JP2021045537A - ４ｄ−キトサンの温度感受性ゲルの調製方法 - Google Patents

Abstract

【課題】４Ｄ−キトサン温度感受性ゲルの調製方法の提供。【解決手段】４Ｄバイオプリントを使用して、設定したプリントパラメーターに従ってキトサン溶液を孔径が５０−１００μｍであるキトサン熱温度感受性ゲルにプリントし、凍結乾燥して凍結乾燥キトサンを得るステップ（１）と、超純水とβ−グリセロリン酸ナトリウムとを加えて、β−グリセロリン酸ナトリウム水溶液を得るステップ（２）と、ステップ（２）で得られたβ−グリセロリン酸水溶液をカルボキシメチルキトサン水溶液に一滴ずつ追加し、均一に混合して、混合溶液を得るステップ（３）と、ステップ（１）で得られた凍結乾燥キトサンとステップ（３）で得られた混合溶液とを１〜２分間架橋して、均一な孔径の４Ｄ−キトサン温度感受性ゲルを得るステップ４とを含むことを特徴とする４Ｄ−キトサン温度感受性ゲルの調製方法。【選択図】図１

Description

本発明は、医療材料の製造及び調製の技術分野に属し、４Ｄ−キトサンの温度感受性ゲルの調製方法に関して、具体的にアルカリ熱傷を修復するためのキトサンの温度感受性ゲルを４Ｄプリンティング技術に基づいて調製することに関する。

角膜の損傷には多くの種類があり、そのなかでも、化学的損傷を臨床的に治療するのはより困難である。角膜アルカリ熱傷は、角膜上皮の壊死と脱落、角膜及び結膜の融解と穿孔及びシンブルファロン（ｓｙｍｂｌｅｐｈａｒｏｎ）などを引き起こす可能性があり、同時に、多数の新しい毛細血管の生成に伴い、重症例では失明などの角膜障害の形成を引き起こす可能性がある。現在、臨床治療に主に角膜移植または羊膜移植が使用されているが、前者はドナー不足と免疫拒絶という二つの大きな問題に直面していて、後者は基底膜として働くため、アルカリ熱傷などの重度の角膜損傷後に、損傷組織に蓄積されたコラゲナーゼなので分解する傾向にあり、自己分解することとなるので、患者は、複数回の移植を受けるとしても効果は良くない。したがって、角膜上皮欠損を修復し、角膜の血管新生と瘢痕の形成を減らす方法は、緊急に解決すべき臨床問題である。

ティッシュエンジニアリング法によって調製されたバイオゲルでリンバス（ｌｉｍｂｕｓ）幹細胞を移植することは、角膜損傷の修復に一定の効果があるが、電子顕微鏡でスキャンされたゲルは、表面が不規則なメッシュ構造を呈して、孔径がさまざまであるので、輪部幹細胞のカプセル化効率に直接影響する。例えば、特許文献１には、キトサンを量り取り、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸に、完全に溶けるまで十分に攪拌して、濃度が１０〜２０ｍｇ／ｍＬのキトサン溶液を得て、グリセロリン酸ナトリウムを脱イオン水に溶解して、濃度が０．２−１．０ｇ／ｍＬのグリセロリン酸ナトリウム溶液を得て、グリセロリン酸ナトリウム溶液をキトサン溶液に滴下して混合し、得られた混合溶液のｐＨを７．１−７．４に調整し、その後、混合液を４℃で均一に攪拌して、キトサンの温度感受性ゲルを得るステップ１と、ＨＰ−β−ＣＤを量り取って乳鉢に入れて、水とＨＰ−β−ＣＤの質量比２−５：１で水に溶かし、ＨＰ−β−ＣＤとチルミコシン２：１の比率で、チルミコシンを量り取って乳鉢に入れて、混合して２０℃で３０分間粉砕し、白い粉末を得て、８０メッシュのふるいを通過して、チルミコシンの包接化合物を得るステップ２と、ステップ（１）で得られたキトサンの温度感受性ゲルを三角フラスコに加え、ステップ（２）で得られたチルミコシン包接化合物を量り取って三角フラスコに入れて、マグネチックスターラーで室温で均一に攪拌し、そうするとチルミコシン包接化合物の温度感受性ゲルを得るステップ（３）とを含むチルミコシン包接化合物のキトサン温度感受性ゲルの調製方法が開示され、上記チルミコシン包接化合物熱温度感受性ゲル中のチルミコシン薬の質量分率は９．９％−１０％であり、チルミコシン包接化合物の温度感受性ゲルは４℃で保存される。

２０１３年２月２５日に、米国カリフォルニア州で開催されたＴＥＤ ２０１３カンファレンスで、マサチューセッツ工科大学のＳｋｙｌａｒ Ｔｉｂｂｉｔｚは、完璧な実験を通じて参加者に４Ｄプリント技術を見せて披露し、且つ実験でそれを詳述した。いわゆる４Ｄプリントは、正確に自動的に変形することができる素材であり、特定の条件（温度、湿度など）のみさえあれば、複雑な電気機械設備に全然接続することなく、製品設計に応じて対応する形状に自動的に折りたたむことができる。４Ｄプリントは、３Ｄプリンターで変形可能な素材をプリントする技術である。４Ｄプリント技術は既にゲル調製技術の分野に導入されていて、特許文献２には、アクリルアミドとアクリル酸の混合溶液に温度開始剤とプロモーター開始剤を加えた後、インキュベーターに入れて保温し、ポリ（アクリル酸−ｃｏ−アクリルアミド）共重合体溶液を得るステップ（１）と、アクリル酸とＮ−イソプロピルアクリルアミドの混合溶液に温度開始剤とプロモーター開始剤を加えた後、インキュベーターに入れて保温し、ポリ（アクリル酸−ｃｏ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）共重合体の溶液を得るステップ（２）と、ポリ（アクリル酸−ｃｏ−アクリルアミド）共重合体の溶液とポリ（アクリル酸−ｃｏ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）共重合体の溶液を混合して、２種類の比率のポリ（アクリル酸−ｃｏ−アクリルアミド）とポリ（アクリル酸−ｃｏ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）の混合溶液を得て、そのうち、ポリ（アクリル酸−ｃｏ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）成分の含有量が高い方は、変形を促進する塩感受性材料とし、もう一つの方はポリ（アクリル酸−ｃｏ−アクリルアミド）溶液と塩感受性混合溶液のバインダーとするステップ（３）と、３Ｄプリントプラットフォームを使用して、ポリ（アクリル酸−ｃｏ−アクリルアミド）及びポリ（アクリル酸−ｃｏ−アクリルアミド）とポリ（アクリル酸−ｃｏ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）の混合溶液を事前設定されたプリントパラメータで、ガラス基板に押し出し、特定の形状と構造を形成させるステップ（４）と、プリントして得られた形状と構造をインキュベーターの第二鉄イオン溶液に入れて、架橋させ、次に、鉄イオン溶液に浸した後のゲルを再びインキュベーターでの脱イオン水溶液に入れて、さらに架橋させて平衡化したゲル構造を得るステップ（５）と、平衡化したゲル構造を濃縮塩水に入れて変形させ、事前設計された形状構造を得るステップ（６）とを含むプログラムと変形が可能な強力なヒドロゲル４Ｄプリント方法が開示され、特許文献３には、
ａ）高密度値の４Ｄインテリジェント温度感受性ハイドロゲルの元の材料の構成：モノマーとしてＮ−イソプロピルアクリルアミド、架橋剤としてＸＬＧ合成ケイ酸リチウムマグネシウム、過硫酸カリウム、Ｎ、Ｎ、Ｎ’を開始剤とし、Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンを触媒とし、ナノウッドパルプセルロースを補強相とし、モノマー、開始剤、触媒のモル比は１００：０．３７０：０．６３８、ナノウッドパルプセルロースの濃度は３〜５ｍｇ／ｍＬ、架橋剤の質量分率は３〜３．５ｗｔ．％であり、
ｂ）材料を配合する：ａに記載されている成分比に従って元の材料の重量を量りとって、ナノウッドパルプセルロースを氷水浴で３０〜４０分間攪拌してから、１０〜１５分間超音波処理し、次にＸＬＧタイプの合成リチウムマグネシウムシリケートを追加して、６０〜６５分間攪拌し、次にＮ−イソプロピルアクリルアミドを加えて１２０〜１３０分間攪拌し、最後に過硫酸カリウムとＮ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンを順番に加えて５〜６分間攪拌し、
ｃ）前記ｂで均一に混合された材料を組み合わせた金型に注入し、平らに削って金型を密封し、２５〜２７℃の環境に２４〜２６時間静置して成形する、高密度の４Ｄインテリジェント温度感受性ハイドロゲル材料を調製するステップ１と、ａ）低密度値の４Ｄインテリジェント温度感受性ハイドロゲルの元の材料の構成：Ｎ−イソプロピルアクリルアミドをモノマーとして、ＸＬＧ合成ケイ酸リチウムマグネシウムを架橋剤として、過硫酸カリウムを開始剤として、Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンを触媒として、ナノウッドパルプセルロースを補強相とし、モノマー、開始剤、触媒のモル比は１００：０．３７０：０．６３８、ナノウッドパルプセルロースの濃度は０〜２ｍｇ／ｍＬ、架橋剤の質量分率は３〜３．５ｗｔ．％であり、
ｂ）成分を配合する：ａに記載されている成分比に従って元の材料の重量を量り取って、ナノウッドパルプセルロースを氷水浴で３０〜４０分間攪拌してから、１０〜１５分間超音波処理し、次にＸＬＧタイプの合成リチウムマグネシウムシリケートを追加して、６０〜６５分間攪拌し、次にＮ−イソプロピルアクリルアミドを加えて１２０〜１３０分間攪拌し、最後に過硫酸カリウムとＮ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンを順番に加えて５〜６分間攪拌し、
ｃ）前記ｂで均一に混合された低密度値４Ｄインテリジェントの温度感受性ハイドロゲル材料を組み合わせた金型に注入して、高密度値４Ｄインテリジェントの温度感受性ハイドロゲルの上に置き、平らに削って金型を密封し、２５〜２７℃の環境に２４〜２６時間静置して成形する、温度駆動のプログラム可能な４Ｄプリントのインテリジェント材料を合成するステップ２とを含む温度駆動のプログラム可能な４Ｄプリントのインテリジェント材料を調製する方法が開示され、
特許文献４には、アミノ基で置換されたペンダント基を持つシクロデキストリンを弱アルカリ溶液に溶解し、アルカリ性無機物で溶液のｐＨを８−１０に調整し、次に酸無水物を加え、４０〜８０℃で４〜８時間攪拌し、次に、溶液中の水の９０−９５％を蒸発させ、次に有機溶媒Ｉを加えて洗浄し、遠心分離し、沈殿物を収集し、真空で乾燥してＣＤ−アクリルアミドが得られる、ＣＤ−アクリルアミドを合成するステップ１と、上記ステップ１におけるアミノ基で置換されたペンダント基を持つシクロデキストリンは６−アミノ−ａ−ＣＤ、３−アミノ−ａ−ＣＤまたは６−アミノ−β−ＣＤである。アゾベンゼン系物質とアミン系物質を有機溶剤ＩＩに溶かして、温度を２０−５０℃に上げ、酸無水物を追加して混合溶液を得て、次に、混合溶液を６０〜６５℃で３〜５時間撹拌し、濾過して沈殿物を除去し、濾液を減圧下で濃縮し、次に有機溶媒ＩＩＩで再結晶してアゾアクリルアミドを得るアゾアクリルアミドを合成するステップ２と、上記アゾベンゼン系物質はｐ−アミノアゾベンゼンまたはポリイミドアゾベンゼンであり、上記アミン系物質はトリヒドロキシエチルアミンまたはトリエチルアミンである。フリーラジカル重合性モノマーとステップ１で得られたＣＤ−アクリルアミドとステップ２で得られたアゾアクリルアミドおよび鎖の剛性を高めるモノマーを有機溶媒ＩＶへ追加し、均一に攪拌された後、６０〜８０°Ｃに加熱して開始剤を追加し、６０〜８０°Ｃで１５〜２０時間攪拌して反応させた後に、攪拌を停止してから、６０〜６５°Ｃの温度で１〜５時間維持して、４Ｄプリントの自己修復性ヒドロゲル材料が得られる、フリーラジカルが重合してゲルを合成するステップ３と、上記フリーラジカル重合性モノマーは、アクリル酸、アクリルアミド、またはアクリル酸メチルであり、鎖の剛性を高めるモノマーは、Ｎ−ビニルカルバゾールまたはスチレンであることを含む４Ｄプリントの自己修復性ヒドロゲル材料の調製方法が開示され、したがって、輪部幹細胞カプセル化の効率を改善すための、４Ｄ−キトサン熱温度感受性ゲル調製方法の開発には、大きな社会的意義と実用的価値がある。

中国特許公開第２０１６１０８３７５２８．３号公報 中国特許公開第２０１８１０２０８７１５．４号公報 中国特許公開第２０１８１０２８０５７９．Ｘ号公報 中国特許公開第２０１９１０１４１２５７．１号公報

本発明は、従来の技術における欠点を克服し、輪部幹細胞カプセル化の効率を効果的に改善し、アルカリ熱傷した角膜上皮の再構築を促進できる４Ｄ−キトサン温度感受性ゲルを調製するための４Ｄ−キトサン温度感受性ゲル調製法を開発及び設計することを目的とする。

上記目的を達成するために、本発明に係わる４Ｄ−キトサン温度感受性ゲルの調製方法は、室温で、キトサンを量り取って酢酸の水溶液に溶かし、キトサンが完全に溶解するまで攪拌し、キトサン溶液を得て、レーザースキャンテクノロジーにより、損傷した角膜のパーソナライズされた３Ｄデータを得て、コンピューター支援設計（ＣＡＤ）によって時間、孔径、形状などの寸法に対する正確な制御を完成し、４Ｄバイオプリント技術により、設定されたプリントパラメーターに従って孔径が均一で、形状が損傷した部位とフィットする４Ｄ−キトサン（孔径が５０−１００μｍである）を調製し、溶媒を除去した後、凍結乾燥して凍結乾燥したキトサンを得るステップ１と、
６０〜７０℃のサーモスタット水浴に超純水とβ−グリセロリン酸ナトリウムを加え、β−グリセロリン酸ナトリウムを溶解した後、自然に室温まで冷却し、β−グリセロリン酸ナトリウム水溶液を得るステップ２と、
カルボキシメチルキトサン水溶液を、超純水を用いて室温で調製し、ステップ（２）で得られたβ−グリセロリン酸水溶液をカルボキシメチルキトサン水溶液に一滴ずつ追加し、均一に混合して、混合溶液を得るステップ３と、
ステップ（１）で得られた凍結乾燥キトサンとステップ（３）で得られた混合溶液を１〜２分間架橋して、均一な孔径の４Ｄキトサン温度感受性ゲルを得るステップ４と、
を含む。

本発明のステップ（１）に係る酢酸水溶液のモル濃度は０．２モル／Ｌであり、キトサン溶液の質量パーセント濃度は２．２〜６．７％であり、ステップ（２）で得られたβ−グリセロリン酸水溶液の質量パーセント濃度は６〜８％であり、ステップ（３）で調製されたカルボキシメチルキトサン水溶液の質量パーセント濃度は２．２〜６．７％であり、ステップ（４）で調製された４Ｄ−キトサン温度感受性ゲル中のキトサン、カルボキシメチルキトサン及びβ−グリセロホスフェートの重量パーセントは、それぞれ１０〜３０％、１０〜３０％、及び６０〜８０％である。

本発明によって調製した４Ｄ−キトサン温度感受性ゲルは、４〜１５℃の無菌環境で６〜１２ヶ月間保存することができる。

本発明により調製された４Ｄ−キトサン温度感受性ゲルは、輪部幹細胞をカプセル化した後、アルカリ火傷の角膜表面に塗布すると、輪部幹細胞を放出して、創傷表面を修復及び治療する。

本発明は、従来技術と比較して、４Ｄバイオプリンティング技術を温度感受性ゲルの調製に適用して、輪部幹細胞の移植担体として調製された同じ孔径を有するキトサン温度感受性ゲルは、輪部幹細胞のカプセル化効率を効果的に改善し、アルカリ熱傷をした角膜上皮の修復を促すことができ、その原理は科学的で信頼するに値して、従来のキトサン温度感受性ゲルに存在した、孔径が不均一であるとの問題を解決して輪部幹細胞のカプセル化効率と能力を向上させて、角膜損傷修復の分野で重要な理論的意義と幅広い応用の展望を持ち、臨床医学において角膜アルカリ熱傷患者の修復を支援する。

本発明の実施例１のステップ（１）に係るキトサンの構造を示す概略図である。 本発明の実施例１のステップ（４）に係る４Ｄーキトサン温度感受性ゲルの構造を示す概略図である。 本発明の実施例２に係る、４０倍顕微鏡下での、４Ｄ−キトサン温度感受性ゲルが輪部幹細胞をカプセル化した、状態を示す模式図である。 本発明の実施例２に係る、１０倍顕微鏡下での、４Ｄ−キトサン温度感受性ゲルが輪部幹細胞をカプセル化した、状態を示す模式図である。 本発明実施例３に係る従来の温度感受性ゲルでカプセル化した輪部幹細胞と４Ｄ−キトサン温度感受性ゲルでカプセル化した輪部幹細胞との、ウサギ角膜アルカリ熱傷に対する治療の効果を示す模式図である。

以下、本発明を実施例及び図面を用いてさらに説明する。

実施例１：
本実施例に係る４Ｄーキトサン温度感受性ゲルの調製方法は、
室温で、キトサンを量り取って、モル濃度０．２Ｍｏｌ／Ｌの酢酸の水溶液に溶かし、キトサンが完全に溶解するまで１２時間攪拌して、質量パーセント濃度が４．４％のキトサン溶液を得て、ＵＮ−４ＤＢＩ−Ｃ０１ ４Ｄバイオプリンターを使用して、穴間隔は６００μｍ、層厚は１００μｍ、プラットフォーム温度は−２５℃、プリント速度は１５ｍｍ／ｓ、ノズル径は０．３ｍｍ、吐出量は０．１ｇ／ｍｉｎであるプリントパラメータに従って、キトサン溶液を孔径５０−１００μｍの円形キトサンにプリントし、溶媒を除去した後凍結乾燥して、図１に示すように、凍結乾燥したキトサンを得るステップ１と、
６５℃のサーモスタット水浴に超純水とβ−グリセロリン酸ナトリウムを加え、β−グリセロリン酸ナトリウムを溶解した後、自然に室温まで冷却して、質量パーセント濃度が７％のβ−グリセロリン酸ナトリウム水溶液を得るステップ２と、
質量パーセント濃度が４．４％のカルボキシメチルキトサン水溶液を超純水を用いて室温で調製し、ステップ（２）で得られたβ−グリセロリン酸水溶液をカルボキシメチルキトサン水溶液に一滴ずつ追加し、均一に混合して、混合溶液を得るステップ３と、
ステップ（１）で得られた凍結乾燥キトサンとステップ（３）で得られた混合溶液を１〜２分間架橋して、図２に示す均一な孔径の４Ｄキトサン温度感受性ゲルを得るが、４Ｄキトサン温度感受性ゲルにおけるキトサンとカルボキシメチルキトサンとβ−グリセロホスフェートの重量パーセントは、それぞれ１８％、１８％、６４％であるステップ４と、
を含む。

実施例２
本実施例は、実施例１で調製された４Ｄーキトサン温度感受性ゲルで輪部幹細胞をカプセル化するプロセスに関し、
４Ｄーキトサン温度感受性ゲルを細胞培養皿に入れて、完全に浸透させ、カプセル化をしようとする４Ｄ−キトサン温度感受性ゲルを得るステップ１と、
輪部幹細胞を分離して培養して、ステップ（１）で得られたカプセル化をしようとする４Ｄ−キトサン温度感受性ゲルに追加して、培養を継続するステップ２と、
２４時間培養した後、４Ｄ−キトサン温度感受性ゲルによってカプセル化された輪部幹細胞の状態を顕微鏡４０倍と１０倍でそれぞれ観察し、その結果は、図３と図４に示すようであるステップ３と、
を含む。

実施例３：
本実施例は、ウサギ角膜アルカリ熱傷に対して、それぞれ従来の温度感受性ゲルでカプセル化した輪部幹細胞による治療の効果と、４Ｄ−キトサン温度感受性ゲルでカプセル化した輪部幹細胞による治療の効果を比較する試験に関し、
アルカリ熱傷の動物モデルを得るために、生きているウサギの角膜をアルカリ熱傷付けるステップ１と、
ステップ（１）で取得したアルカリ熱傷動物モデルを、従来の熱温度感受性ゲルでカプセル化された輪部幹細胞を使用して治療し、従来の温度感受性ゲル治療モデルを得るステップ２と、
ステップ（１）で得られたアルカリ熱傷動物モデルを、実施例１で調製された４Ｄーキトサン温度感受性ゲルでカプセル化した輪部幹細胞を使用して治療し、４Ｄーキトサン熱温度感受性ゲル治療モデルを得るステップ３と、
２８日間の治療後、両者の治療効果を観察したところ、図５に示すように、アルカリ熱傷手術後、各組の角膜損傷領域（図の白い領域）は時間とともに徐々に減少し、４Ｄーキトサン温度感受性ゲル治療組の修復効果は、従来の温度感受性ゲル治療組及び非修復組の修復効果よりもはるかに優れている。

Claims (7)

1. 室温で、キトサンを量り取って酢酸の水溶液に溶かし、キトサンが完全に溶解するまで攪拌してキトサン溶液を得て、４Ｄバイオプリントを使用して、設定したプリントパラメーターに従ってキトサン溶液を孔径が５０−１００μｍであるキトサン熱温度感受性ゲルにプリントし、キトサン温度感受性ゲルが設定した形状と構造を形成するようにして、溶媒を除去した後、凍結乾燥して凍結乾燥キトサンを得るステップ（１）と、
   ６０〜７０℃のサーモスタット水浴に超純水とβ−グリセロリン酸ナトリウムとを加えて、β−グリセロリン酸ナトリウムを溶解した後、室温まで自然に冷却させ、β−グリセロリン酸ナトリウム水溶液を得るステップ（２）と
   カルボキシメチルキトサン水溶液を超純水を用いて室温で調製し、ステップ（２）で得られたβ−グリセロリン酸水溶液をカルボキシメチルキトサン水溶液に一滴ずつ追加し、均一に混合して、混合溶液を得るステップ（３）と、
   ステップ（１）で得られた凍結乾燥キトサンとステップ（３）で得られた混合溶液とを１〜２分間架橋して、均一な孔径の４Ｄーキトサン温度感受性ゲルを得るステップ４と
   を含むことを特徴とする４Ｄーキトサン温度感受性ゲルの調製方法。
2. ステップ（１）に係る酢酸水溶液のモル濃度が０．２モル／Ｌであり、キトサン溶液の質量パーセント濃度が２．２〜６．７％であることを特徴とする請求項１に記載の４Ｄーキトサン温度感受性ゲルの調製方法。
3. ステップ（２）で得られたβ−グリセロリン酸水溶液の質量濃度が６〜８％であることを特徴とする請求項１に記載の４Ｄーキトサン温度感受性ゲルの調製方法。
4. ステップ（３）で調製されたカルボキシメチルキトサン水溶液の質量パーセント濃度が２．２〜６．７％であることを特徴とする請求項１に記載の４Ｄーキトサン温度感受性ゲルの調製方法。
5. ステップ（４）で調製された４Ｄ−キトサン温度感受性ゲル中のキトサン、カルボキシメチルキトサン及びβ−グリセロホスフェートの重量パーセントが、それぞれ１０〜３０％、１０〜３０％、及び６０〜８０％であることを特徴とする請求項１に記載の４Ｄーキトサン温度感受性ゲルの調製方法。
6. ４Ｄーキトサン温度感受性ゲルが４〜１５℃の無菌環境で６〜１２ヶ月保存できることを特徴とする請求項１ないし５のいずれか一項に記載の４Ｄーキトサン温度感受性ゲルの調製方法。
7. ４Ｄーキトサン温度感受性ゲルは輪部幹細胞をカプセル化した後、アルカリ熱傷した角膜の表面に塗布することで、輪部幹細胞を放出して創傷を修復及び治療できることを特徴とする請求項１ないし５のいずれか一項に記載の４Ｄーキトサン温度感受性ゲルの調製方法。

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