CN101748061B - 建立神经元之间单细胞水平连接的装置和生长连接方法 - Google Patents
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Abstract
一种建立神经元之间单细胞水平连接的装置和方法，其包括：上表面上附蛋白条带的基底，基底上蛋白条带外的区域覆聚醚F127层；覆于基底上表面的下表面具微凹槽单元的聚二甲基硅氧烷印章；微凹槽单元包括：一直线型中间凹槽和设于中间凹槽左或/和右侧的至少一条直线型侧凹槽，侧凹槽中间段与中间凹槽不相交，侧凹槽中间段外的两端段向远离中间凹槽方向倾斜；槽端处设垂直孔道；蛋白条带与凹槽相交不重合；神经元送入通道内只黏附在蛋白质条带上，其突起则沿蛋白条带定向生长而不发生分支，从而获得神经元单细胞水平的单线连接；其结构简单、易操作，可控制神经突起有序生长，可精确研究神经细胞间电信号传导，为生物传感器制造提供基础支持。
Description
技术领域
本发明涉及一种在单细胞水平控制神经细胞图案化生长的装置和生长方法，特别是在建立神经元之间单细胞水平连接的装置和生长连接方法。
背景技术
神经元由胞体和神经纤维组成，是构成神经系统结构和功能的基本单位。神经元的功能依赖于神经元间的联系和信息交换，而这种信息交换正是通过神经纤维网络间神经电信号的传导完成的。因此研究神经元之间电信号传导的机制是理解神经元功能的基础。但是，在传统的培养方法中每个神经元表面都有很多突起生成，这些突起又发出大量分支形成网络状结构，导致每个神经元所传导的电信号非常复杂。控制动物神经元使其形成图形规则的网络可以用来研究神经生物学和认知科学的重要问题，这就需要一种可以精确控制神经网络生长的方法，目前人们已经研究出了一些方法：
例如在文献1：Hellera D A.，Gargab V，Kelleherb K J，Leea TC，Mahbubania S，Sigworthb LA，Leea T R，Reab M A，Biomaterials，2005，26，883-889中，ReaMichael A等人对整个神经网络的生长进行了图案化的控制，在该研究中，科研人员用表面带有微结构(该微结构由宽度6微米，间隔50微米的多条直线相互交叉形成网状结构，交叉点为14×14微米的方形结构)的聚二甲基硅氧烷印章将层粘连蛋白的一个具有19个氨基酸的片段PA22-2转移到了金的表面，金原子和氨基酸N-末端的硫原子形成牢固的共价键结合；将神经细胞悬液种植在吸附具有19个氨基酸的片段PA22-2的基底上，神经细胞的胞体黏着于方形结构上，突起则沿着网状结构生长；该方法虽然实现了神经网络的可控生长，但是神经突起还是存在有分支，每个神经元接受多个传导信号，这给精确研究神经电信号的传导带来了一定难度。
在文献2：Taylor A.M.，Blurton-Jones M.，Rhee S.W.，Cribbs D.H.，CotmanC.W.，Jeon N.L.，Nature Methods，2005，2，599-605中，Jeon Nooli小组首次实现了神经轴突的独立生长；该课题组利用软刻蚀技术制作了两个聚二甲基硅氧烷的小室，两个小室之间通过平行排列的10微米宽，3微米深的凹槽相连接，两个小室之间存在50微升的容积差，将神经细胞悬液种植在容积大的一侧小室，神经轴突在静水压的作用下将通过凹槽进入另一侧小室，从而实现了神经轴突的独立生长；该方法在神经突起的控制方面是一个突破，但是此方法操作起来较为复杂，没有实现单细胞水平的调控，并且当神经轴突进入另一侧小室后还是会形成网络状结构。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术在对神经细胞的生长进行图案化控制时，是对整个神经网络进行控制，无法达到单细胞的水平，神经细胞之间的联系也无法达到单线连接的缺点；以及制作工艺较为复杂，重复性不高的缺陷，从而提供一种简单易操作的建立神经元之间单细胞水平连接的装置和生长连接方法，以便研究神经元间电信号传导。
本发明的目的是通过以下的技术方案实现的：
本发明提供的建立神经元之间单细胞水平连接的装置，其包括：
—基底，所述基底上表面上附着有促进神经细胞黏附的宽度为5-10微米的蛋白条带；两相邻蛋白条带间间距为20-100微米；所述基底上表面上蛋白条带之外的其它区域涂覆有抗拒细胞黏附的聚醚F127层；
—紧密覆于所述基底上表面上的下表面上具有至少一组微凹槽单元的聚二甲基硅氧烷印章；
所述微凹槽单元包括：
一条直线型中间凹槽；
设置于所述直线型中间凹槽左侧或/和右侧的至少一条直线型侧凹槽；所述直线型侧凹槽的中间段与所述直线型中间凹槽不相交，所述直线型侧凹槽中间段之外的两端段分别向远离直线型中间凹槽的方向倾斜；所述直线型中间凹槽、和所述直线型侧凹槽的槽端处分别设有与相应凹槽相通的垂直孔道；所述直线型中间凹槽和所述直线型侧凹槽的长度均在1.5-2厘米范围内，宽度均为40微米；两相邻凹槽槽壁间间距为500微米-1厘米；
所述基底上表面上附着的蛋白条带与所述聚二甲基硅氧烷印章的直线型中间凹槽和直线型侧凹槽相交不重合。
所述蛋白条带宽度为5微米。
所述的聚醚F127为(H(OCH2CH2)x(OCH2CHCH3)y(OCH2CH2)zOH)；其中，x≥1，代表-OCH2CH2-的个数；y≥1，代表-OCH2CHCH3-的个数；z≥1，代表-OCH2CH2-的个数。
本发明提供的建立神经元之间单细胞水平连接的生长连接方法，包括以下步骤：
1)使用光刻技术，分别在硅片上刻制微结构单元一和微结构单元二；
所述微结构单元一由平行排列的直线型凹槽组成，所述直线型凹槽宽度为5-10微米，所述直线型凹槽间距为20-100微米；
所述微结构单元二具有至少一组凸型线型微结构单元，该凸形线型微结构单元包括：一条直线型中间凸型线；位于所述直线型中间凸型线左侧或/和右侧的至少一条直线型侧凸型线；所述直线型侧凸型线与所述直线型中间凸型线不相交；所述直线型侧凸型线的中间段之外的两端段分别向远离直线型中间凸型线的方向倾斜；所述直线型中间凸型线和所述直线型侧凸型线长度均在1.5-2厘米范围内，宽度40微米；两相邻凸型线间间距为500微米-1厘米；
2)基底的制备：
以具有微结构单元一的硅片作模板，用聚二甲基硅氧烷其进行翻模，得到聚二甲基硅氧烷印章一；
所述聚二甲基硅氧烷印章一上表面上具有平行排列的凸型条带，该凸型条带宽度为5-10微米，间距为20-100微米；
将聚二甲基硅氧烷印章一的具有凸型条带的面上蘸上促进神经细胞黏附的蛋白溶液，吹干；将其有凸型条带的面朝下垂直置于细胞培养皿表面中，5-10分钟后揭去聚二甲基硅氧烷印章一，蛋白从聚二甲基硅氧烷印一的凸型条带上转移到细胞培养皿表面对应的部位，在细胞培养皿表面形成平行排列的蛋白质条带；
将表面吸附有蛋白质条带的细胞培养皿用聚醚F127孵育45-60分钟后，聚醚F127吸附在细胞培养皿表面蛋白质条带之外的其它区域，形成基底，所述基底上表面上附着有促进神经细胞黏附的宽度为5-10微米的蛋白条带，蛋白条带之外的其它区域涂覆有抗拒细胞黏附的聚醚F127层；
3)聚二甲基硅氧烷印章的制备：
以具有微结构单元二的硅片作模板，用聚二甲基硅氧烷对其进行翻模，得到聚二甲基硅氧烷印章；
所述第二聚二甲基硅氧烷印章的下表面上具有至少一组微凹槽单元；所述微凹槽单元包括：
所述微凹槽单元包括：
一条直线型中间凹槽；
设置于所述直线型中间凹槽左侧或/和右侧的至少一条直线型侧凹槽；所述直线型侧凹槽的中间段与所述直线型中间凹槽不相交，所述直线型侧凹槽中间段之外的两端段分别向远离直线型中间凹槽的方向倾斜；所述直线型中间凹槽、和所述直线型侧凹槽的槽端处分别设有与相应凹槽相通的垂直孔道；所述直线型中间凹槽和所述直线型侧凹槽的长度均在1.5-2厘米范围内，宽度均为40微米；两相邻凹槽槽壁间间距为500微米-1厘米；
4)将所述聚二甲基硅氧烷印章的具有微凹槽单元的下表面朝上，在等离子清洗器中氧化；之后，取出聚二甲基硅氧烷印章与基底进行组装：
将所述聚二甲基硅氧烷印章的具有微凹槽单元的下表面贴覆于基底附着有促进神经细胞黏附的蛋白条带的表面上，所述聚二甲基硅氧烷印章的直线型中间凹槽和直线型侧凹槽分别与基底上表面上的促进神经细胞黏附的蛋白条带相交不重合；所述基底上表面与所述聚二甲基硅氧烷印章的直线型中间凹槽和直线型侧凹槽形成封闭的流通管腔；
5)细胞种植：
提取动物神经元细胞，制备动物神经元细胞密度为106/ml的动物神经元细胞悬浮溶液，把动物神经元细胞悬浮溶液经由与相应凹槽相通的垂直孔道送入相应的流通管腔中，放入细胞培养箱，在37℃，5％CO2条件中培养；
所种植的动物神经元细胞在细胞培养箱中培养30-60分钟后，单个的动物神经元细胞黏附在流通管腔内的基底表面平行排列的蛋白条带上；揭去聚二甲基硅氧烷印章，动物神经元细胞在神经细胞培养液中生长，单根动物神经元突起将会沿着动物神经元胞体黏附的蛋白条带生长；几天后，在同一条蛋白条带上定向生长的动物神经突起相互接触，形成单细胞水平的动物神经元之间的连接。
所述蛋白条带宽度为5微米。
所述的聚醚F127为(H(OCH2CH2)x(OCH2CHCH3)y(OCH2CH2)zOH)；其中，x≥1，代表-OCH2CH2-的个数；y≥1，代表-OCH2CHCH3-的个数；z≥1，代表-OCH2CH2-的个数。
本发明的装置和方法，由于能够在单细胞水平保证神经细胞间连接的唯一性，可以为研究神经细胞之间电信号的传导提供极为精确和便利的方法，同时也可为以神经元为基础的生物传感器的制造提供基础支持；另外，该装置还可用于影响神经信号传递、神经突起发育的药物和分子的筛选，在细胞培养的条件下加入待筛选的药物和分子，对比加入药物和为加入药物的样品之间神经突起发育和电信号的不同，可以在单细胞水平了解哪种药物和分子可以影响神经突起发育和神经信号传递，从而为新药筛选提供一个便利的平台。
本发明的方法首先是在基底形成可以促进神经元黏附和发育的蛋白质条带，其它区域抗拒细胞黏附；然后用聚二甲基硅氧烷印章与基底形成封闭的微流通道，将神经元送入通道内，神经元只黏附在通道内基底表面的蛋白质条带上，神经突起则沿着神经胞体黏附的蛋白条带定向生长并且不发出任何分支，从而形成单细胞水平的神经元间连接。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
1、本发明利用表面化学和微流控相结合，精确的在空间和时间上长时间控制神经胞体的有序排列及神经突起的定向生长；
2、用该方法生成的装置为神经生物学，特别是神经电生理学的基本研究提供了平台，可以在单细胞水平高精度的在空间和时间上对神经电信号传导进行分析；同时，还可作为影响神经电信号传导药物的筛选平台，为该方面药物和分子的筛选提供新的途径；
3、在该装置中，神经突起的生长是有序并且没有分支的，因此该装置也可以用来在微纳米尺度精确的研究神经突起的发育、损伤再生等，进而应用于筛选影响神经突起发育、损伤再生的药物。
4、在该装置中，可以长期的精确控制高等动物神经元(如大鼠海马神经元)在表面生长，我们将可以回答很多科学问题，解决大量技术难点，而且可以开始大脑-计算机界面的研究。
附图说明
图1为本发明的建立神经元单细胞水平联系的装置的结构示意图。
图2为基底的制备流程图；
图3为正常生长的神经元与用本装置生长的神经元的示意图
具体实施方式
图1为本发明的建立神经元之间单细胞水平连接的装置的结构示意图，由图1可知，本发明提供的建立神经元之间单细胞水平连接的装置，包括：
—基底1，所述基底1上表面上附着有促进神经细胞黏附的宽度为5-10微米的蛋白条带；两相邻蛋白条带间间距为20-100微米；所述基板1上表面上蛋白条带之外的其它区域涂覆有抗拒细胞黏附的聚醚F127层；
—紧密覆于所述基底上表面上的下表面上具有至少一组微凹槽单元的聚二甲基硅氧烷印章2；
所述微凹槽单元包括：
一条直线型中间凹槽21；
设置于所述直线型中间凹槽左侧或/和右侧的至少一条直线型侧凹槽；所述直线型侧凹槽的中间段与所述直线型中间凹槽不相交，所述直线型侧凹槽中间段之外的两端段分别向远离直线型中间凹槽的方向倾斜；所述直线型中间凹槽、和所述直线型侧凹槽的槽端处分别设有与相应凹槽相通的垂直孔道；所述直线型中间凹槽和所述直线型侧凹槽的长度均在1.5-2厘米范围内，宽度均为40微米；两相邻凹槽槽壁间间距为500微米-1厘米；
所述基底上表面上附着的蛋白条带与所述聚二甲基硅氧烷印章的直线型中间凹槽和直线型侧凹槽相交不重合。
所述蛋白条带宽度为5微米。
所述的聚醚F127为(H(OCH2CH2)x(OCH2CHCH3)y(OCH2CH2)zOH)；其中，x≥1，代表-OCH2CH2-的个数；y≥1，代表-OCH2CHCH3-的个数；z≥1，代表-OCH2CH2-的个数。
图2为在基底表面附着多条平行排列促进神经细胞黏附蛋白条带，其它区域为抗拒细胞黏附的聚醚F127的基底的制备流程示意图；由图2可知，可分为三个步骤：
步骤1：表面有凸型条带状结构的聚二甲基硅氧烷印章4有微结构面蘸上促进神经细胞黏附的蛋白溶液，朝下垂直置于细胞培养皿3表面；
步骤2：揭去聚二甲基硅氧烷印章4，蛋白就会从聚二甲基硅氧烷印章4的凸型条带状结构表面转移到细胞培养皿3表面对应的部位，在细胞培养皿3表面形成多组平行排列的蛋白条带11；
步骤3：将表面吸附有蛋白条带11的细胞培养皿3用聚醚F127孵育，聚醚F127吸附在细胞培养皿3表面没有蛋白质吸附的区域；制备成表面附着有多条平行排列蛋白条带11，其它区域为抗拒细胞黏附区域12的基底1。
所述聚醚F127的分子式为H(OCH2CH2)x(OCH2CHCH3)y(OCH2CH2)zOH；其中，x≥1，代表-OCH2CH2-的个数；y≥1，代表-OCH2CHCH3-的个数；z≥1，代表-OCH2CH2-的个数。
实施例1
1)光刻：使用光刻技术，分别制备有微结构单元一和微结构单元二的硅片。首先用作图软件L-edit设计出所需要的两种图型，微结构单元一包括平行排列的直线型凹槽，其宽度为5微米(5-10微米均可)，间距为50微米(20-100微米均可)。
所述微结构单元二具有至少一组凸型线型微结构单元，该凸形线型微结构单元包括：一条直线型中间凸型线；位于所述直线型中间凸型线左侧或右侧的至少一条直线型侧凸型线；所述直线型侧凸型线与所述直线型中间凸型线不相交；所述直线型侧凸型线的中间段之外的两端段分别向远离直线型中间凸型线的方向倾斜；所述直线型中间凸型线和所述直线型侧凸型线长度均为1.5厘米(1.5-2厘米均可)，宽度40微米；两相邻凸型线间间距为500微米(200微米-1000微米均可)；
打印分辨率微3600dip的胶片，接着涂胶(SU-8系列负胶)，利用甩胶机均匀的将光刻胶涂在硅片上，80℃烘烤3小时后硬化，把胶片垂直放在涂有光刻胶的基板上，显影曝光后就再涂有光刻胶的硅片上制成了所需的微型结构单元一和微型结构单元二；
2)印章制备：用聚二甲基硅氧烷对步骤1)得到的两种微结构单元进行翻模，得到与这两种微结构单元相对应的聚二甲基硅氧烷印章一和印章二；
把聚二甲基硅氧烷印章一有微结构面朝上，在等离子清洗器中氧化3分钟，制备成具有亲水表面的聚二甲基硅氧烷印章一；
3)基底制备：聚二甲基硅氧烷印章一有微结构单元的面蘸上促进神经细胞黏附的蛋白溶液(层粘连蛋白，laminin)，有微结构单元面朝下垂直置于细胞细胞培养皿表面；5分钟后揭去聚二甲基硅氧烷印章一，层粘连蛋白就会从聚二甲基硅氧烷印章一的凸型条带状结构表面转移到细胞培养皿表面对应的部位，在细胞培养皿表面形成平行排列的层粘连蛋白条带；
将表面吸附有层粘连蛋白条带的细胞培养皿用聚醚F127孵育45分钟后，聚醚F127吸附在细胞培养皿表面的蛋白质条带之外区域；
用双蒸水去除细胞培养皿表面多余的聚醚F127溶液；制备成表面附着有平行排列层粘连蛋白条带，其它区域为抗拒细胞黏附的聚醚F127的基底；
4)加载微流通道：将步骤2)制备的聚二甲基硅氧烷印章二取出，把具有微凹型单元的面朝下，置于步骤3)中制备的基底上表面与其进行接触性连接，形成封闭的流通管腔；
5)种植细胞：从乳鼠(出生后12小时内)大脑海马区提取海马神经元，制备海马神经元细胞悬浮溶液，细胞密度为106/ml，把神经细胞经由与凹槽相通的垂直孔道送入流通管腔中，放入细胞培养箱(37℃，5％CO2)中培养；
6)神经元间单线联系的建立：步骤5)中的装置中的神经元在细胞培养箱中培养30-60分钟后，单个的神经元黏附在流通管腔内的培养皿表面多组平行排列的蛋白条带上，形成纵向单个排列的一列神经元，每个蛋白条带横行上生长两个神经元；揭去聚二甲基硅氧烷印章二，神经元在神经细胞培养液中生长，单根神经突起将会沿着神经胞体黏附的蛋白条带生长；几天后，在同一条蛋白条带上定向生长的两条神经突起相互接触，形成单细胞水平的两个神经元之间的连接。
实施例2
1)光刻：使用光刻技术，分别制备有微结构单元一和微结构单元二的硅片。首先用作图软件L-edit设计出所需要的两种图型，微结构单元一包括多组平行排列的直线型凹槽，其宽度为5微米(5-10微米均可)，间距为50微米(20-100微米均可)。微结构单元二包括至少一组凸型线型微结构单元，该凸形线型微结构单元包括：一个直线型凸型线(凸型线一)，一个斜线形凸型线，(凸型线二)；所述凸型线一和凸型线二中间段不相交，最短间距为500微米，最长间距为1000微米；所述凸型线二的中间段之外的两端部分向远离中间凸型线的方向倾斜；所述凸型线的长度在1.5厘米(1.5-2厘米均可)，宽度40微米；
打印分辨率微3600dip的胶片，接着涂胶(SU-8系列负胶)，利用甩胶机均匀的将光刻胶涂在硅片基底上，80℃烘烤3小时后硬化，把胶片垂直放在涂有光刻胶的基板上，显影曝光后就再涂有光刻胶的硅片上制成了所需的微型结构单元一和微型结构单元二；
2)印章制备：用聚二甲基硅氧烷对步骤1)得到的两种微结构单元进行翻模，得到与这两种微结构单元相对应的聚二甲基硅氧烷印章一和印章二；
把聚二甲基硅氧烷印章一有微结构面朝上，在等离子清洗器中氧化3分钟，制备成具有亲水表面的聚二甲基硅氧烷印章一；
3)基底制备：聚二甲基硅氧烷印章一有微结构面蘸上促进神经细胞黏附的蛋白溶液(层粘连蛋白，laminin)，有微结构面朝下垂直置于细胞细胞培养皿表面；5分钟后揭去聚二甲基硅氧烷印章一，层粘连蛋白就会从聚二甲基硅氧烷印章一的凸型条带状结构表面转移到细胞培养皿表面对应的部位，在细胞培养皿表面形成多组平行排列的层粘连蛋白条带；
将表面吸附有层粘连蛋白条带的细胞培养皿用聚醚F127孵育45分钟后，聚醚F127吸附在细胞培养皿表面蛋白质条带之外的区域；
用双蒸水去除细胞培养皿表面多余的聚醚F127溶液；制备成表面附着有多条平行排列层粘连蛋白条带，其它区域为抗拒细胞黏附的聚醚F127的基底；
4)加载微流通道：将步骤2)制备的聚二甲基硅氧烷印章二取出，把具有微凹型单元的面朝下，置于步骤3)中制备的基底上表面与其进行接触性连接，形成封闭的流通管腔；
5)种植细胞：从乳鼠(出生后12小时内)大脑海马区提取海马神经元，制备海马神经元细胞悬浮溶液，细胞密度为106/ml，把神经细胞经由与凹槽相通的垂直孔道送入流通管腔中，放入细胞培养箱(37℃，5％CO2)中培养；
6)神经元间单线联系的建立：步骤5)中的装置中的神经元在细胞培养箱中培养30-60分钟后，单个的神经元黏附在流通管腔内的培养皿表面多组平行排列的蛋白条带上，形成纵向单个排列的一列神经元，每个蛋白条带横行上生长两个神经元；揭去聚二甲基硅氧烷印章二，神经元在神经细胞培养液中生长，单根神经突起将会沿着神经胞体黏附的蛋白条带生长；几天后，由于距离不同，在同一条蛋白条带上定向生长的两条神经突起陆续相互接触，形成单细胞水平的两个神经元之间的连接。
实施例3
1)光刻：使用光刻技术，分别制备有微结构单元一和微结构单元二的硅片。首先用作图软件L-edit设计出所需要的两种图型，微结构单元一包括多组平行排列的直线型凹槽，其宽度为5微米(5-10微米均可)，间距为50微米(20-100微米均可)。微结构单元二包括至少一组凸型线型微结构单元，该凸形线型微结构单元包括三个直线型凸型线(凸型线一、凸型线二、凸型线三)；所述凸型线一位于凸型线二和凸型线三中间，凸型线一、凸型线二和凸型线三中间段平行，间距为500微米；所述凸型线二、凸型线三的中间段之外的两端部分向远离中间凸型线的方向倾斜；所述凸型线的长度在1.5厘米(1.5-2厘米均可)，宽度40微米；
打印分辨率微3600dip的胶片，接着涂胶(SU-8系列负胶)，利用甩胶机均匀的将光刻胶涂在硅片基底上，80℃烘烤3小时后硬化，把胶片垂直放在涂有光刻胶的基板上，显影曝光后就再涂有光刻胶的硅片上制成了所需的微型结构单元一和微型结构单元二；
2)印章制备：用聚二甲基硅氧烷对步骤1)得到的两种微结构单元进行翻模，得到与这两种微结构单元相对应的聚二甲基硅氧烷印章一和印章二；
把聚二甲基硅氧烷印章一有微结构面朝上，在等离子清洗器中氧化3分钟，制备成具有亲水表面的聚二甲基硅氧烷印章一；
3)基底制备：聚二甲基硅氧烷印章一有微结构面蘸上促进神经细胞黏附的蛋白溶液(层粘连蛋白，laminin)，有结构面朝下垂直置于细胞细胞培养皿表面；5分钟后揭去聚二甲基硅氧烷印章一，层粘连蛋白就会从聚二甲基硅氧烷印章一的凸型条带状结构表面转移到细胞培养皿表面对应的部位，在细胞培养皿表面形成多组平行排列的层粘连蛋白条带；
将表面吸附有层粘连蛋白条带的细胞培养皿用聚醚F127孵育45分钟后，聚醚F127吸附在细胞培养皿表面没有蛋白质吸附的区域；
用双蒸水去除细胞培养皿表面多余的聚醚F127溶液；制备成表面附着有多条平行排列层粘连蛋白条带，其它区域为抗拒细胞黏附的聚醚F127的基底；
4)加载微流通道：将步骤2)制备的聚二甲基硅氧烷印章二取出，把具有微凹型单元的面朝下，置于步骤3)中制备的基底上表面与其进行接触性连接，形成封闭的流通管腔；
5)种植细胞：从乳鼠(出生后12小时内)大脑海马区提取海马神经元，制备海马神经元细胞悬浮溶液，细胞密度为106/ml，把神经细胞经由与凹槽相通的垂直孔道送入流通管腔中，放入细胞培养箱(37℃，5％CO2)中培养；
6)神经元间单线联系的建立：步骤5)中的装置中的神经元在细胞培养箱中培养30-60分钟后，单个的神经元黏附在流通管腔内的培养皿表面多组平行排列的蛋白条带上，形成纵向单个排列的一列神经元，每个蛋白条带横行上生长三个神经元；揭去聚二甲基硅氧烷印章二，神经元在神经细胞培养液中生长，单根神经突起将会沿着神经胞体黏附的蛋白条带生长；几天后，在同一条蛋白条带上沿着蛋白条带定向生长的几根神经突起相互接触，形成单细胞水平的三个神经元之间的连接。
Claims (6)
1.一种建立神经元之间单细胞水平连接的装置，其特征在于，包括：
-基底，所述基底上表面上附着有促进神经细胞黏附的宽度为5-10微米的蛋白条带；两相邻蛋白条带间间距为20-100微米；所述基底上表面上蛋白条带之外的其它区域涂覆有抗拒细胞黏附的聚醚F127层；
-紧密覆于所述基底上表面上的下表面上具有至少一组微凹槽单元的聚二甲基硅氧烷印章；
所述微凹槽单元包括：
一条直线型中间凹槽；
设置于所述直线型中间凹槽左侧或/和右侧的至少一条直线型侧凹槽；所述直线型侧凹槽的中间段与所述直线型中间凹槽不相交，所述直线型侧凹槽中间段之外的两端段分别向远离直线型中间凹槽的方向倾斜；所述直线型中间凹槽、和所述直线型侧凹槽的槽端处分别设有与相应凹槽相通的垂直孔道；所述直线型中间凹槽和所述直线型侧凹槽的长度均在1.5-2厘米范围内，宽度均为40微米；两相邻凹槽槽壁间间距为500微米-1厘米；
所述基底上表面上附着的蛋白条带与所述聚二甲基硅氧烷印章的直线型中间凹槽和直线型侧凹槽相交不重合。
2.如权利要求1所述的建立神经元之间单细胞水平连接的装置，其特征在于：所述蛋白条带宽度为5微米。
3.如权利要求1所述的建立神经元之间单细胞水平连接的装置，其特征在于，所述的聚醚F127为(H(OCH2CH2)x(OCH2CHCH3)y(OCH2CH2)zOH)；其中，x≥1，代表-OCH2CH2-的个数；y≥1，代表-OCH2CHCH3-的个数；z≥1，代表-OCH2CH2-的个数。
4.一种建立神经元之间单细胞水平连接的生长连接方法，包括以下步骤：
1)使用光刻技术，分别在硅片上刻制微结构单元一和微结构单元二；
所述微结构单元一由平行排列的直线型凹槽组成，所述直线型凹槽宽度为5-10微米，所述直线型凹槽间距为20-100微米；
所述微结构单元二具有至少一组凸型线型微结构单元，该凸形线型微结构单元包括：一条直线型中间凸型线；位于所述直线型中间凸型线左侧或/和右侧 的至少一条直线型侧凸型线；所述直线型侧凸型线与所述直线型中间凸型线不相交；所述直线型侧凸型线的中间段之外的两端段分别向远离直线型中间凸型线的方向倾斜；所述直线型中间凸型线和所述直线型侧凸型线长度均在1.5-2厘米范围内，宽度40微米；两相邻凸型线间间距为500微米-1厘米；
2)基底的制备：
以具有微结构单元一的硅片作模板，用聚二甲基硅氧烷对其进行翻模，得到聚二甲基硅氧烷印章一；
所述聚二甲基硅氧烷印章一上表面上具有平行排列的凸型条带，该凸型条带宽度为5-10微米，间距为20-100微米；
将聚二甲基硅氧烷印章一的具有凸型条带的面上蘸上促进神经细胞黏附的蛋白溶液，吹干；将其有凸型条带的面朝下垂直置于细胞培养皿表面中，5-10分钟后揭去聚二甲基硅氧烷印章一，蛋白从聚二甲基硅氧烷印章一的凸型条带上转移到细胞培养皿表面对应的部位，在细胞培养皿表面形成平行排列的蛋白质条带；
将表面吸附有蛋白质条带的细胞培养皿用聚醚F127孵育45-60分钟后，聚醚F127吸附在细胞培养皿表面蛋白质条带之外的其它区域，形成基底，所述基底上表面上附着有促进神经细胞黏附的宽度为5-10微米的蛋白条带，蛋白条带之外的其它区域涂覆有抗拒细胞黏附的聚醚F127层；
3)聚二甲基硅氧烷印章的制备：
以具有微结构单元二的硅片作模板，用聚二甲基硅氧烷对其进行翻模，得到聚二甲基硅氧烷印章；
所述聚二甲基硅氧烷印章的下表面上具有至少一组微凹槽单元；所述微凹槽单元包括：
一条直线型中间凹槽；
设置于所述直线型中间凹槽左侧或/和右侧的至少一条直线型侧凹槽；所述直线型侧凹槽的中间段与所述直线型中间凹槽不相交，所述直线型侧凹槽中间段之外的两端段分别向远离直线型中间凹槽的方向倾斜；所述直线型中间凹槽、和所述直线型侧凹槽的槽端处分别设有与相应凹槽相通的垂直孔道；所述直线型中间凹槽和所述直线型侧凹槽的长度均在1.5-2厘米范围内，宽度均为40微米；两相邻凹槽槽壁间间距为500微米-1厘米；
4)将所述聚二甲基硅氧烷印章的具有微凹槽单元的下表面朝上，在等离子 清洗器中氧化；之后，取出聚二甲基硅氧烷印章与基底进行组装：
将所述聚二甲基硅氧烷印章的具有微凹槽单元的下表面贴覆于基底附着有促进神经细胞黏附的蛋白条带的表面上，所述聚二甲基硅氧烷印章的直线型中间凹槽和直线型侧凹槽分别与基底上表面上的促进神经细胞黏附的蛋白条带相交不重合；所述基底上表面与所述聚二甲基硅氧烷印章的直线型中间凹槽和直线型侧凹槽形成封闭的流通管腔；
5)细胞种植：
提取动物神经元细胞，制备动物神经元细胞密度为106/ml的动物神经元细胞悬浮溶液，把动物神经元细胞悬浮溶液经由与相应凹槽相通的垂直孔道送入相应的流通管腔中，放入细胞培养箱，在37℃，5％CO2条件中培养；
所种植的动物神经元细胞在细胞培养箱中培养30-60分钟后，单个的动物神经元细胞黏附在流通管腔内的基底表面平行排列的蛋白条带上；揭去聚二甲基硅氧烷印章，动物神经元细胞在神经细胞培养液中生长，单根动物神经元突起将会沿着动物神经元胞体黏附的蛋白条带生长；几天后，在同一条蛋白条带上定向生长的动物神经突起相互接触，形成单细胞水平的动物神经元之间的连接。
5.如权利要求4所述的建立神经元之间单细胞水平连接的生长连接方法，其特征在于：所述蛋白条带宽度为5微米。
6.如权利要求4所述的建立神经元之间单细胞水平连接的生长连接方法，其特征在于，所述的聚醚F127为(H(OCH2CH2)x(OCH2CHCH3)y(OCH2CH2)zOH)；其中，x≥1，代表-OCH2CH2-的个数；y≥1，代表-OCH2CHCH3-的个数；z≥1，代表-OCH2CH2-的个数。
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