CN111514947B - 一种细胞电阻抗谱测量的微流控芯片 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种细胞电阻抗谱测量的微流控芯片，由上盖板和下基板组成，上盖板上开通孔构成流体入口和流体出口，下基板的上表面分布有正六边形微孔单元阵列以及微流体通道，每个正六边形微孔单元内部设置有细胞捕获阱，正六边形微孔单元上靠近细胞捕获阱相邻壁面设有一对测量电极，正六边形微孔单元之间通过微流体通道串联成一条液体通道，液体通道与上盖板的流体入口和流体出口相接处设有入口处蓄液池、出口处蓄液池，上盖板与下基板通过键合封接形成密封微流控芯片。本发明将单细胞捕获及细胞阻抗谱测量集成在单块微流控芯片上，通过提供相应的操作方法，实现快速获取并精确分析单细胞阻抗谱。
Description
技术领域：
本发明涉及一种细胞电阻抗谱测量的微流控芯片。
背景技术：
阻抗谱测量是通过在被测样品的两端施加小幅度的交流电压，然后通过信号分析仪，得出样品中的粒子群体的阻抗随频率的变化关系。阻抗谱测量是研究细胞或其他微纳米粒子的电特性的一种重要方法，能够实现对微纳粒子群体的表征。电阻抗测试和分析在药物筛选、疾病诊断及治疗、食品检验、环境监测等领域都得到了广泛的应用。面向生物样品的阻抗谱测量称为生物阻抗技术(Bio-impedance technology)，其具有快速、免标记、易操作的特点，逐步成为生物医学研究中一个有效的分析工具。
目前的阻抗谱测量技术面向的是细胞集群，对单个细胞的捕获和测量研究尚未完善，无法实现对细胞集群中的特定的某个单细胞进行测量。而在很多情况下，对单细胞阻抗谱的研究都很有必要且具有重要意义。例如癌症早期患者外周血液中含有从病灶脱离下来的循环肿瘤细胞(CTC，Circulating Tumor Cell)，其被医学界广泛视为癌症早期的标志性产物，通过阻抗谱参数之间的差异从数量繁多的血液细胞中辨别出循环肿瘤细胞，有利于癌症的及时诊断，提高治愈率。
因此，在继承上述阻抗谱测量的基本原理的基础上，如何实现对细胞群体中单个细胞进行阻抗测量是解决上述局限的关键问题。
发明内容：
本发明是为了解决上述现有技术存在的问题而提供一种细胞电阻抗谱测量的微流控芯片，能够从细胞悬浮液中快速提取单个细胞，并将单细胞捕捉、冲洗和阻抗谱测量集成在单个微流控芯片上，通过简单的操作，实现单细胞尺度阻抗谱的精确测量。
本发明所采用的技术方案有：一种细胞电阻抗谱测量的微流控芯片，由上盖板和下基板组成，所述上盖板上开通孔构成流体入口和流体出口，所述下基板的上表面分布有正六边形微孔单元阵列以及微流体通道，每个正六边形微孔单元内部设置有细胞捕获阱，所述正六边形微孔单元上靠近细胞捕获阱相邻壁面设有一对测量电极，所述正六边形微孔单元之间通过微流体通道串联成一条液体通道，所述液体通道与上盖板的流体入口和流体出口相接处设有入口处蓄液池、出口处蓄液池，所述上盖板与下基板通过键合封接形成密封微流控芯片。
进一步地，所述正六边形微孔单元阵列等间距错落排布，且相邻两排正六边形微孔单元之间由与正六边形边长等宽的微流体通道连通，组成“之”字形曲折通道，正六边形边长取值为100～200μm。
进一步地，所述细胞捕获阱由水平对称分布的两个弯折壁组成，两个弯折壁平行部分之间的距离为目标细胞直径的1.2～1.5倍，向内弯折部分开口之间的距离为目标细胞直径的0.5～0.8倍，弯折部分所成夹角为60～120°。
进一步地，所述细胞捕获阱窄口中心与正六边形微孔单元7最近顶角之间的距离为正六边形边长的0.2～0.5倍。
进一步地，所述细胞捕获阱的壁面高度为目标细胞直径的0.8～1.2倍。
进一步地，所述测量电极成对对称布置在细胞捕获阱的最近相邻壁面上。
进一步地，所述测量电极的长度为正六边形边长的0.5倍，宽度与正六边形微孔单元的深度相同。
进一步地，所述流体入口和流体出口连接有用于驱动液体流动的注射泵。
进一步地，所述测量电极通过基板表面沉积的金属导线与外接阻抗分析仪相连。
进一步地，所述微流控芯片通过用软光刻法结合聚二甲硅氧烷(PDMS)制作成型。
本发明具有如下有益效果：
1、本发明在一块微流控芯片上实现了单细胞的捕获和阻抗谱测量，在本发明所涉及的分子生物学领域和医学诊断领域中，对单细胞的精确分析带来了几个显著优势：首先，大大提高了分析的精确度，从而可以在大量正常细胞群体中检测是否存在异常细胞；其次，与常规单细胞分析方法相比，采用的电阻抗测量方法对细胞施加不影响其生理状态的微小交流电压信号，保留了细胞结构的完整性，可实现多次重复测量，且避免了引入化学试剂污染流道，提高了后续分子生物学分析的准确性。
2、本发明提出的细胞捕获阱结构位于六边形微孔单元内部，利用流体力学原理与粒子的惯性聚焦特性，细胞一旦被捕获，周围的低速流场很难对位置产生影响，保证了阻抗谱测量的准确可靠。
3、实现了单细胞的可靠捕捉和阻抗谱精确测量。
4、细胞捕获结构稳定可靠。
5、免标记分析方法不影响细胞活性，可连续重复测量。
6、操作简单，清洗方便。
附图说明：
图1为本发明实施例微流控芯片的整体图。
图2为本发明实施例微流控芯片中下基板的俯视图。
图3为本发明实施例微流控芯片中下基板的纵向剖面图。
图4为图3中A的局部放大图。
图5为本发明实施例微流控芯片中六边形微孔单元的放大图。
图6为本发明实施例微流控芯片键合后的透视图。
图7为图6中B的局部放大图。
具体实施方式：
以下对本发明的实施方式作详细说明。应该强调的是，下述说明仅仅是示例性的，而不是为了限制本发明的范围及其应用。
请参照图1至图5所示，本发明所述的一种细胞电阻抗谱测量的微流控芯片，由上盖板1和下基板2组成，上盖板1上开通孔构成流体入口3和流体出口4，下基板2的上表面分布有正六边形微孔单元7阵列，每个正六边形微孔单元7内部设置有细胞捕获阱10，用于捕获细胞悬浮液中的单个细胞，正六边形微孔单元7上靠近细胞捕获阱10相邻壁面设计有一对测量电极9，用于施加小幅度交流电压激励实现细胞阻抗谱测量；正六边形微孔单元7之间通过微流体通道8串联成一条液体通道；液体通道与上盖板1的流体入口3和流体出口4相接处设有入口处蓄液池5、出口处蓄液池6；上盖板1与下基板2通过键合封接形成密封微流控芯片。
在优选的实施例中，正六边形微孔单元阵列7等间距错落排布，且相邻两排正六边形微孔单元7之间由与正六边形边长等宽的微流体通道8连通，组成“之”字形曲折通道，正六边形边长取值为100～200μm。
在优选的实施例中，细胞捕获阱10由水平对称分布的两个弯折壁组成，弯折壁为两条成一定夹角相接的微壁面，两个弯折壁平行部分之间的距离为目标细胞直径的1.2～1.5倍，向内弯折部分开口之间的距离为目标细胞直径的0.5～0.8倍，弯折部分所成夹角为60～120°。
在优选的实施例中，细胞捕获阱10窄口中心与正六边形微孔单元7最近顶角之间的距离为正六边形边长的0.2～0.5倍。
在优选的实施例中，细胞捕获阱10的壁面高度为目标细胞直径的0.8～1.2倍。
在优选的实施例中，入口处蓄液池5、出口处蓄液池6与上盖板2的流体入口3和流体出口4轴线重合，入口处蓄液池5、出口处蓄液池6直径大于流体入口3和流体出口4直径。
在优选的实施例中，流体入口3和流体出口4连接有用于驱动液体流动的注射泵。
在优选的实施例中，阻抗测量电极通过基板表面沉积的导线与阻抗分析仪相连。
在优选的实施例中，微流控芯片通过用软光刻法结合聚二甲硅氧烷(PDMS)制作成型。
鉴定细胞捕获结果及位置需要借助光学显微镜，因此上盖板1需要选用透明材质，同时，上盖板1应与下基板2的材质具有兼容性，以便形成密封微流体通道。聚二甲基硅氧烷(PDMS)由于具有无毒、化学惰性、良好的透光性、生物兼容性、结构高弹性，为制造所述微流控芯片上盖板1与下基板2的最佳材料。
流体入口3、流体出口4、入口处蓄液池5、出口处蓄液池6的排布可按照下基板2流体通道的形状自由设计，其直径大小可根据测量系统的流量要求进行适当变更。
正六边形微孔单元7阵列相邻两排之间错落排布，形成类似蜂窝状结构，微流体通道8将相邻两排之间邻近的微孔单元串联成一条完整的流道，微流道之间呈“之”字形排列，其目的在于引导流体在微流体通道8中曲折通过，在流道区域内部形成不均匀的速度场分布，正六边形微孔单元7内部远离流体进出口处流体速度较低，与细胞捕获阱10配合，更容易捕获单个细胞。
细胞捕获阱10由水平对称分布的两个弯折壁组成，对于每个正六边形微孔单元7，细胞从微流体通道8进入后，在流体剪切力与惯性升力的合力作用下，向细胞捕获阱结构流动并限位于细胞捕获阱10的窄口部分，整个细胞捕获阱结构位于微孔远离流体进出口的低速流场区，捕获的细胞不易受流体扰动影响而逃逸。
当细胞被捕获阱捕捉后，通过细胞捕获阱10的流量会由于细胞的阻挡进一步缩小，导致其它细胞绕流通过。细胞捕获阱结构尺寸按目标捕获细胞直径大小进行设计，允许容纳单个细胞。
测量电极9通过溅射工艺制得，其过程描述如下：在下基板2正面溅射0.1微米厚的铬金属层，再在铬金属层上溅射0.5微米厚的金层，溅射时将下基板2倾斜45度并旋转，以保证金属对微孔侧壁的覆盖。对下基板2正面进行真空辅助涂胶和光刻，定义出所需电极的形状，然后再使用碘化钾溶液腐蚀金层，使用硝酸铈铵腐蚀铬层，这样就得到了正六边形微孔单元7中的测量电极9。用同样的方法在下基板2上表面引出测量电极9的导线。
上盖板1与下基板2通过聚二甲基硅氧烷(PDMS)成型技术制备基底，结合软光刻法制备微流道结构。上盖板1和下基板2通过氧等离子辅助键合方法键合在一起组成完整芯片。
微流控芯片系统搭建：在微流控芯片的基础上，使用聚四氟乙烯管连接微流体注射泵和上盖板的流体入口和流体出口，用导线将电极引出端与多路复用选通电路相连，再连接至阻抗分析仪，并将微流控芯片放置在荧光显微镜下，即可完成整套系统的搭建。
本发明所述微流控芯片的工作流程描述如下：将待检测的细胞悬浮液和除去细胞的缓冲液分别灌注于两支注射器，灌注细胞悬浮液的注射器在注射泵推动杆的作用下，将流体缓慢从微流控芯片的流体入口注入微流体通道，悬浮液在曲折微流体通道的导向下依次流经每个正六边形微孔单元。对于每个正六边形微孔单元，细胞从微流体通道进入后，由于自身惯性效应以及流体剪切力的作用，移动并限位于低速场区域的细胞捕获阱结构，完成单细胞捕捉。利用显微镜观察到每个微流体通道都获得单个细胞后，切换注射器向芯片通入缓冲液洗去流道中残留的多余细胞，并为阻抗谱测量提供稳定的背景溶液，阻抗分析仪通过多路复用选通电路，依次向微孔中的测量电极依次提供激励电压并完成该单元内细胞阻抗谱的测量。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细特征以及详细方法，但本发明并不局限于上述详细特征以及详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细特征以及详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明选用组分的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (9)
1.一种细胞电阻抗谱测量的微流控芯片，其特征在于：由上盖板(1)和下基板(2)组成，所述上盖板(1)上开通孔构成流体入口(3)和流体出口(4)，所述下基板(2)的上表面分布有正六边形微孔单元(7)阵列以及微流体通道(8)，每个正六边形微孔单元(7)内部微流体通道延长交汇一侧设置有细胞捕获阱(10)，所述细胞捕获阱(10)由对称分布的两个弯折壁组成，两个弯折壁平行部分之间的距离为目标细胞直径的1.2～1.5倍，向内弯折部分开口之间的距离为目标细胞直径的0.5～0.8倍，弯折部分所成夹角为60～120°，所述正六边形微孔单元(7)上靠近细胞捕获阱(10)相邻壁面设有一对测量电极(9)，所述正六边形微孔单元(7)之间通过微流体通道(8)串联成一条液体通道，所述液体通道与上盖板(1)的流体入口(3)和流体出口(4)相接处设有入口处蓄液池(5)、出口处蓄液池(6)，所述上盖板(1)与下基板(2)通过键合封接形成密封微流控芯片。
2.如权利要求1所述的细胞电阻抗谱测量的微流控芯片，其特征在于：所述正六边形微孔单元(7)阵列等间距错落排布，且相邻两排正六边形微孔单元(7)之间由与正六边形边长等宽的微流体通道(8)连通，组成“之”字形曲折通道，正六边形边长取值为100～200μm。
3.如权利要求2所述的细胞电阻抗谱测量的微流控芯片，其特征在于：所述细胞捕获阱(10)窄口中心与正六边形微孔单元7最近顶角之间的距离为正六边形边长的0.2～0.5倍。
4.如权利要求3所述的细胞电阻抗谱测量的微流控芯片，其特征在于：所述细胞捕获阱(10)的壁面高度为目标细胞直径的0.8～1.2倍。
5.如权利要求1所述的细胞电阻抗谱测量的微流控芯片，其特征在于：所述测量电极(9)成对对称布置在细胞捕获阱(10)的最近相邻壁面上。
6.如权利要求5所述的细胞电阻抗谱测量的微流控芯片，其特征在于：所述测量电极(9)的长度为正六边形边长的0.5倍，宽度与正六边形微孔单元(7)的深度相同。
7.如权利要求1-6中任意一项所述的细胞电阻抗谱测量的微流控芯片，其特征在于：所述流体入口(3)和流体出口(4)连接有用于驱动液体流动的注射泵。
8.如权利要求1-6中任意一项所述的细胞电阻抗谱测量的微流控芯片，其特征在于：所述测量电极(9)通过基板表面沉积的金属导线与外接阻抗分析仪相连。
9.如权利要求1-6中任意一项所述的细胞电阻抗谱测量的微流控芯片，其特征在于：所述微流控芯片通过用软光刻法结合聚二甲硅氧烷(PDMS)制作成型。
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