CN101730736A - 心脏折返模型芯片以及利用心脏折返模型芯片的药剂评价装置和方法 - Google Patents

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Abstract

开发出一种如下的芯片：能够以一个细胞为单位正确地测量细胞电位、细胞形态，并且通过构成适当地分散配置心肌细胞和成纤维细胞而成的闭环来构成心脏模型，能够评价药物所产生的影响。利用将一个细胞事先封入到特定的空间配置中的结构，使由配置在设置于透明基板上的透明电极上的心肌细胞和成纤维细胞形成的闭环的任意的心肌细胞或特定的心肌细胞的搏动向环的两侧传播，电性地检测闭环上的细胞的搏动状况，从而制作出在体外的心脏折返模型芯片。使药物作用于该心脏折返模型芯片，测量各个细胞的细胞电位，来评价药物对于心肌细胞的有用性或毒性。

Description

心脏折返模型芯片以及利用心脏折返模型芯片的药剂评价装置和方法
技术领域
本发明涉及一种心脏折返模型芯片(Cardiac Reentry ModelChip)以及利用心脏折返模型芯片的药剂评价装置和方法。
背景技术
在观察细胞的状态变化、细胞对于药物等的反应时常使用生物测定(Bioassay)。在以往的生物测定中，一般使用培养细胞的情况较多。由于在这种系统中使用多个细胞进行测定，因此如同一个细胞的特性那样观察细胞群的值的平均值。
但是，实际上，在细胞群中细胞周期同步的情况很少，各个细胞以不同的周期表达蛋白质。因此，在解析对于刺激的反应结果时，总是伴随着发生波动的问题。
即，由于细胞的反应机构自身存在普遍具有的反应的波动，因此常常只能得到平均的反应。为了解决这些问题，开发出同步培养等的方法，但是要使用始终处于相同阶段的细胞群就必须始终持续供给这种细胞，由此成为生物测定广泛普及的障碍。
另外，在实际情况下，对细胞的刺激(signal：信号)中存在由包含在细胞周围的溶液中的信号物质、营养、溶解气体的量所带来的刺激以及与其它细胞之间的物理接触和细胞间的相互作用所引起的刺激这两种，因此难以进行关于波动的判断。
通过以如组织碎片那样的细胞块进行生物测定来在某种程度上能够解决细胞的物理接触和细胞间的相互作用的问题。但是，在这种情况下，与培养细胞不同，无法得到始终均一的属性的细胞块。因此，存在如下问题：导致所得到的数据分散，或者信息被埋没在群中。
为了进行以细胞群的每个细胞为最小构成单位的信息处理模型的测量，本申请的发明人已经提出了一种如下结构的聚集细胞微阵列(生物测定芯片)：如日本特开2006-94703(专利文献1)所示的那样，构成用于事先将细胞封入特定的空间配置中的多个细胞培养区域，相邻的区域之间以细胞无法穿过的槽或通道相互连结，并且根据需要，在槽或通道或细胞培养区域中具有用于测量细胞的电位变化的多个电极图案。
专利文献1：日本特开2006-94703号公报
发明内容
发明要解决的问题
在以往的生物测定中，将细胞视为组织碎片进行处理，或者如培养细胞那样视为一个细胞而进行处理。如果细胞数量过多，则如上述现有技术一项所述的那样存在如下问题：导致所得到的信息成为平均信息，而无法正确地得到对药剂等的反应。在每次使用一个细胞的情况下，由于将本来作为多细胞组织的细胞而发挥功能的细胞作为分开的独立状态的细胞来使用，导致无法表现细胞之间的相互作用的影响，在得到正确的药剂反应、即生物测定数据的方面仍旧存在问题。
为了验证成为心脏搏动的基础的心肌细胞(Myocardial Cell)以及成纤维细胞(Fibroblast)的动作，开发如下的芯片非常重要：通过来自相邻的心肌细胞或成纤维细胞的搏动的传播，能够以一个细胞为单位正确地测量细胞电位、细胞形态，并且通过构成适当地分散配置心肌细胞和成纤维细胞而成的闭环来构成心脏模型，能够评价药物所产生的影响。
用于解决问题的方案
本发明提供一种如下的心脏折返模型芯片、利用该心脏折返模型芯片的药剂评价装置以及利用该心脏折返模型芯片的药剂评价方法。
(1)一种心脏折返模型芯片，其特征在于，具有：基板；凝胶层，其设置在该基板上，具有规定的大小和厚度；多个开口，该多个开口形成于该凝胶层，用于容纳细胞；闭环，其具有将该多个开口的各个开口之间连通的多个槽，并由上述多个开口和上述多个槽形成；壁，其用于在上述凝胶层的周围填充细胞培养液；微小电极，其设置在上述基板上的上述开口位置处，载置被容纳在上述开口中的细胞；比较电极，其设置在由上述壁包围的区域内；以及分别与上述微小电极相连接的引出线以及与上述比较电极相连接的引出线。
(2)根据上述(1)所记载的心脏折返模型芯片，上述槽是上述细胞无法穿过的间隙。
(3)一种利用心脏折返模型芯片的药剂评价装置，其特征在于，具有：基板；凝胶层，其设置在该基板上，具有规定的大小和厚度；多个开口，该多个开口形成于该凝胶层，用于容纳细胞；闭环，其具有将该多个开口的各个开口之间连通的多个槽，并由上述多个开口和上述多个槽形成；壁，其用于在上述凝胶层的周围填充细胞培养液；微小电极，其设置在上述基板上的上述开口位置处，载置被容纳在上述开口中的细胞；比较电极，其设置在由上述壁包围的区域内；以及分别与上述微小电极相连接的引出线以及与上述比较电极相连接的引出线；培养液供给和排出单元，其向由上述壁包围的区域内供给上述细胞培养液以及从由上述壁包围的区域内排出上述细胞培养液；添加单元，其将想要作用于上述细胞的药剂添加到上述细胞培养液中；以及测量记录单元，其使用上述引出线对载置于上述微小电极的细胞的电位进行测量并记录。
(4)一种利用心脏折返模型芯片的药剂评价方法，其特征在于，使用心脏折返模型芯片，从将想要作用于上述细胞的药剂添加到上述细胞培养液的单元将该药剂添加到上述细胞培养液中，该心脏折返模型芯片具备：基板；凝胶层，其设置在该基板上，具有规定的大小和厚度；多个开口，该多个开口形成于该凝胶层，用于容纳细胞；闭环，其具有将该多个开口的各个开口之间连通的多个槽，由上述多个开口和上述多个槽形成；壁，其用于在上述凝胶层的周围填充细胞培养液；微小电极，其设置在上述基板上的上述开口位置处，载置被容纳在上述开口中的细胞；比较电极，其设置在由上述壁包围的区域内；分别与上述微小电极相连接的引出线以及与上述比较电极相连接的引出线；培养液供给和排出单元，其向由上述壁包围的区域内供给上述细胞培养液以及从由上述壁包围的区域内排出上述细胞培养液；添加单元，其将想要作用于上述细胞的药剂添加到上述细胞培养液中；以及测量记录单元，其使用上述引出线对载置于上述微小电极的细胞的电位进行测量并记录。
(5)根据上述(1)所记载的心脏折返模型芯片，设置在上述基板上的凝胶层是对细胞没有粘合性的凝胶。
(6)根据上述(3)所记载的利用心脏折返模型芯片的药剂评价装置，设置在上述基板上的凝胶层是对细胞没有粘合性的凝胶。
(7)根据上述(3)所记载的利用心脏折返模型芯片的药剂评价方法，设置在上述基板上的凝胶层是对细胞没有粘合性的凝胶。
(8)一种心脏折返模型芯片，具备：基板；凝胶层，其设置在该基板上，具有规定的大小和厚度；多个开口，该多个开口形成于该凝胶层，用于容纳细胞；槽，其将该多个开口分别相互连通，与上述多个开口一起形成流体能够连通的流路的闭环，该槽形成于该凝胶层；用于填充细胞培养液的区域，该区域由上述基板的表面和在该基板上的上述凝胶层的周围形成的壁规定；微小电极，其设置在上述基板上的上述开口内，载置被容纳在上述开口中的细胞；比较电极，其设置在上述基板上的上述用于填充细胞培养液的区域内；以及分别与上述微小电极相连接的引出线以及与上述比较电极相连接的引出线。
(9)根据上述(8)所记载的心脏折返模型芯片，上述槽的宽度是上述细胞无法穿过的大小。
(10)一种利用心脏折返模型芯片的药剂评价装置，是用于使用上述(8)或(9)所记载的心脏折返模型芯片来进行药剂评价的药剂评价装置，该药剂评价装置具备：载物台，其用于载置上述心脏折返模型芯片；培养液供给和排出单元，其向上述用于填充细胞培养液的区域内供给上述细胞培养液以及从上述用于填充细胞培养液的区域内排出上述细胞培养液；药剂供给单元，其用于将想要作用于上述细胞的药剂添加到上述细胞培养液中；以及测量记录单元，其使用上述引出线对载置于上述微小电极的细胞的电位进行测量并记录。
(11)一种利用心脏折返模型芯片的药剂评价方法，是使用上述(10)所记载的利用心脏折返模型芯片的药剂评价装置来进行药剂评价的方法，该方法包括以下步骤：将想要作用于上述细胞的药剂从上述药剂供给单元添加到上述细胞培养液中。
(12)一种心脏折返模型芯片，具备：基板；凝胶层，其设置在该基板上，具有规定的大小和厚度；多个开口，该多个开口形成于该凝胶层，用于容纳细胞；槽，其将该多个开口分别相互连通，与上述多个开口一起形成流体能够连通的流路的闭环，该槽形成于该凝胶层；用于填充细胞培养液的区域，该区域由上述基板的表面和在该基板上的上述凝胶层的周围形成的壁规定；微小电极，其设置在上述基板上的上述开口内，载置被容纳在上述开口中的细胞；比较电极，其设置在上述基板上的上述用于填充细胞培养液的区域内；以及分别与上述微小电极相连接的引出线以及与上述比较电极相连接的引出线，其中，上述微小电极、上述多个开口以及将上述多个开口之间连通的槽能够保持多个细胞。
(13)一种利用心脏折返模型芯片的药剂评价装置，是用于使用上述(12)所记载的心脏折返模型芯片来进行药剂评价的药剂评价装置，该药剂评价装置具备：载物台，其用于载置上述心脏折返模型芯片；培养液供给和排出单元，其向上述用于填充细胞培养液的区域内供给上述细胞培养液以及从上述用于填充细胞培养液的区域内排出上述细胞培养液；药剂供给单元，其用于将想要作用于上述细胞的药剂添加到上述细胞培养液中；以及测量记录单元，其使用上述引出线对载置于上述微小电极的细胞的电位进行测量并记录。
(14)根据上述(13)所记载的利用心脏折返模型芯片的药剂评价装置，还具备以下单元，该单元导出从所有的微小电极得到的细胞电位的相加值。
(15)一种利用心脏折返模型芯片的药剂评价方法，是用于使用上述(13)或(14)所记载的利用心脏折返模型芯片的药剂评价装置来进行药剂评价的方法，该药剂评价方法包括以下步骤：将想要作用于上述细胞的药剂从上述药剂供给单元添加到上述细胞培养液中。
本发明利用将一个细胞事先封入到特定的空间配置中的结构，使由配置在设置于透明基板上的透明电极上的心肌细胞和成纤维细胞形成的闭环的任意的心肌细胞或特定的心肌细胞的搏动向环的两侧传播，电性地检测闭环上的细胞的搏动状况，从而制作出在体外(In vitro)的心脏折返模型芯片。使药物作用于该心脏折返模型芯片，测量各个细胞的细胞电位，来评价药物对于心肌细胞的有用性或毒性。
发明的效果
能够构成心肌细胞和成纤维细胞混合存在的在体外的折返模型芯片，能够利用该折返模型芯片来评价药物对于心肌细胞的有用性或毒性。根据本发明的模型芯片，能够得到如下特别显著的效果：虽然是在体外，但是能够以尽可能接近体内(invivo)状态的条件进行药物试验，能够针对药物的有用性和/或毒性进行可靠性高的评价。
附图说明
图1是示意性地表示本发明的一个实施方式所涉及的心脏折返模型芯片的结构的一例的立体图。
图2是示意性地表示图1所示的心脏折返模型芯片的细胞容纳部CH的结构的一例的立体图。
图3的(a)是概念性地说明保持在开口4中的细胞通过槽5具有物理接触和细胞间的相互作用由此所引起的细胞搏动的传播的情形的一例的图，(b)是以在电极2处所得到的电信号的一例来说明细胞搏动的传播的图。
图4是将时间轴放大来示出所有的被保持在细胞容纳部CH中的细胞以所谓的正常的脉冲电位进行搏动的期间T1、被保持在细胞容纳部CH4和CH6中的细胞在正常的脉冲电位之后伴随着与心律不齐(不整脈)对应的异常的脉冲电位进行搏动的期间T2切换时的脉冲电位的图。
图5的(A)～(C)是表示着眼于第二实施方式的模型芯片100的琼脂糖凝胶层(Agarose Gel Layer)3和微小电极2的结构(根据需要而称为腔(Chamber))的图。(A)是以通过琼脂糖凝胶层3构成的由心肌细胞和成纤维细胞所形成的闭环为单位的显微镜照片。(B)是(A)的示意图。(C)是在琼脂糖凝胶层3上喷洒心肌细胞和成纤维细胞混合存在的细胞来进行细胞培养六天并在第七天所拍摄到的显微镜照片。
图6是示意性地表示本发明的第二实施方式中的心脏折返模型芯片的细胞容纳部CH的结构的一例的立体图。
图7的(A)和(B)是表示在如图5的(C)所示那样对细胞进行了培养的状态下的折返模型芯片的各通道(Channel)的微小电极2处所得到的电位波形以及将各通道的峰值时间绘制成图表的一个例子的图。
图8的(A)表示更简单地评价图7的(A)所示的信号意味着是与正常的心脏活动对应的信号的波形图。(B)是表示处于人的心电图的正常范围的心电图的例子的图。(C)是估计构成与正常的心脏活动对应的状态下的折返模型芯片的细胞的搏动的传播状况而得到的图。
图9的(A)和(B)是表示在如图5的(C)所示那样对细胞进行了培养的状态下的折返模型芯片的各通道的微小电极2处所得到的电位波形以及将各通道的峰值时间绘制成图表的另一例的图。
图10的(A)表示更简单地评价图9的(A)所示的信号意味着不是与正常的心脏活动对应的信号的波形图。(B)是表示人的心电图包含很多心律不齐而超出正常范围的心电图的例子的图。(C)是对构成呈现图9的(A)、(B)的波形图、峰值时间的状态下的折返模型芯片的细胞的搏动传播状况进行估计而得到的图。
附图标记说明
1：透明基板；2：微小电极；2c：比较电极；2’：微小电极2的引出线；3：琼脂糖凝胶层；4：开口；5：槽；7：包围周围的壁；81、82、83：管；PC：个人计算机；Ms：个人计算机的操作信号；10：心肌细胞或成纤维细胞；CH：细胞保持部。
具体实施方式
图1是示意性地表示本发明的一个实施方式所涉及的心脏折返模型芯片的结构的一例的立体图。图2是示意性地表示图1所示的心脏折返模型芯片的细胞容纳部CH的结构的一例的立体图。
100是折返模型芯片，构成为以构建于透明基板1上的部件为主体。透明基板1是光学透明的材料、例如玻璃基板或硅基板。2是微小电极，例如设为由ITO形成的透明电极，被配置在透明基板1上。2’是微小电极2的引出线，它也被设为由ITO形成的透明电极。3是琼脂糖凝胶层。在琼脂糖凝胶层3的应该容纳心肌细胞或成纤维细胞的位置处以规定的周期形成从琼脂糖凝胶层3的表面到达透明基板1的表面的开口4，从而构成细胞容纳部CH。并且，在相邻的开口4之间形成从琼脂糖凝胶层3的表面到达透明基板1的表面的槽5。在构成细胞容纳部CH的开口4处的透明基板1上根据需要来配置微小电极2。在图1中，设为在所有的构成细胞容纳部的开口4处都配置微小电极2。不管是否存在微小电极2，在构成细胞容纳部CH的开口4中容纳一个心肌细胞或成纤维细胞10。在图2中，在构成细胞容纳部CH的开口4的位置处去除比槽5更靠前侧的琼脂糖凝胶层3而示出透明基板1上的微小电极2、载置在微小电极2上的心肌细胞或成纤维细胞10、与微小电极2连接并引出的引出线2’的情形。优选的是在微小电极2的细胞载置面以及不设置微小电极2而在透明基板1上直接载置细胞的情况下的细胞载置面上事先涂敷胶原蛋白(Collagen)等的有助于粘合细胞的材料。关于由琼脂糖凝胶层包围的构成细胞容纳部CH的开口4内的细胞，由于琼脂糖凝胶对于细胞来说没有粘合性，因此即使将琼脂糖凝胶层3的壁的高度设为与细胞相同程度，细胞10也不会越过壁而移动。另外，由于琼脂糖凝胶层3的槽5的两侧之间的宽度被设为小于细胞的大小，因此细胞10不会挤出该槽5而移动到相邻的构成细胞容纳部CH的开口4。在此，琼脂糖凝胶层3只要是能够形成用于保持细胞的μm量级的开口且能够以μm量级的槽来连通开口之间的凝胶材料，就能够使用任意的凝胶材料。
在图1中，构成细胞容纳部CH的开口4呈直线状以规定的间隔配置有8个，平行地设置两排该开口4。各排的构成细胞容纳部CH的开口4分别通过槽5相连接，并且各排两端的构成细胞容纳部CH的开口4也分别通过槽5相连接。即，16个构成细胞容纳部CH的开口4构成闭环。构成细胞容纳部CH的各个开口4分别保持一个心肌细胞或成纤维细胞10，并且如图2所示那样分别具备微小电极2，从各微小电极2引出了引出线2’。关于这些16个被直列排列的心肌细胞和/或成纤维细胞的分配，只要随机分配即可。另外，优选为不将所有的细胞都设为心肌细胞或成纤维细胞。作为心脏折返模型，最好是这些细胞适当地混合存在。并且，在对16个构成细胞容纳部CH的开口4分配细胞时，也可以设为以如下形式进行分配：在琼脂糖凝胶层3的上表面喷洒与应该分配到16个构成细胞容纳部CH的各个开口4的细胞的数量相比足够多的数量的细胞。通过这样，成为除了在开口4分配有细胞之外细胞还搭载于槽5上、细胞分散于琼脂糖凝胶层3的周围部分的形式，即使就这样放置这些细胞，也不会成为障碍。被保持在相邻的构成细胞容纳部CH的开口4中的细胞通过槽5能够发生物理接触和细胞之间的相互作用。在琼脂糖凝胶层3的端部的下部设有比较电极2C，引出了引出线2’C。
7是包围周围的壁，包围琼脂糖凝胶层3和比较电极2C。81和82是用于对壁7的内部区域供给细胞的培养液以及从壁7的内部区域排出细胞的培养液的管。在图1的例子中，从延伸到基板1的底面附近的管81供给培养液，从延伸到基板1的底面附近的管82排出培养液。在供给培养液的管81的培养液的出口附近与管83相结合，通过该管83来供给想要作用于细胞的药剂。因而，细胞10被暴露于通过管81供给到壁7的内部区域的细胞的培养液的同时，稳定地保持在微小电极2上。在不需要将细胞暴露于培养液时，只要通过管82从壁7的内部区域排出培养液即可。另外，当将培养液更换为新的培养液时，只要在排出培养液之后或者在排出的同时供给培养液即可。另一方面，当想要使药剂作用于细胞时，只要在通过管82排出培养液的同时，通过管83将想要作用于细胞的药剂添加到培养液中，通过管81来与培养液一起供给即可。此外，管81、管82以及管83的结构也可以根据测量的方法任意地变更配置。例如，也可以设为将管81和管83分离，还可以设为省略管82，将管81用于供给和排出的两方。
PC是个人计算机，在构成细胞容纳部CH的开口4的微小电极2的引出线2’与比较电极2C的引出线2’C之间测量细胞电位并进行记录。此外，在图1中，由于会使图变得复杂，因此省略显示上部的构成细胞容纳部CH的开口4的微小电极2的引出线2’的引出线对个人计算机PC提供信号的线。另外，对个人计算机9输入操作者的操作信号Ms。
图1所示的折返模型芯片100的结构的主要尺寸的例子如下所示。这是将细胞的大小设为10μmφ的例子。透明基板1的大小是100mm×150mm，微小电极2是8μm×8μm的大小，琼脂糖凝胶层3的大小是4.5mm×2mm×10μm(高度)，成为细胞容纳部的开口4是12μmφ的圆柱状，开口4之间的距离是50μm，开口4之间的槽5的宽度是5μm，形成于周围的壁7的外形设为5mm×5mm，高度是5mm。此外，在此，微小电极2设为8μm×8μm的正方形，但是也可以设为与构成细胞容纳部CH的开口4的12μmφ相同的圆状的电极。
下面，说明使用了本发明的折返模型芯片100的具体的测量例。
图3的(a)是概念性地说明被保持在开口4中的细胞通过槽5具有物理接触和细胞间的相互作用由此所引起的细胞搏动的传播的情形的一例的图，图3的(b)是以在电极2处所得到的电信号的一例来说明细胞搏动的传播的图。
在图3的(a)中涂黑表示的记号对应于具有开口4的细胞容纳部CH，为了便于说明，对各个记号附加了CH1、CH2、…、CH16的参照标记。在图3的(a)中，示意性地表示如下情形：搏动从细胞容纳部CH6起沿顺时针方向(CW)和逆时针方向(C CW)传播，来自两个方向的搏动在与细胞容纳部CH6相距等距离的细胞容纳部CH14处发生碰撞而消失。显然，虽然成纤维细胞自身既不搏动也不产生电信号，但是具有对被传递的搏动和电信号进行传递的功能。
对图1所示的实施方式的心脏折返模型的细胞容纳部CH适当地分配心肌细胞和成纤维细胞，在规定的培养液中以规定的培养条件进行培养。当持续培养了几天时，进行如图3的(a)所例示那样的搏动以及电信号的传递。
图3的(b)是针对被保持在细胞容纳部CH4、CH6、CH11以及CH15中的细胞示出在开始培养后的第五天通过个人计算机PC取入细胞容纳部CH的微小电极2的电位来测量得到的结果的例子的图。在此，T1是所有的被保持在细胞容纳部CH中的细胞以所谓的正常的脉冲电位进行搏动的期间，T2是被保持在细胞容纳部CH4和CH6中的细胞在正常的脉冲电位之后伴随着与心律不齐对应的异常的脉冲电位进行搏动的期间。参照图的右下方的比例尺条可知，以1次/1秒的程度产生脉冲电位。另外，在该例子中，以正常的脉冲电位进行搏动的期间T1大约为5分钟，伴随着与心律不齐对应的异常的脉冲电位进行搏动的期间T2大约为30秒。
在该测量中，在时间轴上比较期间T1的脉冲电位则可知，由于被保持在细胞容纳部CH6中的细胞以最早的时刻产生脉冲电位，因此被保持在细胞容纳部CH6中的细胞成为起搏点(Pacemaker)。还可知，被保持在细胞容纳部CH6中的细胞所产生的脉冲电位沿逆时针方向(CCW)传播，从而被保持在细胞容纳部CH4中的细胞产生了脉冲电位，并沿顺时针方向(CW)进行传播，从而被保持在细胞容纳部CH11和CH15中的细胞产生了脉冲电位。
在该状态继续维持了期间T1之后，被保持在细胞容纳部CH4和CH6中的细胞在正常的脉冲电位之后突然伴随着与心律不齐对应的异常的脉冲电位而开始进行搏动，在该状态继续维持了期间T2之后，突然再次成为以正常的脉冲电位搏动的状态，并持续期间T1。在此，当观察被保持在细胞容纳部CH4和CH6中的细胞的与心律不齐对应的异常的脉冲电位时，观察到被保持在细胞容纳部CH4中的细胞的异常的脉冲电位在比被保持在细胞容纳部CH6中的细胞的异常的脉冲电位早的时刻产生。即，被保持在细胞容纳部CH4中的细胞成为起搏点，从而异常的脉冲电位沿顺时针方向传播。确认出该期间T1、期间T2的重复状态是在正常的脉冲电位下的搏动、伴随着异常的脉冲电位的搏动的重复，但是期间T1、期间T2并不是固定的，每当进行测量时，都分别发生变动。
图4是放大时间轴来示出从期间T1切换为期间T2时的脉冲电位的图。在上部以成为起搏点的被保持在细胞容纳部CH6中的细胞的脉冲电位为基准针对被保持在细胞容纳部CH10、CH15、CH2中的细胞的脉冲电位示出了沿顺时针方向(CW)的传播。在下部以成为起搏点的被保持在细胞容纳部CH6中的细胞的脉冲电位为基准针对被保持在细胞容纳部CH4、CH3、CH2中的细胞的脉冲电位示出了沿逆时针方向(CCW)的传播。
当观察沿顺时针方向(CW)的传播时，可以认为：细胞容纳部CH6中的细胞的脉冲电位依次向细胞容纳部CH10、CH15传播，但是当被保持于CH2中的细胞产生了脉冲电位而该脉冲电位被传播到细胞容纳部CH6的细胞时，该细胞产生与心律不齐对应的异常的脉冲电位。另一方面，当观察沿逆时针方向(CCW)的传播时，细胞容纳部CH6中的细胞的脉冲电位向细胞容纳部CH4传播，但是到达CH3后中断。其结果，如上所述，可以认为：沿顺时针方向(CW)传播的脉冲电位传播到细胞容纳部CH6的细胞，从而产生与心律不齐对应的异常的脉冲电位。
此外，关于在图3、图4中没有显示的细胞容纳部CH的细胞的脉冲电位，细胞被认为是成纤维细胞，在无法得到脉冲电位的情况下或许不需要进行说明，因此没有进行显示。
在上述第一实施方式中，设利用了在由心肌细胞和成纤维细胞形成的闭环的特定的空间内封入一个细胞的结构。在以下要说明的第二实施方式中，为了使操作更加简单并且容易从微小电极得到电信号，使以规定的周期配置于由心肌细胞和成纤维细胞形成的闭环中的透明电极变大，并且使事先封入细胞的空间(开口)也变大，还使将空间(开口)与空间(开口)连接的槽的宽度变宽。下面，参照附图进行说明。
图5的(A)～(C)是表示着眼于第二实施方式的模型芯片100的琼脂糖凝胶层3和微小电极2的结构(根据需要而称为腔)的图。模型芯片100的结构以及系统的整体结构的构思本身与图1所说明的构思相同。图5的(A)是以通过琼脂糖凝胶层3构成的由心肌细胞和成纤维细胞所形成的闭环为单位的显微镜照片。图5的(B)是图5的(A)的示意图。图5的(C)是在琼脂糖凝胶层3上喷洒心肌细胞和成纤维细胞混合存在的细胞来进行细胞培养六天并在第七天所拍摄到的显微镜照片。
图5的(A)～(C)的参照标记(没有对全部附加标记)与图1的相应标记相同，2是微小电极，2’是微小电极2的引出线，3是琼脂糖凝胶层，4是保持心肌细胞和成纤维细胞并且配置有微小电极2的空间(开口)，但是设为在腔的上下两端将4个微小电极配置于一个空间(开口)的结构(将参照标记设为4’来与其它空间(开口)相区别)。5是连接空间(开口)之间的槽。它们被形成在透明基板1的表面上。在图5的(A)中可以看到与由心肌细胞和成纤维细胞形成的闭环的微小电极2无关的微小电极2的引出线2’，这是因为为了方便而构成为能够在透明基板1的表面上形成多个由心肌细胞和成纤维细胞形成的闭环，作为由心肌细胞和成纤维细胞形成的闭环的一个单位，示出图5的(B)所示的示意性的结构。分别位于图5的(C)的左侧(Left)、右侧(Right)的8个微小电极2附近所附加的1～8的数字是对各微小电极2附加的通道编号，在后述的说明中使用。
在此，说明图5的(A)～(C)所示的腔的主要尺寸和结构的例子。在此，也将细胞的大小设为10μmφ。设微小电极2为50μm×50μm的大小，微小电极2之间的距离为450μm，琼脂糖凝胶层3的厚度(高度)为10μm，空间(开口)4为60μmφ。空间(开口)4之间的槽5的宽度设为20μm～60μm，但是在此设为50μm。设空间(开口)4之间的距离为450μm，腔的上下两端的空间(开口)4’为500μm×500μm的大小。此外，在此没有提及琼脂糖凝胶层3的大小、透明基板1的大小、形成于周围的壁7的外形以及高度。只要考虑上述尺寸来确定它们即可。
从该尺寸的例子也可知，在第二实施方式中，由于空间(开口)4和槽5相对于细胞的尺寸足够大，因此当从琼脂糖凝胶层3的上表面喷洒心肌细胞和成纤维细胞混合存在的细胞时，适当地分布到微小电极2、空间(开口)4、4’以及槽5。图6是示意性地表示该状态的图。在处于空间(开口)4的位置的微小电极2处搭载5个细胞10，在其两侧的槽5中也存在细胞10，在琼脂糖凝胶层3的上表面也搭载有细胞10。在此示出了在微小电极2处搭载5个细胞10的例子，但是能够估计出搭载1个到10个左右的细胞。对比图6和图2清楚可知，在第二实施方式中，闭环由载置了多个细胞10的微小电极2和在多个微小电极2之间的载置了细胞10的槽5构成。由于只要将心肌细胞和成纤维细胞混合存在的细胞群喷洒在琼脂糖凝胶层3的上表面即可，因此能够简单地构成折返模型芯片。在这种情况下，不需要管理心肌细胞和成纤维细胞的混合比例。另外，期望在微小电极2处搭载多个细胞10，并不认为搭载在微小电极2处的细胞都是成纤维细胞，因此不存在如第一实施方式那样无法得到电位信号的微小电极2，从而能够期望从所有的微小电极2得到电位信号。
图7的(A)和(B)是表示在如图5的(C)所示那样对细胞进行了培养的状态下的折返模型芯片的各通道的微小电极2处所得到的电位波形以及将各通道的峰值时间绘制成图表的一个例子的图。以折返模型芯片的左右两侧的t＝0为基点进行观察。从图7的(A)可知，在折返模型芯片的左右两侧的各通道的微小电极2处所得到的电位在所有的通道中都成为稳定的周期波形。图7的(B)是为了解析图7的(A)的电位波形而将各通道的峰值时间绘制成图表的图，将图7的(A)的折返模型芯片的左右两侧的电位波形所对应的时间带的峰值时间叠加显示在同一时间轴上。能够通过图1示出的个人计算机PC简单地进行该处理。示出了根据在连接图7的(A)与图7的(B)之间的箭头的根部位置的电位波形信号推导出箭头前端位置的峰值时间。实线的箭头与折返模型芯片左侧的微小电极2的信号相对应，虚线的箭头与折返模型芯片右侧的微小电极2的信号相对应。在图7的(B)中，用×记号表示与折返模型芯片左侧的微小电极2的信号对应的峰值时间，用○记号表示与折返模型芯片右侧的微小电极2的信号对应的峰值时间。从图7的(B)容易地知道，在该例子中，搏动从第一通道到第八通道以大致相同的速度传播，从第一通道产生的搏动大约在100ms内传播到第八通道并消失。
即，图7的(A)所示的信号意味着是与正常的心脏活动对应的信号。因此，在图7的(B)所示的解析结果中附加“N”的显示来表示正常的意思。
图8的(A)表示更简单地评价图7的(A)所示的信号意味着是与正常的心脏活动对应的信号的波形图。图8的(A)的波形图是将图7的(A)所示的第一通道至第八通道的信号波形全部相加得到的波形图。能够通过图1示出的个人计算机PC简单地进行该处理。在图8的(A)的波形图中，具有稳定的峰值波形的信号以规定的周期稳定地呈现。该情形能够根据图8的(A)的波形图与图7的(A)的波形图之间的对应或者图8的(A)的波形图与图7的(B)的峰值时间之间的对应来容易地估计出。因而，在该图8的(A)的波形图中，附加“N”的显示来表示是正常状态的心脏活动的意思。
图8的(B)是表示处于人的心电图的正常范围的心电图的例子的图。将图8的(A)所示的信号波形与图8的(B)所示的波形相比可知，根据稳定的峰值波形、稳定的周期可知，构成折返模型芯片的细胞的活动对应于与正常的心脏活动相类似的正常的活动。
图8的(C)是对构成与正常的心脏活动对应的状态下的折返模型芯片的细胞的搏动的传播状况进行估计而得到的图。位于左右两侧的第一通道的微小电极附近的细胞成为起搏点(PM)，如箭头所示，该搏动在左右两侧的通道中依次传播，在第七通道或第八通道的微小电极附近发生碰撞而消失。估计出上述情形以规定的周期重复发生。
图9的(A)和(B)是表示在如图5的(C)所示那样对细胞进行了培养的状态下的折返模型芯片的各通道的微小电极2处所得到的电位波形以及将各通道的峰值时间绘制成图表的另一例的图。与图7的(A)同样地，以折返模型芯片的左右两侧的t＝0为基点进行观察。从图9的(A)可知，在折返模型芯片的左右两侧的各通道的微小电极2处所得到的电位与图7的(A)的该电位相比，成为不稳定的周期的波形。图9的(B)是为了解析图9的(A)的电位波形而将各通道的峰值时间绘制成图表的图，将图9的(A)的折返模型芯片的左右两侧的电位波形所对应的时间带的峰值时间叠加显示在同一时间轴上。能够通过图1示出的个人计算机PC简单地进行该处理。示出了根据在连接图9的(A)与图9的(B)之间的箭头的根部位置的电位波形信号来推导出箭头前端位置的峰值时间。实线的箭头对应于折返模型芯片左侧的微小电极2的信号，虚线的箭头对应于折返模型芯片右侧的微小电极2的信号。在图9的(B)中，用×记号表示与折返模型芯片左侧的微小电极2的信号对应的峰值时间，用○记号表示与折返模型芯片右侧的微小电极2的信号对应的峰值时间。
在图9的(A)、(B)中，进行着与图7的(A)、(B)相比复杂的动作。在该例子中，如图9的(B)所示，在紧接着t＝0之后，搏动从第一通道到第八通道以大致相同的速度传播，在测量到从第一通道所产生的搏动在大约100ms内传播到第八通道并消失的正常的搏动的传播(N1)之后，测量到从折返模型芯片左侧的微小电极2的第三通道到第七通道为止的搏动的传播(E1)，之后，测量到如下的部分循环型传播(U)：从折返模型芯片右侧的微小电极2的第三通道到第八通道为止的搏动的传播之后，该传播折回而从折返模型芯片左侧的微小电极2的第八通道到第三通道为止传播。之后不久，搏动从第一通道到第八通道以大致相同的速度传播，在测量到从第一通道所产生的搏动在大约100ms内传播到第八通道并消失的正常的搏动的传播(N2)之后，测量到从折返模型芯片左侧的微小电极2的第三通道到第七通道为止的搏动的传播(E2)，之后，进行搏动的传播(R1)后，该传播折回而进行搏动的传播(R2)，之后，该传播再次折回而进行从折返模型芯片右侧的微小电极2的第一通道到第六通道为止的搏动的传播(R3)后消失，其中，上述搏动的传播(R1)是搏动从折返模型芯片右侧的微小电极2的第一通道到第八通道为止传播之后，该传播折回而搏动从折返模型芯片左侧的微小电极2的第八通道到第一通道为止传播，上述搏动的传播(R2)是该搏动的传播(R1)折回而搏动从折返模型芯片左侧的微小电极2的第一通道到第八通道为止传播后，该传播折回而搏动从折返模型芯片左侧的微小电极2的第八通道到第一通道为止传播。
即，图9的(A)所示的信号即使发生了正常的搏动的传播N1、N2，也会产生伴随着部分传播E1、E2、部分传播U以及2次半的循环型传播的折返R1、R2、R3。这不能说是正常的心脏活动。
图10的(A)表示更简单地评价图9的(A)所示的信号意味着不是与正常的心脏活动对应的信号的波形图。图10的(A)的波形图是将图9的(A)所示的第一通道至第八通道的信号波形全部相加得到的波形图。能够通过图1示出的个人计算机PC简单地进行该处理。如在图10的(A)的波形图中示出了图9的(B)的峰值时间的解析中所示的传播的状况N1、N2、E1、E2、U、R1、R2以及R3那样，图10的(A)的波形图很好地对应于图9的(B)的峰值时间的解析。因而，该图10的(A)的波形图意味着不是正常状态的心脏活动。
图10的(B)是表示人的心电图包含很多心律不齐而超出正常范围的心电图的例子的图。将图10的(A)所示的信号波形与图10的(B)所示的波形相比可知，构成呈现图10的(A)所示的信号波形的折返模型芯片的细胞的活动对应于与呈现超出正常心脏活动的心电图的情况下的人的心脏活动相类似的异常的活动。
图10的(C)是对构成呈现图9的(A)、(B)的波形图、峰值时间的状态下的折返模型芯片的细胞的搏动传播状况进行估计而得到的图。N1、N2与如下的例子相同：在图8的(C)中所说明的位于左右两侧的第一通道的微小电极附近的细胞成为起搏点(PM)，该搏动如箭头所示那样在左右两侧的通道依次传播，并在第七通道或第八通道的微小电极附近发生碰撞而消失。E1、E2是如下的例子：位于左侧的第三通道的微小电极附近的细胞成为起搏点(PM)，该搏动如箭头所示那样仅在左侧的通道依次传播，在第七通道或第八通道的微小电极附近消失。U是如下的例子：位于右侧的第三通道的微小电极附近的细胞成为起搏点(PM)，该搏动如箭头所示那样仅在右侧的通道依次传播，在第七通道或第八通道的微小电极附近传播到左侧的第八通道，在从左侧的第八通道依次传播到第四通道之后，与从位于左侧的第三通道的微小电极附近的细胞所产生的搏动发生碰撞而消失。R1是如下的例子：位于右侧的第一通道的微小电极附近的细胞成为起搏点(PM)，该搏动如箭头所示那样在右两侧的通道依次传播，在第七通道或第八通道的微小电极附近传播到左侧的第八通道，在达到从左侧的第八通道依次传播到第一通道为止的状态之后，进一步如R2所示那样，再次成为经由位于左侧通道的微小电极附近的细胞传播的搏动而循环，不仅如此还如R3所示那样，再次成为经由位于右侧通道的微小电极附近的细胞传播的搏动而传播到第七通道之后消失。
根据第二实施方式，如图8的(A)和图10的(A)所示，通过观察将所有电极的电压信号合计得到的信号波形，能够一目了然地获知形成折返模型芯片的细胞群是进行正常状态的动作、还是进行包含心律不齐的超出正常区域的动作。通过在个人计算机中具备合适的软件，能够容易地实现该信号波形的合计以及评价。当然，也可以设为由个人计算机进行合计并由医生进行评价。
因而，例如，对于输出图8的(A)的信号波形的折返模型芯片，如第一实施方式所说明的那样，只要观察使药剂发生作用的结果，就能够评价出药剂是否有害。即，如果使药剂发生作用的结果，图8的(A)的输出波形如图10的(A)那样，则可以说该药剂有害，如果没有产生较大的变化，则可以说不是有害的药剂。同样地，对于输出图10的(A)的信号波形的折返模型芯片，如第一实施方式所说明的那样，只要观察使药剂发生作用的结果，就能够评价出药剂是否有用。即，如果使药剂发生作用的结果，图10的(A)的输出波形如图8的(A)那样，则可以说该药剂有可能是对心脏疾病有用的药，如果没有带来较大的变化，则可以说该药剂不可能是对心脏疾病有用的药。
这样，根据本发明，能够构成心肌细胞和成纤维细胞混合存在的在体外的心脏折返模型芯片。因而，通过管83供给想要作用于细胞的药剂，只要检测图3的(b)所示的脉冲电位的变化并进行评价，就能够评价出药剂对于心肌细胞的有用性或毒性。即，如果与心律不齐对应的异常的脉冲电位变大或者产生该异常的脉冲电位的持续期间变长，则可知不适合用作药剂，相反地，如果与心律不齐对应的异常的脉冲电位变小或者产生该异常的脉冲电位的持续期间变短，则可知适合用作药剂。
此外，在上述实施方式中，由于设为由光学透明的材料构成基板1和微小电极2，因此虽然没有进行具体的说明，但是能够并用通过光学显微镜观察细胞搏动的状态的技术。这样，与仅通过脉冲电位进行评价相比，能够更多方面地评价药剂的影响。相反地，在不通过光学显微镜进行观察的情况下，不需要由光学透明的材料构成基板1和电极2。
产业上的可利用性
根据本发明，能够提供一种如下的芯片：通过来自相邻的心肌细胞或成纤维细胞的搏动的传播，能够以一个细胞为单位正确地测量细胞电位、细胞形态，并且通过构成使心肌细胞和成纤维细胞适当地分散配置而成的闭环来构成心脏模型，能够评价药物所产生的影响。

Claims (9)

1.一种心脏折返模型芯片，具备：
基板；
凝胶层，其设置在该基板上，具有规定的大小和厚度；
多个开口，该多个开口形成于该凝胶层，用于容纳细胞；
槽，其将该多个开口分别相互连通，与上述多个开口一起形成流体能够连通的流路的闭环，该槽形成于该凝胶层；
用于填充细胞培养液的区域，该区域由上述基板的表面和在该基板上的上述凝胶层的周围形成的壁规定；
微小电极，其设置在上述基板上的上述开口内，载置被容纳在上述开口中的细胞；
比较电极，其设置在上述基板上的上述用于填充细胞培养液的区域内；以及
分别与上述微小电极相连接的引出线以及与上述比较电极相连接的引出线。
2.根据权利要求1所述的心脏折返模型芯片，其特征在于，
上述槽的宽度是上述细胞无法穿过的大小。
3.根据权利要求1所述的心脏折返模型芯片，其特征在于，
设置在上述基板上的凝胶层是对细胞没有粘合性的凝胶。
4.一种利用心脏折返模型芯片的药剂评价装置，是使用权利要求1～3中的任一项所述的心脏折返模型芯片来评价药剂的药剂评价装置，该药剂评价装置具备：
载物台，其用于载置上述心脏折返模型芯片；
培养液供给和排出单元，其向上述用于填充细胞培养液的区域内供给上述细胞培养液以及从上述用于填充细胞培养液的区域内排出上述细胞培养液；
药剂供给单元，其用于将想要作用于上述细胞的药剂添加到上述细胞培养液中；以及
测量记录单元，其使用上述引出线对载置于上述微小电极的细胞的电位进行测量并记录。
5.一种利用心脏折返模型芯片的药剂评价方法，是使用权利要求4所述的利用心脏折返模型芯片的药剂评价装置来评价药剂的方法，该方法包括以下步骤：
将想要作用于上述细胞的药剂从上述药剂供给单元添加到上述细胞培养液中。
6.一种心脏折返模型芯片，具备：
基板；
凝胶层，其设置在该基板上，具有规定的大小和厚度；
多个开口，该多个开口形成于该凝胶层，用于容纳细胞；
槽，其将该多个开口分别相互连通，与上述多个开口一起形成流体能够连通的流路的闭环，该槽形成于该凝胶层；
用于填充细胞培养液的区域，该区域由上述基板的表面和在该基板上的上述凝胶层的周围形成的壁规定；
微小电极，其设置在上述基板上的上述开口内，载置被容纳在上述开口中的细胞；
比较电极，其设置在上述基板上的上述用于填充细胞培养液的区域内；以及
分别与上述微小电极相连接的引出线以及与上述比较电极相连接的引出线，
其中，上述微小电极、上述多个开口以及连通上述多个开口之间的槽能够保持多个细胞。
7.一种利用心脏折返模型芯片的药剂评价装置，是使用权利要求6所述的心脏折返模型芯片来评价药剂的药剂评价装置，该药剂评价装置具备：
载物台，其用于载置上述心脏折返模型芯片；
培养液供给和排出单元，其向上述用于填充细胞培养液的区域内供给上述细胞培养液以及从上述用于填充细胞培养液的区域内排出上述细胞培养液；
药剂供给单元，其用于将想要作用于上述细胞的药剂添加到上述细胞培养液中；以及
测量记录单元，其使用上述引出线对载置于上述微小电极的细胞的电位进行测量并记录。
8.根据权利要求7所述的利用心脏折返模型芯片的药剂评价装置，其特征在于，
还具备以下单元，该单元导出从所有的微小电极得到的细胞电位的相加值。
9.一种利用心脏折返模型芯片的药剂评价方法，是使用权利要求7或8所述的利用心脏折返模型芯片的药剂评价装置来评价药剂的方法，该方法包括以下步骤：
将想要作用于上述细胞的药剂从上述药剂供给单元添加到上述细胞培养液中。
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