CN112485247B - 一种异质结构的结构色微纤维及其制备方法和心肌细胞检测方法 - Google Patents

一种异质结构的结构色微纤维及其制备方法和心肌细胞检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种异质结构的结构色微纤维及其制备方法和心肌细胞检测方法，其中制备方法为采用毛细管构建微流控芯片用于异质结构的结构色微纤维制备平台，配置预聚液作为纤维组分，预聚液包括生物相容性水凝胶溶液和至少一种浓度的二氧化硅非密堆积胶体晶体预凝胶，各预聚液中分别加入有光引发剂；两类预聚液经由微流控芯片程序化交替注入收集管中，通过紫外光持续照射收集管部分，获得异质结构的结构色微纤维。本发明具有可控制备、成本低廉、可实现细胞生理可视化定量传感等优点。

Description

一种异质结构的结构色微纤维及其制备方法和心肌细胞检测 方法
技术领域
本发明属于生物医药材料领域，尤其涉及一种异质结构的结构色微纤维及其制备方法和心肌细胞检测方法。
背景技术
细胞产生的机械力在调节从细胞到组织水平的生物学功能中具有重要作用。细胞机械力的异常通常与器官组织的功能失调和解剖状态异常有关，因此细胞机械力已逐渐被视为疾病评估的要素。为了有效地测量细胞机械力，研究人员已经提出并开发了各种机械力传感技术，例如原子力显微镜、牵引力显微镜、弹性体微柱阵列分析等。这些微量力学传感技术虽然在生物力学过程和亚细胞结构观察方面具有巨大优势，但是大多都依赖于复杂的设备和繁琐的模拟计算，费用高昂，耗时较长。此外，其中的一些技术甚至可能在测量过程中对细胞造成结构损坏，导致测量结果的可信度下降。因此，可用于细胞力学的简便有效的动态检测方法仍有待开发。
心脏是人体最重要的器官之一，其为全身器官、组织提供充足的血流量，维持器官、组织细胞的正常代谢和功能。心肌细胞产生的周期性收缩是心脏发挥功能的重要前提，如果心肌细胞有损，则会导致心脏功能缺陷。近年来，随着冠心病及先心病对人类威胁日益加重，针对心肌细胞药物的研发、筛选和评估成为生物医学领域急需解决的问题之一。同时，能够解决心肌细胞实时监测、同步反馈的传感平台也是该领域面临的挑战。
光子晶体材料是一类具有两种或两种以上折射率的周期性微纳结构材料，因其可以调控光子在其内部的运动、反射一定波长的电磁波，从而具有光子带隙和结构色的独特性质。通过调控光子晶体材料的结构构成或折射率大小，可以实现对其结构色的调控。
发明内容
为了解决心肌细胞传感依赖大型复杂仪器、心脏新药开发缺乏有效体外模型的缺点，本发明提供了一种基于微流控芯片的、具有轴向异质结构的结构色微纤维及其制备方法和心肌细胞检测方法，所述心肌细胞检测方法的特征在于通过心肌细胞周期性收缩拉动微纤维结构色区域产生形变和颜色变化，实现心肌细胞的可视化检测传感。该微纤维可应用于心肌细胞生理信号转化、可视化检测等技术领域中。
为实现上述目的，本发明提供一种异质结构的结构色微纤维的制备方法，具有这样的特征：采用毛细管构建微流控芯片用于异质结构的结构色微纤维制备平台，配置预聚液作为纤维组分，预聚液包括生物相容性水凝胶溶液和至少一种浓度的二氧化硅非密堆积胶体晶体预凝胶，各预聚液中分别加入有光引发剂；两类预聚液经由微流控芯片程序化交替注入收集管中，通过紫外光持续照射收集管部分，聚合后获得异质结构的结构色微纤维。
其中通过调整微流控流速、预聚液通入时间、收集管毛细管管径、注液口数量及预聚液种类，可以获得不同长度、组分、直径、结构的异质结构结构色微纤维。将其中一种组分对应的微流控速调快，通入时间加长，对应组分所在纤维中的长度会相应增长；增加或减小收集管毛细管管径，纤维直径会相应地增大或减小；增加或减少注液口数量及预聚液种类，异质结构的结构色微纤维所包含组分会相应的增加或减少。
进一步，本发明提供一种异质结构的结构色微纤维的制备方法，还可以具有这样的特征：其中，所述生物相容性水凝胶溶液为10～30％质量体积比浓度的甲基丙烯酸酯化明胶溶液。
进一步，本发明提供一种异质结构的结构色微纤维的制备方法，还可以具有这样的特征：其中，所述二氧化硅非密堆积胶体晶体预凝胶为磺酸根修饰的二氧化硅粒子分散在丙烯酰胺(AAm)、异丙基丙烯酰胺(NIPAM)、聚乙二醇双丙烯酸酯(PEGDA)的一种或两种以上材料的水溶液中，其中含有丙烯酰胺和/或异丙基丙烯酰胺材料的水溶液中还添加有交联剂；磺酸根修饰的二氧化硅粒子的质量体积比浓度为5％-60％(w/v)。磺酸根修饰的二氧化硅粒子浓度不同，所展现的结构色不同，在多组分异质结构结构色微纤维中可以实现多元颜色编码。
进一步，本发明提供一种异质结构的结构色微纤维的制备方法，还可以具有这样的特征：其中，构建微流控芯片的方法为：根据所需结构色微纤维直径，选择同样管径的毛细管作为收集管；根据所需组分数量，设置相同数量的毛细管注液口，并在玻片上与收集管组装成微流控芯片，收集管和注液口均固定在玻片上，注液口均收集管连接相通；所述生物相容性水凝胶预聚液和二氧化硅非密堆积胶体晶体预聚液，分别经由注射器、软管注入注液口，接入微流控芯片，通过程序化交替地向微流控芯片中泵入生物相容性水凝胶预聚液和二氧化硅非密堆积胶体晶体预聚液。
本发明还提供由上述方法制备的异质结构的结构色微纤维，直径为150-600μm，长度为500-3000mm。
本发明还提供上述异质结构的结构色微纤维的心肌细胞检测方法，具有这样的特征：将所述异质结构的结构色微纤维用作心肌细胞培养基底，其生物相容性水凝胶溶液聚合后形成的部分为心肌细胞生长区域，心肌细胞在该区域上生长，二氧化硅非密堆积胶体晶体预凝胶聚合后形成的部分具有结构色，且对拉伸敏感为结构色检测区域；当心肌细胞恢复自主跳动后，其周期性收缩拉动检测区域，该区域产生与心肌收缩周期同步的结构色变化，从而检测心肌细胞。
进一步，本发明提供一种异质结构的结构色微纤维的心肌细胞检测方法，还可以具有这样的特征：单端拉伸的心肌细胞检测方法：分别固定异质结构的结构色微纤维中相邻的结构色检测区域(二氧化硅非密堆积胶体晶体)远端与心肌细胞生长区域(生物相容性水凝胶)远端，其中远端指远离交界面的一端；心肌细胞只生长在心肌细胞生长区域(生物相容性水凝胶部分)，在异质结构的结构色微纤维两端被固定的情况下，心肌细胞收缩将经由两个区域的交界面将力学信号传导到结构色检测区域(二氧化硅非密堆积胶体晶体部分)，进而使其产生形变和结构色变化，将心肌力学信号转为光学信号，从而检测心肌细胞。
进一步，本发明提供一种异质结构的结构色微纤维的心肌细胞检测方法，还可以具有这样的特征：两端拉伸的心肌细胞检测方法：分别固定异质结构的结构色微纤维中由一段结构色检测区域(二氧化硅非密堆积胶体晶体部分)分隔开的两个心肌细胞生长区域(生物相容性水凝胶部分)的远端，其中远端指远离与结构色检测区域交界面的一端；心肌细胞生长在两段心肌细胞生长区域(生物相容性水凝胶部分)，在异质结构的结构色微纤维两处被固定的情况下，结构色检测区域(二氧化硅非密堆积胶体晶体部分)两侧的心肌细胞收缩将通过类似“拔河”的方式从左右两个方向拉动其产生形变和结构色变化，将心肌力学信号转为光学信号，从而检测心肌细胞。
进一步，本发明提供一种异质结构的结构色微纤维的心肌细胞检测方法，还可以具有这样的特征：所述异质结构的结构色微纤维用作心肌细胞培养基底，具体培养过程为：将制备得到的所述异质结构的结构色微纤维灭菌后，置于干净的细胞培养皿中；心肌细胞用培养基充分分散后形成细胞悬液，将细胞悬液滴加入置有异质结构的结构色微纤维的细胞培养皿中，放于37℃、5％CO2培养箱中培养1天；待细胞黏附于异质结构的结构色微纤维的生物相容性水凝胶部分后，将异质结构的结构色微纤维转移至新的培养环境，并将其固定；每天更换37℃预热的培养基，观察结构色检测区域。
当心肌恢复自主跳动，其周期性收缩会拉动异质结构的结构色微纤维中结构色检测区域(二氧化硅非密堆积胶体晶体部分)并导致其发生形变和结构色变化，从而实现心肌细胞的动态检测。通过对异质结构的结构色微纤维的结构色检测区域(二氧化硅非密堆积胶体晶体部分)进行光谱统计，可以得到心肌细胞收缩力大小和跳动频率的相关信息。
本发明的有益效果在于：
一、本发明以轴向异质结构的结构色微纤维为心肌细胞培养和传感基底，具有便捷、灵敏、实时、可视化检测传感的特点。具体的，本发明提出的结构色微纤维是一种轴向异质的纤维，将光学传感区与细胞生长区分开；细胞不黏附在光学传感区域，因此细胞的生理活动不会影响该区域的表面结构，保证了光学信号的稳定性、灵敏性和准确性。
二、本发明以微流控芯片为异质结构的结构色微纤维的制备平台，制备方法简单、操作方便、可重复利用，且所制备的微纤维形貌、组分高度可控。具体的，各组分材料可直接通过紫外聚合预凝胶溶液一步制得，具有更易制备、操作简单、光学特性更可控等优点。
三、本发明设计的基于异质结构的结构色微纤维的心肌细胞检测方法可以用于心肌药物的筛选和评估，具体的，本发明的心肌细胞检测方法是基于微纤维轴向形变的方法，即心肌细胞收缩时，将拉动结构色光学传感区域产生形变(被拉伸变长)，改变非密堆积纤维中胶体粒子间距，进而产生结构色及对应光谱变化。且基于轴向拉伸的光学信号转换方法具有更好的重复性，对更微小的心肌细胞收缩力具有更高的传感稳定性和灵敏性。此外，还可通过不同结构色作为多元编码，实现多组药物的同时测试和评估。
附图说明
图1是双组分异质结构结构色微纤维制备过程示意图；其中1为注液口，2为二氧化硅非密堆积胶体晶体预凝胶预聚液，3为生物相容性水凝胶溶液预聚液，4为收集管，5为紫外灯和紫外光；
图2是双组分异质结构结构色微纤维的图片；
图3是单端拉伸模式下双组分异质结构结构色微纤维的心肌检测示意图；其中1为固定器，2为拉伸前的结构色检测区域及局部放大图，3为拉伸前的心肌细胞生长区域及局部放大细胞图，4为拉伸后的结构色检测区域及局部放大图，5为拉伸后的心肌细胞生长区域及局部放大细胞图；
图4是心肌细胞单端拉伸双组分异质结构结构色微纤维拉伸和收缩半个循环的图片；
图5是多组分异质结构结构色微纤维的图片；
图6是心肌细胞两端拉伸多组分异质结构结构色微纤维拉伸和收缩半个循环的图片；
图7是两端拉伸模式下多组分异质结构结构色微纤维的心肌检测示意图；其中1为固定器，2为二氧化硅浓度较低的结构色检测区域，3为二氧化硅浓度中等的结构色检测区域，4为二氧化硅浓度较高的结构色检测区域，5为心肌细胞生长区域；
图8为不同培养条件下结构色光谱变化，其中a为普通培养基，b为异丙肾上腺素，c为艾司洛尔。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
本实施例提供一种双组分异质结构结构色微纤维的制备方法及其基于单端拉伸的心肌细胞检测方法。
制备方法过程如图1所示：用内径200μm疏水的毛细管作为收集管。将内径300μm的毛细管在喷枪外焰中烧热并拉长，形成锥形前端，截取两段合适长度的锥形前端毛细管用作注液口，注液口锥形前端均与收集管连接相通，组装成微流控芯片。
配置15％(w/v)的甲基丙烯酸酯化明胶(GelMA)水溶液，将磺酸根修饰的二氧化硅纳米粒子(粒径约145nm)按12％(w/v)的浓度分散在15％(w/v)聚丙烯酰胺(AAm)∶N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(Bis、交联剂)为29∶1的水溶液，上述两种溶液分别加入1％(v/v)光引发剂(2-羟基-2甲基苯丙酮)配成水凝胶预聚液。
将两种水凝胶预聚液加入到注射器中，通过PE软管连接到微流控芯片的注液口，并将注射器安装在蠕动泵上。以0.5mL/h的流速交替泵入两种预聚液，将收集管暴露在紫外下，即可在收集管末端得到聚合的双组分异质结构结构色微纤维，如图2中d所示。
其中，甲基丙烯酸酯化明胶溶液的浓度还可以为10～30％范围中的任意浓度；磺酸根修饰的二氧化硅粒子的分散浓度也可以为5％-60％范围中的任意浓度，磺酸根修饰的二氧化硅粒子浓度不同，所展现的结构色不同，例如，当磺酸根修饰的二氧化硅纳米粒子的分散浓度为35％、25％和20％所得到的双组分异质结构结构色微纤维如图2中a-c所示。
含交联剂Bis的聚丙烯酰胺水溶液还可以替换为丙烯酰胺(AAm)、异丙基丙烯酰胺(NIPAM)、聚乙二醇双丙烯酸酯(PEGDA)中的一种或两种以上材料的水溶液，其中含有丙烯酰胺和/或异丙基丙烯酰胺材料的水溶液中还需要添加有交联剂。
基于单端拉伸的双组分异质结构结构色微纤维的心肌细胞检测方法：提取新生乳大鼠心肌细胞，配置成密度为106个/mL的细胞悬液。制备所得的双组分异质结构结构色微纤维经75％酒精浸泡、紫外照射充分灭菌后，将其放置在细胞瓶培养皿中，并加入心肌细胞悬液。放于37℃、5％CO2培养箱中培养1天。待细胞贴壁后，用平头镊子轻轻夹起微纤维结构色一端，将其转移至新的培养环境中，并将两端固定；每天更换37℃预热的培养基。当心肌细胞恢复周期性收缩后，异质结构结构色微纤维的结构色检测区域会在心肌细胞的带动下产生同步的周期性拉伸和收缩，并产生颜色变化，即可实时反馈心肌细胞生理状态，如图3所示。图4为心肌细胞单端拉伸双组分异质结构结构色微纤维拉伸和收缩半个循环的图片。
实施例2
本实施例提供一种双组分异质结构结构色微纤维的制备方法及其基于单端拉伸的心肌细胞检测方法。
制备方法：用内径300μm疏水的毛细管作为收集管。将内径500μm的毛细管在喷枪外焰中烧热并拉长，形成锥形前端，截取4段合适长度的锥形前端毛细管用作注液口，注液口锥形前端均与收集管连接相通，组装成微流控芯片。
配置20％(w/v)的GelMA水溶液；将聚乙二醇双丙烯酸酯(PEGDA)与AAm(含1/30的交联剂Bis)按2∶15的比例配制成复合水凝胶前聚体溶液，将磺酸根修饰的二氧化硅纳米粒子(粒径约145nm)分别按15％，23％，35％(w/v)的浓度分散在15％(w/v)的复合水凝胶前聚体溶液中，其分别显示红、绿、蓝结构色；上述四种溶液分别加入1％(v/v)光引发剂(2-羟基-2甲基苯丙酮)配成水凝胶预聚液。
将四种水凝胶预聚液加入到注射器中，通过软管连接到微流控芯片的注液口，并将注射器安装在蠕动泵上。以0.25mL/h的流速交替泵入GelMA预聚液和一种含二氧化硅的预聚液，将收集管暴露在紫外下，即可在收集管末端得到聚合的多组分异质结构结构色微纤维。通过控制通入组分，可以制备得到具有GelMA-红-GelMA-红、GelMA-红-GelMA-绿、GelMA-红-GelMA-蓝的多组分异质结构结构色微纤维，依次如图5中a-c所示。
基于两端拉伸的多组分异质结构结构色微纤维的心肌细胞检测方法：复苏由诱导多能干细胞分化的心肌细胞(iPSC-CMs)，配置成密度为5*105个/mL的细胞悬液。制备所得多组分异质结构结构色微纤维充分灭菌后，将其放置在不同的细胞瓶培养皿中，并加入细胞悬液。放于37℃、5％CO2培养箱中培养1天。待细胞贴壁后，用平头镊子轻轻夹起微纤维游离的结构色一端，将其转移至新的培养环境中，并将纤维红色部分两边的GelMA段远离红色部分的两端固定。当心肌细胞恢复周期性收缩后，异质结构微纤维的结构色区域会在心肌细胞的带动下产生类似“拔河”的同步的周期性拉伸和收缩，产生颜色变化。图6为心肌细胞两端拉伸多组分异质结构结构色微纤维拉伸和收缩半个循环的图片。
如图7所示，通过红-红、红-绿、红-蓝三种颜色编码，分别对应普通培养基、加入异丙肾上腺素的培养基和加入艾司洛尔的培养基，以这三种多组分异质结构结构色微纤维中夹在两段GelMA段中的红色区域作为传感区域，通过观察、记录、分析其光谱位移，得到药物对iPSC-CMs的作用，实现心肌监测和药物筛选。图8为不同培养条件下结构色光谱变化，由图可知，异丙肾上腺素对心肌细胞周期性收缩有正向作用，对心肌细胞的恢复有积极影响，而艾司洛尔对心肌产生的作用在收缩力上影响较小，主要影响收缩频率。

Claims (8)

1.一种异质结构的结构色微纤维的制备方法，其特征在于：
采用毛细管构建微流控芯片用于异质结构的结构色微纤维制备平台，配置预聚液作为纤维组分，预聚液包括生物相容性水凝胶溶液和至少一种浓度的二氧化硅非密堆积胶体晶体预凝胶，各预聚液中分别加入有光引发剂；
所述生物相容性水凝胶溶液为10～30%质量体积比浓度的甲基丙烯酸酯化明胶溶液；所述二氧化硅非密堆积胶体晶体预凝胶为磺酸根修饰的二氧化硅粒子分散在丙烯酰胺、异丙基丙烯酰胺、聚乙二醇双丙烯酸酯的一种或两种以上材料的水溶液中，其中含有丙烯酰胺和/或异丙基丙烯酰胺材料的水溶液中还添加有交联剂；磺酸根修饰的二氧化硅粒子的质量体积比浓度为5%-60%；
两类预聚液经由微流控芯片程序化交替注入收集管中，通过紫外光持续照射收集管部分，获得异质结构的结构色微纤维。
2.根据权利要求1所述的异质结构的结构色微纤维的制备方法，其特征在于：
其中，构建微流控芯片的方法为：根据所需结构色微纤维直径，选择同样管径的毛细管作为收集管；根据所需组分数量，设置相同数量的毛细管注液口，并在玻片上与收集管组装成微流控芯片，收集管和注液口均固定在玻片上，注液口均收集管连接相通；
所述生物相容性水凝胶预聚液和二氧化硅非密堆积胶体晶体预聚液，分别经由注射器、软管注入注液口，接入微流控芯片，通过程序化交替地向微流控芯片中泵入生物相容性水凝胶预聚液和二氧化硅非密堆积胶体晶体预聚液。
3.权利要求1-2任意一项所述方法制备的异质结构的结构色微纤维。
4.根据权利要求3所述的异质结构的结构色微纤维，其特征在于：
直径为150-600 μm，长度为500-3000 mm。
5.如权利要求3所述的异质结构的结构色微纤维的心肌细胞检测方法，其特征在于：
将所述异质结构的结构色微纤维用作心肌细胞培养基底，其生物相容性水凝胶溶液形成的部分为心肌细胞生长区域，心肌细胞在心肌细胞生长区域上生长，二氧化硅非密堆积胶体晶体预凝胶形成的部分为结构色检测区域；
当心肌细胞恢复自主跳动后，其周期性收缩拉动检测区域，检测区域产生与心肌收缩周期同步的结构色变化，从而检测心肌细胞。
6.根据权利要求5所述的异质结构的结构色微纤维的心肌细胞检测方法，其特征在于：
单端拉伸的心肌细胞检测方法：分别固定异质结构的结构色微纤维中相邻的结构色检测区域远端与心肌细胞生长区域远端；
心肌细胞只生长在心肌细胞生长区域，在异质结构的结构色微纤维两端被固定的情况下，心肌细胞收缩将经由两个区域的交界面将力学信号传导到结构色检测区域，进而使其产生形变和结构色变化，从而检测心肌细胞。
7.根据权利要求5所述的异质结构的结构色微纤维的心肌细胞检测方法，其特征在于：
两端拉伸的心肌细胞检测方法：分别固定异质结构的结构色微纤维中由一段结构色检测区域分隔开的两个心肌细胞生长区域的远端；
心肌细胞生长在两段心肌细胞生长区域，在异质结构的结构色微纤维两处被固定的情况下，结构色检测区域两侧的心肌细胞收缩将从左右两个方向拉动其产生形变和结构色变化，从而检测心肌细胞。
8.根据权利要求5所述的异质结构的结构色微纤维的心肌细胞检测方法，其特征在于：
所述异质结构的结构色微纤维用作心肌细胞培养基底，具体培养过程为：
将制备得到的所述异质结构的结构色微纤维灭菌后，置于干净的细胞培养皿中；
心肌细胞用培养基充分分散后形成细胞悬液，将细胞悬液滴加入置有异质结构的结构色微纤维的细胞培养皿中，放于37℃、5% CO2培养箱中培养1天；
待细胞黏附于异质结构的结构色微纤维的生物相容性水凝胶部分后，将异质结构的结构色微纤维转移至新的培养环境，并将其固定；
每天更换37℃预热的培养基，观察结构色检测区域。
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