CN109833515A - 一种具有3d微图案的胶原薄膜及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医用材料领域，公开了一种具有3D微图案的胶原薄膜及其制备方法和应用。采用具有3D微图案的掩膜版通过光刻技术在硅片上形成3D微图案，然后在硅片上浇注PDMS预聚物，交联固化后得到带有3D微图案的PMDS基底；将胶原溶解于酸性溶液中，加水搅拌均匀，得到胶原溶液，然后加入交联剂交联；将交联反应产物经除泡后浇注在PDMS基底上，风干成膜后剥离，得到具有3D微图案的胶原薄膜。本发明的制备工艺简单，成本较低，所制备的薄膜结合了胶原蛋白和表面图案化的优势，具有良好的理化性能和生物相容性，可用于角膜组织工程，诱导角膜组织再生，并对角膜细胞的行为进行调控，形成与天然组织相似的结构。
Description
技术领域
本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种具有3D微图案的胶原薄膜及其制备方法和应用。
背景技术
胶原是一种不溶于水的纤维蛋白，是构成细胞外基质的主要成分之一，在维持细胞的正常生存和各种生理学活动中起到关键作用，在动物体内的很多组织中都大量存在。因此，胶原作为生物材料植入人体内时具有良好的生物相容性，可生物降解性，不易与人体发生免疫排斥反应。胶原同时具有高抗张强度和低延展性，亲水性强，透水透气性好，所以被广泛地应用于生物医学领域。
表面图案化是指利用微加工技术在生物材料表面构建不同的拓扑图案，使细胞选择性地粘附于特定区域形成图案化分布。研究表明，细胞的这种图案化分布会对细胞的铺展、吸附、取向、增殖和分化等一系列行为造成影响。因此，利用这种方法可以进行细胞生物学的基础研究，也可以利用这种方式对细胞行为进行调控，制备出能对细胞产生积极影响的第三代生物医用材料。
目前在胶原薄膜上构建微图案的研究还比较少，还没有简单可行的图案化胶原的制备方法。
发明内容
针对以上现有技术存在的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种具有3D微图案的胶原薄膜的制备方法。
本发明的另一目的在于提供一种通过上述方法制备得到的具有3D微图案的胶原薄膜。
本发明的再一目的在于提供上述具有3D微图案的胶原薄膜作为角膜修复材料的应用。
本发明目的通过以下技术方案实现：
一种具有3D微图案的胶原薄膜的制备方法，包括如下制备步骤：
(1)采用具有3D微图案的掩膜版通过光刻技术在硅片上形成3D微图案，然后在硅片上浇注PDMS预聚物，交联固化后得到带有3D微图案的PMDS基底；
(2)将胶原溶解于酸性溶液中，加水搅拌均匀，得到胶原溶液，然后加入交联剂交联反应；
(3)将步骤(2)的交联反应产物经除泡后浇注在步骤(1)的PDMS基底上，风干成膜后，将薄膜从PDMS基底上剥离，得到具有3D微图案的胶原薄膜。
进一步地，所述3D微图案为微米级沟槽图案或点阵图案等规则图案。
进一步地，步骤(2)中所述胶原为干态I型胶原。
进一步地，步骤(2)中所述酸性溶液为浓度为0.01mol/L的盐酸溶液；酸性溶液与胶原的体积质量比为0.15L/g。
进一步地，步骤(2)中所述胶原溶液的浓度为2.0～6.5g/L。
进一步地，步骤(2)中所述交联剂是指1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)水溶液和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)水溶液。
进一步地，步骤(2)在4℃的环境下进行。
进一步地，步骤(3)中所得具有3D微图案的胶原薄膜进一步浸泡在PBS中，然后经灭菌处理。
一种具有3D微图案的胶原薄膜，通过上述方法制备得到。
上述具有3D微图案的胶原薄膜作为角膜修复材料的应用。
本发明的制备方法及所得到的产物具有如下优点及有益效果：
(1)本发明的方法能在胶原薄膜上构建3D微图案，能调控细胞的行为。且具有3D微图案的胶原薄膜的溶胀性能、亲水性、透光性能等能满足角膜修复的需求。
(2)本发明方法相较于传统的微加工的方法而言具有工艺简单，成本较低的优势。
附图说明
图1为对比例及实施例1～3制备的胶原薄膜的表面形貌图；(a)对比例，(b)实施例1，(c)实施例2，(d)实施例3。
图2为对比例及实施例1～3制备的胶原薄膜的饱和含水率测试结果图。
图3为对比例及实施例1～3制备的胶原薄膜在可见光范围内的透光率曲线图。
图4为对比例及实施例1～3制备的胶原薄膜的降解速率曲线图(a)及胶原降解后溶液的pH结果图(b)。
图5为对比例及实施例1～3制备的胶原薄膜上的角膜上皮细胞和基质细胞的定向排列情况(a)、角膜上皮细胞的定向排列程度(b)及角膜基质细胞的定向排列程度(c)图。
图6为对比例及实施例1～3制备的胶原薄膜上的角膜上皮细胞划痕实验结果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
对比例
(1)在平滑硅片上浇注PDMS预聚物，交联固化后得到无图案的PMDS基底。
(2)在4℃下，称取2.63g胶原浸泡在400ml稀盐酸中，稀盐酸浓度为0.01mol/L，浸泡48h。然后利用磁力搅拌器对溶液进行搅拌，搅拌时长约为48h，搅拌器转速在200～400rpm，搅拌过程中分两次加水至溶液体积为1000ml。将0.43gEDC和0.43gNHS分别溶于30ml去离子水中，然后将所得的EDC溶液和NHS溶液先后加入所得的胶原溶液中，继续搅拌交联反应3天。
(3)将步骤(2)中所得胶原溶液置于室温中搅拌24小时除去气泡，然后浇注在步骤(1)所得的PDMS基底上，置于通风处，待溶剂缓慢挥发形成薄膜后，将无图案的胶原薄膜从PDMS基底上剥离。
(4)将步骤(3)所得的胶原薄膜浸泡在PBS中，经灭菌处理后，得到无图案的胶原薄膜，命名为Smooth。
实施例1
(1)采用CAD软件绘制3D微沟槽图案的俯视图，沟槽间距为50μm，沟槽宽度为25μm，制成掩膜版，用掩膜版通过光刻技术在硅片上制备3D微沟槽图案，然后在硅片上浇注PDMS预聚物，交联固化后得到带有3D微沟槽图案的PMDS基底。
(2)在4℃下，称取2.63g胶原浸泡在400ml稀盐酸中，稀盐酸浓度为0.01mol/L，浸泡48h。然后利用磁力搅拌器对溶液进行搅拌，搅拌时长约为48h，搅拌器转速在200～400rpm，搅拌过程中分两次加水至溶液体积为1000ml。将0.43gEDC和0.43gNHS分别溶于30ml去离子水中，然后将所得的EDC溶液和NHS溶液先后加入所得的胶原溶液中，继续搅拌交联反应3天。
(3)将步骤(2)中所得胶原溶液置于室温中搅拌24小时除去气泡，然后浇注在步骤(1)所得的PDMS基底上，置于通风处，待溶剂缓慢挥发形成薄膜后，将具有3D图案的胶原薄膜从PDMS基底上剥离。
(4)将步骤(3)所得的胶原薄膜浸泡在PBS中，经灭菌处理后，得到具有微图案的胶原薄膜，命名为W25D50。
实施例2
(1)采用CAD软件绘制3D微沟槽图案的俯视图，沟槽间距为50μm，沟槽宽度为50μm，制成掩膜版，用掩膜版通过光刻技术在硅片上制备3D微沟槽图案，然后在硅片上浇注PDMS预聚物，交联固化后得到带有3D微沟槽图案的PMDS基底。
(2)在4℃下，称取2.53g胶原浸泡在400ml稀盐酸中，稀盐酸浓度为0.01mol/L，浸泡48h。然后利用磁力搅拌器对溶液进行搅拌，搅拌时长约为48h，搅拌器转速在200～400rpm，搅拌过程中分两次加水至溶液体积为1000ml。将0.43g EDC和0.43g NHS分别溶于30ml去离子水中，然后将所得的EDC溶液和NHS溶液先后加入所得的胶原溶液中，继续搅拌交联反应3天。
(3)将步骤(2)中所得胶原溶液置于室温中搅拌24小时除去气泡，然后浇注在步骤(1)所得的PDMS基底上，置于通风处，待溶剂缓慢挥发形成薄膜后，将具有3D图案的胶原薄膜从PDMS基底上剥离。
(4)将步骤(3)所得的胶原薄膜浸泡在PBS中，经灭菌处理后，得到具有微图案的胶原薄膜，命名为W50D50。
实施例3
(1)采用CAD软件绘制3D微沟槽图案的俯视图，沟槽间距为50μm，沟槽宽度为100μm，制成掩膜版，用掩膜版通过光刻技术在硅片上制备3D微沟槽图案，然后在硅片上浇注PDMS预聚物，交联固化后得到带有3D微沟槽图案的PMDS基底。
(2)在4℃下，称取2.53g胶原浸泡在400ml稀盐酸中，稀盐酸浓度为0.01mol/L，浸泡48h。然后利用磁力搅拌器对溶液进行搅拌，搅拌时长约为48h，搅拌器转速在200～400rpm，搅拌过程中分两次加水至溶液体积为1000ml。将0.43g EDC和0.43g NHS分别溶于30ml去离子水中，然后将所得的EDC溶液和NHS溶液先后加入步骤(2)所得的胶原溶液中，继续搅拌交联反应3天。
(3)将步骤(2)中所得胶原溶液置于室温中搅拌24小时除去气泡，然后浇注在步骤(1)所得的PDMS基底上，置于通风处，待溶剂缓慢挥发形成薄膜后，将具有3D图案的胶原薄膜从PDMS基底上剥离。
(4)将步骤(3)所得的胶原薄膜浸泡在PBS中，经灭菌处理后，得到具有微图案的胶原薄膜，命名为W100D50。
以上对比例及实施例1～3制备的胶原薄膜的表面形貌图如图1所示。由图1可见，实施例1～3的胶原薄膜具有规则微米级沟槽图案。
以上对比例及实施例1～3制备的胶原薄膜的饱和含水率测试结果图如图2所示。由图2可见，有微图案的胶原薄膜与无图案的胶原薄膜饱和含水率无明显差别，植入人眼后能满足需要。
以上对比例及实施例1～3制备的胶原薄膜在可见光范围内的透光率曲线图如图3所示。由图3可见，与无图案的胶原膜相比，有微图案的胶原膜的透光率稍有下降。但与人眼在可见光范围内的透光率相近，能够满足用作角膜组织工程材料的要求。
以上对比例及实施例1～3制备的胶原薄膜的降解速率曲线图(a)及胶原降解后溶液的pH结果图(b)如图4所示。有微图案的胶原薄膜与无图案的胶原薄膜饱和含水率无明显差别，图案化对胶原膜的体外降解性能没有显著影响，且胶原膜降解之后不会影响周围环境的酸碱性。
以上对比例及实施例1～3制备的胶原薄膜上的角膜上皮细胞和基质细胞的定向排列情况(a)、角膜上皮细胞的定向排列程度(b)及角膜基质细胞的定向排列程度(c)如图5所示。由图5可见，角膜上皮细胞和基质细胞都在图案化胶原膜表面都呈现出了明显的群体定向排列，细胞的取向度由无图案胶原膜上的20％增长到60％左右，有效地模仿了体内细胞的规整排列的结构。
以上对比例及实施例1～3制备的胶原薄膜上的角膜上皮细胞划痕实验结果如图6所示。与无图案胶原膜相比，在图案化胶原膜上的伤痕愈合得更快，两天后就已基本愈合完成。因此，有微图案的胶原可用于角膜组织工程，促进角膜上皮细胞的修复。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种具有3D微图案的胶原薄膜的制备方法，其特征在于包括如下制备步骤：
(1)采用具有3D微图案的掩膜版通过光刻技术在硅片上形成3D微图案，然后在硅片上浇注PDMS预聚物，交联固化后得到带有3D微图案的PMDS基底；
(2)将胶原溶解于酸性溶液中，加水搅拌均匀，得到胶原溶液，然后加入交联剂交联反应；
(3)将步骤(2)的交联反应产物经除泡后浇注在步骤(1)的PDMS基底上，风干成膜后，将薄膜从PDMS基底上剥离，得到具有3D微图案的胶原薄膜。
2.根据权利要求1所述的一种具有3D微图案的胶原薄膜的制备方法，其特征在于：所述3D微图案为微米级沟槽图案或点阵图案。
3.根据权利要求1所述的一种具有3D微图案的胶原薄膜的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述胶原为干态I型胶原。
4.根据权利要求1所述的一种具有3D微图案的胶原薄膜的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述酸性溶液为浓度为0.01mol/L的盐酸溶液；酸性溶液与胶原的体积质量比为0.15L/g。
5.根据权利要求1所述的一种具有3D微图案的胶原薄膜的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述胶原溶液的浓度为2.0～6.5g/L。
6.根据权利要求1所述的一种具有3D微图案的胶原薄膜的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述交联剂是指1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺水溶液和N-羟基琥珀酰亚胺水溶液。
7.根据权利要求1所述的一种具有3D微图案的胶原薄膜的制备方法，其特征在于：步骤(2)在4℃的环境下进行。
8.根据权利要求1所述的一种具有3D微图案的胶原薄膜的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所得具有3D微图案的胶原薄膜进一步浸泡在PBS中，然后经灭菌处理。
9.一种具有3D微图案的胶原薄膜，其特征在于：通过权利要求1～8任一项所述的方法制备得到。
10.权利要求9所述的一种具有3D微图案的胶原薄膜作为角膜修复材料的应用。
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