CN105543091A - 一种基于肥大细胞-巨噬细胞共培养微流控芯片的构建及其应用 - Google Patents

一种基于肥大细胞-巨噬细胞共培养微流控芯片的构建及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于肥大细胞-巨噬细胞共培养微流控芯片的构建及其应用，属于食品质量分析检测领域。本发明采用特殊流道设计、“张力阀道”实现了对两种细胞的非直接接触共培养，从而能够精确控制两种细胞共培养过程以及有效的研究细胞旁分泌机制；采用电化学技术与微流控芯片相结合，在PDMS基底表面电镀金电极采用电化学阻抗信号对共培养中细胞的生理活动实时监测。通过以上设计，构建了用于食品过敏原识别评价研究的细胞共培养微流控芯片平台。本发明通过构建二维细胞的PDMS微流控芯片平台，成功应用于食品过敏原识别评价研究。

Description

一种基于肥大细胞-巨噬细胞共培养微流控芯片的构建及其应用
技术领域
本发明涉及一种基于肥大细胞-巨噬细胞共培养微流控芯片的构建及其应用，属于食品质量分析检测领域。
背景技术
食物过敏原是指食物中能引起机体免疫反应的抗原分子，水产品作为人类重要的食源性蛋白质的主要来源，其中虾、蟹等甲壳类水产品所引起的过敏症在临床反应中最为常见。食品过敏症是在全世界范围内广泛流行的一类常见变态反应性疾病，其具有症状种类繁多、病症情况复杂、危害广泛、难以彻底根治的特点，长期以来一直都是困扰医学界的一大难题。近年来，在全世界范围内，随着食品过敏症的发病率不断上升，对食物过敏的预防和检测已经成为一项迫切的需求，但由于目前尚无有效治疗食物过敏症的方法，而避免进食含有致敏原的食物是唯一的预防手段，因此建立一种或多种灵敏检测过敏原的分析方法显得尤为重要。
现有检测过敏病症的方法主要分为以下两大类：体内检测和体外检测。虽然体内检测对医生或是病人来说都是最方便可靠的方法，但是其潜在的风险无法忽视，需要谨慎对待。在我国，对过敏原的体外检测尚未得到大力重视，传统的诊断模式依旧在使用，这不但不利于对过敏疾病的及时确诊和治疗，也会给病人带来额外的身心痛苦。由于过敏原种类众多，且因同个体而多变化，因此建立多种快速灵检测过敏原的方法来取代体内试验成为迫切需要。
细胞是形成有机体形态和功能的基本组成单位，对研究机体结构和探索生命活动具有重要意义。细胞传感技术以活细胞作为探测元件，通过对活细胞的基本生理性质或细胞对被测物的响应进行检测，从而定性定量地确定细胞的生理状态或被检物的含量。因此，细胞传感技术对于研究细胞的结构和功能、探索生命的活动和规律、疾病的诊断和治疗、药物的设计和筛选、食品安全的监督和检测等都具有十分重大的意义。随着生命工程技术的发展与信息技术的飞跃，各学科间的交叉融合，使得细胞传感检测研究得到了飞速发展，新型的纳米材料、荧光及电化学细胞传感器不断问世，极大推动了生物传感技术地迅猛发展。
近年来，微流控细胞芯片己被广泛运用于临床检测和疾病治疗领域，通过在微型芯片上集成多种功能单元，可实现对被检样品的完整检测，包括进样、反应、分离、输出等操作。早在1998年，Whitesides等就提出了采用软光刻技术在聚二甲基硅氧烷(PDMS)基础上制备微流控芯片的想法，并开发了多层微流通道实现了微流泵、阀等对微流体的良好控制。相比传统的分析方法，微流控芯片具有样品量需求量少，污染小，响应时间短，分析效率高的特点。此外PDMS材料透明便于观察，有利于精确控制实验过程，满足批量化生产和高通量的需求。固定有细胞的微流控芯片能在细胞和分子水平上对细胞活动(如细胞增殖生长、固定迁移、内吞外排、药物作用)等进行分析。
发明内容
针对现有技术存在的上述不足，本发明建立了肥大细胞与巨噬细胞共培养体系(二维细胞)的PDMS微流控芯片平台，成功应用于食品过敏原识别评价研究。本发明实现肥了大细胞与巨噬细胞共培养体系(二维细胞)的PDMS微流控芯片平台。采用特殊流道设计，采用“张力阀道”实现了对两种细胞的非直接接触共培养，从而能够精确控制两种细胞共培养过程，从而有效的研究细胞旁分泌机制，以及通过在PDMS基底表面电镀金电极，借助电化学阻抗信号对共培养中细胞的生理活动实时监测。通过以上设计，构建了用于食品过敏原识别评价研究的细胞共培养微流控芯片平台。
本发明的第一个目的是提供一种PDMS微流控芯片，所述PDMS微流控芯片的主要结构－PDMS流道层，由两条平行等长的主通道构成，通道两端设有插槽以便注入液体；两条主通道通过一条毛细管道垂直联通。
所述PDMS微流控芯片是将电化学技术与微流控芯片相结合设计得到的，由PDMS流道层和镀金硅片层这两部分组成；所述毛细管道的两端设计有插孔，用于插入微型参比电极；每一条主通道底面电镀一枚金电极；所述PDMS微流控芯片还包括键合在PDMS流道层下的镀金硅片层，镀金硅片层表面电镀四组金电极(如图2)，每个工作电极的引导线将工作电极和芯片边缘的金手指(供电极夹固定)相连接，在工作电极的前方是半圈电镀金层作为对电极，其也由电镀导线连接到芯片边缘的金手指上；所述微流控芯片的PDMS流道层与镀金硅片层键合在一起构成完整芯片。
所述PDMS流道层全长44670.83μm、宽31200μm、厚4mm，由2条宽1000μm，长31673.16μm的平行主通道构成；每条主通道的两端是直径为2500μm的插槽，通过该插槽细胞悬液、培养液、以及致敏药物能够由此注入两条主流道中；两条主通道中间是有一条直径为100μm、长10000μm的张力阀道，即毛细管道。
所述PDMS微流控芯片是将电化学技术与微流控芯片相结合设计得到的；在毛细管道两端设计出直径为2000μm的插孔，用于插入微型Ag/AgCl参比电极；每一条主通道底面电镀一枚金电极；在PDMS流道层下键合有镀金硅片层，镀金硅片层电镀四组金电极，每个工作电极的直径为1000μm，直径为500μm引导线将工作电极和芯片边缘宽为4000μm的金手指相连接，在工作电极的前方是半圈宽为1000μm的电镀金层作为对电极，对电极也由宽500μm的电镀导线连接到芯片边缘的金手指上；将PDMS流道层与镀金硅片层键合在一起构成完整得到PDMS微流控芯片。
所述PDMS微流控芯片中，当两条主通道内同时同向等速流动细胞悬液或者培养液时，毛细管道的两端因为压力相同，使平行的两条主通道连通；而当平行主通道的其中一个主通道停止泵入流体，则另一个主通道内的液体就会通过毛细管道流入该通道内，从而实现两平行主通道的联通。即当压力相同时，两条主通道自己连通；而压力不同时，一条主通道的液体通过压力差流过毛细管通道流入另一个通道。
本发明的第二个目的是提供一种细胞共培养的方法，是利用所述PDMS微流控芯片进行共培养。
在本发明的一种实施方式中，所述细胞共培养，是指共培养肥大细胞和巨噬细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述细胞共培养，是将RBL-2H3肥大细胞和ANA-1巨噬细胞先在培养皿中培养2-3天，使细胞处于对数生长期，然后再用于芯片上培养。
在本发明的一种实施方式中，所述芯片上的培养，是使用注射器分别吸取肥大细胞悬液和巨噬细胞悬液、拍气泡，然后定速控制(速度一般控制在200μL/h～0.1mL/h)，使两个注射器中的细胞悬液以相同流速注入芯片中，当芯片两条通道内注满两种细胞悬液后，同时停止两台注射泵的运作，将芯片放入CO2培养箱中孵育6小时(保证细胞的贴壁，防止培养基的流动冲刷对细胞生长的影响)，然后将注射器更换为不含细胞的新鲜培养液(用于肥大细胞的为DMEM、巨噬细胞的为RPMI-1640)，再使注射器中培养液同时启动两台注射泵持续泵入(端口不封闭)，以相同流速继续培养细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述芯片上的培养，当需要研究巨噬细胞与肥大细胞的相互作用时，在培养箱中孵育后，只启动两台泵中的一台(另一端封闭)，即研究巨噬细胞对肥大细胞影响时只启动巨噬细胞一端的泵，反之则只启动肥大细胞一端的泵，从而使一条流道内的细胞代谢物随着液体通过张力阀流入另一条细胞流道内，达到共培养的目的。
在本发明的一种实施方式中，所述PDMS微流控芯片进行共培养，指经高压灭菌和紫外照射后的微流控芯片，用5ml注射器吸取细胞悬液后并架设在XSP01注射泵上，采用安装在笔记本上的操作程序控制泵的运作，调节泵的流速将细胞悬液注入到微通道中；待注射泵将细胞悬液把细胞芯片的流道充满时，停止泵的流速，将芯片放置于CO2培养箱中孵育6小时，保证细胞的贴壁，防止培养基的流动冲刷对细胞生长的影响。待细胞完全贴壁之后，将内装不含细胞的新鲜培养液的注射器泵连接芯片一端的进口，并使用电脑软件调节一定的流速，向芯片内连续不断的供给培养液，从而达到连续培养的目的。
本发明的第三个目的是提供所述PDMS微流控芯片在食品过敏原检测方面的应用。
所述应用，是在PDMS微流控芯片中的巨噬细胞和肥大细胞共培养体系、巨噬细胞单独培养体系或者肥大细胞单独培养体系中，注射入不同浓度的过敏原溶液处理细胞，处理时间为12h-24h，采用了交流阻抗-时间关系(Impedance-Time)程序对不同细胞不同时间内阻抗信号的变化进行监测。
在本发明的一种实施方式中，所述采用交流阻抗-时间关系进行检测，是在频率为25kHz、正弦交流电压幅值为50mV下进行，每个信号点采集时间间隔2s。
在本发明的一种实施方式中，所述过敏原为DNP-BSA，是用10-3ng/mL、10-1ng/mL、10ng/mLDNP-BSA处理巨噬细胞和肥大细胞共培养体系、巨噬细胞单独培养体系及肥大细胞单独培养体系，并且使用lμg/mL的脂多糖(LPS)阳性对照；分别收集不同培养方式下细胞芯片中相应培养体系，并测定其中的白细胞介素6(IL-6)、免疫干扰素(INF-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的分泌。
本发明有如下的有益效果：
(1)建立了微流控细胞共培养芯片，对ANA-1巨噬细胞和RBL-2H3肥大细胞进行独立培养或者共培养。
(2)采用特殊流道设计，采用“张力阀道”实现了对两种细胞的非直接接触共培养，从而能够精确控制两种细胞共培养过程以及有效的研究细胞旁分泌机制。通过芯片中两条主流道之间利用“毛细管道”进行连接，利用了液面张力作用原理，可以自由控制巨噬细胞与肥大细胞之间的接触或者隔离，达到自由共培养的目的。
(3)创造性地将电化学技术与微流控芯片技术相结合，在PDMS基底表面电镀金电极在微流控芯片中集成了电化学三电极系统，并采用电化学阻抗信号对芯片中细胞的生长状态以及过敏原对细胞共培养体系的影响进行实时监测。
(4)在建立ANA-1巨噬细胞和RBL-2H3肥大细胞的共培养体系后，通过ELISA法检测巨噬细胞和肥大细胞单独培养或两种细胞共培养中炎症因子IL-6、TNF-α、MCP-1的分泌量，观察过敏原模型物质DNP-BSA对细胞共培养体系产生炎症因子TNF-α、IL-6、INF-γ的影响。
(5)采用流道内的电化学三电极系统对共培养体系中巨噬细胞、肥大细胞单独培养和共培养过程进行了实时监测，以细胞数来反应细胞阻抗值的变化趋势，同时该结果与ELSIA法检测共培养体系炎症因子的分泌结果相吻合，证明了该电化学检测系统的成功构建，为该共培养芯片检测食品过敏原做好的基础铺垫。
附图说明
图1：微流控芯片PDMS层尺寸图(单位μm)；
图2：微流控芯片镀金层尺寸图(单位μm)；
图3：微流控芯片装配示意图(单位μm)；
图4：微流控注射泵软件操作程序工作界面；
图5：DNP-BSA对微流控芯片细胞共培养体系影响。
具体实施方式
实施例1微流控芯片实物图
微流控芯片实物图如图1所示，具体操作如下：
(1)第一部分是芯片的主要结构－PDMS流道层，全长44670.83μm，宽31200μm，厚4mm；在芯片上设计两个宽1000μm，长31673.16μm的长直流道，两端分别配置有直径为2500μm的进出孔。
(2)在两个流道之间连接了一条长10mm、宽100μm的毛细管道。
(3)在毛细管道的两端设置直径2mm的开孔，便于微型参比电极的插入。
(4)在细胞芯片底表面电镀集成4组金电极，配合插入式的参比电极构成三电极系统。
(5)所有芯片通道的高度皆为100μm。
实施例2微流控芯片镀金层尺寸图
如图2所示，具体操作如下：
(1)在其表面电镀四组金电极，每个工作电极的直径为1000μm。
(2)直径为500μm引导线将工作电极和芯片边缘宽为4000μm的金手指(供电极夹固定)相连接，在工作电极的前方是半圈宽为1000μm的电镀金层(对电极)，其也由宽500μm的电镀导线连接到芯片边缘的金手指上。
实施例3微流控芯片装配示意图
制作整个微流控芯片采用了软光刻方法，以聚二甲基硅氧烷为主要材料进行制作，该材料具有良好生物相容性和透气性的特点(如图3)。具体操作如下：
(1)采用标准光刻工艺在清洗过的硅片上制作SU-8负胶(SU82075)母板，母板经过前烘、掩膜覆盖、紫外曝光、后烘和显影等工序后完成基本制作。
(2)其次，采用浇筑法制做出含有微通道的PDMS基片，模具在65℃坚膜5min后，将抽真空除气泡后的PDMS预聚物和交联剂(质量比为10:1)均匀混合后倒入模具内并放入80℃烘箱内烘干2小时。
(3)聚合完成后，把PDMS从模具里剥离下来，在PDMS层上相应位置打钻出进样孔、出样孔、电极插孔等孔道。
(4)用等离子体活化PDMS基片表面并将之不可逆地封接到载玻片上，制得完整的PDMS细胞培养芯片，并将其放入60℃烘箱里放置2小时以增强键合效果。
实施例4微流控注射泵软件操作程序工作界面
对于肥大细胞和巨噬细胞共培养的具体操作，说明如下：
首先RBL-2H3肥大细胞采用85％的DMEM培养基(添加NaHCO31.5g/L，丙酮酸钠0.11g/L)加15％优质热灭活胎牛血清进行培养，并添加100U/mL的青霉素和链霉素。培养环境为细胞培养箱，95％的空气，5％的二氧化碳，37℃。其次ANA-1巨噬细胞使用90％的RPMI-1640(添加NaHCO31.5g/L,葡萄糖2.5g/L,丙酮酸钠0.11g/L)加10％胎牛血清进行培养，并添加100U/mL的青霉素和链霉素。培养环境为细胞培养箱，95％的空气，5％的二氧化碳，37℃。RBL-2H3肥大细胞和ANA-1巨噬细胞先在培养皿中培养2-3天，然后再用于芯片上培养，所有的实验都在细胞处于对数生长期进行。
(1)分别取用2支5mL的一次性医用注射器，从制备好的肥大细胞悬液和巨噬细胞悬液中吸取3mL，轻轻混合均匀后手动排气泡。
(2)将2支注射器分别安装在XSP01流动注射泵上后，利用笔记本上的控制程序(如图4)对2个注射泵进行定速控制(速度一般控制在200μL/h～0.1mL/h)，使两个注射泵以相同流速向芯片中同时注入细胞悬液，利用张力阀道两端压力相同，主流道内流体不会向摩擦力大的空间流动的原理，保证上下两流道内的细胞悬液在注射过程中不会彼此接触。
(3)当芯片两条通道内注满两种细胞悬液后，同时停止两台注射泵的运作，将芯片放入CO2培养箱中孵育6小时。
(4)分别更换内含3mLDMEM(肥大细胞)和RPMI-1640(巨噬细胞)培养液的注射器，再同时启动两台注射泵持续泵入，不封闭，以相同流速继续培养细胞。当要研究巨噬细胞-肥大细胞的相互作用时，前三步操作步骤同上(1)(2)(3)，但区别在第四步，即只启动两台泵中的一台(另一端封闭)，研究巨噬细胞对肥大细胞影响时只启动巨噬细胞一端的泵，反之则只启动肥大细胞一端的泵，从而使一条流道内的细胞代谢物随着液体通过张力阀流入另一条细胞流道内，达到共培养的目的。
实施例5DNP-BSA对细胞共培养体系炎症因子IL-6、INF-γ、TNF-α生成及表达的影响
(A)共培养细胞的培养与处理
(1)采用高糖DMEM培养液(含各种氨基酸和葡萄糖的培养基)稀释DNP-BSA(过敏原标准品)贮存液(100ng/L)，按不同实验目的稀释为10-3ng/L－10ng/L梯度，使用不同浓度的过敏原标准品来处理共培养体系中无牛血清饥饿培养的细胞12小时、24小时、48小时。
(2)在细胞芯片中单独培养的巨噬细胞及肥大细胞中也加入含有相应剂量的DNP-BSA培养液作为对照。
(B)共培养体系细胞上清液中IL-6、TNF-α、INF-γ分泌量的ELISA检测
按上述方法用不同浓度DNP-BSA处理细胞12小时、24小时后，从细胞芯片废液出口端接取细胞培养后上清液，2500转离心5min来去除细胞碎片，－20℃保存，用于检测共培养后肥大细胞的三种炎症因子IL-6、TNF-α、INF-γ的分泌量。
实施例6电化学检测DNP对细胞共培养体系中肥大细胞的影响
为了测试细胞芯片内共培养体系中不同细胞不同时间内阻抗信号的变化，基于电化学无损交流小信号系统来对细胞交流阻抗信号进行测试。具体操作如下：
(1)整个测试保持在培养箱环境下进行，即5％CO2和37℃的恒温，以避免微流控芯片在整个电化学测试过程中不会受到外界环境如温度，二氧化碳浓度变化的影响。
(2)通过导线将微流控芯片与培养箱外的辰华电化学工作站(上海辰华CHI660E)相连接，其中参比工作电极和对电极是电镀在流道内，而参比电极是订制的微型特制电极，可以方便地插在主流道与毛细管道连接的开孔处，从而与工作电极和对电极构成三电极系统，对工作电极表面的细胞阻抗值进行实时监测。
(3)当细胞芯片在培养箱内稳定5～10min后即开始进行频谱扫描测试。
(4)测定不同扰动振幅(50～900mV)下细胞(1×106个/mL)的阻抗谱，确定扰动振幅。
(5)在优化扰动振幅下，在扫描频率1～100kHz。
(6)优化最佳扫描频率，最终确定在频率为25kHz、正弦交流电压幅值为50mV、下对芯片内细胞阻抗与时间的阻抗关系曲线进行长时程监测，每个信号点采集时间间隔2s。
实施例7DNP-BSA对微流控芯片细胞共培养体系影响
通过上文对两种细胞共培养细胞生长曲线的测量，发现肥大细胞在巨噬细胞的影响下生长代谢有一定程度的增长，推测巨噬细胞上清液中具有促肥大细胞的生长因子以及信号传递物质，与实验之前的推测相符合。故采用含有不同浓度DNP-BSA的培养液加入到整个共培养体系中，观测肥大细胞电阻抗信号的变化，以此来反推共培养体系可以用来检测过敏原的推论。具体结果如下：
实验中取已共培养20h达到稳定期的肥大细胞的细胞指数(CI)值为起点，由图5可以发现，继续稳定培养1h后开始加入含有10-3ng/mL、10-2ng/mL、10-1ng/mL、1ng/mL和10ng/mLDNP-BSA的培养液，在不同浓度的DNP-BSA作用下，肥大细胞的生长开始被抑制，表现为CI值不同程度的下降，且CI的下降速度及幅度都具有浓度、时间依赖性。10-1ng/mL的DNP-BSA组，CI值下降最为明显，速度也最快，其他浓度组跟据浓度值的不同也有减小的趋势。但是1ng/mL、10ng/mL两个高浓度组的CI值下降幅度低于10-1ng/mL组，且两曲线几乎重合，说明在没有DNP-IgE介导(DNP-IgE为抗体，作用机理：肥大细胞识别过敏原并发生过敏反应必须在特异性抗原IgE介导下完成，即DNP-BSA必须通过抗体DNP-IgE，才能作用到肥大细胞，产生过敏炎症反应)的条件下，通过共培养系统来识别、呈递抗原信号只能在一定程度上使肥大细胞发生脱颗粒反应，该方法存在一定的饱和值，只能对一定浓度范围内的抗原进行定性识别。此外10-3ng/mL、10-2ng/mL的过敏原浓度太低，说明该体系已经不敏感，证明了上述推测。此时control组为阴性对照组，培养液中没有药物作用，细胞指数(CI)继续保持稳定，而只用DNP-BSA加入单独培养的肥大细胞为阳性对照组，结果显示肥大细胞CI值没有变化，因为在没有DNP-IgE介导的情况下，肥大细胞不能特异性识别DNP-BSA。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种PDMS微流控芯片，其特征在于，所述PDMS微流控芯片的主要结构－PDMS流道层，由两条平行等长的主通道构成，通道两端设有插槽以便注入液体；两条主通道通过一条毛细管道垂直联通。
2.根据权利要求1所述的PDMS微流控芯片，其特征在于，所述毛细管道的两端设计有插孔，用于插入微型参比电极；每一条主通道底面电镀一枚金电极；所述PDMS微流控芯片还包括键合在PDMS流道层下的镀金硅片层，镀金硅片层表面电镀四组金电极，每个工作电极的引导线将工作电极和芯片边缘的金手指相连接，在工作电极的前方是半圈电镀金层作为对电极，其也由电镀导线连接到芯片边缘的金手指上；所述微流控芯片的PDMS流道层与镀金硅片层键合在一起构成完整芯片。
3.根据权利要求1所述的PDMS微流控芯片，其特征在于，所述PDMS流道层全长44670.83μm、宽31200μm、厚4mm，由2条宽1000μm，长31673.16μm的平行主通道构成；每条主通道的两端是直径为2500μm的插槽，通过该插槽细胞悬液、培养液、以及致敏药物能够由此注入两条主流道中；两条主通道中间是有一条直径为100μm、长10000μm的张力阀道，即毛细管道。
4.根据权利要求1所述的PDMS微流控芯片，其特征在于，所述PDMS微流控芯片是将电化学技术与微流控芯片相结合设计得到的；在毛细管道两端设计出直径为2000μm的插孔，用于插入微型Ag/AgCl参比电极；每一条主通道底面电镀一枚金电极；在PDMS流道层下键合有镀金硅片层，镀金硅片层电镀四组金电极，每个工作电极的直径为1000μm，直径为500μm引导线将工作电极和芯片边缘宽为4000μm的金手指相连接，在工作电极的前方是半圈宽为1000μm的电镀金层作为对电极，对电极也由宽500μm的电镀导线连接到芯片边缘的金手指上；将PDMS流道层与镀金硅片层键合在一起构成完整得到PDMS微流控芯片。
5.根据权利要求1所述的PDMS微流控芯片，其特征在于，所述PDMS微流控芯片中，当两条主通道内同时同向等速流动细胞悬液或者培养液时，毛细管道的两端因为压力相同，使平行的两条主通道连通；而当平行主通道的其中一个主通道停止泵入流体，则另一个主通道内的液体就会通过毛细管道流入该通道内，从而实现两平行主通道的联通。
6.一种细胞共培养的方法，其特征在于，所述方法是利用权利要求1-5任一所述PDMS微流控芯片。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法用于共培养肥大细胞与巨噬细胞，用于检测共培养对炎症因子IL-6、TNF-α、MCP-1的分泌量的影响。
8.权利要求1-5任一所述PDMS微流控芯片在食品过敏原检测方面的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用是在PDMS微流控芯片中的巨噬细胞和肥大细胞共培养体系、巨噬细胞单独培养体系或者肥大细胞单独培养体系中，注射入不同浓度的过敏原溶液处理细胞，处理时间为12h-24h，采用了交流阻抗-时间关系(Impedance-Time)程序对不同细胞不同时间内阻抗信号的变化进行监测。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述采用交流阻抗-时间关系进行检测，是在频率为25kHz、正弦交流电压幅值为50mV下进行，每个信号点采集时间间隔2s。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107983422A (zh) * 2016-10-26 2018-05-04 中国科学院大连化学物理研究所 基于双层pcb的pci引脚数字微流控芯片及其方法
CN108021041A (zh) * 2016-11-02 2018-05-11 中国科学院大连化学物理研究所 一种数字式微流控芯片液滴驱动控制系统及其控制方法
CN115350736A (zh) * 2022-08-22 2022-11-18 华东理工大学 一种皮肤炎症因子的检测装置和检测方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
孙秀兰 等: "生物芯片技术与食品分析", 《生物技术通报》 *
孙秀兰 等: "食品过敏原体外检测方法研究进展", 《东北农业大学学报》 *
蒋栋磊: "基于肥大细胞传感器检测食品过敏原蛋白技术研究", 《中国博士学位论文全文数据库，工程科技I辑》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107983422A (zh) * 2016-10-26 2018-05-04 中国科学院大连化学物理研究所 基于双层pcb的pci引脚数字微流控芯片及其方法
CN107983422B (zh) * 2016-10-26 2020-12-29 中国科学院大连化学物理研究所 基于双层pcb的pci引脚数字微流控芯片及其方法
CN108021041A (zh) * 2016-11-02 2018-05-11 中国科学院大连化学物理研究所 一种数字式微流控芯片液滴驱动控制系统及其控制方法
CN115350736A (zh) * 2022-08-22 2022-11-18 华东理工大学 一种皮肤炎症因子的检测装置和检测方法
CN115350736B (zh) * 2022-08-22 2023-09-19 华东理工大学 一种皮肤炎症因子的检测装置和检测方法

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