CN112305209B - 一种无接触贴壁细胞三维形态测量方法及细胞封接方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种无接触贴壁细胞三维形态测量方法及细胞封接方法，包括以下步骤：(1)对电极接近贴壁细胞上表面的过程进行电学仿真，确定电极距细胞表面距离与检测电阻上升的关系曲线；(2)提取细胞轮廓，并通过对细胞表面上5个点的无接触高度检测结果拟合细胞三维形态；(3)对电极进行三维定位，并根据细胞三维形态信息确定细胞表面上能够最大程度覆盖电极口的接触点位置；(4)控制电极移动到设定接触点处接触细胞表面，接触细胞，下降压入细胞膜并完成细胞封接。本发明所述细胞三维形态测量方法中，电极堵塞几率低，保证了后续细胞封接操作的正常进行。本发明所述的细胞封接方法可实现70％的封接成功率。

Description

一种无接触贴壁细胞三维形态测量方法及细胞封接方法
技术领域
本发明涉及细胞级别的显微操作领域，具体涉及一种无接触贴壁细胞三维形态测量方法及细胞封接方法。
背景技术
膜片钳技术是细胞电生理信号测量的“金标准”。膜片钳操作中操作者使用内径1μm以下的玻璃电极将一小部分细胞膜吸入电极微管内，对膜中单离子通道开闭产生的PA级别的电流进行测量。在膜片钳信号记录前需要使细胞膜和电极之间形成GΩ级的封接，称为高阻封接。高阻封接是将细胞膜与周围环境进行有效的电隔离的保证，是实现高信噪比的细胞电生理信号测量的前提条件。因此提高细胞高阻封接(以下简称封接)成功率是提高膜片钳操作效率的关键。
当前的贴壁细胞封接主要由操作者手动完成，对操作者的专业水平依赖较大，贴壁封接成功率从30％到60％不等。为了提高封接成功率，应该在进行吸持前尽量增大电极口被细胞膜覆盖面积比例。由于细胞表面呈突起的形状，这就需要在细胞表面上选择合适的接触点，使得电极口与细胞表面基本处于平行状态。选择上述合适的接触点需要对细胞的三维形态信息进行检测。
现有的细胞三维形态测量方法及其缺陷：(1)原子力显微镜法：通过使用探针敲击细胞表面绘制细胞的三维形态，但是把电极安装到探针上是一项极具挑战性的工作；(2)共聚焦显微镜法：通过逐层扫描经过染色的细胞结构，堆积形成细胞三维结构，但是使用共聚焦显微镜进行细胞三维测量往往需要较长的时间，而且长时间的曝光也会导致荧光漂白等问题；(3)电极接触测量法：使用电极接触细胞表面通过图像处理检测细胞变形获得细胞高度信息，但是使用电极多次接触细胞表面很容易导致电极堵塞，继而失去进行细胞封接的能力。因此开发一种无接触的简易细胞三维形态测量方法，并利用测得细胞三维形态选择合适的接触点进行细胞封接，对于提高细胞封接成功率十分关键。
发明内容
本发明提出了一种无接触贴壁细胞三维形态测量方法及细胞封接方法，该方法利用检测电极电阻值的变化趋势实现贴壁细胞表面高度的无接触测量，通过采样点处获得细胞高度拟合出整个细胞的三维形态，并根据细胞三维形态确定细胞表面上能使电极口被细胞膜以较大比例覆盖的接触点，并在此点处进行高成功率的贴壁细胞封接。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：一种无接触贴壁细胞三维形态测量方法，包括以下步骤：
S1，通过细胞轮廓检测方法获得细胞边界，并对细胞边界进行椭圆拟合，确定细胞的中心和长短轴；
S2，利用有限元模型对电极接近贴壁细胞上表面的过程进行电学仿真，确定电极到细胞表面距离与检测电阻上升数值之间的关系曲线；
S3，在由长半轴与短半轴包裹的四分之一细胞表面上选取五个检测点，利用电极下降过程中的检测电阻值变化，进行细胞上表面五个检测点处细胞高度的无接触测量，由高度检测结果通过曲面拟合获得整个细胞的三维形态。
进一步地，步骤S3中，细胞表面选取的五个检测点中，一个为细胞椭圆中心点，两个为靠近电极一侧的椭圆长半轴起点和中心，两个为椭圆短半轴起点和中心。
进一步地，步骤S3中，五个检测点处的细胞表面高度无接触测量中，电极电阻值上升0.2％时，电极距离细胞表面的距离为1μm，各个检测点处的细胞高度值由电极的初始位置减去电极下降的距离，再减去1μm计算得到。
进一步地，步骤S3中，设定贴壁细胞关于长轴和短轴对称，通过长半轴和短半轴上五个检测点处测量得到的细胞高度，拟合出两条三次样条函数曲线，在利用两条曲线上20个点的高度信息进行三次曲面拟合，确定细胞的三维形态。
进一步地，步骤S2中，有限元仿真模型中，电极建模为中空圆柱形，内含导电溶液，贴壁细胞建模为圆柱体，环境为圆柱形液体环境，接地线在圆柱形液体环境的边缘，电极圆柱内外径分别为1μm和1.5μm，材料为标准玻璃，贴壁细胞圆柱体高度为5μm，直径为10μm，电导率为0.5S/m，环境电导率为1.45S/m，电极的导电溶液电导率为1.45S/m。
本发明还包括一种贴壁细胞封接方法，包括以下步骤：
步骤一：利用本发明所述的无接触贴壁细胞三维形态测量方法，确定所需封接的贴壁细胞三维形态；
步骤二：对电极进行三维定位，确定电极口的平面位置；
步骤三：根据细胞三维形态遍历细胞表面，寻找并确定所在细胞表面切面与电极口平面夹角最小的点为设定接触点；
步骤四：控制电极移动到设定接触点上方，下降到细胞表面，接触细胞，下降至下压深度，并完成细胞GΩ封接操作。
作为优选，本发明所述的贴壁细胞封接方法还包括如下步骤：通过有限元仿真设定不同细胞下压深度下，不同接触点处电极口覆盖率与电极下压深度的曲线关系，并验证相同下压深度下，设定接触点处的电极口覆盖率高于与其它点处电极口覆盖率。
进一步地，本发明所述贴壁细胞封接方法中，步骤四具体为：电极下降到细胞表面的过程中以0.5psi的气压向外吹出液体，无接触检测到细胞表面后，电极向下下降1μm到达细胞表面，再继续下降压入细胞膜1μm深度完成细胞接触，以-0.5psi的气压将细胞膜吸入电极内形成GΩ封接。
作为优选，在本发明所述贴壁细胞封接方法的步骤三中，当细胞表面存在某点处所在的细胞表面切面与电极口平面平行时，以该点为细胞封接操作的设定接触点。
进一步地，在本发明所述贴壁细胞封接方法的有限元仿真中，电极建模为外径1.5μm内径1μm的刚性体，细胞建模为各项同性的弹性体，根据细胞边缘点、顶点和设定接触点处获得的三条电极口覆盖率-电极下压深度关系曲线，验证设定接触点电极口覆盖率大于其余接触点。
本发明同现有技术相比具有以下优点及效果：
1、本发明可以对每一个需要封接的贴壁细胞进行细胞三维形态的无接触在线测量，并根据每个细胞的三维形态选择高封接成功率的接触点位置，对细胞进行GΩ封接，因此对每个细胞具有较强的适用性，且无需依赖操作人员的操作经验。
2、在本发明所述的无接触贴壁细胞三维形态测量方法中，不需要除了传统膜片钳模块之外的任何额外设备，无需对细胞进行接触测量，对细胞提供在线形态测量的同时，有效减少了电极堵塞的几率，保证后续细胞封接操作的正常进行。
3、本发明可以显著提高贴壁细胞的封接成功率，使得小鼠成骨细胞的封接成功率较人工操作提升50％以上。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明所述贴壁细胞封接方法的流程图。
图2为本发明所述电极接近细胞表面的有限元电学建模及电场仿真结果图。
图3为本发明所述无接触贴壁细胞三维形态测量原理示意图和有限元仿真图。
图4为本发明实施例中小鼠贴壁细胞封接过程中的输出气压和测量电极电阻变化趋势图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释而本发明并不局限于以下实施例。
实施例1：如图1的流程框图所示，一种贴壁细胞封接方法，包括以下步骤：
步骤一：对所需封接的贴壁细胞进行无接触三维形态的在线测量；
步骤二：对电极进行三维定位，确定电极口的平面位置；
步骤三：根据细胞三维形态遍历细胞表面，寻找并确定所在细胞表面切面与电极口平面夹角最小的点为设定接触点；
步骤四：控制电极移动到设定接触点上方，下降到细胞表面，接触细胞，下降至下压深度，检测电极电阻，完成细胞GΩ封接操作。
在本实施例1中，所用贴壁细胞为小鼠成骨细胞，细胞在含有10％FBS，40μML谷氨酰胺、100U/ML青霉素和0.1mM链霉素的DMEM培养基中，在37℃和5％CO2的环境中正常传代，当细胞覆盖率达到70％，将细胞转移到玻璃盖玻片上生长，用于电生理信号测量实验。
其中，在本发明所述贴壁细胞封接方法的步骤一中，根据离线接触检测获得的结果，贴壁细胞基本关于椭圆的长轴和短轴对称，因此仅需要测量由长半轴与短半轴包裹的四分之一细胞表面的三维形态既可以根据对称性确定细胞的全部三维形态。
具体地，如图3所示：对所需封接的贴壁细胞进行无接触三维形态在线测量的方法如下：
S1，确定细胞的水平位置：通过细胞轮廓检测方法获得细胞边界，并对细胞边界进行椭圆拟合，确定细胞的中心和长短轴；
S2，利用有限元模型对电极接近贴壁细胞上表面的过程进行电学仿真，确定电极到细胞表面距离与检测电阻上升数值之间的关系曲线；
S3，在由长半轴与短半轴包裹的四分之一细胞表面上选取五个检测点，利用电极下降过程中的检测电阻值变化，进行细胞上表面五个检测点处细胞高度的无接触测量，由高度检测结果通过曲面拟合获得整个细胞的三维形态。
进一步地，如图2所示，在步骤S2中，对电极接近细胞上表面的过程进行有限元电学建模的方法如下：
由于暂时缺少形态信息，将细胞建模为圆柱体。细胞的高度通过接触检测获得的平均细胞高度确定为5μm，细胞的直径由图像处理获得。如图2(a)所示，电极被建模为内径1μm，外径1.5μm的空心玻璃圆柱体，电极内导电溶液液、细胞环境外液和细胞胞质的电导率通过文献分别确定为1.45S/m、1.45S/m和0.5S/m。仿真获得的电场如图2(b)所示，由电场计算获得电极下降过程中的检测电极电阻值变化曲线。由于细胞的实际形状为突起状，电极与细胞接触位置不同时电极与细胞的夹角也会发生变化。在仿真中，通过改变电极与细胞表面的夹角来模拟接触位置的变化。仿真中电极和细胞表面的三个夹角分别为30°、60°和90°。三个夹角获得的电极下降过程中的测量电阻值变化曲线如图2(c)所示。从仿真结果可以看出，虽然不同夹角的电极-细胞表面距离和检测电极电阻上升的关系曲线有所不同，但是当电极距离细胞表面大于2μm时，测量电极电阻几乎都没有变化，当电极距离细胞表面接近1μm时，电极电阻上升大约0.2％。该阈值用于后续的无接触细胞高度测量中，测量的细胞表面位置为电极以下1μm。
进一步地，如图3所示，在步骤S3中，细胞表面选取的五个检测点中，一个为细胞椭圆中心点，两个为靠近电极一侧的椭圆长半轴起点和中心，两个为椭圆短半轴起点和中心，如图3(a)所示。进行所述五个检测点处的细胞表面高度无接触测量中，电极电阻值上升0.2％时，电极距离细胞表面的距离为1μm，各个检测点处的细胞高度值由电极的初始位置减去电极下降的距离，再减去1μm计算得到。通过上述5个点的测量高度信息，先通过三次样条函数获得长轴和短轴上的两条细胞表面曲线，然后利用两条曲线上的20个点的高度信息进行三次曲面拟合，最终确定细胞的三维形态，如图3(b)所示。
具体地，在本发明所述贴壁细胞封接方法的步骤二中，电极不同部位聚焦时的显微图像中，电极轮廓长度也会变化，当电极针尖聚焦时，显微图像中的电极轮廓长度将达到最大值，本发明通过图像处理检测电极轮廓长度的最大值来对电极进行自动聚焦，聚焦后通过轮廓检测获得电极针尖的位置，并根据此位置获得电极口的平面位置。
具体地，在本发明所述贴壁细胞封接方法的步骤三中，通过获得的细胞三维形态信息和电极针口信息，遍历细胞表面，寻找当细胞表面存在所在细胞表面切面和电极口平面平行的点，则以该点作为设定接触点；若不存在，则以所在细胞表面切面与电极口平面夹角最小的点作为设定接触点，如图3(c)所示。
进一步，本发明还通过有限元仿真设定不同细胞下压深度下，不同接触点处电极口覆盖率与电极下压深度的曲线关系，并验证相同下压深度下，设定接触点的电极口覆盖率高于与其它点处的电极口覆盖率。
在有限元仿真过程中，电极建模为外径1.5μm内径1μm的刚性体，细胞建模为各项同性的弹性体，细胞的三维形态通过上述步骤中测得的曲面函数取平均确定。所采用测试点分别为长轴边缘点P1，细胞顶点PT和设定接触点PS。根据边缘点P1、顶点PT和设定接触点PS处获得的三条电极口覆盖率-压入细胞表面的深度(以下简称电极压入深度)关系曲线，如图3(d)和3(e)所示。从图中可以看出：(1)同样压入深度下，设定接触点处电极口被覆盖的面积比例明显大于其它两个点，继而验证了本发明所述接触位置的封接有效性和可靠性；(2)同一接触点在不同压入深度下，电极口的覆盖率亦随之变化，当电极下压深入接近1μm时，电极口覆盖率高达100％。
本发明所述贴壁细胞封接方法的具体封接操作如下：
如图1的流程框图所示：将培养皿放到试验台上后，系统通过自动聚焦和轮廓检测获得细胞的水平位置；进而由用户通过鼠标选择目标细胞；之后系统将自动对目标细胞进行无接触的细胞三维形态进行测量；根据测得结果和电极定位结果确定接触位置；之后自动控制电极移动到设定接触点上方；电极微管输出0.5psi的正压并以0.1μm的步距向下快速移动电极去接近目标细胞；当检测电极电阻值上升达到阈值之后，先下降1μm到达细胞表面，在继续下降压入细胞膜1μm深度完成细胞接触；电极微管施加-0.5psi的负压，直至GΩ的有效封接形成。图4中给出了对一个贴壁细胞封接过程中的输出气压和检测电阻值的变化图。
表1中归纳了电极在细胞边缘点P1，顶点PT和接触点PS处三个不同压入细胞深度下，共9组180个贴壁细胞GΩ封接实验结果。从实验结果中可以看出设定接触点PS下压深度为1μm时，细胞的封接成功率最高为70％(14/20)。作为对比具有2年手动细胞封接操作经验的操作者的封接成功率仅为45％(9/20)。由于本发明所述的细胞封接方法需要对细胞表面5个点处的细胞高度进行测量，因此总体细胞封接速度要慢于不需要进行细胞高度测量的人工操作(50.7s Vs 35.6s)，但考虑到细胞电生理信号记录一般持续几十分钟，而成功细胞封接是进行信号记录的前提，因此多出的不到20秒的细胞封接时间对于操作者完全可以接受。
表I不同挤压深度和接触点处的GΩ封接实验结果汇总
Figure BDA0002742293360000071
表II本发明贴壁细胞封接方法与人工操作结果对比
Figure BDA0002742293360000072
进一步地，结合有限元仿真中的电极下压深度和试验过程的电极压入深度，可知：当电极下压深度为1μm时，细胞封接成功率明显高于其它下压深度。
此外，需要说明的是，本说明书中所描述的具体实施例，其零、部件的形状、所取名称等可以不同。凡依本发明专利构思所述的构造、特征及原理所做的等效或简单变化，均包括于本发明专利的保护范围内。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离本发明的结构或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种无接触贴壁细胞三维形态测量方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，通过细胞轮廓检测方法获得细胞边界，并对细胞边界进行椭圆拟合，确定细胞的中心和长短轴；
S2，利用有限元模型对电极接近贴壁细胞上表面的过程进行电学仿真，确定电极到细胞表面距离与检测电阻上升数值之间的关系曲线；
S3，在由长半轴与短半轴包裹的四分之一细胞表面上选取五个检测点，利用电极下降过程中的检测电阻值变化，进行细胞上表面五个检测点处细胞高度的无接触测量，由高度检测结果通过曲面拟合获得整个细胞的三维形态；
具体为：细胞表面选取的五个检测点中，一个为细胞椭圆中心点，两个为靠近电极一侧的椭圆长半轴起点和中心，两个为椭圆短半轴起点和中心，设定贴壁细胞关于长轴和短轴对称，通过长半轴和短半轴上五个检测点处测量得到的细胞高度，拟合出两条三次样条函数曲线，再利用两条曲线上20个点的高度信息进行三次曲面拟合，确定细胞的三维形态。
2.根据权利要求1所述的无接触贴壁细胞三维形态测量方法，其特征在于，步骤S3中，五个检测点处的细胞表面高度无接触测量中，电极电阻值上升0.2％时，电极距离细胞表面的距离为1μm，各个检测点处的细胞高度值由电极的初始位置减去电极下降的距离，再减去1μm计算得到。
3.根据权利要求1所述的无接触贴壁细胞三维形态测量方法，其特征在于，步骤S2中，有限元仿真模型中，电极建模为中空圆柱形，内含导电溶液，贴壁细胞建模为圆柱体，环境为圆柱形液体环境，接地线在圆柱形液体环境的边缘，电极圆柱内外径分别为1μm和1.5μm，材料为标准玻璃，贴壁细胞圆柱体高度为5μm，直径为10μm，电导率为0.5S/m，环境电导率为1.45S/m，电极的导电溶液电导率为1.45S/m。
4.一种贴壁细胞封接方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：利用权利要求1至3任一所述的无接触贴壁细胞三维形态测量方法，确定所需封接的贴壁细胞三维形态；
步骤二：对电极进行三维定位，确定电极口的平面位置；
步骤三：根据细胞三维形态遍历细胞表面，寻找并确定所在细胞表面切面与电极口平面夹角最小的点为设定接触点；
步骤四：控制电极移动到设定接触点上方，下降到细胞表面，接触细胞，下降至下压深度，并完成细胞GΩ封接操作。
5.根据权利要求4所述的贴壁细胞封接方法，其特征在于，所述细胞封接方法中，还包括如下步骤：通过有限元仿真设定不同细胞下压深度下，不同接触点处电极口覆盖率与电极下压深度的曲线关系，并验证相同下压深度下，设定接触点的电极口覆盖率高于与其它点处的电极口覆盖率。
6.根据权利要求4所述的贴壁细胞封接方法，其特征在于，所述步骤四具体为：电极下降到细胞表面的过程中以0.5psi的气压向外吹出液体，无接触检测到细胞表面后，电极下降1μm到达细胞表面，再继续下降压入细胞膜1μm深度完成细胞接触，以-0.5psi的气压将细胞膜吸入电极内形成GΩ封接。
7.根据权利要求4所述的贴壁细胞封接方法，其特征在于，在所述步骤三中，当细胞表面存在某点处所在的细胞表面切面与电极口平面平行时，以该点为细胞封接操作的设定接触点。
8.根据权利要求5所述的贴壁细胞封接方法，其特征在于，所述有限元仿真中，电极建模为外径1.5μm，内径1μm的刚性体，细胞建模为各项同性的弹性体，根据细胞边缘点、顶点和设定接触点处获得的三条电极口覆盖率-电极下压深度关系曲线，验证设定接触点处的电极口覆盖率大于其余接触点。
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