JP2017500047A - 筋芽細胞の筋管への分化を規格化するための装置および方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、筋芽細胞の筋管への分化を規格化するための装置であって、基材（１）と前記基材上で筋芽細胞を培養するための少なくとも１つの細胞接着パターン（２）とを含んでなり、前記パターン（２）は、中央領域（２Ｃ）と、前記中央領域から前記パターンの縦軸に沿って両方向に延伸する２つの側部領域（２Ｌ）とを含んでなる細長い表面を有し、ここで、中央領域（２Ｃ）と各側部領域（２Ｌ）の間には輪郭の不連続性があり、前記中央領域（２Ｃ）の最大幅（ＷＣ）と前記側部領域（２Ｌ）の最大幅（ＷＬ）の間の比は２以上であり、前記パターン（２）の長さ（Ｌ）と最大幅（ＷＣ）の間の比は４以下である装置に関する。本発明はまた、筋芽細胞の筋管への分化を規格化するための方法であって、（ｉ）上記の装置を準備すること、（ｉｉ）前記装置の少なくとも１つの細胞接着パターン上に筋芽細胞を付着させること、（ｉｉｉ）筋管への細胞分化を促進し、かつ、細胞接着パターン上での筋管の伸長を拘束するために、前記筋芽細胞を所定のインキュベーション時間の間、分化培地中で培養することを含んでなる方法である。本発明の別の態様は、筋毒性および創薬に関する細胞系アッセイにおける化合物スクリーニングのための方法である。
Description
本発明は、筋芽細胞の筋管への分化を規格化するための装置および方法、ならびにそのような装置を用いた化合物スクリーニングのための方法に関する。
筋形成は、胚発生および組織修復の際に起こるｉｎ ｖｉｖｏプロセスである。筋衛星細胞が増殖し始め、筋芽細胞を形成する。筋芽細胞は単核細胞種であり、これは他の筋芽細胞との融合（これは「分化」とも呼ばれるプロセスの一部である）により筋管を生じ、成熟し、その後、最終的に筋繊維へと発達する。筋管の成熟は、筋節内のミオシン重鎖分子の横紋組織形成およびその構造の中央に核があることによって容易に特徴付けることができる[Abmayr 2012]。筋管を細胞培養装置で成長させる場合、その成長方法は、生理学的筋管にできる限り近い筋管の成長に作用するように意図される。
一般にランダム配向の筋管を提供する均一な、パターンの無い細胞接着表面を備えた基材に対して、パターン入りの基材は、筋管の特定の配向を促すことが示されている。
前記パターンは一般に線の形態であるが、円、四角およびＹ型パターンなどの有限の幾何学形状も検討されている[Junkin 2011]。
これらの実験は、筋管の形態学的特性が、それらが成長されるパターンの形状に強く影響を受けることを示す。
他のパターンは、エッチング技術によって基材の表面に形成された線状の溝からなる[Yamamoto 2008]。
これらの線は、「無限」の長さと考えられ、これはそれらの長さが筋管の長さよりもはるかに長いことを意味する。
これらの線状パターンのいくつかの変形形態が、筋管配向に関して最も適当な形状を定義するために試験された。
特に、線状要素と線状要素の中央に置かれた弧状要素の組合せからなる、いわゆる「ハイブリッド」パターンは、融合指数、すなわち、核の総数に対する２以上の核を有する筋細胞中の核の数の比と、成熟指数、すなわち、５つ以上の核を有する筋管の数の両方を増大させ、加えて、これらのパターンは筋管の良好なアラインメントも提供することが証明されている[Bajaj 2011]。より厳密には、この点で最良の結果をもたらすパターンは、幅１００μｍ、長さ２０００μｍの線状要素からなり、一方、弧状要素の弧度は３０°である。いわゆる「ハイブリッド」パターンを図１に示す。
軟質基材（１０〜１５ｋＰａに近いヤング率）上の筋芽細胞のパターン化は、成熟の増大を伴って、配向された筋管をもたらすことが示されている[Engler 2004]。
しかしながら、筋管の配向は文献で鋭意研究されているものの、完全に成熟した構造の個別化およびそれらの形態の規格化が困難なために、それらの形態学的パラメーターの定量化が不十分で、変動が大きい。この高い変動性のために、ロバストな細胞系アッセイの開発ができない。また、達成される筋管成熟の程度は、横紋および核配置に関してｉｎ ｖｉｖｏ様からまだ遠い。
本発明の目的は、細胞系アッセイの実施の観点から、幅および長さなどの筋管の形態学的パラメーターの規格化を可能とする装置を提供することである。
第１の態様によれば、本発明は、筋芽細胞の、再現性の高い形態学的パラメーターを有する筋管への分化を規格化するための装置を提供する。
前記装置は、基材と、前記基材上で筋芽細胞を培養するための少なくとも１つの細胞接着パターンを含んでなり、
前記パターンは、中央領域と、前記中央領域から前記パターンの縦軸に沿って両方向に延伸する２つの側部領域とを含んでなる細長い表面を有し、ここで、中央領域と各側部領域の間には輪郭の不連続性があり、前記パターンの長さは１００〜１０００μｍであり、前記パターンの最大幅は５０〜５００μｍであり、
前記中央領域の最大幅と前記側部領域の最大幅の間の比は２以上であり、
前記パターンの長さと最大幅の間の比は４以下である。
前記パターンは、中央領域と、前記中央領域から前記パターンの縦軸に沿って両方向に延伸する２つの側部領域とを含んでなる細長い表面を有し、ここで、中央領域と各側部領域の間には輪郭の不連続性があり、前記パターンの長さは１００〜１０００μｍであり、前記パターンの最大幅は５０〜５００μｍであり、
前記中央領域の最大幅と前記側部領域の最大幅の間の比は２以上であり、
前記パターンの長さと最大幅の間の比は４以下である。
本発明の一つの実施態様によれば、前記パターンは、その縦軸および縦軸に対して垂直な横軸に対して対称である。
一つの実施態様によれば、前記パターンは、３つの楕円表面：
前記パターンの中央領域を画定する第１の楕円表面、および
前記パターンの側部領域を画定する第１の楕円の主軸に一致する主軸を有する第２および第３の楕円表面
の部分的重畳からなり、
第２および第３の楕円表面はそれらの横軸に沿って第１の楕円表面と交差する。
前記パターンの中央領域を画定する第１の楕円表面、および
前記パターンの側部領域を画定する第１の楕円の主軸に一致する主軸を有する第２および第３の楕円表面
の部分的重畳からなり、
第２および第３の楕円表面はそれらの横軸に沿って第１の楕円表面と交差する。
好ましい実施態様によれば、前記パターンの長さと最大幅の間の比は２．５である。
好ましくは、前記パターンの面積は５，０００〜５００，０００μｍ２である。
一つの実施態様によれば、前記基材は硬質基材である。
あるいは、前記基材は軟質基材であり、その基材のヤング率は、好ましくは５〜１５ｋＰａである。
本発明の別の目的は、上記の装置を用いて筋芽細胞の筋管への分化を規格化するための方法であって、
（ｉ）前記装置を準備すること、
（ｉｉ）前記装置の少なくとも１つの細胞接着パターン上に筋芽細胞を付着させること、
（ｉｉｉ）筋管への細胞分化を促進し、かつ、細胞接着パターン上での筋管の伸長を拘束するために、前記筋芽細胞を所定のインキュベーション時間の間、分化培地中で培養すること
を含んでなる方法である。
（ｉ）前記装置を準備すること、
（ｉｉ）前記装置の少なくとも１つの細胞接着パターン上に筋芽細胞を付着させること、
（ｉｉｉ）筋管への細胞分化を促進し、かつ、細胞接着パターン上での筋管の伸長を拘束するために、前記筋芽細胞を所定のインキュベーション時間の間、分化培地中で培養すること
を含んでなる方法である。
筋芽細胞の分化および形成される筋管の成熟は、本発明を使用することにより増大することが見て取れ、筋形成の後期に神経筋接合部(neuromuscular junction)（ＮＭＪ）の確立に至るまで、ｉｎ ｖｉｖｏで見られるものに極めて近いものとなる。
本発明の別の態様は、限定されるものではないが、特に、筋毒性および創薬に関して細胞系アッセイを開発するためのその利益である。筋管形態の規格化は、筋管成熟に関して特徴的な利益と相まって、健常ドナーおよび病態ドナーで採取された筋芽細胞から分化される筋管の生理に対する微妙な化合物の効果の検出に信頼性の高い手段を提供する。
本発明のさらなる特徴および利点は、添付の図面を参照し、以下の詳細な説明から明らかとなる。
図１は、弧度３０°の[Bajaj 2011]による「ハイブリッド」パターンを示す。
図２Ａ〜２Ｄは、本発明の種々の実施態様による細胞接着パターンを示す。
図３は、種々の細胞接着パターンが形成された（領域１〜８）装置（前記装置はパターンの無い領域も含む（領域９））および各領域で形成されたＣ２Ｃ１２筋管の写真を示す。
図４Ａ〜４Ｄは、図３に示された各タイプのパターンに関するＣ２Ｃ１２筋管の融合指数、成熟指数、配向角度および幅／長さ比をそれぞれ示す。
図５Ａおよび５Ｂはそれぞれ、パターンの無い基材および本発明によるパターン（この場合、図３の領域５のパターン）上で成長させたＣ２Ｃ１２筋管の位相差顕微鏡像を示す。
図６は、種々の初代ヒト筋芽細胞密度を用いて、一定の時点での、パターンの無い表面に比べた場合の本発明によるマイクロパターン（この場合、図３の領域５のパターン）での融合指数の増大を示す経時的推移である。
図７Ａは、パターン無し（上）およびマイクロパターン（本発明による、図３の領域５のパターンを使用、下）の表面での初代ヒト筋芽細胞由来の筋管の横紋を示す。筋管（筋節横紋断面）の代表的な成熟度を写真の右上に拡大して示す。
図７Ｂは、前記マイクロパターン表面とパターンの無い表面上での；３日間の分化の後の横紋筋管の定量値である。
図８Ａは、マイクロパターン上で培養した、アグリン処理により「プレッツェル」として知られるｉｎ ｖｉｖｏ様構造を形成する、アセチルコリン受容体のクラスター化を伴う初代ヒト筋管を示す。
図８Ｂは、アグリンおよびＷｎｔシグナル伝達を介したクラスター形成の調節の定量値である。
図９は、軟質基材上に細胞接着パターンが形成される場合の、本発明による装置の断面図である。
図１０Ａおよび１０Ｂはそれぞれ、パターンの無い軟質基材および本発明によるパターン（この場合、図３の領域５のパターン）上のＣ２Ｃ１２筋管の形状を示す。
図１１は、マイクロパターンおよび／または軟質基材を包含するまたは包含しない装置上で形成されたＣ２Ｃ１２筋管の幅の比較を示す。
図１２は、異なる形状を有するパターンが形成された軟質基材を含んでなる装置上でのＣ２Ｃ１２筋管の形成を示す。
図１３Ａ〜１３Ｆはそれぞれ、軟質基材を含んでなる装置上の種々のパターンに関するＣ２Ｃ１２筋管の融合指数、成熟指数、配向角度、幅／長さ比、幅および長さを示す。
図１４Ａは、パターンの無い（ＮＰ）表面およびマイクロパターン表面（本発明による、図３の領域５のパターンを使用）表面での、７２時間の対照条件（ＣＴＲＬ、左）および萎縮性化合物（デキサメタゾン、中央）および肥大性化合物（ＩＧＦ−１、右）処理後の初代ヒト筋芽細胞に由来する筋管形態の代表的な顕微鏡写真を示す。
図１４Ｂは、ＮＰおよび領域５パターン上、対照および処理条件で培養した筋管の最大幅読み取りの、いわゆる高応答細胞総数(high responder count)の定量値である。
本発明によれば、細胞接着パターンは、特定の形状の細長い表面を有する。
より厳密には、パターンは、一方で中央領域、および他方で、前記中央領域からパターンの縦軸に沿って両方向に延伸する２つの側部領域を含んでなる。
「細長い」とは、パターンの最大寸法が前記縦軸に沿って測定でき、かつ、縦軸に対して垂直な横軸に沿ったパターンの最大寸法よりも大きいことを意味する。
従って、縦軸に沿った寸法は「長さ」と呼ばれ、横軸に沿った寸法は「幅」と呼ばれる。
側部領域は一般に、中央領域よりも狭い（横軸に沿う）。
加えて、中央領域と各側部領域の間には輪郭の不連続性がある。言い換えれば、中央領域と側部領域の間の接合部では、中央領域の輪郭に対する接線は、側部領域の輪郭に対する接線と一致しない。
例えば、パターンは、パターンの中央領域において部分的に重畳される少なくとも３つの幾何学的表面の組合せと考えることができる。
この実施態様に限定されるものではないが、パターンは有利には縦軸と横軸の両方に対して対称である。
一つの実施態様によれば、各側部領域は、連続的輪郭を有する。
あるいは、少なくとも１つの側部領域および／または中央領域は、それ自体輪郭の不連続性を含んでなる。
このような実施態様では、側部領域および／または中央領域は、部分的に重畳される少なくとも２つの幾何学的表面の組合せと考えることができる。
側部領域が少なくとも２つの幾何学的表面の組合せである場合、各表面の最大幅は、パターンの中央領域から末端へと減少する。
本発明によるパターンでは、中央領域の最大幅と側部領域の最大幅の間の比は２以上である。
加えて、パターンの長さと最大幅の間の比は４以下である。
図１に示される既知の「ハイブリッド」パターンに比べて、本発明によるパターンは「有限」長を有すると考えることができ、これはパターンの長さが筋管の長さに実質的に相当することを意味する。これに対して、「ハイブリッド」パターンは、実質的に「無限長」、すなわち、筋管の長さよりもはるかに長い長さを有する。例えば、「ハイブリッド」パターンの長さは一般に数ｍｍより長く、例えば６ｍｍより長い。
当然のことながら、パターンの長さは得られる筋管に必要とされる形態に応じて調整され得るのでこれは相対的概念であり、これが、なぜパターンの寸法が数値によって定義されず、異なる特定の寸法間の比によって定義されるかという理由である。
一般に、パターンの長さは、１００〜１０００μｍを含んでなり得、パターンの幅は５０〜５００μｍを含んでなり得、パターンの面積は５，０００〜５００，０００μｍ２を含んでなり得る。
その形状および「有限」長のために、本パターンは、筋管の拘束、従って、それらにそれらの始動および伸長の空間的誘導を拘束することを可能とする。
以下の実験結果に示されるように、より広い中央領域とより狭い側部領域を有するこのようなパターンは筋管分化に下記の効果を有する：その幅のために、中央領域は、その上に播種された細胞が自由に移動し得る表面となる。これに対して、より狭い側部領域はそれらの細胞に拘束の増強を提供し（前記拘束は好ましくは、パターンの末端に向かって増す）、 従ってそれらを好ましい方向、すなわち、パターンの縦軸に沿って誘導する。従って、筋芽細胞融合および筋管伸長は前記の好ましい方向に沿って制御される。
加えて、本パターンは、従来のイメージング法によってその全体を画像化することができ、それにより、その上で成長した筋管の長さの測定が可能となる。従って、本パターンは、筋管に関する付加的情報を提供する。
これに対して、上記の「ハイブリッド」パターンなどの「無限」パターンは、その過剰な長さのために全体としての画像化ができず、従って、その上で成長した筋管の長さの測定ができない。
図２Ａ〜２Ｄは、本発明による細胞接着パターンの種々の実施態様を示す。
図２Ａで、本パターンの中央領域２Ｃは、最大幅ＷＣを有する実質的な楕円形状を有する。
各側部領域２Ｌは、最大幅ＷＬを有する楕円の一部の形状を有する。
中央領域および側部領域を画定する楕円の主軸は一致する。
各側部領域と中央領域の間の接合部は、おおよそ、側部領域を画定する楕円の横軸に位置する。
パターンの長さはＬと呼ばれる。
図２Ｂで、中央領域２Ｃは、実質的に２つの接合楕円の形状を有する。中央領域の最大幅ＷＣは両楕円の、それらの横軸に沿った最大寸法である。
図２Ａについては、各領域２Ｌは、最大幅ＷＬを有する楕円の一部の形状を有する。
各側部領域と中央領域の間の接合部は、おおよそ、側部領域を画定する楕円の横軸に位置する。
図２Ｃで、中央領域２Ｃは、実質的に、図２Ａと同様の楕円の形状である。
各側部領域２Ｌは、２つの接合楕円の形状を有し、ここで、中央領域に最も近い楕円は、中央領域から最も遠い楕円よりも大きな幅を有する。
このような場合、各側部領域２Ｌの最大幅は、より広い楕円の最大幅であると定義される。
パターンの形状は、図２Ａ〜２Ｃに示されるような円形でなくてもよい。
例えば、図２Ｄに示されるように、パターンの中央領域２Ｃは幅ＷＣを有する矩形の形状を有し、各側部領域２Ｌは幅ＷＬを有する矩形の形状を有する。
当然のことながら、図２Ａ〜２Ｄに示される実施態様は単に例であり、本発明の範囲を限定するものではない。上記の寸法要件に従ういずれの他のパターンも本発明の一部である。
このようなパターンは、筋芽細胞を培養し成熟させるための装置を形成するために基材上に形成される。パターン表面が細胞接着性であるが、パターンの外部での筋管成長を妨げるために、基材の周囲表面は非細胞接着性であるか、または低細胞接着性である。
一つの実施態様によれば、基材は、ガラス、シリコーン、プラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン）などの、細胞を培養するために一般に使用される硬質基材である。「硬質」とは、基材のヤング率が１ＭＰａ以上であることを意味する。別の実施態様によれば、基材は軟質基材である。「軟質」とは、基材のヤング率が５〜１５ｋＰａを含んでなることを意味する。
１０ｋＰａ前後のヤング率が最適な分化および成熟に最も適当であると考えられる[Engler2008]。
このような軟質基材としては、
・合成ヒドロゲル材料、例えば、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）（ＰｏｌｙＨＥＭＡ）、ポリアクリルアミド（ＰＡＡ）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリアクリル酸、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン、ポリイミド、ポリウレタンなど、および上述の材料とそれらの誘導体のハイブリッド；
・天然ヒドロゲル材料、例えば、アガロース、デキストラン、ゼラチン、マトリゲル、ＤＮＡ、ポリイソシアノペプチドなど；
・シリコーン材料
が挙げられる。
・合成ヒドロゲル材料、例えば、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）（ＰｏｌｙＨＥＭＡ）、ポリアクリルアミド（ＰＡＡ）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリアクリル酸、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン、ポリイミド、ポリウレタンなど、および上述の材料とそれらの誘導体のハイブリッド；
・天然ヒドロゲル材料、例えば、アガロース、デキストラン、ゼラチン、マトリゲル、ＤＮＡ、ポリイソシアノペプチドなど；
・シリコーン材料
が挙げられる。
このような軟質材料は細胞を培養するためにすでに使用されている。
パターンは下記を含む既知の技術によってこのような基材上に形成され得る：
・マイクロコンタクトプリンティング[Engler 2004]、
・深ＵＶ活性化[Tseng 2011]、
・マイクロパターン転写[Polio 2012]、
・光化学結合[Hahn 2006]。
・マイクロコンタクトプリンティング[Engler 2004]、
・深ＵＶ活性化[Tseng 2011]、
・マイクロパターン転写[Polio 2012]、
・光化学結合[Hahn 2006]。
軟質基材上の線または溝の形態のパターンは文献で報告されている[Serena 2010]、[Cimetta 2009]、[Monge 2012]、ＵＳ２０１１／０１８９７１９。
筋芽細胞の筋管への分化の規格化は一般に、下記の工程を含んでなる。
まず、前記筋芽細胞を培養するための、基材（軟質または硬質のいずれか）と少なくとも１つの前記基材上に上記のように形成された細胞接着パターンとを含んでなる装置を準備する。
次に、筋芽細胞を、少なくとも１つの細胞接着パターンに付着される。
筋芽細胞を増殖培地中で所与の増殖時間インキュベートする。
この増殖工程の後、筋管への細胞分化を促進し、かつ、細胞接着パターン上での筋管の伸長を拘束するために、細胞を所定のインキュベーション時間の間に、分化培地中で培養する。
例えば、Ｃ２Ｃ１２マウス細胞では、増殖培地はＤＭＥＭ、２０％ＦＢＳ、０．５％Ｐ／Ｓであり、増殖時間は２４時間であり、分化培地はＤＭＥＭ／Ｆ１２、２％ウマ血清、０．５％Ｐ／Ｓであり、インキュベーション時間は７〜１１日であり、分化培地は２日毎に交換する（本明細書では、組成を定義するために使用する％は、慣例的に１００ｍｌ当たりの重量グラムを意味する）。
このインキュベーション時間の終了時に、分化した筋管を明らかにするために細胞を染色してもよい。
しかしながら、以下に示されるように、本発明によるパターンは筋管の様相を改善し、免疫染色なく、位相差顕微鏡による筋管の検出を可能とする。
硬質基材
図３は、種々の細胞接着パターンが形成された（領域１〜８）装置（前記装置はパターンの無い領域も含む（領域９））および各領域で形成された筋管の写真を示す。
図３は、種々の細胞接着パターンが形成された（領域１〜８）装置（前記装置はパターンの無い領域も含む（領域９））および各領域で形成された筋管の写真を示す。
領域１、２および３では、パターンは、種々の長さ／幅比を有する楕円形状を有し、このようなパターンは本発明の範囲内にない。
領域４、５および６は、本発明の実施態様によるパターンを含んでなる。各場合で、パターンの中央領域は楕円であり、かつ、側部領域は楕円の一部である。これらのパターンは、中央領域および側部領域の長さ／幅比で異なる。
領域７では、パターンは、図１に示される「ハイブリッド」パターンである。すでに述べたように、このようなパターンは本発明の範囲内にない。
領域８では、パターンは線であり、これは本発明の範囲内にない。
表１は、各領域の個々のマイクロパターン寸法を示す。
各写真では、パターンは点線で輪郭が示されている。
Ｃ２Ｃ１２マウスまたは初代ヒト筋芽細胞（ＨＳＭＭ、Ｌｏｎｚａ）をフィブロネクチンコーティングマイクロパターン上、増殖培地（それぞれＤＭＥＭ、２０％ＦＢＳ、０．５％Ｐ／ＳまたはＬｏｎｚａ ＳｋＧＭ（商標）−２細胞培養キット）内で２４時間培養した。次に、ＨＳＭＭおよびＣ２Ｃ１２のそれぞれに関して、両細胞種を、分化培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、２％ウマ血清、０．５％Ｐ／Ｓ）内で５〜１１日間培養した。分化培地は２日毎に交換した。細胞を固定し、ミオシン重鎖（カラー画像では緑−添付の白黒図面では薄いグレー）、アクチン（カラー画像では赤−添付の白黒図面では中等度のグレー）および核（カラー画像では青−添付の白黒図面では濃いグレー）に対して免疫染色を行った。画像は落射蛍光顕微鏡（ＤＭＩ６０００、Ｌｅｉｃａ）を用いて取得した。
図４Ａ〜４Ｄは、図３に示された各タイプのパターンに関する筋管の融合指数（筋管内の核と核の総数の比）、成熟指数（筋管当たりの核の数）、配向角度および幅／長さ比をそれぞれ示す。
しかしながら、パターン上の筋管の角度配向は、筋管が任意の配向をとり得るパターンの無い基材に比べて十分に再現性がある（パターンの形状が何であれ０に近い角度）。
最後に、図４Ｄは、既知の「ハイブリッド」パターンおよび本発明によるパターンのいくつかの実施態様を用いた場合に筋管の幅／長さ比がより安定であること（すなわち、その変動が低減される）ことを示す。言い換えれば、前記特定のパターンは、パターンの無い基材に比べて筋管形状の規格化を可能とする。さらに、領域５マイクロパターンは、他の供試パターンに比べて低い幅／長さ比を示し、このことは、円形で（より高い幅／長さ比を有する）、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化の第１段階に形成されることが知られる「ミオサック（myosacs)」様構造に比べて、筋管がより細長く、続いてより成熟することを示す。言い換えれば、このデザインは筋管成熟の増強をもたらす。
筋芽細胞のタイプに応じて、領域４の場合などの長さの短い側部領域は細胞を拘束するには十分でない可能性がある。よって、パターンの側部領域の長さは、その上で成長させる細胞のタイプに応じて調整され得る。
図５Ａおよび５Ｂはそれぞれ、パターンの無い基材および本発明によるパターン（この場合、図３の領域５のパターン）上で成長させた筋管の位相差顕微鏡像を示す。両場合とも、細胞は染色されておらず、画像は位相差顕微鏡を用いて取得された。
これらの画像は、細胞染色を行わなくても、本発明によるパターンによって筋管の視覚的様相が有意に改善されることを示す。これは、前記パターンによって行使される拘束が筋管のより顕著な起伏を生じる（これは位相差装置を用いて容易に観察可能である）という事実によって説明できる。
加えて、図３のこれらの画像は、パターンの無い基材（領域９）上では、筋管が人為的結果としての分岐（これは生理学的筋管には見られない）を示すが、本発明によるパターン（特に、領域５）上では、筋管は直線的であり、このような分岐を示さないことを示す。言い換えれば、パターンは、より生理学的な筋管分化をもたらす。
図６は、種々の細胞密度に関して、分化の最初の３日の融合指数の漸進的変化を示す。これらの定量値は、細胞分化が細胞密度とともに増すこと、および、より重要なことには、マイクロパターン（この場合、図３の領域５のパターン）が筋芽細胞分化を加速化することを示す。
図７Ａおよび７Ｂは、パターンの無い基材に比べてマイクロパターン（図３の領域５）基材で培養された構造内の、筋管の成熟マーカーである筋節横紋の改善を示し、定量する。
図８Ａは、マイクロパターン上で培養された筋管の、神経筋接合部形成の第１段階を再現する能力を示す。アグリン処理の後、マイクロパターン筋管は、それらのアセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）の大きなクラスター化を示す。ここで、ＴＭＲ−ブンガロトキシンは、アセチルコリン受容体と相互作用させた後にそれらの位置を明らかにするための蛍光プローブとして使用された。さらに、それらの側部の末端で、ＡＣｈＲクラスターは穿孔を有し、その結果、シナプス核の動員を伴ったプレッツェル様構造をとり、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＮＭＪのシナプス後成熟の古典的形質を再現する。さらに、図８Ｂは、それぞれマウスにおいてＡＣｈＲのクラスター化を阻害および刺激することが知られているＷｎｔ３ａおよびＷｎｔ４分子処理[Strochlic 2012, Wang 2008]が、本装置上で培養されたヒト初代細胞に由来する筋管でｉｎ ｖｉｖｏ状況を完全に再現することを示す。
これらの結果を併せると、マイクロパターンが筋管の成熟を改善することが示される。結論として、本発明によるパターンは、筋管の長さおよび幅の変動を低減し、免疫染色なく筋管の検出を可能とし、筋管の識別および計数を容易にし、より容易な画像解析および定量を提供し、かつ、ＮＭＪ形成の第１段階の再現能を含む、全体としての筋管の配向および成熟を改善する。
軟質基材
筋管の規格化は、軟質基材上に形成された本発明によるパターン上で細胞を培養することにより、硬質基材上に形成された同じパターンに比べてさらに改善され得る。
筋管の規格化は、軟質基材上に形成された本発明によるパターン上で細胞を培養することにより、硬質基材上に形成された同じパターンに比べてさらに改善され得る。
よって、図９に示されるように、装置は、ガラスプレートなどの補剛材３により支持されたヒドロゲルなどの軟質基材を含んでなる。複数の細胞接着パターンが前記軟質基材２の上に形成される。
図３のパターンと類似のパターンが軟質基材上にも形成された。
細胞インキュベーションのプロトコールは次の通りであった。
Ｃ２Ｃ１２細胞（マウス筋芽細胞）を１０ｋＰａのヤング率を有するパターン入りのヒドロゲルに播種した。
播種条件は３ｍｌ培養培地中３００．０００細胞／ウェルであった。
第１のインキュベーション工程は、３７℃にて、５％ＣＯ２下、増殖培地（ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）、２０％ＦＢＳ（ＰＡＡ）、０．５％Ｐ／Ｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））中で２４時間行った。
第２のインキュベーション工程は、３７℃にて、５％ＣＯ２下、分化培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１、Ｇｉｂｃｏ）、２％ウマ血清（ＰＡＡ）、０．５％Ｐ／Ｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で５日間行った。培地は２日毎に交換した。
次に、核、アクチンおよびミオシンを免疫染色した。
図１０Ａおよび１０Ｂはそれぞれ、パターンの無い軟質基材および本発明によるパターン（この場合、図３の領域５のパターン）上での筋管の形状を示す。
パターンの無い硬質基材に関してすでに見られたように、筋管は人為的結果としての分岐を示し、これは生理学的筋管には典型的でない。
対照的に、軟質基材上に形成されたパターン上インキュベートした筋管は、より生理学的な構成に相当する直線的形状を示す。
筋管は、図３の硬質基材に比べて、より微細で、成熟した構造に典型的な核配置を示す。さらに、筋管の形態学的パラメーターは、図１１に示されているように、硬質基材に比べても、構造間で高度な規格化を呈する。
図１２は、異なる形状を有するパターンが形成された軟質基材を含んでなる装置上での筋管の形成を示す。
筋管形成は、総てのパターン幾何学で、分化培地中５日後に見られ、硬質基材比べて２倍早く、筋芽細胞分化プロセスに対する強い影響を示す。
図１３Ａ〜１３Ｆはそれぞれ、軟質基材を含んでなる装置上の種々のパターンに関する筋管の融合指数、成熟指数、配向角度、幅／長さ比、幅および長さを示す。
硬質基材を用いた場合と同様に、総てのパターンが融合指数および成熟指数に関して実質的に同等の効果をもたらす。
加えて、パターン上でインキュベートされた筋管の角度配向は、パターンの無い基材上での培養に比べて再現性がある。
より重要なことに、本発明によるパターンは、楕円などの有限形状およびまた「ハイブリッド」パターンおよび線状などの「無限」形状に比べて、筋管の長さおよび幅の変動の低減を提供する。特に、供試パターンの中で最良のものである図１３Ｄの右の第２のパターンで得られた結果を参照。
規格化された長さおよび幅を有する筋管が得られるという事実は、細胞系アッセイを助長する。
パターン形状は、アッセイの目的ならびに筋管の所望の幅および長さに応じて調整され得る。
細胞系アッセイ
本発明の１つの利点は、ハイコンテントスクリーニング(high content screening)細胞系アッセイとのその適合性であり、筋毒性試験および／または有効化合物スクリーニングなどの種々の適用を可能とする。
本発明の１つの利点は、ハイコンテントスクリーニング(high content screening)細胞系アッセイとのその適合性であり、筋毒性試験および／または有効化合物スクリーニングなどの種々の適用を可能とする。
特に、本発明は、骨格筋細胞、特に、筋管または筋芽細胞において変化を誘導する化合物をスクリーニングするための方法を提供する。
本発明はまた、骨格筋の分化、成熟、萎縮および肥大を調節する化合物を同定するための方法も提供する。
本発明はまた、骨格筋細胞、特に、筋管または筋芽細胞において変化を調節する分子機構を研究するための方法も提供する。
本発明によるマイクロパターン、特に、図３の領域５のパターンは、筋管の形成に対する化合物の作用機序を特徴付けるために筋毒性アッセイで使用され得る。
筋毒性とは、本明細書では、筋芽細胞分化、筋管成熟、筋管肥大、筋管萎縮、または細胞生存に及ぼす化合物の影響を意味する。
本発明のもう１つの可能性のある適用は創薬である。
これに関して、本発明は、骨格筋細胞、特に、筋管または筋芽細胞の萎縮または肥大に作用する治療用化合物を同定するための方法を提供する。
筋関連の疾患および虚弱（ミオパチー、サルコペニア、悪液質、横紋筋融解症、リソソームミオパチー、筋原線維性ミオパチー、炎症性ミオパチー、低カリウム血症性ミオパチー（hypakalemia myopathies）、コルチコステロイドミオパチー、ミオシン欠乏症、筋無力症、筋炎、およびニューロン障害による筋欠損を含む）を有するドナーから、細胞株、同質遺伝子細胞株、誘導幹細胞（ＩＰｓ、ＥＳを含む）から採取された筋芽細胞を使用することにより、標的病態に治癒効果を有する新薬の発見を可能とする候補を見出すために、化合物、例えば、横紋筋融解症に罹患している患者から採取された筋芽細胞に肥大をもたらす化合物がスクリーニングされ得る。
スクリーニング方法は一般に、以下の工程を含んでなる。このようなスクリーニング方法はｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる。
上記のような細胞接着パターンを含んでなる装置を準備する。
好ましい実施態様によれば、これらのパターンは図３の領域５のパターンである。
筋芽細胞を前記細胞接着パターン上に付着させる。
細胞系アッセイの目的に応じて、筋芽細胞は、健常ドナーから（例えば、化合物毒性を試験する場合）または所定の筋関連病態に罹患しているドナーから（例えば、このような筋疾患に対する化合物の治癒効果を試験する場合）、細胞株、同質遺伝子細胞株、誘導幹細胞（ＩＰｓ、ＥＳを含む）から得ることができる。筋芽細胞の取得は、本発明に含まれない前工程である。
筋芽細胞を、それらの筋管への分化を促進するために分化培地中で培養する。
所与の時間に、少なくとも１つの化合物を細胞培養物に加える。化合物の添加は、筋芽細胞培養の開始時、筋芽細胞のインキュベーション中、または筋管が成熟した際に行うことができる。当業者ならば、アッセイの目的に応じて化合物の適当な添加時間を選択することができる。
前記化合物とともに筋管を所定の時間インキュベーションした後、筋管に及ぼす前記化合物の影響を決定するために筋管の画像解析を行う。インキュベーション時間は、試験プロトコールおよび細胞種によって異なる。このインキュベーション時間は一般に、ヒト筋管では２〜１５日、好ましくは２〜６日を含んでなる。
筋管の形態学的パラメーターの規格化は、供試化合物の影響を定量する観点から、筋管の特徴の決定を可能とする。実際に、化合物の影響は、骨格筋細胞、特に、筋管または筋芽細胞において萎縮または肥大により誘導される形態学的変化、例えば、大きさ、直径、厚さまたは幅を測定することによって評価することができる。
図１４Ａは、パターンの無い（ＮＰ）表面および領域５のパターンの両方での、萎縮性および肥大性の対照化合物処理（それぞれデキサメタゾンおよびＩＧＦ−１）後の代表的筋管を示す。ヒト初代筋芽細胞（ＨＳＭＭ、Ｌｏｎｚａ）を、フィブロネクチンコーティング表面上の増殖培地（Ｌｏｎｚａ ＳｋＧＭ（商標）−２細胞培養キット）内で２４時間培養する。次に、細胞を分化培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、２％ウマ血清、０．５％Ｐ／Ｓ）内で２４時間培養する。化合物（デキサメタゾン１００μＭおよびＩＧＦ−１ １５ｎＭ濃度）を形成中の筋管に７２時間加える。細胞を固定し、ミオシン重鎖、ミオゲニンおよび核に対して免疫染色を行う。Ｏｐｅｒｅｔｔａハイコンテントイメージングシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて画像を取得する。
筋管モデル（筋芽細胞分化、筋管成熟、筋管肥大、筋管萎縮、または細胞生存）に対する化合物の作用機序を特徴付けるために、自動画像分割および分析法が、Ａｃａｐｅｌｌａソフトウエアライブラリ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて発明者らにより開発された。
まず、カスタマイズした筋管および核の分割を行う。
次に、筋管総数、核総数、筋管形態（それらの長さ、幅、面積、および配向を含む）、融合指数（ミオゲニンを含有する核のパーセンテージによる）などの基本パラメーターを抽出するために対象物を分析する。前記パラメーターを考慮して、異常な筋管を除く。
最後に、「最大幅読み取り」と呼ばれる発展記述子、すなわち、残った筋管内の内部距離地図の最高値を測定する。
「距離地図」とは、最近接対象境界点までのユークリッド距離を各画素に割り当てる筋管画像の２値化の後に描写される「距離変換」操作を含む画像処理の結果を意味する。距離地図は当技術分野で公知であり、さらに記載する必要はない。
この発展記述子のハイレスポンダー(high responder)のパーセンテージを用いて、ＮＰおよび領域５のパターンの両方について対照および処理条件で培養した筋管を特徴付けた。
「ハイレスポンダー」とは、従前に記載した記述子の１つに関して所定の閾値よりも大きい値を有する筋管を意味する。
図１４Ｂは、画像処理の代表的な結果である。本発明によるパターンは、パターンの無い表面比べて、萎縮処理（＋１４４％）および肥大処理（＋７３３％）の両方について、対照および処理条件の間にアッセイウィンドウの大きな増加をもたらす。
提供される規格化とともに、アッセイウィンドウにおけるこの増大は、本発明の化合物スクリーニングとの適合性をバリデートする（０．２を超えるＺ’因子）。
本発明を、筋毒性活性に関して知られている選択された化合物（１０μＭ濃度）を用いたスクリーン原則の証明に用いた。
このスクリーニング法では、ヒト初代筋芽細胞（ＨＳＭＭ、Ｌｏｎｚａ）をフィブロネクチンコーティング表面（領域５のパターン）上の増殖培地（Ｌｏｎｚａ ＳｋＧＭ（商標）−２細胞培養キット）内で２４時間培養する。次に、細胞を分化培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、２％ウマ血清、０．５％Ｐ／Ｓ）内で２４時間培養する。筋毒性（横紋筋融解症候群、リソソームミオパチー、筋原線維性ミオパチー、炎症性ミオパチー、低カリウム血症性ミオパチー、コルチコステロイドミオパチー、筋炎、ミオシン欠乏症を含む）の誘導物質として知られる６０の異なる化合物と対照を形成中の筋管に７２時間の間加える。細胞を固定し、ミオシン重鎖、ミオゲニンおよび核に対して免疫染色を行う。Ｏｐｅｒｅｔｔａハイコンテントイメージングシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて画像を取得する。
ハイレスポンダー、すなわち、所定の閾値より大きい最大幅を有する筋管を計数する。
結果として、ミオパチーを誘発する化合物の４０％〜７０％が筋毒性として検出される。より厳密には、スタチン剤ファミリーメンバーは、パターンの無い表面を有する標準的な組織培養装置を用いた場合には１であるのに対し、本発明の使用によれば、ほとんどのもの（供試した７のうち６）が検出される。
参照文献
Claims (14)
- 基材（１）と該基材上で筋芽細胞を培養するための少なくとも１つの細胞接着パターン（２）とを含んでなる、筋芽細胞の、規格化された形態学的パラメーターを有する筋管への分化を制御するための装置であって、
前記パターン（２）は、中央領域（２Ｃ）と、前記中央領域から前記パターンの縦軸に沿って両方向に延伸する２つの側部領域（２Ｌ）とを含んでなる細長い表面を有し、ここで、中央領域（２Ｃ）と各側部領域（２Ｌ）の間には輪郭の不連続性があり、前記パターンの長さ（Ｌ）は１００〜１０００μｍであり、前記パターンの最大幅（Ｗｃ）は５０〜５００μｍであり、
前記中央領域（２Ｃ）の最大幅（ＷＣ）と前記側部領域（２Ｌ）の最大幅（ＷＬ）の間の比は２以上であり、
前記パターン（２）の長さ（Ｌ）と最大幅（ＷＣ）の間の比は４以下である、
装置。 - 前記パターンがその縦軸（Ｘ）および該縦軸に対して垂直な横軸（Ｙ）に対して対称である、請求項１に記載の装置。
- 前記パターンが３つの楕円表面：
前記パターンの中央領域を画定する第１の楕円表面、および
前記パターンの側部領域を画定する第１の楕円の主軸に一致する主軸を有する第２および第３の楕円表面
の部分的重畳からなり、
第２および第３の楕円表面はそれらの横軸に沿って第１の楕円表面と交差する、
請求項１または２のいずれか一項に記載の装置。 - 前記パターンの長さ（Ｌ）と最大幅（ＷＣ）の間の比が２．５である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の装置。
- 前記パターンの面積が５，０００〜５００，０００μｍ２である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の装置。
- 前記基材が硬質基材である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の装置。
- 前記基材が軟質基材である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の装置。
- 前記基材のヤング率が５〜１５ｋＰａである、請求項７に記載の装置。
- 筋芽細胞の筋管への分化を促進するための方法であって、
（ｉ）請求項１〜８のいずれか一項に記載の装置を準備すること、
（ｉｉ）前記装置の少なくとも１つの細胞接着パターン上に筋芽細胞（ドナーからの初代細胞、細胞株、同質遺伝子細胞株、誘導幹細胞を含む）を付着させること、
（ｉｉｉ）横紋筋管への細胞分化を促進し、かつ、細胞接着パターン上での筋管の伸長を拘束するために、前記筋芽細胞を所定のインキュベーション時間の間、分化培地中で培養すること
を含んでなる、方法。 - 骨格筋細胞、特に、筋管または筋芽細胞における変化を誘導する化合物をスクリーニングするための方法であって、
（ｉ）請求項１〜８のいずれか一項に記載の装置を準備すること、
（ｉｉ）前記装置の少なくとも１つの細胞接着パターン上に筋芽細胞を付着させること、
（ｉｉｉ）筋管への細胞分化を促進するために、前記筋芽細胞を分化培地中で培養すること、
（ｉｖ）前記培養物に少なくとも１つの化合物を加えること、
（ｖ）筋管を前記化合物とともに所定の時間インキュベーションした後、筋管の画像解析を行い、骨格筋細胞、特に、筋管または筋芽細胞における形態学的変化を測定することにより、筋管に及ぼす前記化合物の影響を決定すること
を含んでなる、方法。 - 骨格筋細胞、特に、筋管または筋芽細胞における筋毒性に関連する化合物のスクリーニングを可能とする、前記筋芽細胞が健常ドナーまたは細胞株から得られ、かつ、筋芽細胞分化、筋管成熟、筋管萎縮、筋管肥大、および骨格筋細胞、特に、筋管における細胞傷害性の不在を測定することにより、筋毒性に関する前記化合物の影響を決定するために画像解析が行われる、請求項１０に記載の方法。
- 創薬分野において、骨格筋細胞、特に、筋管または筋芽細胞の萎縮または肥大に作用する治療用化合物を同定するための、前記筋芽細胞が所定の筋関連病態に罹患しているドナーからまたは細胞株から得られ、かつ、萎縮または肥大特性に関する前記化合物の影響を決定するために画像解析が行われる、請求項１０に記載の方法。
- 前記の測定される形態学的変化が、化合物とのインキュベーション後の筋管の最大幅を含んでなり、かつ、画像解析が筋管画像の２値化、前記筋管の距離地図の計算およびの前記距離地図からの各筋管の最大幅の計算を含んでなる、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
- 所定の値より大きい最大幅を有する筋管を計数することをさらに含んでなる、請求項１３に記載の方法。
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| "高速化を目的としたセグメントの接続を用いた輪郭座標からのフリーマンチェーンコード作成法", 計測自動制御学会論文集, vol. 22, no. 2, JPN6018041001, 1986, pages 75 - 80, ISSN: 0004048552 * |
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