいかなるスクリーニング装置も、受け入れられた方法により決定された既知化合物の薬理学を再現することができるべきであることが好ましい。これが本発明の場合であったことを検証するために、定められた活性の一連の試験化合物を、NaV2チャネルを発現するCHO細胞系統を用いて分析した。これを行うために、細胞を96ウェルプレートで培養し、付録A1に述べられているように電圧感応性染料で染色した。試験化合物をオキシノールローディング緩衝液とともに細胞に加えた。特に記載がなければ、化合物は、アッセイプレートの11の列にまたがって1/3希釈して、8の繰り返しとして試験した。
我々は1Hzの刺激周波数でチャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)に対する内在性NaVチャネルに対するいくつかの知られたチャネルブロッカーの使用依存性効果の特徴付けを実証する。我々のデータは電界刺激と高速電圧感受性染料とを組み合わせれば、使用依存性ブロックを引き起こして、測定する有効なアプローチが得られることを裏付けるものである。さらに、この方法により決定された試験化合物の力価および使用依存特性は、パッチクランプ技術を用いた同じチャネル型について報告されたものと一致する。この新しい技術は新規の使用依存性化合物の検出および特徴付けの高速化を可能にする。
高スループットスクリーニングの目的のためには、反応は、活性化合物と不活性化合物との間の違いを確信をもって語るために十分に信頼できるものでなければならない。これは、同一の刺激条件の下で得た反応の分布を調べ、元のチャネルを完全にブロックされたチャネルと比較することによって定量化できる。実験上の不確定性と装置内の雑音のために、反応にいくらかの乱れが存在するであろう。我々はこの乱れを統計的に定量化し、偽陽性または偽陰性として反応を誤って識別する確率を予測するためにそれを使用したい。
それを行うために、NaV2電位依存ナトリウムチャネルを発現する細胞のプレートが、FRET染料でロードされた。1列当たり1つのウェルが、1μMのTTXすなわち半遮断濃度の約200倍で、「無作為に」スパイク(spike)された。細胞は、20Hz、25V/cmの3秒バースト、5ms/相、二相刺激でアッセイされた。結果が図25に示されている。TTXでスパイクされたウェルは検出できる反応をほとんど、またはまったく生じないので、肉眼で容易に判別できる。
多数のチャネルを発現する細胞の電気刺激の可能性は、HL5細胞系統の培養を用いて示された。それらの細胞は、心筋細胞を不死化することにより発生された(Claycombら、1998、PNAS 95:2979−84)。それらは電圧で活性化されるいくつかのナトリウム、カルシウムおよびカリウムチャネルと、内向きの強い整流のカリウム電流と、カリウムおよび塩化物漏れ電流を含む。細胞は96ウェル微少滴定プレート内で成長させられ、コンフルエンスでアッセイされた。それらは、付録A1におけるプロトコルに従って染色された。電気刺激中に、上記のようにVIPR(商標)を用いて比率測定法蛍光測定を行い、データを付録A2における手順に従って解析した。刺激パラメータを:パルス持続時間が5ms/相である二相方形波刺激カーネルで、10Hzの3秒長さのバースト、であるように随意に選択した。刺激は、閾値電界を決定するために、変化する電界で行った。2行のウェルが心臓ナトリウムチャネルを部分的にブロックするために10μMのTTXを含んでおり、2行が電位依存カリウムチャネルをブロックするために、10mMのTEAを含んでいた。図27は、各ウェルの正規化された反応を示す。一般に、電界の強さが増大するにつれて、細胞の反応は大きくなる。最後の3つの列は、電圧が上昇し続けるにつれて電気的透過化の符号を示す。列6、7、8では、比は実際には出発比よりも下にはね返り、後過分極(電位依存カリウムチャネルのゆっくりとした閉鎖により引き起こされる現象)を示唆する。
表面に装着されている電極は、クロム(付着層)および金(導電層)によって誘導されたガラスカバーリップ上に用意された。金属を誘導されたカバーリップは、Thin Film Devices,Inc.社(カリフォルニア州アナハイム)により特注で製作された。カバーリップは、1インチ(25.4mm)四方で、厚さ0.17mmのCorning7059ガラス製であった。金属付着は空スパッタリング付着により行われた。クロム層の厚さは約1000オングストロームで、付着層として機能した。金層の厚さは約5000オングストロームで、導電層として機能した。付着された金属の抵抗率は、0.1Ω/平方より小さかった。耐薬品性ポリマー(S1400−27、Shipley Co.、Marlborough MA)によって金属の表面を手作業で覆い、その後、
金エッチング剤TFAで金属層を5分間エッチングし、それに続いてクロムエッチング剤TFD(Transene Co.、マサチューセッツ州ダンバース)で5分間エッチングすることにより、金属に4mmの間隙をエッチングで形成した。カバーリップは、96ウェルプレートの底にシリコーンエラストマー(Sylgard 184(Corning)、70℃で90分間硬化した)で取り付けられた。30分間の365nmのUV放射で滅菌し、細胞付着分子ポリ−D−リシンを付着した後で(分子量300,000、Dulbeccoのリン酸塩で緩衝された食塩水中で1mg/mLで30分間浸し、その後で蒸留水で3回リンスした)、生きている細胞を電極表面上で成長および培養することに成功した。
ラット好塩基球性白血病(RBL)細胞は、カリウム内向きレクチファイヤチャネルIRK1を内生的に発現する(Wischmeyerら、Pfluger Arch.429:809−819、1995)。このチャネルは、カリウムイオンを選択的に導き、高い非線形コンダクタンス特性を持つ。コンダクタンスはカリウムの反転電位VK以下ではほぼ直線形であり、VKよりおよそ10mV正で始まってゼロ近くまで降下する。多数の内向きレクチファイヤチャネルを発現している細胞は、VKの数ミリボルト以内である休止膜内外電位差を有する傾向にある。
多くの電気生理学的試験では、パルス対実験を用いて電圧不活性化からのおよびチャネルブロッカーのブロッケードからの電圧ゲートイオンチャネルの回復が特徴付けられてきた。典型的には、電圧ゲートチャネルは、数ミリ秒〜数十秒の種々の中間パルス間隔(すなわち回復時間)によって分割された2つの連続的な活性化電圧段階の連続によって活性化される。次いで、不活性化チャネルからのブロッカーの解離速度は、第1および第2のパルス段階に関する不活性化された2つのピーク電流と回復時間tとの比から推定することができる。この関係は一般に、単一または2つの指数方程式と最も適合する:
第2のパルスのINa/第1のパルスのNa=A1指数(−t/τfast)+A2指数(−t/τslow)+A3
式中、A1、A2、A3は定数を表し;τfastおよびτslowは早い回復および遅い回復についの時定数である。
a.試験化合物の解離定数
b.以下のブロックからの化合物の回復の周波数依存性
・ 使用非依存性ブロック
・ 使用依存性ブロック
c.化合物の回復の濃度依存性
図34および35はNaVsおよび知られている使用依存性のNaV拮抗体を用いたパルス対プロトコルの適用を示している。図34Aは使用非依存性ブロックおよび使用依存性ブロックからのチャネルの回復を試験するための刺激プロトコルの一例を示している。Δtは2つのパルス列間の時間間隔を表す。図34Bはパルス列の時間間隔が0.5秒におけるテトラカイン(Tetracaine)およびラモトリジン(Lamotrigine)からの濃度依存性の回復を示す。0.5秒の休止期間によって分けられた10Hzの2つの単相パルス列を用いて、Nav1.8を発現する細胞を刺激した。各パルス列は3ms、80Vp−p単相パルスとした。ブロックからのチャネルの回復は、パルス列の各々によって誘起される2つの第1のピーク蛍光反応の比によって決定した(第2ピーク/第1ピーク)。1は完全な回復を示す。このデータはラモトリジンブロックからのチャネルの回復は0.5秒Δtで試験したラモトリジンの濃度に大きく依存しているわけではないことを証明している。対照的に、テトラカインからのチャネルの回復は、図35に示したテトラカインの濃度に強く依存していることを示している。
異なる時間間隔Δtを用いたブロックからのチャネルの回復もラモトリジンおよびテトラカインについて考察した。図36Aは時間間隔が異なる50μMにおけるラモトリジンブロックの結果を示し、図36Bは時間間隔が異なる4μMにおけるテトラカインブロックの結果を示す。
図38はAδ型またはC型ニューロンのスライス標本においてブピバカインおよびリドカインによって発射周波数が低減することを示している。ブピバカインおよびリドカインによるTTX抵抗性のNavチャネルの使用依存性ブロックのために、ニューロンのスライス標本では発射速度は遅くなっている(Scholzら、1998)。この効果は高周波数の単相パルスを用いた非興奮細胞の光学的ヘキシルオキソノールアッセイによって再現することができる。
である。
電圧ゲートCaターゲットのための使用依存性化合物を検出するために、DISBAC6(3)およびCC2−DMPEなどの電圧感受性FRETプローブなどの高速の膜電位センサを用いてアッセイを開発することもできる。以下の例示的な実施例は、96ウェルプレートと互換性のあるハードウェアを用いたN型カルシウムチャネルについてのものである。
我々は後根神経節ニューロンにおけるナトリウムチャネルの電位依存性ブロッカーの検出および定量化を可能にする光学的検出プラットフォームを用いた電気刺激に基づいた、後根神経節(DRG)ニューロンアッセイを開発した。neoratal子ラットからDRGニューロンを切り離し、FRET電圧検出用染料で染色した。次いで、このニューロンを96ウェルプレートのウェルの中央に置き、種々の濃度の試験化合物とともに事前にインキュベートした。電気刺激を与え、得られた反応をプレート読取器で記録した。次いで、試験した化合物の各々について容量反応グラフを作成した。濃度を上げたカリウムを添加してニューロンを脱分極し、さらに多くのナトリウムチャネルを不活性化状態にした。濃度を上げてカリウムを添加した前後の容量反応グラフは、関係が左方向にずれ、相応してIC50が低減していることを示している。これにより上記化合物に関する電圧または状態依存性の程度が推察される。図41は周知の2つの電位依存性ナトリウムチャネルブロッカーであるテトラカインおよびラモトリジンの、16mMのカリウムを添加した前後のデータを示している。図示のように、高カリウム濃度は細胞を脱分極させる。この化合物のブロックは電位依存性で、使用依存性活性のタイプである。左方向にずれた容量反応曲線に示したように、この化合物は脱分極した膜電位においてより高い親和性でブロックする。この例は主要なニューロンを用いたこの方法の使用も示している。
L型カルシウムチャネルは心収縮および血管平滑筋緊張において重要な役割を担う。この標的の拮抗体は高血圧および不整脈において有用であることが明らかとなっている。他の指示薬のための薬剤開発化合物はL型カルシウムチャネルのブロックを回避して、心血管の副作用を最小化しなくてはならない。我々は、DISBAC2(3)およびCC2−DMPE電圧感受性FRETプローブ存在下での電気刺激を組み入れた、L型カルシウムチャネルの拮抗体用の96ウェルプレートアッセイを開発した。
A1.電圧FRET染料の染色プロトコル
1.試薬
(a)アッセイ緩衝液#1
140mM NaCl
4.5mM KCl
2mM CaCl2
1mM MgCl2
10mM HEPES
10mMグルコース pH7.40、330mOs/kg
(b)プルロニックストック(1000倍)
乾燥DMSO中の100mg/mL pluronic 127
(c)オキソノールストック(3333倍)
乾燥DMSO中の10mM DiSBAC2(3)
(d)クマリンストック(1000倍)
乾燥DMSO中の10mM CC2−DMPE
(e)ESS−CY4ストック(400倍)
水中の200mM ESS−CY4
2.ローディングおよびアッセイプロトコル:
1.CC2−DMPEローディング緩衝液の用意。通常は、96ウェルプレートに対して、10mLの染色溶液をプレートごとに用意する。
i)等量(10μL)のクマリンストックとプルロニックストックとを試験管内で混合する。
ii)試験管内を緩やかにかきまぜながら、10mLのアッセイ緩衝液#1を試験管に加える。
ローディング濃度:10μMのCC2−DMPEおよび0.1μg/mlのプルロニック。
2.オキソノールローディング緩衝液の用意:
i)等体積(3.3μL)のオキソノールストックとプルロニックストックとを試験管内で混合する。
ii)試験管内を緩やかにかきまぜながら、10mLのアッセイ緩衝液#1を試験管に加える。
iii)かきまぜながら25μLのESS−CY4を加える。
ローディング濃度:3μMのDiSBAC2(3)、0.2μg/mlのプルロニックおよび0.5mMのESS−CY4。
iv)要求があれば、このときに試験化合物にローディング緩衝液を加える。
3.細胞をアッセイ緩衝液#1で2回すすぎ、そのたびにウェルからすべての流体を除去する。
4.100μLのCC2−DMPEローディング緩衝液を各ウェルに加える。室温で30分間インキュベートする。明るい光を避ける。
5.細胞をアッセイ緩衝液#1で2回リンスし、そのたびにウェルからすべての流体を除去する。
6.100μLのオキソノールローディング緩衝液を各ウェルに加える。
7.明るい光を避けて室温で30分間インキュベートする。直ちに使用する。
データは、460nmと580nmチャネルで測定された強度の正規化された比として、解析および報告された。それらの比を計算する過程は、以下のようにして行われた。すべてのプレートにおいて、列12は、細胞プレートで用いられている濃度と同じDiSBAC2(3)およびESS−CY4濃度のアッセイ緩衝液#1を含んでいたが、列12には細胞は含まれていなかった。各波長における強度値は、最初の(刺激前)ウィンドウと最後の(刺激後)ウィンドウで平均された。それらの平均値は、すべてのアッセイウェルにおいて、同じ時間期間にわたって平均された強度値から差し引かれた。最初のウィンドウの標本(Ri)と最後のウィンドウの標本(Rf)とから得られる比は、次のように定義される:
A3.スクリーニングウィンドウ
反応に対するスクリーニングウィンドウWは、次のようにして定義される。同一の刺激条件における多数のウェルからのデータが求められる。対照ウェルは、薬理学的に遮断されているものか、またはフル電界で刺激された、トランスフェクトされていない細胞である。あるいは、刺激されていないトランスフェクトされた細胞を使用するかもしれない。
Claims (6)
- 生物細胞上で、1以上の候補化合物の効果を試験するためのイオンチャネル活性分析方法であって、
第1の細胞の集団と、電位感知性の染料と、第1の濃度の塩化カリウムを含む溶媒と、を標本ウェルの観察エリア内に設置することと、
前記第1の細胞の集団を少なくとも1の候補化合物に曝露することと、
前記候補化合物に曝露させながら、電極を用いて前記第1の細胞の集団を電界に曝露して前記第1の細胞の集団の内外膜電位の変化を生じさせることと、
前記第1の細胞の集団の内外膜電位の変化をモニタリングすることと、
第2の細胞集団と、電位感知性の染料と、第2の濃度の塩化カリウムを含む溶媒と、を標本ウェルの観察エリア内に設置することと、
前記第2の細胞の集団を前記候補化合物に曝露することと、
前記候補化合物に曝露させながら、電極を用いて前記第2の細胞の集団を電界に曝露して前記第2の細胞の集団の内外膜電位の変化を生じさせることと、
前記第2の細胞の集団の内外膜電位の変化をモニタリングすることと、
前記第1の塩化カリウムの濃度における前記第1の細胞の集団の膜内外電位を、前記第2の塩化カリウムの濃度における前記第2の細胞の集団の膜内外電位と比較して、前記候補化合物の電位依存性を決定すること、
を含むイオンチャネル活性分析方法。 - 前記モニタリングは光学的モニタリングを含む請求項1に記載のイオンチャネル活性分析方法。
- 前記光学的モニタリングには、前記細胞の集団を含んだ観察エリアからのFRETベースの電圧センサの蛍光放出を検出することを含む請求項2に記載のイオンチャネル活性分析方法。
- 前記第2の塩化カリウムの濃度における前記第2の細胞の集団の膜内外電位と比較される前記第1の塩化カリウムの濃度における前記第1の細胞の集団の膜内外電位の割合は、前記候補化合物の電位に依存するイオンチャネルブロックを表す請求項1から3のいずれか1項に記載のイオンチャネル活性分析方法。
- 前記細胞の集団が、一次神経細胞を含む請求項1から4のいずれか1項に記載のイオンチャネル活性分析方法。
- 前記細胞の集団が、後根神経節(dorsal root ganglion)細胞を含む請求項1から4のいずれか1項に記載のイオンチャネル活性分析方法。
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