CN106397819B - 一种用于调控细胞三维微图案化生长的水凝胶及其制备方法 - Google Patents

一种用于调控细胞三维微图案化生长的水凝胶及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医用材料和组织工程领域，具体涉及了一种用于调控细胞三维微图案化生长的水凝胶及其制备方法。所述制备方法包括：微图案化水凝胶的制备；水凝胶的氨基化处理；水凝胶非三维凹形区域的处理；水凝胶三维凹形区域的处理。本发明制备所得具有三维微图案的水凝胶可用于调控细胞三维微图案化生长，细胞高效的限定在三维微图案里生长，很好的模拟了细胞在机体内的生存环境，不仅适用于在体外构建仿生的功能性组织结构，而且植入动物体内，显示出非常好的生物相容性，较低的炎症反应，良好的可调节降解能力，对动物体内的组织再生和修复有一定的效果，具有很好的医用价值。

Description

一种用于调控细胞三维微图案化生长的水凝胶及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医用材料和组织工程领域，具体涉及了一种用于调控细胞三维微图案化生长的水凝胶及其制备方法。
背景技术
在体外构建细胞和生物材料支架的复合体，并研究细胞与材料间的相互作用，其中一个关键点就是要模拟机体内的形貌、结构和功能等细胞外环境。生物材料的三维微图案化，能更好模拟细胞在机体内的生存环境，调控细胞行为并形成仿生结构。生物材料的微图案化和细胞的微图案化技术，对研究细胞与基底材料的相互作用，细胞之间的相互影响，拓扑结构对细胞行为的调控，细胞对药物刺激的响应等，具有重要的研究意义和应用价值。因此，随着组织工程的不断发展，调控细胞微图案化越来越受到重视，并得以广泛的研究和应用。
目前，光刻、微接触印刷、机械微点样等技术，可以用作调控细胞微图案化，使细胞在材料基底上形成具有微图案结构的组织形态。为了在有序结构的材料微图形化区域，获得更有利于细胞有序化生长的微环境，则要对基底材料进行区域性的表面改性，使细胞在所设计区域促进粘附、生长，在其他区域抑制细胞粘附生长。可用于促进细胞粘附生长的表面化处理方式多用细胞外基质蛋白，如胶原蛋白、明胶、纤连蛋白、层粘蛋白等，或者一些特殊的大分子物质如多聚赖氨酸、RGD多肽等。同时，可用于抑制细胞粘附的物质有聚乙二醇、F127等。
高分子水凝胶由于良好的可塑性、生物相容性，可以很好的传递、供给细胞营养，同时还可以作为药物和生长因子缓释体系，此外还能模拟各种机体内物化环境，因此被广泛应用于组织工程支架的选择。将高分子水凝胶通过微图案化处理，形成具有高度仿生的精细结构，可以更好、更全面地调控细胞行为，是优秀的研究细胞与生物材料相互作用的组织工程载体。目前，可用于微图案化的水凝胶材料有琼脂糖、聚丙烯酰胺、壳聚糖、胶原、透明质酸、褐藻糖胶、海藻酸钙等。然而，需要对这类水凝胶材料进行表面改性，才能使细胞能定向可控地生长于所设计区域内。但目前相应的水凝胶表面改性技术，即表面化处理方法甚少，这极大地限制了微图案化技术在水凝胶和细胞间相互作用的研究和后期组织工程应用。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的不足，目的在于提供一种用于调控细胞三维微图案化生长的水凝胶及其制备方法。
为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案为：
一种用于调控细胞三维微图案化生长的水凝胶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)微图案化水凝胶的制备：通过负光刻胶光刻在硅片上制备三维微图案，通过PDMS胶倒模固化后，揭模，得到PDMS胶模板；配制一定浓度的高分子溶液，加入交联剂，浇筑在所得PDMS胶模板表面，待高分子彻底固化成为水凝胶后，揭除PDMS胶模板，获得具有三维微图案的水凝胶，所述三维微图案由多个三维凹形区域排列形成；
(2)水凝胶的氨基化处理：将所得具有三维微图案的水凝胶浸泡在含有NHS的MES缓冲液体系中，再加入EDC活化，然后加入乙二胺进行氨基化处理，得到氨基化的水凝胶；
(3)水凝胶非三维凹形区域的处理：将一片光滑无图案的水凝胶块，泡在PEG-NHS溶液中，待水凝胶块充分吸附PEG-NHS后，取出水凝胶块，晾至半干，覆盖在步骤(2)所得水凝胶的三维微图案正表面，使非三维凹形区域上的氨基与PEG-NHS发生酰胺反应接枝上PEG，反应结束后，取下水凝胶块，得到非三维凹形区域连接有PEG的水凝胶；
(4)水凝胶三维凹形区域的处理：向步骤(3)所得水凝胶的三维凹形区域滴加可促进细胞粘附生长的高分子溶液，然后进行灭菌处理，得到一种可用于调控细胞三维微图案化生长的水凝胶。
上述方案中，所述EDC在反应体系中的浓度为0.11～1.01mol/L，所述NHS在反应体系中的浓度为0.1～1mol/L，所述乙二胺在反应体系中的浓度为0.1～2mol/L。
上述方案中，所述NHS、EDC、乙二胺的摩尔比为1：5：2。
上述方案中，所述MES缓冲液体系的pH值为4～6，所述MES缓冲液体系的质量浓度为0.5wt％。
上述方案中，所述活化的温度为25～26℃，时间为30min～60min。
上述方案中，所述氨基化处理的温度为4℃，时间为6～12h。
上述方案中，所述PEG-NHS溶液的浓度为10～30mg/mL。
上述方案中，所述酰胺反应的温度为25～26℃，时间为30min～60min。
上述方案中，所述三维微图案为三维微孔阵列、直条纹凹槽、环形条纹凹槽或网状条纹凹槽，所述三维微孔的横截面形状为圆形、三角形、正方形、长方形、菱形和纺锤形中的一种或几种。
上述方案中，所述三维微孔横截面的当量直径为50μm～0.5mm，所述凹槽的槽宽为
50μm～0.5mm，槽深50μm～0.5mm。
上述方案中，步骤(1)所述高分子为琼脂糖、丙烯酰胺、壳聚糖、胶原、明胶、透明质酸和海藻酸钠中的一种或几种；
上述方案中，步骤(1)所述高分子选用壳聚糖、胶原、明胶、琼脂糖时，所述交联剂选自HDI、戊二醛或京尼平；所述高分子选用丙烯酰胺时，所述交联剂为TEMED或AP；所述高分子选用海藻酸钠时，所述交联剂选用钙离子溶液或其粉末；所述高分子选用透明质酸时，所述交联剂选用甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)或者1，4丁二醇缩水甘油醚(BDDE)。
上述方案中，步骤(5)所述可促进细胞粘附生长的高分子溶液为细胞外基质蛋白溶液、RGD多肽溶液和多聚赖氨酸溶液中的一种。
上述方案中，所述细胞外基质蛋白为胶原蛋白、明胶、纤连蛋白和层粘蛋白中的一种或几种。
本发明的有益效果：
(1)现有技术中的惰性基底材料只能用于体外细胞培养来模拟细胞在基底中的生长情况，而不能植入动物体内进行各种相容性评价，因此，不具有医用价值；本发明克服了现有技术的不足，以水凝胶为基底，通过三维微图案化及表面改性处理，使细胞高效的限定在三维微图案里生长，很好的模拟了细胞在机体内的生存环境，不仅适用于在体外构建仿生的功能性组织结构，而且植入动物体内，显示出非常好的生物相容性，较低的炎症反应，良好的可调节降解能力，对动物体内的组织再生和修复有一定的效果，具有很好的医用价值；
(2)本发明所述制备方法简单易行、实验条件温和、反应易于控制、安全无毒性、成本低廉、无需特殊材料和设备；
(3)本发明所述水凝胶为研究各单因素对细胞生长、迁移及分化等的影响提供了研究模型，从而为更好地应用于细胞与组织再生的研究提供了基础。
附图说明
图1为本发明中三维微图案化水凝胶的制备方法示意图。
图2为本发明制备所得具有三维微图案的水凝胶的照片图。
图3为本发明实施例1～2制备所得具有三维微图案的水凝胶的荧光图。
图4为本发明中在三维微图案水凝胶上培养细胞的显微图片。
图5为在实施例1～3制备所得具有三维微图案的水凝胶上培养细胞的荧光图片。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合附图、实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
实施例1
一种调控细胞直条纹状生长的三维微图案海藻酸钙水凝胶，通过如下方法制备得到：
(1)用设计好的掩膜版通过微图案负光刻法，制备出槽宽50μm、间距50μm、深度50μm的条纹状凹槽一级光刻胶微图案模板，在其表面浇筑PDMS胶预聚物，60℃烘箱中交联固化12小时后，剥离揭膜，得到二级PDMS胶微图案模板，微图案朝上置于直径3cm的培养皿中；
(2)配制浓度10mg/ml海藻酸钠水溶液20mL，其中加入0.06g的磷酸钙粉末，搅拌10min至分散均匀，得到海藻酸钠与磷酸钙粉末的混合体系；
(3)取步骤(2)所得混合体系5mL浇筑在步骤(1)所述置于培养皿中的PDMS胶微图案模板上，使混合体系在PDMS胶表面形成均匀的薄层；再将培养皿放在滴加有醋酸溶液的大培养皿中，放进37℃烘箱里进行交联6小时后；待交联反应结束后，揭除PDMS胶模板，并数次置于水中浸泡去除残余杂质，即得到具有三维直条纹状沟槽微图案的海藻酸钙水凝胶；
(4)将具有三维直条纹状沟槽微图案的海藻酸钙水凝胶浸泡在含有NHS的MES缓冲液体系中(MES缓冲液体系的pH值为5，所述MES缓冲液体系的质量浓度为0.5wt％)，再加入EDC活化(EDC浓度1.01mol/L，NHS浓度1mol/L，常温25℃下活化1小时)，再加入0.1mL的乙二胺溶液(乙二胺浓度1mol/L，NHS、EDC、乙二胺的摩尔比为1：5：2)4℃反应过夜12h，得到氨基化的具有三维直条纹状沟槽微图案的海藻酸钙水凝胶；
(5)将一片光滑无图案的琼脂糖水凝胶块，浸泡在10mg/mL的PEG-NHS溶液中，30分钟后取出待半干后，覆盖在步骤(4)所得氨基化的具有三维直条纹状沟槽微图案的海藻酸钙水凝胶表面，使海藻酸钙水凝胶表面直条纹状沟槽外的氨基与PEG-NHS发生酰胺反应，反应温度为25℃，反应时间30min后，取下水凝胶块，得到具有三维直条纹状沟槽微图案、非微图案区连接有PEG的海藻酸钙水凝胶；
(6)在步骤(5)所得海藻酸钙水凝胶的微图案区直条纹状沟槽内滴加1mg/ml的罗丹明-胶原蛋白，30分钟后用无菌水清洗三遍，再经辐照灭菌后，得到可用于调控细胞直条纹状生长的三维微图案海藻酸钙水凝胶。
将本实施例制备所得三维微图案海藻酸钙水凝胶取一块置于荧光显微镜下观察，如图3(a)所示，可见海藻酸钙水凝胶呈现条纹状凹槽三维微图案。将所述具有条纹状凹槽三维微图案的海藻酸钙水凝胶置于24孔板中，每孔加入1*105个细胞悬液，放入二氧化碳培养箱中培养2天后，细胞能够限制生长在海藻酸钙水凝胶的条纹状凹槽三维微图案中，用多聚甲醛固定细胞，并用FITC-鬼笔环肽和DAPI染料染色后，置于荧光显微镜下观察可见细胞条纹状生长的结构，如图5(a)所示。
实施例2
一种调控细胞正方形阵列生长的三维微图案聚丙烯酰胺水凝胶，通过如下方法制备得到：
(1)用设计好的掩膜版通过微图案负光刻法，制备出边长100μm、间距50μm、深度100μm的正方形阵列状凹槽一级光刻胶微图案模板，在其表面浇筑PDMS胶预聚物，60℃烘箱中交联固化12小时后，剥离揭下得到二级PDMS胶微图案模板，微图案朝上置于直径3cm的培养皿中；
(2)将4mL 50wt％的丙烯酰胺溶液、4.8mL 0.5wt％的甲叉双丙烯酰胺溶液、1μL四甲基乙二胺(TEMED)催化剂和10％0.1mL过硫酸铵(AP)溶液混合均匀后，取5mL浇筑在步骤(1)所述得到的PDMS胶微图案模板上，待2小时聚丙烯酰胺水凝胶固化交联后，揭除PDMS胶并数次置于水中浸泡去除残余杂质；得到具有正方形微孔阵列的三维微图案丙烯酰胺水凝胶；
(3)将具有正方形微孔阵列的三维微图案丙烯酰胺水凝胶浸泡在含有NHS的MES缓冲液体系中(MES缓冲液体系的pH值为4.5，所述MES缓冲液体系的质量浓度为0.5wt％)，再加入EDC活化(EDC浓度1mol/L，NHS浓度1mol/L，常温25℃下活化1小时)，再加入0.1ml的乙二胺溶液(乙二胺浓度1mol/L，NHS、EDC、乙二胺的摩尔比为1：5：2)4℃反应过夜8h，得到氨基化的具有正方形微孔阵列的三维微图案丙烯酰胺水凝胶；
(4)将一片光滑无图案的琼脂糖水凝胶块，浸泡在15mg/ml的PEG-NHS溶液中，30分钟后取出待半干后，覆盖在步骤(3)所得氨基化的正方形微孔阵列的三维微图案丙烯酰胺水凝胶表面，使丙烯酰胺水凝胶表面微孔外的氨基与PEG-NHS发生酰胺反应，反应温度为25℃，反应时间为30min，取下水凝胶块，得到具有正方形微孔阵列微图案、微孔外连接有PEG的丙烯酰胺水凝胶；
(5)在步骤(4)所得丙烯酰胺水凝胶的微图案区微孔内滴加1mg/ml的多聚赖氨酸，30分钟后用无菌水清洗三遍，再经辐照灭菌后，得到可用于调控细胞正方形阵列生长的三维微图案聚丙烯酰胺水凝胶。
将本实施例制备所得具有三维微图案的聚丙烯酰胺水凝胶取一块置于荧光显微镜下观察，如图3(b)所示，可见聚丙烯酰胺水凝胶呈现正方形微孔阵列微图案。将所述具有正方形微孔阵列三维微图案的聚丙烯酰胺水凝胶置于24孔板中，每孔加入1*105个细胞悬液，放入二氧化碳培养箱中培养2天后，细胞能够限制生长在聚丙烯酰胺水凝胶的正方形微孔阵列三维微图案中，用多聚甲醛固定细胞，并用FITC-鬼笔环肽和DAPI染料染色后，置于荧光显微镜下观察可见细胞正方形阵列生长的结构，如图5(b)所示。
实施例3
一种调控细胞网状条纹凹槽生长的三维微图案明胶水凝胶，通过如下方法制备得到：
(1)用设计好的掩膜版通过微图案负光刻法，制备出边长50μm、间距100μm、深度100μm的网状条纹凹槽一级光刻胶微图案模板，在其表面浇筑PDMS胶预聚物，60℃烘箱中交联固化12小时后，剥离揭下得到二级PDMS胶微图案模板，微图案朝上置于直径3cm的培养皿中；
(2)将5wt％的明胶分散均匀，取5mL浇筑在步骤(1)所述得到的PDMS胶微图案模板上，将载有明胶和PDMS胶的小培养皿置于4℃中固化2小时后，加入5wt％的戊二醛进行交联1小时后取出，揭除PDMS胶并数次置于水中浸泡去除残余戊二醛，并用5wt％的BSA溶液封闭多余戊二醛，再用无菌水清洗数次，得到具有网状条纹凹槽的三维微图案明胶水凝胶；
(3)将具有网状条纹凹槽的三维微图案明胶水凝胶浸泡在含有NHS的MES缓冲液体系中(MES缓冲液体系的pH值为4.5，所述MES缓冲液体系的质量浓度为0.5wt％)，再加入EDC活化(EDC浓度1.01mol/L，NHS浓度1mol/L，常温25℃下活化1小时)，再加入0.1mL的乙二胺溶液(乙二胺浓度1.5mol/L，NHS、EDC、乙二胺的摩尔比为1：5：2)4℃反应过夜12h，得到氨基化的具有明胶网状条纹凹槽的三维微图案明胶水凝胶；
(4)将一片光滑无图案的琼脂糖水凝胶块，浸泡在20mg/mL的PEG-NHS溶液中，30分钟后取出待半干后，覆盖在步骤(3)所得氨基化的具有明胶网状条纹凹槽的三维微图案明胶水凝胶表面，使明胶水凝胶表面网状条纹凹槽外的氨基与PEG-NHS发生酰胺反应，反应温度25℃，反应时间30min，取下水凝胶块，得到具有网状条纹凹槽微图案、网状条纹凹槽外连接有PEG的明胶水凝胶；
(5)在步骤(4)所得明胶水凝胶的微图案区网状条纹凹槽内滴加1mg/ml的多聚赖氨酸，30分钟后用无菌水清洗三遍，再经辐照灭菌后，得到可用于调控细胞网状阵列生长的三维微图案明胶水凝胶。
将本实施例制备所得具有网状条纹凹槽三维微图案的明胶水凝胶置于24孔板中，每孔加入1*105个细胞悬液，放入二氧化碳培养箱中培养2天后，细胞能够限制生长在明胶水凝胶的网状条纹凹槽三维微图案中，用多聚甲醛固定细胞，并用FITC-鬼笔环肽和DAPI染料染色后，置于荧光显微镜下观察可见细胞网状生长的结构，如图5(c)所示。
本发明所得具有三维微图案的水凝胶可以使细胞高效的限定在三维微图案里生长，很好的模拟了细胞在机体内的生存环境，不仅适用于在体外构建仿生的功能性组织结构，而且植入动物体内，显示出非常好的生物相容性，较低的炎症反应，良好的可调节降解能力，对动物体内的组织再生和修复有一定的效果，具有很好的医用价值。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于调控细胞三维微图案化生长的水凝胶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）微图案化水凝胶的制备：通过负光刻胶光刻在硅片上制备三维微图案，通过PDMS胶倒模固化后，揭模，得到PDMS胶模板；配制一定浓度的高分子溶液，加入交联剂，浇筑在所得PDMS胶模板表面，待高分子彻底固化成为水凝胶后，揭除PDMS胶模板，获得具有三维微图案的水凝胶，所述三维微图案由多个三维凹形区域排列形成；
（2）水凝胶的氨基化处理：将所得具有三维微图案的水凝胶浸泡在含有NHS的MES缓冲液体系中，再加入EDC活化，然后加入乙二胺进行氨基化处理，得到氨基化的水凝胶；
（3）水凝胶非三维凹形区域的处理：将一片光滑无图案的水凝胶块，泡在PEG-NHS溶液中，待水凝胶块充分吸附PEG-NHS后，取出水凝胶块，晾至半干，覆盖在步骤（2）所得水凝胶的三维微图案正表面，使非三维凹形区域上的氨基与PEG-NHS发生酰胺反应接枝上PEG，反应结束后，取下水凝胶块，得到非三维凹形区域连接有PEG的水凝胶；
（4）水凝胶三维凹形区域的处理：向步骤（3）所得水凝胶的三维凹形区域滴加可促进细胞粘附生长的高分子溶液，然后进行灭菌处理，得到一种可用于调控细胞三维微图案化生长的水凝胶。
2.根据权利要求1所述的用于调控细胞三维微图案化生长的水凝胶的制备方法，其特征在于，所述EDC在反应体系中的浓度为0.11~1.01 mol/L所述NHS在反应体系中的浓度为0.1~1 mol/L，所述乙二胺在反应体系中的浓度为0.1~2 mol/L。
3.根据权利要求1所述的用于调控细胞三维微图案化生长的水凝胶的制备方法，其特征在于，所述NHS、EDC、乙二胺的摩尔比为1：5：2。
4.根据权利要求1所述的用于调控细胞三维微图案化生长的水凝胶的制备方法，其特征在于，所述MES缓冲液体系的pH值为4~6，所述MES缓冲液体系的质量浓度为0.5wt%。
5.根据权利要求1所述的用于调控细胞三维微图案化生长的水凝胶的制备方法，其特征在于，所述活化的温度为25~26℃，时间为30min~60min。
6.根据权利要求1所述的用于调控细胞三维微图案化生长的水凝胶的制备方法，其特征在于，所述氨基化处理的温度为4℃，时间为6~12h。
7.根据权利要求1所述的用于调控细胞三维微图案化生长的水凝胶的制备方法，其特征在于，所述PEG-NHS溶液的浓度为10~30mg/mL。
8.根据权利要求1所述的用于调控细胞三维微图案化生长的水凝胶的制备方法，其特征在于，所述酰胺反应的温度为25~26℃，时间为30min~60min。
9.根据权利要求1所述的用于调控细胞三维微图案化生长的水凝胶的制备方法，其特征在于，所述三维微图案为三维微孔阵列、直条纹凹槽、环形条纹凹槽或网状条纹凹槽，所述三维微孔的横截面形状为圆形、三角形、正方形、长方形、菱形和纺锤形中的一种或几种。
10.根据权利要求1所述的用于调控细胞三维微图案化生长的水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述高分子为琼脂糖、聚丙烯酰胺、壳聚糖、胶原、明胶、透明质酸和海藻酸钠中的一种或几种；步骤（5）所述可促进细胞粘附生长的高分子溶液为细胞外基质蛋白溶液、RGD多肽溶液和多聚赖氨酸溶液中的一种。
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