CN113249294B - 一种能够使细胞图案化生长的表面及其应用 - Google Patents

一种能够使细胞图案化生长的表面及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种能够使细胞图案化生长的表面，制备步骤为：1)用硅烷偶联剂制备氨基修饰的玻璃表面；2)按照a或b的任一步骤进行：a、用带有预设图案的聚二甲基硅氧烷印章，以氧等离子体刻蚀的方式，在步骤1)得到的玻璃片表面形成氨基预设图案，得到氨基图案化玻璃片；再用羧基被活化的天然多糖与氨基图案化玻片发生酰胺化反应，在玻璃片表面形成多糖预设图案；b、步骤1)得到的玻璃片和羧基被活化的天然多糖进行酰胺化反应；再用带有预设图案的聚二甲基硅氧烷印章，以氧等离子体刻蚀的方式，在玻璃片表面形成多糖预设图案。通过图案化表面培养细胞，细胞优先黏附在非多糖区域，形成细胞图案化，且具有良好的取向。

Description

一种能够使细胞图案化生长的表面及其应用
技术领域
本发明属于生物材料领域，涉及一种能够使细胞图案化生长的表面及其应用。
背景技术
细胞在体内处于一个充满了各种物理化学信号高度信息化的微环境中，细胞生长微环境对于细胞的生长发育和动态平衡非常重要。细胞图案化是一种体外细胞培养技术，具体地，通过在材料表面制备一定的图案，诱导细胞自身的响应机制黏附在特定的区域形成图案。目前，常用表面化学修饰的方法在基底形成具有细胞黏附反差的表面，从而实现细胞图案化。细胞图案化作为一种体外研究和控制细胞生物学行为的重要方法，被广泛用于研究细胞与细胞之间以及细胞与基底之间相互作用的机制，同时可以一定程度上模拟体内复杂的微环境以控制细胞的功能性，从而满足组织工程学的需要。
目前，微接触压印技术常被用于构建图案化表面。该方法一般会用到PDMS印章，然而 PDMS没有足够的刚性，压印过程中的过度形变会导致形成的图案不规整，因此不仅对PDMS 印章的图案高度要求严格，而且对操作者而言，需要在压印时非常小心。另外，在以往的研究中，聚乙二醇(PEG)及其衍生物的单分子层常被用作抗细胞黏附的表面，然而不可忽视的是聚乙二醇应用于生物医用材料有很多副反应，例如，PEG分子本身或者在合成过程中引入的副产物可能会引起机体的过敏反应，PEG的不可生物降解性和在有氧环境中容易降解的特点都会对它的使用产生不利的影响。
针对上述弊端，我们采用一种天然多糖为原料，利用氧等离子体刻蚀的方法与玻璃基底进行图案化修饰，从而实现细胞图案化的目的。该方法的优势在于不仅能够很好地形成规整的细胞图案，而且原料具有更加优异的生物相容性和生物功能性，同时操作更加简便，反应条件温和。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种能够使细胞图案化生长的表面。本发明具体提供了如下的技术方案：
1、一种能够使细胞图案化生长的表面，其特征在于，制备步骤为：
1)用硅烷偶联剂制备氨基修饰的玻璃表面；
2)按照a或b的任一步骤进行：
a、用带有预设图案的聚二甲基硅氧烷印章，以氧等离子体刻蚀的方式，在步骤1)得到的玻璃片表面形成氨基预设图案，得到氨基图案化玻璃片；再用羧基被活化的天然多糖与氨基图案化玻片发生酰胺化反应，在玻璃片表面形成多糖预设图案；
b、步骤1)得到的玻璃片和羧基被活化的天然多糖进行酰胺化反应；再用带有预设图案的聚二甲基硅氧烷印章，以氧等离子体刻蚀的方式，在玻璃片表面形成多糖预设图案。
进一步，步骤2)中所述的天然多糖的羧基用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺与 N-羟基琥珀酰亚胺的混合物或4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉激活。
进一步，所述的天然多糖需配成溶液，浓度为1～5mg/mL，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺的浓度分别为20～100mM和50～200mM，4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉的用量为天然多糖的羧基的物质的量的2～4倍。
进一步，所述的天然多糖为透明质酸、海藻酸钠、肝素、葡聚糖、壳聚糖或普鲁兰。
进一步，所述的天然多糖的溶液的pH为5.0～7.0。
进一步，步骤1)的具体步骤为：将洁净的玻璃片用氧等离子体进行处理，以富集表面羟基，然后将其浸泡在体积分数为5％～10％的硅烷偶联剂溶液中，密封反应6～12h，反应温度为60～80℃，反应结束后，先用乙醇和去离子水清洗，N2吹干，在60～80℃下烘箱固化4～8h。
进一步，所述的处理的时间为2～5min，功率为80～100W，所述的硅烷偶联剂的溶剂为 90％wt的乙醇溶液。
进一步，步骤2)所述的带有预设图案的聚二甲基硅氧烷印章的制备方法为：将液态的聚二甲基硅氧烷预聚体和固化剂混合倒入预设图案模板中固化，得到带有预设图案的聚二甲基硅氧烷印章；所述的固化剂为道康宁Sylguard-184硅弹性体固化剂。
进一步，步骤2)所述的氧等离子体刻蚀的步骤为：将步骤1)得到的带有预设图案的聚二甲基硅氧烷印章置于需刻蚀玻璃片表面，稍用力压使印章图案面的凸起部分中的与玻璃片表面完全贴合，然后放入氧等离子体机处理，氧等离子体处理功率为80～100W，处理次数为2～5次，每次处理时间为7～10min。
2、一种能够使细胞图案化生长的表面的应用，将细胞接种在所述表面上，细胞能够在表面上进行图案化生长。
本发明的有益效果在于：
1.本发明利用天然多糖形成条带图案，通过控制天然多糖的浓度为1～5mg/mL，用20～ 100mM EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)与50～200mM NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)或过量的DMTMM(4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉)活化天然多糖，将其修饰到氨基化的玻片表面，采用氧等离子体刻蚀的方式形成了天然多糖的图案，利用天然多糖抗细胞黏附的性能来实现细胞图案化。在此过程中，天然多糖浓度过低，使得玻片表面的修饰密度过低，不能起到足够的抗细胞黏附效果，从而导致不能形成预设的细胞图案。
2.基底无需通过特殊处理即可接种细胞，对细胞无毒无害，适用于细胞行为的体外研究。
3.本发明步骤简单，只需提供细胞黏附性表面，例如天然多糖(透明质酸、肝素、葡聚糖、普鲁兰、壳聚糖、海藻酸钠等)，然后通过氧等离子体刻蚀，并且经过简单的化学反应将抗细胞黏附的物质修饰到表面，该方法操作简单，条件温和，形成的图案完整，适用于普通实验室。
4.天然多糖具有优异的生物功能性和生物相容性，无免疫原性，在组织工程支架的设计与优化方面具有非常大的应用潜力。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
图1为在本发明的能够使细胞图案化生长表面上培养的细胞形成的图案；其中，(a)为在实施例1-3表面上细胞图案化示意图；(b)为在实施例1-3表面上图案化生长的L929和A549细胞图案。
图2为在本发明能够使细胞图案化生长表面上培养的细胞的免疫染色图（L929和A549细胞的免疫染色图）；
图3为对比例1的表面上细胞黏附生长图（L929细胞在对比例1表面黏附生长图）；
图4为对比例2的表面上细胞黏附生长图（L929细胞在对比例2表面黏附生长图）。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
实施例1
(1)PDMS印章的制作：将PDMS预聚体(道康宁Sylguard-184硅弹性体)与固化剂(道康宁Sylguard-184硅弹性体固化剂)以10:1混合均匀，真空排气。把带有图案的硅片置于模腔中，将PDMS混合物缓慢倒入模腔中，平放在60℃烘箱中固化4h，从硅片上揭下(动作需轻缓，以免损伤硅片)即得到条带图案化的PDMS印章，根据需要裁成合适的大小。
(2)玻片的清洗：挑选干净、无划痕的玻片用去离子水冲洗后置于浓度为5％(v/v)的Decon 90(迪康90清洗液)水溶液中，浸泡2～12h。随后，在超声清洗机中超声15min，倒去清洗Decon 90水溶液。之后加入去离子水，超声15min，按此步骤用去离子水重复超声清洗3次。最后将清洗干净的玻片浸泡在去离子水中，放在4℃冰箱内待用。
(3)玻片表面氨基化修饰：将洁净的玻璃片用氧等离子体进行处理2min，功率为90W，然后将其浸泡在体积分数为5％的APTES(3-氨丙基三乙氧基硅烷)溶液中，溶剂为90％的乙醇溶液。之后密封放入60℃烘箱反应6h，然后先用乙醇清洗10min，再用去离子水洗3次，每次10min。最后用N2吹干，放入60℃烘箱固化4h即可。
(4)玻片表面氨基图案的形成：将(1)中得到的图案化的PDMS印章置于步骤(3) 得到的修氨基化玻片表面，稍用力压使印章图案面的凸起部分中的与基底表面完全贴合。用氧等离子体处理3次，每次8min，功率为90W。PDMS印章的突起部分与基底表面贴合，保护基底不被氧等离子刻蚀，突起之间的区域因未被PDMS保护而重新产生羟基，从而在玻片表面产生了氨基图案。
(5)玻片表面透明质酸图案的形成：将透明质酸溶于0.1M的pH 6.0的MES缓冲液，配制成1mg/mL的溶液，之后加入20mM EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺) 与50mMNHS(N-羟基琥珀酰亚胺)活化羧基。将(4)中所得的玻片浸入到溶液中，然后在室温下反应12～24h后取出，用去离子水洗5遍，用N2吹干，即得到透明质酸的图案化表面。
(6)透明质酸图案化表面培养细胞：将(5)中所得玻片裁成1×1cm2的大小，放入24孔板中，经过紫外灭菌1h。将刚消化下的L929和A549细胞(L929为小鼠成纤维细胞，A549 为人肺癌细胞)以5×104/孔的密度接种在材料上，在细胞培养箱中培养两天(37℃，5％CO2)。
图1(a)为在实施例1得到的表面上的细胞图案化示意图，细胞会优先粘附在非多糖的区域，形成规整的条带图案。图1(b)为L929和A549细胞培养两天的细胞黏附状态图，从图中可以看出，细胞在表面上形成条带图案，该图案是由细胞只在非透明质酸区域选择性黏附，从而形成了预设的图案，且细胞在黏附区域有良好的铺展形态。由于透明质酸优异的抗黏附性能，细胞在培养两天的时间内，仍不会向透明质酸(HA)区域迁移。由于区域限制，随着培养时间延长，细胞定向排列更加紧密，导致细胞的取向性也更好。
(7)细胞免疫染色：将(6)中培养的细胞用PBS溶液清洗一次。加入4％组织固定液在孵育箱中固定10min。之后加入0.5％TritonX-100在4℃条件下通透10min。接着用1％的BSA/PBS溶液常温孵育1h。然后依次加入兔抗人黏着斑蛋白(Vinculin)多克隆抗体、AlexaFluor 647标记的山羊抗兔IgG、Actin-Tracker Green(Phalloidin-FITC)和DAPI对细胞的黏着斑蛋白(Vinculin)、肌动蛋白(Actin)和细胞核(Nucleus)在特定条件下进行染色。同样的方式用兔抗人纤连蛋白(Fibronectin)多克隆抗体、Alexa Fluor 647标记的山羊抗兔IgG 对细胞的纤连蛋白(Fibronectin)进行染色用CLSM观察。
图2为L929和A549细胞的免疫染色图，从图中可以看出两种细胞均在材料表面沿着条带方向伸展良好，黏着斑蛋白和纤连蛋白表达明显，肌动蛋白丝组装明显，沿着条带方向排列。
实施例2
(1)PDMS印章的制作：将PDMS预聚体与固化剂以10:1混合均匀，真空排气。把带有图案的硅片置于模腔中，将PDMS混合物缓慢倒入模腔中，平放在60℃烘箱中固化4h，从硅片上揭下(动作需轻缓，以免损伤硅片)即得到条带图案化的PDMS印章，根据需要裁成合适的大小。
(2)玻片的清洗：挑选干净、无划痕的玻片用去离子水冲洗后置于浓度为10％(v/v) 的Decon 90水溶液中，浸泡2～12h。随后，在超声清洗机中超声15min，倒去清洗Decon90 水溶液。之后加入去离子水，超声15min，按此步骤用去离子水重复超声清洗3次。最后将清洗干净的玻片浸泡在去离子水中，放在4℃冰箱内待用。
(3)玻片表面氨基化修饰：将洁净的玻璃片用氧等离子体进行处理5min，功率为90W，然后将其浸泡在体积分数为10％的APTES(3-氨丙基三乙氧基硅烷)溶液中，溶剂为90％的乙醇溶液。之后密封放入80℃烘箱反应6h，然后先用乙醇清洗10min，再用去离子水洗3 次，每次10min。最后用N2吹干，放入80℃烘箱固化4h即可。
(4)玻片表面氨基图案的形成：将(1)中得到的图案化的PDMS印章置于步骤(3) 得到的修饰氨基化玻片表面，稍用力压使印章图案面的凸起部分中的与基底表面完全贴合。用氧等离子体处理3次，功率为90W，每次10min。PDMS印章的突起部分与基底表面贴合，保护基底不被氧等离子刻蚀，突起之间的区域因未被PDMS保护而重新产生羟基，从而在玻片表面产生了氨基图案。
(5)玻片表面修饰海藻酸钠图案的形成：将海藻酸钠于pH 6.0的MES缓冲液配制成3 mg/mL的溶液，之后加入过量的DMTMM(4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉)活化羧基。将(4)中所得的玻片浸入到溶液中，然后在室温下反应12～24h后取出，用去离子水洗5遍，用N2吹干，即得到海藻酸钠的图案化表面。
(6)海藻酸钠图案化表面培养细胞：将(5)中所得玻片裁成1×1cm2的大小，放入24孔板中，经过紫外灭菌1h。将刚消化下的L929和A549细胞(L929为小鼠成纤维细胞，A549 为人肺癌细胞)以5×104/孔的密度接种在材料上，在细胞培养箱中培养两天(37℃，5％CO2)，得到了细胞在表面上形成的条带图案，该图案是由细胞只在非海藻酸钠区域选择性黏附，从而形成了预设的图案，且细胞在黏附区域有良好的铺展形态。(6)海藻酸钠图案化表面培养细胞：将(5)中所得玻片裁成1×1cm2的大小，放入24孔板中，经过紫外灭菌1h。将刚消化下的L929和A549细胞(L929为小鼠成纤维细胞，A549为人肺癌细胞)以5×104/孔的密度接种在材料上，在细胞培养箱中培养两天(37℃，5％CO2)。
图1(a)为在实施例2得到的表面上细胞图案化示意图，图1(b)为L929和A549细胞培养两天的细胞黏附状态图，从图中可以看出，细胞在基底上形成条带图案，该图案是由细胞只在非海藻酸钠区域选择性黏附，从而形成了预设的图案，且细胞在黏附区域有良好的铺展形态。由于海藻酸钠优异的抗黏附性能，细胞在培养两天的时间内，仍不会向海藻酸钠区域迁移。由于区域限制，随着培养时间延长，细胞定向排列更加紧密，导致细胞的取向性也更好。
实施例3
(1)PDMS印章的制作：将PDMS预聚体与固化剂以10:1混合均匀，真空排气。把带有图案的硅片置于模腔中，将PDMS混合物缓慢倒入模腔中，平放在60℃烘箱中固化4h，从硅片上揭下(动作需轻缓，以免损伤硅片)即得到条带图案化的PDMS印章，根据需要裁成合适的大小。
(2)玻片的清洗：挑选干净、无划痕的玻片用去离子水冲洗后置于浓度为5％(v/v)的 Decon 90水溶液中，浸泡2～12h。随后，在超声清洗机中超声15min，倒去清洗Decon 90水溶液。之后加入去离子水，超声15min，按此步骤用去离子水重复超声清洗3次。最后将清洗干净的玻片浸泡在去离子水中，放在4℃冰箱内待用。
(3)玻片表面氨基化修饰：将洁净的玻璃片用氧等离子体进行处理2min，功率为90W，然后将其浸泡在体积分数为5％的APTES(3-氨丙基三乙氧基硅烷)溶液中，溶剂为90％的乙醇溶液。之后密封放入60℃烘箱反应6h，然后先用乙醇清洗10min，再用去离子水洗3次，每次10min。最后用N2吹干，放入60℃烘箱固化4h即可。
(4)玻片表面修饰肝素：将肝素溶于pH 6.0的MES缓冲液配制成5mg/mL的溶液，之后加入20mM EDC与50mM NHS活化羧基。将(3)中所得的氨基化玻片浸入到溶液中，然后在室温下反应12h后取出，用去离子水洗5遍，用N2吹干，即得到肝素涂层表面。
(5)玻片表面肝素图案的形成：将PDMS印章置于肝素修饰的玻片表面，稍用力压使印章图案面的凸起部分中的与基底表面完全贴合。用氧等离子体处理3次，每次10min，功率为90W。基底表面与PDMS印章的突起贴合区域的肝素不被氧等离子刻蚀，突起之间的区域的肝素因未被PDMS保护而被刻蚀掉，从而在玻片表面产生了肝素酸图案。
(6)肝素图案化表面培养细胞：将(5)中所得玻片裁成1×1cm2的大小，放入24孔板中，经过紫外灭菌1h。将刚消化下的L929和A549细胞(L929为小鼠成纤维细胞，A549 为人肺癌细胞)以5×104/孔的密度接种在材料上，在细胞培养箱中培养两天(37℃，5％CO2)。
图1(a)为在实施例1得到的表面上细胞图案化示意图，图1(b)为L929和A549细胞培养两天的细胞黏附状态图，从图中可以看出，细胞在基底上形成条带图案，该图案是由细胞只在非肝素区域选择性黏附，从而形成了预设的图案，且细胞在黏附区域有良好的铺展形态。由于肝素优异的抗黏附性能，细胞在培养两天的时间内，仍不会向肝素区域迁移。由于区域限制，随着培养时间延长，细胞定向排列更加紧密，导致细胞的取向性也更好。
对比例1
(1)PDMS印章的制作：将PDMS预聚体与固化剂以10:1混合均匀，真空排气。把带有图案的硅片置于模腔中，将PDMS混合物缓慢倒入模腔中，平放在60℃烘箱中固化4h，从硅片上揭下(动作需轻缓，以免损伤硅片)即得到条带图案化的PDMS印章，根据需要裁成合适的大小。
(2)玻片的清洗：挑选干净、无划痕的玻片用去离子水冲洗后置于浓度为5％(v/v)的 Decon 90水溶液中，浸泡2～12h。随后，在超声清洗机中超声15min，倒去清洗Decon 90水溶液。之后加入去离子水，超声15min，按此步骤用去离子水重复超声清洗3次。最后将清洗干净的玻片浸泡在去离子水中，放在4℃冰箱内待用。
(3)玻片表面氨基化修饰：将洁净的玻璃片用氧等离子体进行处理2min，功率为90W，然后将其浸泡在体积分数为5％的APTES(3-氨丙基三乙氧基硅烷)溶液中，溶剂为90％的乙醇溶液。之后密封放入60℃烘箱反应6h，然后先用乙醇清洗10min，再用去离子水洗3次，每次10min。最后用N2吹干，放入60℃烘箱固化4h即可。
(4)玻片表面氨基图案的形成：将(1)中得到的图案化的PDMS印章置于修氨基化玻片表面，稍用力压使印章图案面的凸起部分中的与基底表面完全贴合。用氧等离子体处理3次，每次8min，功率为90W。PDMS印章的突起部分与基底表面贴合，保护基底不被氧等离子刻蚀，突起之间的区域因未被PDMS保护而重新产生羟基，从而在玻片表面产生了氨基图案。
(5)玻片表面透明质酸图案的形成：将透明质酸溶于0.1M的pH 6.0的MES缓冲液，配制成0.1mg/mL的溶液，之后加入20mM EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺) 与50mM NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)活化羧基。将(4)中所得的玻片浸入到溶液中，然后在室温下反应12h后取出，用去离子水洗5遍，用N2吹干，即得到透明质酸的图案化表面。
(6)透明质酸图案化表面培养细胞：将(5)中所得玻片裁成1×1cm2的大小，放入24孔板中，经过紫外灭菌1h。将刚消化下的L929细胞(L929为小鼠成纤维细胞)以5×104/ 孔的密度接种在材料上，在细胞培养箱中培养一天(37℃，5％CO2)，用相差显微镜观察细胞生长情况。
图3为L929细胞在材料表面黏附生长图，从图中可以看出L929细胞随机分布、黏附，没有形成预设的条带图案，这是由于所用的透明质酸溶液的浓度过小，使得玻片表面修饰的透明质酸密度过小，没有起到足够的抗细胞黏附的作用，从而导致没有形成很好的细胞图案。
对比例2
(1)PDMS印章的制作：将PDMS预聚体与固化剂以10:1混合均匀，真空排气。把带有图案的硅片置于模腔中，将PDMS混合物缓慢倒入模腔中，平放在60℃烘箱中固化4h，从硅片上揭下(动作需轻缓，以免损伤硅片)即得到条带图案化的PDMS印章，根据需要裁成合适的大小。
(2)玻片的清洗：挑选干净、无划痕的玻片用去离子水冲洗后置于浓度为5％(v/v)的 Decon 90水溶液中，浸泡2～12h。随后，在超声清洗机中超声15min，倒去清洗Decon 90水溶液。之后加入去离子水，超声15min，按此步骤用去离子水重复超声清洗3次。最后将清洗干净的玻片浸泡在去离子水中，放在4℃冰箱内待用。
(3)玻片表面氨基化修饰：将洁净的玻璃片用氧等离子体进行处理2min，功率为90W，然后将其浸泡在体积分数为5％的APTES(3-氨丙基三乙氧基硅烷)溶液中，溶剂为90％的乙醇溶液。之后密封放入60℃烘箱反应6h，然后先用乙醇清洗10min，再用去离子水洗3次，每次10min。最后用N2吹干，放入60℃烘箱固化4h即可。
(4)玻片表面氨基图案的形成：将(1)中得到的图案化的PDMS印章置于修氨基化玻片表面，稍用力压使印章图案面的凸起部分中的与基底表面完全贴合。用氧等离子体处理3次，每次8min，功率为90W。PDMS印章的突起部分与基底表面贴合，保护基底不被氧等离子刻蚀，突起之间的区域因未被PDMS保护而重新产生羟基，从而在玻片表面产生了氨基图案。
(5)玻片表面肝素图案的形成：将肝素溶于0.1M的H 6.0的MES缓冲液，配制成0.3mg/mL的溶液，之后加入20mM EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)与50mM NHS (N-羟基琥珀酰亚胺)活化羧基。将(4)中所得的玻片浸入到溶液中，然后在室温下反应 12h后取出，用去离子水洗5遍，用N2吹干，即得到肝素的图案化表面。
(6)肝素图案化表面培养细胞：将(5)中所得玻片裁成1×1cm2的大小，放入24孔板中，经过紫外灭菌1h。将刚消化下的L929细胞(L929为小鼠成纤维细胞)以5×104/孔的密度接种在材料上，在细胞培养箱中培养一天(37℃，5％CO2)，用相差显微镜观察细胞生长情况。
图4为L929细胞在材料表面黏附生长图，从图中可以看出L929细胞随机分布、黏附，没有形成预设的条带图案，这是由于所用的肝素溶液的浓度过小，使得玻片表面修饰的肝素密度过小，没有起到足够的抗细胞黏附的作用，从而导致没有形成很好的细胞图案。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (9)

1.一种能够使细胞图案化生长的表面，其特征在于，制备步骤为：
1)用硅烷偶联剂制备氨基修饰的玻璃表面；
2)按照a或b的任一步骤进行：
a、用带有预设图案的聚二甲基硅氧烷印章，以氧等离子体刻蚀的方式，在步骤1)得到的玻璃片表面形成氨基预设图案，得到氨基图案化玻璃片；再用羧基被活化的天然多糖与氨基图案化玻片发生酰胺化反应，在玻璃片表面形成多糖预设图案；
b、步骤1)得到的玻璃片和羧基被活化的天然多糖进行酰胺化反应；再用带有预设图案的聚二甲基硅氧烷印章，以氧等离子体刻蚀的方式，在玻璃片表面形成多糖预设图案；
所述的天然多糖需配成溶液，浓度为1～5mg/mL，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺的浓度分别为20～100mM和50～200mM，4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉的用量为天然多糖的羧基的物质的量的2～4倍。
2.根据权利要求1所述的一种能够使细胞图案化生长的表面，其特征在于，步骤2)中所述的天然多糖的羧基用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺的混合物或4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉激活。
3.根据权利要求1所述的一种能够使细胞图案化生长的表面，其特征在于，所述的天然多糖为透明质酸、海藻酸钠、肝素、葡聚糖、壳聚糖或普鲁兰。
4.根据权利要求2所述的一种能够使细胞图案化生长的表面，其特征在于，所述的天然多糖的溶液的pH为5.0～7.0。
5.根据权利要求1所述的一种能够使细胞图案化生长的表面，其特征在于，步骤1)的具体步骤为：将洁净的玻璃片用氧等离子体进行处理，以富集表面羟基，然后将其浸泡在体积分数为5％～10％的硅烷偶联剂溶液中，密封反应6～12h，反应温度为60～80℃，反应结束后，先用乙醇和去离子水清洗，N2吹干，在60～80℃下烘箱固化4～8h。
6.根据权利要求5所述的一种能够使细胞图案化生长的表面，其特征在于，所述的处理的时间为2～5min，功率为80～100W，所述的硅烷偶联剂的溶剂为90％wt的乙醇溶液。
7.根据权利要求1所述的一种能够使细胞图案化生长的表面，其特征在于，步骤2)所述的带有预设图案的聚二甲基硅氧烷印章的制备方法为：将液态的聚二甲基硅氧烷预聚体和固化剂混合倒入预设图案模板中固化，得到带有预设图案的聚二甲基硅氧烷印章；所述的固化剂为道康宁Sylguard-184硅弹性体固化剂。
8.根据权利要求1所述的一种能够使细胞图案化生长的表面，其特征在于，步骤2)所述的氧等离子体刻蚀的步骤为：将步骤1)得到的带有预设图案的聚二甲基硅氧烷印章置于需刻蚀玻璃片表面，稍用力压使印章图案面的凸起部分中的与玻璃片表面完全贴合，然后放入氧等离子体机处理，氧等离子体处理功率为80～100W，处理次数为2～5次，每次处理时间为7～10min。
9.权利要求1-8任一所述的一种能够使细胞图案化生长的表面的应用，其特征在于，将细胞接种在所述表面上，细胞能够在表面上进行图案化生长。
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