JP2016118635A - 観察用透明基板、観察用容器及びその製造方法、透明基材の研磨方法、並びに観察方法 - Google Patents

Abstract

【課題】倒立顕微鏡を用いて高倍率で細胞を観察することが可能な観察用透明基板、観察用容器及びその製造方法、透明基材の研磨方法、並びに観察方法を提供する。【解決手段】観察用透明基板１０は、所定の観察領域１３Ａを含む第１面１１ａ及び当該第１面１１ａに対向する第２面１１ｂを有する基部１１を備え、第１面１１ａ上の観察領域１３Ａ内の観察対象物を第２面１１ｂ側から観察するために用いられるものであって、基部１１の第１面１１ａ側には、観察領域１３Ａ内にナノ凹凸パターン１２が形成されており、基部１１の厚みＴ11が０．５ｍｍ以下である。【選択図】図２

Description

本発明は、観察対象物を観察するために用いられる観察用透明基板、観察用容器及びそれを製造する方法、透明基材を研磨する方法、並びに観察対象物を観察する方法に関する。

近年、創薬開発、再生医療等のバイオテクノロジー関連分野において、生体組織から単離した細胞や、細胞を構成する細胞構成要素（例えば、培養細胞から分泌される膜小胞（エクソソーム）、細胞小器官（オルガネラ）、小胞（リソソーム、エンドソーム、ファゴソーム、液胞等）、顆粒（メラノソーム、微小体、グリオキシソーム、バイベル・パラーデ小体等）、細胞骨格、中心小体、鞭毛、繊毛、リボソーム等）を用いた試験・研究が盛んに行われている。一般に、培養細胞を用いた試験・研究は、動物を用いた試験・研究に比べて安価であり、評価する試薬量が少なくて済む、均質な実験データが得られやすいといった利点がある。このような試験・研究において、生体組織から単離した細胞の細胞死を抑制し、当該細胞を安定的に培養し、増殖させることが重要となる。

細胞を安定的に培養し、増殖させるために、細胞を培養するための細胞培養容器に関する開発が進められている。従来、培養する細胞の生存率を高め、安定的な培養が可能な細胞培養容器として、細胞が培養される面に複数の微細な突起を設けてなる細胞培養容器が提案されている（特許文献１参照）。

国際公開２００７／１０５４１８号公報

上記特許文献１に記載の細胞培養容器は、細胞を培養する面に複数の微細な突起が形成されており、当該突起の幅又は直径が２０ｎｍ〜３μｍであり、アスペクト比が０．２〜３．０であることで、細胞が擬似足場となる接着斑を形成し、突起上に接着することができるため、培養する細胞の生存率を高めることができ、安定的な培養が可能となる。

ところで、上記特許文献１に記載の細胞培養容器を用いて細胞を培養する過程において、細胞が安定的に培養されているか否か等、定期的に観察することが重要である。このような細胞観察の手法としては、倒立顕微鏡を用い、細胞が収容された容器の底面側から観察する方法が一般的である。正立顕微鏡を用いて観察しようとすると、容器内の培養液に対物レンズが接触してしまうためである。

このような細胞観察において、倒立顕微鏡を用いて細胞をより高倍率で観察するためには、容器の底面側に位置する対物レンズと、観察対象物である細胞との距離を短くしなければならない。この点、上記特許文献１に記載の細胞培養容器においては、容器底面の厚みが厚すぎるために、倒立顕微鏡を用いて高倍率で細胞を観察することが困難である。そのため、上記細胞培養容器は、培養される細胞の観察、特に高倍率での観察には適していないという問題がある。

このような課題に鑑みて、本発明は、倒立顕微鏡を用いて高倍率で観察対象物を観察することが可能な観察用透明基板、観察用容器及びその製造方法、透明基材の研磨方法、並びに観察方法を提供することを目的とする。

上記課題を解決するために、本発明は、所定の観察領域を含む第１面及び当該第１面に対向する第２面を有する基部を備え、前記第１面上の前記観察領域内の観察対象物を前記第２面側から観察するために用いられる観察用透明基板であって、前記基部の前記第１面側には、前記観察領域内にナノ凹凸パターンが形成されており、前記基部の厚みが０．５ｍｍ以下であることを特徴とする観察用透明基板を提供する（発明１）。

上記発明（発明１）において、前記ナノ凹凸パターンの寸法が、１００〜５００ｎｍであるのが好ましく（発明２）、前記観察対象物が、細胞又は前記細胞を構成する細胞構成要素であるのが好ましい（発明３）。

また、本発明は、貫通孔が形成されてなる底部及び前記底部の外周縁に連続する周壁部を有する容器本体と、前記底部に取り付けられてなる上記発明（発明１〜３）に係る観察用透明基板とを備え、前記容器本体の平面視において前記観察用透明基板の前記ナノ凹凸パターンが前記貫通孔に重なるように、かつ前記容器本体内に位置するようにして、前記観察用透明基板が前記底部に取り付けられており、前記貫通孔は、前記観察用透明基板により塞がれていることを特徴とする観察用容器を提供する（発明４）。

上記発明（発明４）において、前記観察用透明基板は、前記容器本体の平面視において前記ナノ凹凸パターンが前記貫通孔に物理的に包含されるようにして、前記底部に取り付けられてなるのが好ましく（発明５）、前記観察用透明基板が、前記貫通孔から前記ナノ凹凸パターンを露出させるようにして、前記容器本体の前記底部の外面に取り付けられているのが好ましく（発明６）、前記観察用透明基板が、接着剤を介して前記底部に取り付けられているのが好ましい（発明７）。

さらに、本発明は、第１面及び当該第１面に対向する第２面を有し、前記第１面側にナノ凹凸パターンが形成されてなる透明基材を準備する工程と、前記第１面側の前記ナノ凹凸パターンを被覆する金属含有膜を形成する工程と、前記金属含有膜上に有機膜を形成する工程と、前記有機膜が形成された前記透明基材を前記第２面側から研磨する工程とを含み、前記第２面側から研磨された後の前記透明基材の厚みが０．５ｍｍ以下であることを特徴とする研磨方法を提供する（発明８）。

上記発明（発明８）において、前記ナノ凹凸パターンの寸法が、１００〜５００ｎｍであるのが好ましく（発明９）、前記金属含有膜の厚みが５０ｎｍ以上であるのが好ましく（発明１０）、前記透明基材は、前記ナノ凹凸パターンの形成されている領域が複数割り付けられているのが好ましい（発明１１）。

さらに、本発明は、貫通孔が形成されてなる底部及び前記底部の外周縁に連続する周壁部を有する容器本体と、第１面及び当該第１面に対向する第２面を有し、前記第１面上の観察対象物を前記第２面側から観察するために用いられる観察用透明基板とを備え、前記観察用透明基板が前記底部に取り付けられている観察用容器を製造する方法であって、第１面及び当該第１面に対向する第２面を有し、当該第１面側にナノ凹凸パターンが形成されてなる透明基材を、当該第２面側から研磨することで作製された前記観察用透明基板を、前記容器本体の平面視において前記観察用透明基板の前記ナノ凹凸パターンが前記貫通孔に重なるようにして前記容器本体内に位置し、かつ前記貫通孔を塞ぐように前記容器本体の底面に取り付ける工程を含み、前記観察用透明基板は、上記発明（発明８〜１１）に係る研磨方法により前記透明基材を研磨して作製されたものであることを特徴とする観察用容器の製造方法を提供する（発明１２）。

上記発明（発明１２）において、前記容器本体の平面視において前記ナノ凹凸パターンが前記貫通孔に物理的に包含されるようにして、前記容器本体の前記底部に前記観察用透明基板を取り付けるのが好ましく（発明１３）、前記貫通孔から前記ナノ凹凸パターンを露出させるようにして、前記容器本体の前記底部の外面に前記観察用透明基板を取り付けるのが好ましく（発明１４）、前記観察用透明基板を、接着剤を介して前記底部に取り付けるのが好ましく（発明１５）、前記観察対象物が、細胞又は前記細胞を構成する細胞構成要素であるのが好ましい（発明１６）。

さらにまた、本発明は、上記発明（発明４〜７）に係る観察用容器内に観察対象物を収容し、前記ナノ凹凸パターン上の前記観察対象物を、前記観察用透明基板の前記第２面側から観察することを特徴とする観察方法を提供する（発明１７）。

上記発明（発明１７）において、倒立顕微鏡を用いて前記観察対象物を観察するのが好ましい（発明１８）。

本発明によれば、倒立顕微鏡を用いて高倍率で観察対象物を観察することが可能な観察用透明基板、観察用容器及びその製造方法、透明基材の研磨方法、並びに観察方法を提供することができる。

図１は、本発明の一実施形態に係る観察用透明基板の概略構成を示す平面図である。 図２は、本発明の一実施形態に係る観察用透明基板の概略構成を示す、図１におけるＩ−Ｉ線切断端面図である。 図３は、本発明の一実施形態に係る観察用透明基板の製造工程を切断端面図にて示す工程フロー図である。 図４は、本発明の一実施形態に係る観察用透明基板の製造工程であって、図３に示す工程に連続する各工程（透明基材の研磨方法の各工程）を切断端面図にて示す工程フロー図である。 図５は、本発明の一実施形態における観察用容器の概略構成を示す平面図である。 図６は、本発明の一実施形態における観察用容器の概略構成を示す、図５におけるII−II線切断端面図である。 図７は、本発明の一実施形態における観察用容器を用いた観察方法を示す概略図である。

本発明の実施の形態について、図面を参照しながら説明する。
［観察用透明基板］
図１は、本実施形態に係る観察用透明基板の概略構成を示す平面図であり、図２は、本実施形態に係る観察用透明基板の概略構成を示す、図１におけるＩ−Ｉ線切断端面図である。

図１及び図２に示すように、本実施形態に係る観察用透明基板１０は、第１面１１ａ及び第１面１１ａに対向する第２面１１ｂを有する基部１１を備え、基部１１の第１面１１ａ側における観察領域１３Ａ内にナノ凹凸パターン１２が形成されている。本実施形態に係る観察用透明基板１０は、ナノ凹凸パターン１２上に存在する、観察対象物としての細胞又は細胞を構成する細胞構成要素（例えば、培養細胞から分泌される膜小胞（エクソソーム）、細胞小器官（オルガネラ）、小胞（リソソーム、エンドソーム、ファゴソーム、液胞等）、顆粒（メラノソーム、微小体、グリオキシソーム、バイベル・パラーデ小体等）、細胞骨格、中心小体、鞭毛、繊毛、リボソーム等）を、倒立顕微鏡を用いて第２面１１ｂ側から観察するために用いられるものである。以下、細胞及び細胞構成要素を含め「細胞等」と称する場合がある。

なお、本実施形態において「透明」とは、波長１９０〜８００ｎｍの光を対象物（本実施形態においては観察用透明基板１０）の片側（第１面１１ａ側又は第２面１１ｂ側）から照射した際、照射された側とは反対側（第２面１１ｂ側又は第１面１１ａ側）へ光が到達することを意味する。好適な基準を透過率で示すならば２０％以上、好ましくは５０％以上、特に好ましくは８０％以上である。

基部１１を構成する材料としては、石英ガラス、合成石英ガラス、ソーダガラス、蛍石、フッ化カルシウム、フッ化マグネシウム、アクリルガラス、ホウケイ酸ガラス等のガラス材料；ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン、その他ポリオレフィン等の樹脂材料等の透明材料等を用いることができる。

基部１１の形状（平面視形状）は、特に限定されるものではなく、例えば、平面視略矩形状、平面視略円形状等を挙げることができる。また、平面視における基部１１の大きさは特に限定されるものではないが、後述するように、本実施形態に係る観察用透明基板１０は、好適には、貫通孔２ｃを有する容器本体２の底部２ａに、貫通孔２ｃを塞ぐようにして取り付けられて用いられる（図５及び図６参照）。そのため、基部１１の大きさは、当該容器本体２の貫通孔２ｃの大きさに応じ、貫通孔２ｃを塞ぐことのできる程度に設定されるのが好ましい。

基部１１の厚みＴ₁₁は、０．５ｍｍ以下であり、好ましくは０．０３〜０．５ｍｍであり、特に好ましくは０．１〜０．２ｍｍである。本実施形態に係る観察用透明基板１０は、ナノ凹凸パターン１２上に存在する観察対象物を、倒立顕微鏡を用いて第２面１１ｂ側から観察する用途に用いられる。特に、観察対象物としての細胞等を観察する場合、極めて高倍率（２０倍以上、好ましくは５０倍以上程度）で観察可能であることが望ましい。基部１１の厚みＴ₁₁が０．５ｍｍを超えると、ナノ凹凸パターン１２上の観察対象物と、基部１１を挟むようにして対向して第２面１１ｂ側に位置する倒立顕微鏡の対物レンズとの距離が長くなってしまい、高倍率（２０倍以上程度）での観察が困難となる。

なお、本実施形態において基部１１の厚みＴ₁₁とは、第１面１１ａ側に形成されているナノ凹凸パターン１２の頂部と第２面１１ｂとの間の板厚方向の長さを意味し、当該厚みＴ₁₁は、マイクロメーター等を用いて測定され得る。

ナノ凹凸パターン１２は、基部１１と一体的な構造物として、基部１１の第１面１１ａ上の観察領域１３Ａ内に形成されている。基部１１の第１面１１ａ上に占める観察領域１３Ａの大きさは、特に限定されるものではないが、後述するように、本実施形態に係る観察用透明基板１０は、好適には、底部２ａの略中央に貫通孔２ｃが形成された容器本体２の当該底部２ａの外面（容器本体２外）に、貫通孔２ｃからナノ凹凸パターン１２が露出するようにして取り付けられて用いられる（図５及び図６参照）。そのため、観察領域１３Ａの大きさ、換言すればナノ凹凸パターン１２の形成されるべき領域の大きさは、当該容器本体２の貫通孔２ｃの大きさに応じ、ナノ凹凸パターン１２が貫通孔２ｃから露出され得る程度に、すなわち、観察用透明基板１０を取り付けた容器本体２の平面視において観察領域１３Ａが貫通孔２ｃに物理的に包含され得る程度に適宜設定される（図１参照）。

ナノ凹凸パターン１２の形状としては、平面視略円形、略矩形又は略多角形のピラー状、ライン状等が好適であるが、これらの形状に限定されるものではなく、例えば、平面視略円形、略矩形又は略多角形のホール状等であってもよい。また、ナノ凹凸パターン１２は、テーパー状又は逆テーパー状の側壁形状を有していてもよい。

ナノ凹凸パターン１２の寸法は、１００〜５００ｎｍであるのが好ましい。ナノ凹凸パターン１２の寸法が上記範囲内であることで、観察対象物としての細胞が当該ナノ凹凸パターン１２に対して良好な接着性を示すため、当該細胞の観察、特に長時間の観察が容易になる。

なお、ナノ凹凸パターン１２の寸法とは、例えば、ナノ凹凸パターン１２が平面視略正方形のピラー状であれば当該正方形の一辺の長さ、平面視略円形のピラー状であれば当該円の直径、ライン状であれば短手方向の幅を意味する。

ナノ凹凸パターン１２の高さ（アスペクト比）は、特に限定されるものではなく、ナノ凹凸パターン１２の寸法に応じて、適宜設定され得る。通常、ナノ凹凸パターン１２のアスペクト比が０．５〜５程度になるように、ナノ凹凸パターン１２の高さが設定され得る。

なお、基部１１の第１面１１ａにおける観察領域１３Ａの外側の領域は、後述する底部２ａの略中央に貫通孔２ｃが形成された容器本体２の当該底部２ａの外面に取り付けられる際に接着剤が塗布される領域として構成される。

上述した構成を有する本実施形態に係る観察用透明基板１０によれば、基部１１の厚みＴ₁₁が０．５ｍｍ以下と非常に薄いことで、第１面１１ａ上の観察対象物を、倒立顕微鏡を用いて第２面１１ｂ側から高倍率で観察することが可能である。また、第１面１１ａ側にナノ凹凸パターン１２が形成されていることで、観察対象物としての細胞が当該ナノ凹凸パターン１２に対する良好な接着性を示すため、倒立顕微鏡を用いた長時間の観察を容易に行うことができる。

［観察用透明基板の製造方法］
上述した構成を有する観察用透明基板１０は、以下のようにして製造することができる。図３は、本実施形態に係る観察用透明基板の製造工程を切断端面図にて示す工程フロー図であり、図４は、本実施形態に係る観察用透明基板の製造工程であって、図３に示す工程に連続する各工程（透明基材の研磨方法の各工程）を切断端面図にて示す工程フロー図である。

まず、第１面３１ａ及び第１面３１ａに対向する第２面３１ｂを有し、第１面３１ａ上にハードマスク層４１及びレジスト膜４２がその順に形成されてなる透明基材３１を準備する（図３（Ａ）参照）。

透明基材３１としては、本実施形態に係る観察用透明基板１０の構成材料（例えば、石英ガラス、合成石英ガラス、ソーダガラス、蛍石、フッ化カルシウム、フッ化マグネシウム、アクリルガラス、ホウケイ酸ガラス等のガラス材料；ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン、その他ポリオレフィン等の樹脂材料等の透明材料）からなる基材等を用いることができる。かかる透明基材３１は、０．５ｍｍを超える厚みを有するものであり、通常、１．０〜６．３５ｍｍ程度の厚みを有するものである。

本実施形態において、透明基材３１は、第１面３１ａ側に複数の観察用透明基板１０に相当する領域が割り付けられてなる多面付け透明基材であって、後述する工程（図４（Ｄ）参照）において切断されることによって、各観察用透明基板１０が製造される。

ハードマスク層４１を構成する材料としては、例えば、金属クロム、酸化クロム、窒化クロム、酸窒化クロム等を用いることができる。ハードマスク層４１は、後述する工程（図３（Ｃ）参照）により透明基材３１をエッチングするために用いられるハードマスクパターン４４を形成するための層である。そのため、透明基材３１を構成する材料とのエッチング選択比や、観察用透明基板１０におけるナノ凹凸パターン１２のアスペクト比を考慮した材料により構成される。例えば、透明基材３１が石英ガラスにより構成される場合、ハードマスク層４１は金属クロム等により構成されるのが望ましい。

レジスト膜４２を構成するレジスト材料としては、特に限定されるものではなく、従来公知のエネルギー線感応型レジスト材料（例えば、電子線感応型レジスト材料、紫外線感応型レジスト材料等）等を用いることができる。

次に、レジスト膜４２をパターニングして、観察用透明基板１０のナノ凹凸パターン１２に対応するレジストパターン４３を、透明基材３１の第１面３１ａ側における、観察用透明基板１０の観察領域１３Ａ（図１及び図２参照）に相当する領域内に形成する（図３（Ｂ）参照）。

レジストパターン４３を形成する方法としては、特に限定されるものではない。例えば、電子線リソグラフィー法、フォトリソグラフィー法、ナノインプリントリソグラフィー法等によりレジストパターン４３を形成することができる。

続いて、レジストパターン４３をマスクとして用いてハードマスク層４１をドライエッチング法によりエッチングし、ハードマスクパターン４４を形成する（図３（Ｃ）参照）。そして、当該ハードマスクパターン４４をマスクとして用いて透明基材３１の第１面３１ａをエッチングしてナノ凹凸パターン１２を形成した後、ハードマスクパターン４４を除去する（図３（Ｄ）参照）。

このようにして第１面３１ａ側にナノ凹凸パターン１２が形成された透明基材３１を第２面３１ｂ側から研磨して、透明基材３１の厚みを０．５ｍｍ以下にする。かかる透明基材３１を研磨する方法は、以下のようにして実施され得る。図４は、本実施形態における透明基材３１（第１面３１側にナノ凹凸パターン１２が形成された透明基材３１）を研磨する方法の工程を概略的に切断端面図にて示す工程フロー図である。

まず、第１面３１ａにナノ凹凸パターン１２が形成された透明基材３１の当該第１面３１の全面を覆うように、当該第１面３１ａ上に金属含有膜５１を形成する（図４（Ａ）参照）。

金属含有膜５１を構成する材料としては、例えば、クロム、銅等の金属材料、当該金属の酸化物、窒化物等が挙げられる。後述の研磨工程（図４（Ｃ）参照）後に、金属含有膜５１をエッチング処理により剥離する（図４（Ｅ）参照）ことを考慮すると、透明基材３１として石英ガラスを用いる場合には、選択比等の観点から剥離の容易なクロム、酸化クロム等を、金属含有膜５１を構成する材料として用いるのが好ましい。

金属含有膜５１の厚み（ナノ凹凸パターン１２の頂部上の厚み）は、５０ｎｍ以上であるのが好ましく、５０〜２００ｎｍであるのが好ましい。本実施形態において、透明基材３１の厚みが０．５ｍｍ以下になるまで、透明基材３１の第２面３１ｂ側から研磨するため（図４（Ｃ）参照）、研磨処理の過程で透明基材３１の厚みが薄くなるに従い、透明基材３１の強度が低下する。また、後述するように、厚みが０．５ｍｍ以下にまで研磨された透明基材３１が切断され個片化されることで、観察用透明基板１０が製造される（図４（Ｄ），（Ｅ）参照）。そのため、金属含有膜５１の厚みが５０ｎｍ未満であると、透明基材３１の補強効果が不十分となり、研磨処理や切断工程において透明基材３１が破損してしまうおそれがある。

第１面３１ａに金属含有膜５１を形成する方法としては、特に限定されるものではなく、例えば、スパッタリング法、ＣＶＤ法、ＰＶＤ法、真空蒸着法等の公知の成膜法を採用することができる。

次に、金属含有膜５１上に有機膜５２を形成する（図４（Ｂ）参照）。後述する研磨工程（図４（Ｃ）参照）において、微細なパーティクル等が生じるが、金属含有膜５１上に有機膜５２を形成しておくことで、有機膜５２を除去する過程で当該パーティクル等も同時に除去することができるため、当該パーティクル等がナノ凹凸パターン１２内に付着してしまうのを防止することができる。

有機膜５２を構成する材料としては、特に限定されるものではなく、例えば、上述したレジスト膜４２（図３（Ａ）参照）を構成する材料と同様の材料を用いることができる。
金属含有膜５１上に有機膜５２を形成する方法としては、特に限定されるものではなく、例えば、スピンコート法等の公知の塗布方法により有機膜５２を構成する材料を塗布した後、当該材料を硬化させる方法等を採用することができる。

有機膜５２の厚みは、特に限定されるものではなく、後述する研磨工程（図４（Ｃ）参照）において生じ得る微細なパーティクル等がナノ凹凸パターン１２内に付着してしまうのを防止し得る程度の厚みであればよい。例えば、有機膜５２の厚みは、２００〜５００ｎｍ程度である。

続いて、有機膜５２が形成された透明基材３１を、厚みが０．５ｍｍ以下になるまで第２面３１ｂ側から研磨する（図４（Ｃ）参照）。第１面３１ａ側に金属含有膜５１が形成されていることで、透明基材３１を破損させることなく、厚みが０．５ｍｍ以下になるまで研磨することができる。また、金属含有膜５１上に有機膜５２が形成されていることで、研磨の過程で生じるパーティクル等がナノ凹凸パターン１２内に付着してしまうのを防止することができる。

透明基材３１を研磨する方法としては、特に限定されるものではなく、例えば、化学機械研磨処理（Chemical Mechanical Polishing，ＣＭＰ）、回転研磨盤等を用いた機械研磨処理等が挙げられる。好ましくは、機械研磨処理により厚み０．５ｍｍ超１ｍｍ以下程度まで研磨（１次研磨）した後、ＣＭＰにより厚み０．５ｍｍ以下になるまで研磨（２次研磨）する。

このようにして研磨され、０．５ｍｍ以下の厚みを有する透明基材３１を、ダイシング装置等を用いて切断して個片化する（図４（Ｄ）参照）。最後に、切断され個片化された各透明基材３１の第１面３１ａ側から有機膜５２及び金属含有膜５１を剥離することで、本実施形態に係る観察用透明基板１０を製造することができる（図４（Ｅ）参照）。

有機膜５２及び金属含有膜５１を剥離する方法は、特に限定されるものではなく、例えば、硫酸等を含む洗浄液にて有機膜５２を溶解して除去する方法、金属含有膜５１を構成する金属材料等をエッチング可能なエッチング液を用いて金属含有膜５１を除去する方法等が挙げられる。

本実施形態における研磨方法やそれを含む観察用透明基板１０の製造方法によれば、第１面３１ａ側にナノ凹凸パターン１２が形成されてなる透明基材３１を破損させることなく、厚み０．５ｍｍ以下にまで研磨することができ、倒立顕微鏡を用いて第２面１１ｂ側から観察可能な観察用透明基板１０を容易に製造することができる。

［観察用容器］
上述した構成を有する観察用透明基板１０は、第１面１１ａ側におけるナノ凹凸パターン１２上に存在する観察対象物（細胞等）を、倒立顕微鏡を用いて第２面１１ｂ側から観察するために用いられるものであるが、後述する観察用容器の態様で用いられるのが好適である。図５は、本実施形態における観察用容器の概略構成を示す平面図（上面図）であり、図６は、本実施形態における観察用容器の概略構成を示す、図５におけるII−II線切断端面図である。

図５及び図６に示すように、本実施形態における観察用容器１は、底部２ａ及び当該底部２ａの外周縁に連続する周壁部２ｂを有し、底部２ａの略中央に貫通孔２ｃが形成されてなる容器本体２と、容器本体２の底部２ａに取り付けられている本実施形態に係る観察用透明基板１０とを備える。

本実施形態において、容器本体２は、底部２ａの略中央に貫通孔２ｃが形成され、上方に開口するシャーレ状容器であるが、底部に貫通孔が形成されている限りにおいて、このような態様に限定されるものではない。例えば、底部に貫通孔が形成されているフラスコ状容器等であってもよい。

平面視における容器本体２の大きさは、特に限定されるものではなく、細胞培養等において一般的に用いられているシャーレと同等の直径、例えば、直径３０〜６０ｍｍ程度であるのが好ましい。また、容器本体２の底部２ａの厚みは、０．８〜１．５ｍｍ程度である。

容器本体２は、合成樹脂製のものであってもよいし、ガラス製のものであってもよい。また、周壁部２ｂと底部２ａとが異なる材質（例えば、周壁部２ｂが合成樹脂製であって、底部２ａがガラス製等）により構成されるものであってもよい。

貫通孔２ｃの大きさは、特に限定されるものではないが、観察用透明基板１０の第１面１１ａの観察領域１３Ａ内に形成されているナノ凹凸パターン１２を物理的に包含し得る大きさであるのが好ましく、例えば、直径１０〜３０ｍｍ程度である。

本実施形態において、観察用透明基板１０は、容器本体２内にナノ凹凸パターン１２が位置するように、すなわちナノ凹凸パターン１２が貫通孔２ｃから露出するようにして、容器本体２の底部２ｂの外面に取り付けられている。そして、観察用容器１（容器本体２）の平面視（上面視）において、観察用透明基板１０は、ナノ凹凸パターン１２が貫通孔２ｃに重なるように、すなわちナノ凹凸パターン１２が貫通孔２ｃに物理的に包含されるようにして、容器本体２の底部２ａの外面に取り付けられている。

観察用透明基板１０は、貫通孔２ｃを塞ぐようにして容器本体２の底部２ａの外面に取り付けられている。すなわち、貫通孔２ｃが形成されている底部２ａと、当該貫通孔２ｃを塞ぐ観察用透明基板１０とにより、容器本体２の底面が構成されている。

観察用透明基板１０は、接着剤（図示せず）を介して容器本体２の底部２ａの外面における貫通孔２ｃの周縁近傍に接着することで取り付けられているのが好ましい。かかる接着剤としては、特に限定されるものではないが、観察用透明基板１０及び容器本体２の底部２ａの構成材料に応じてそれらに対する接着力が高く、観察用容器１内に収容される培養液等に対するシール性（液密性）を有し、細胞等の観察対象物に対して悪影響を与えない（毒性等を有しない）ものであるのが好まし。当該接着剤としては、例えば、脱オキシム型シリコーン系接着剤等が用いられ得る。

上述した構成を有する本実施形態における観察用容器１によれば、０．５ｍｍ以下の厚みＴ₁₁を有する観察用透明基板１０が容器本体２の底部２ａの外面に、ナノ凹凸パターン１２が容器本体２の貫通孔２ｃに物理的に包含されるようにして取り付けられていることで、ナノ凹凸パターン１２上に存在する観察対象物（細胞等）を、倒立顕微鏡を用いて高倍率で観察することができる。また、観察対象物としての細胞は、ナノ凹凸パターン１２に対して良好な接着性を示すため、本実施形態における観察用容器１によれば、ナノ凹凸パターン１２上の細胞の長時間観察が容易となる。

［観察用容器の製造方法］
上述した観察用容器１は、底部２ａ及び当該底部２ａの外周縁に連続する周壁部２ｂを有し、底部２ａの略中央に貫通孔２ｃが形成されてなる容器本体２を準備し、当該容器本体２の底部２ａの外面に、観察用透明基板１０の第１面１１ａの観察領域１３Ａの外周の領域に塗布された接着剤を介して当該観察用透明基板１０を取り付けることにより製造され得る。

このとき、容器本体２の貫通孔２ｃを塞ぐように、かつ観察用透明基板１０におけるナノ凹凸パターン１２が、貫通孔２ｃから露出するようにして、当該観察用透明基板１０を容器本体２の底部２ａに取り付ける。これにより、ナノ凹凸パターン１２を容器本体２内に位置させることができる。

本実施形態によれば、容器本体２の底部２ａの略中央に形成されている貫通孔２ｃを塞ぐように観察用透明基板１０を接着させるだけで観察用容器１を製造することができるため、観察用容器１を容易に製造することができる。

［観察方法］
上述した観察用容器１は、観察対象物を観察するために用いられるものである。以下、当該観察用容器１を用いて観察対象物としての細胞を観察する方法について説明する。図７は、本実施形態における観察方法を示す概略図である。

図７に示すように、本実施形態においては、観察用容器１内に観察対象物としての細胞７１を収容し、当該観察用容器１を倒立顕微鏡（図示せず）のステージ６１上に載置する。倒立顕微鏡のステージ６１には、所定の大きさの開口６２が形成されているため、この開口６２内に観察用容器１のナノ凹凸パターン１２が位置するように、観察用容器１を載置する。

観察用容器１内に観察対象物としての細胞７１を収容する方法としては、細胞７１を含む培養液７２の液滴を観察用容器１のナノ凹凸パターン１２上に滴下する方法等を例示することができる。

そして、倒立顕微鏡の対物レンズ６３を、観察用容器１の底部２ａに接着されている観察用透明基板１０の第２面１１ｂ側に近接させて、所望とする倍率で細胞７１を第２面１１ｂ側から観察する。

本実施形態における観察方法によれば、観察用容器１の底部２ａに取り付けられている観察用透明基板１０の厚みＴ₁₁が０．５ｍｍ以下であることで、ナノ凹凸パターン１２上に存在する観察対象物としての細胞７１と対物レンズ６３との間の距離を極めて短くして観察することができる。そのため、極めて高い倍率で観察対象物を観察することができる。また、観察対象物としての細胞７１をナノ凹凸パターン１２上に存在させると、当該細胞７１がナノ凹凸パターン１２に対して良好な接着性を示すため、長時間の観察も容易に行うことができる。

以上説明した実施形態は、本発明の理解を容易にするために記載されたものであって、本発明を限定するために記載されたものではない。したがって、上記実施形態に開示された各要素は、本発明の技術的範囲に属する全ての設計変更や均等物をも含む趣旨である。

上記実施形態において、観察用容器１は、観察用透明基板１０が容器本体２の底部２ａの外面に取り付けられてなるが、本発明はこのような態様に限定されるものではない。例えば、観察用透明基板１０の第２面１１ｂ側に接着剤を塗布し、容器本体２における底部２ａの貫通孔２ｃの外周縁の領域に当該観察用透明基板１０を接着し、観察用透明基板１０が容器本体２内に取り付けられてなるものであってもよい。

上記実施形態においては、観察用透明基板１０を、底部２ａに貫通孔２ｃが形成されてなる容器本体２の当該底部２ａに取り付けて用いる態様を例に挙げて説明したが、本発明はこのような態様に限定されるものではない。上記観察用透明基板１０は、そのまま観察対象物の観察用途に用いられてもよい。

上記実施形態においては、透明基材３１の第１面３１ａ側にナノ凹凸パターン１２を形成した後、ハードマスクパターン４４を除去してから金属含有膜５１を形成しているが、本発明はこのような態様に限定されるものではない。例えば、ハードマスクパターン４４を除去することなく、金属含有膜５１を形成してもよい。この場合、金属含有膜５１を剥離する工程（図４（Ｅ）参照）において、金属含有膜５１とともにハードマスクパターン４４を除去可能であるのが好ましいため、ハードマスクパターン４４と金属含有膜５１とは、同一のエッチング液にてエッチング可能な材料により構成されているのが好ましい。

上記実施形態においては、第１面３１ａ側に複数の観察用透明基板１０に相当する領域が割り付けられてなる多面付け透明基材３１を用いて観察用透明基板１０を製造する態様を例に挙げて説明したが、本発明はこのような態様に限定されるものではない。例えば、一の観察用透明基板１０に相当する大きさの透明基材を用いて、一の観察用透明基板１０を製造してもよい。このような態様によれば、研磨後の透明基材を切断する工程（図４（Ｄ）参照）を省略することができる。

以下、実施例等を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は下記の実施例等により何ら限定されるものではない。

〔実施例１〕
厚み６ｎｍの金属クロムからなるハードマスク層４１が第１面３１ａに設けられている透明基材３１（石英ガラス基板，サイズ：１５２ｍｍ×１５２ｍｍ，厚み：６．３５ｍｍ）を用意し、電子線感応型レジスト（製品名：ＳＥＢＰ−９０１２，信越化学工業社製）をハードマスク層４１上に塗布してレジスト膜４２（厚み：１００ｎｍ）を形成した。そして、当該レジスト膜４２上における複数の観察領域１３Ａ（１４ｍｍφに物理的に包含され得る大きさ）に相当する領域内のそれぞれに電子線描画装置（ＪＢＸ９０００，日本電子社製）を用いてピラー状のレジストパターン４３を形成した。

次に、レジストパターン４３をマスクとして用いてハードマスク層４１をドライエッチング（エッチングガス：Ｃｌ₂＋Ｏ₂）し、残存するレジストパターン４３を除去して、ハードマスクパターン４４を形成した。

上述のようにして形成されたハードマスクパターン４４をマスクとして用いて透明基材３１（石英ガラス基板）をエッチングし、ハードマスクパターン４４を剥離することで、透明基材３１（石英ガラス基板）の第１面３１ａに、ピラー状のナノ凹凸パターン１２（寸法：２００ｎｍ）を形成した。

続いて、第１面３１ａ側のピラー状のナノ凹凸パターン１２を被覆するようにして、当該第１面３１ａに金属含有膜５１としての金属クロム膜を厚み１００ｎｍで成膜し、当該金属含有膜５１上に電子線感応型レジスト（製品名：ＳＥＢＰ−９０１２，信越化学工業社製）をスピンコート法により塗布し、硬化させて、厚み３５０ｎｍの有機膜５２を形成した。

このようにして金属含有膜５１及び有機膜５２がこの順に形成された透明基材３１（石英ガラス基板）の有機膜５２上に接着性を有する有機材料を塗布し、ダイヤモンド砥石を有する研磨機（ティーエスシー社製，製品名：ＫＵＵＫＡＩ）の定盤に当該透明基材３１（石英ガラス基板）を固定し、第２面３１ｂ側から研磨（１次研磨）した。その後、ＣＭＰスラリー（ＡＧＣセイミケミカル社製，製品名：ルミノックス・ルミトップ）を用いたＣＭＰ処理により、さらに第２面１ｂ側から研磨（２次研磨）した。

研磨後の透明基材３１（石英ガラス基板）を、ダイヤモンドブレードを用いたダイシング装置により２０ｍｍ角に切断して個片化した。そして、硫酸で有機膜５２を洗浄した後、クロムエッチング液に浸漬させることで、金属含有膜５１を除去し、観察用透明基板１０を作製した。なお、作製した観察用透明基板１０の厚みを、マイクロメーターを用いて測定した結果、当該厚みは０．１７ｍｍであった。

このようにして作製した観察用透明基板１０を、底部２ａの中央に貫通孔２ｃが形成されてなる容器本体２としての穴あきディッシュ（松浪硝子工業社製，製品名：３５ｍｍφガラスボトムディッシュ）の底部２ａに、貫通孔２ｃを塞ぐように、接着剤（信越シリコーン社製，一液型ＲＴＶゴム）を介して取り付けて、観察用容器１を製造した。

〔実施例２〕
ナノ凹凸パターン１２に対応する微細凹凸パターンを有するインプリントモールドを準備し、ナノインプリント装置（東芝機械社製，ＳＴ５０）を用いたナノインプリントリソグラフィー法により、透明基材３１（石英ガラス基板）の第１面３１ａにナノ凹凸パターン１２を形成した以外は、実施例１と同様にして観察用透明基板１０（厚み：０．１７ｍｍ）を作製し、観察用容器１を製造した。

〔参考例１〕
実施例１と同様にして透明基材３１の第１面３１ａにナノ凹凸パターン１２を形成し、ナノ凹凸パターン１２が形成された第１面３１ａ上に金属含有膜５１及び有機膜５２を形成せずに、透明基材３１の第２面３１ｂ側から研磨したところ、透明基材３１の厚みが０．５ｍｍ以下になる前に、当該透明基材３１が破損してしまった。

〔参考例２〕
実施例１と同様にして透明基材３１の第１面３１ａにナノ凹凸パターン１２を形成し、ナノ凹凸パターン１２が形成された第１面３１ａ上に金属含有膜５１を形成せず、有機膜５２のみを形成して、透明基材３１の第２面３１ｂ側から研磨したところ、透明基材３１の厚みが０．５ｍｍ以下になる前に、当該透明基材３１が破損してしまった。

〔参考例３〕
有機膜５２を形成しなかった以外は、実施例１と同様にして観察用透明基板を作製した。当該観察用透明基板のナノ凹凸パターン１２上を、電子顕微鏡を用いて観察したところ、研磨処理時に生じたと考えられる微細なパーティクルがナノ凹凸パターン１２上に付着していることが確認された。

〔試験例１〕
実施例１の観察用容器１のナノ凹凸パターン１２上に、口腔上皮細胞７１を含む培養液７２を滴下し、倒立顕微鏡（ニコン社製，製品名：ＥＣＬＩＰＳＥ Ｔｉ）を用い、倍率５０倍で当該細胞を観察した。その結果、細胞と、細胞を構成する細胞構成要素とを明瞭に観察することができた。また、ナノ凹凸パターン１２上に細胞が接着しているのを確認することができた。

上記試験例１から、底部２ａに貫通孔２ｃが形成されてなる容器本体２の当該貫通孔２ｃを塞ぐようにして、極めて薄い観察用透明基板１が当該底部２ａに取り付けられている観察用容器１を用いることで、観察対象物である細胞を、倒立顕微鏡を用いて極めて高倍率で観察可能であることが明らかとなった。

本発明は、創薬開発、再生医療等のバイオテクノロジー関連分野における細胞の観察等において有用である。

１…観察用容器
２…容器本体
２ａ…底部
２ｂ…周壁部
２ｃ…貫通孔
１０…観察用透明基板
１１…基部
１１ａ…第１面
１１ｂ…第２面
１２…ナノ凹凸パターン
１３Ａ…観察領域

Claims (18)

1. 所定の観察領域を含む第１面及び当該第１面に対向する第２面を有する基部を備え、前記第１面上の前記観察領域内の観察対象物を前記第２面側から観察するために用いられる観察用透明基板であって、
   前記基部の前記第１面側には、前記観察領域内にナノ凹凸パターンが形成されており、
   前記基部の厚みが０．５ｍｍ以下であることを特徴とする観察用透明基板。
2. 前記ナノ凹凸パターンの寸法が、１００〜５００ｎｍであることを特徴とする請求項１に記載の観察用透明基板。
3. 前記観察対象物が、細胞又は前記細胞を構成する細胞構成要素であることを特徴とする請求項１又は２に記載の観察用透明基板。
4. 貫通孔が形成されてなる底部及び前記底部の外周縁に連続する周壁部を有する容器本体と、
   前記底部に取り付けられてなる請求項１〜３のいずれかに記載の観察用透明基板と
   を備え、
   前記容器本体の平面視において前記観察用透明基板の前記ナノ凹凸パターンが前記貫通孔に重なるように、かつ前記容器本体内に位置するようにして、前記観察用透明基板が前記底部に取り付けられており、
   前記貫通孔は、前記観察用透明基板により塞がれていることを特徴とする観察用容器。
5. 前記観察用透明基板は、前記容器本体の平面視において前記ナノ凹凸パターンが前記貫通孔に物理的に包含されるようにして、前記底部に取り付けられてなることを特徴とする請求項４に記載の観察用容器。
6. 前記観察用透明基板が、前記貫通孔から前記ナノ凹凸パターンを露出させるようにして、前記容器本体の前記底部の外面に取り付けられていることを特徴とする請求項４又は５に記載の観察用容器。
7. 前記観察用透明基板が、接着剤を介して前記底部に取り付けられていることを特徴とする請求項４〜６のいずれかに記載の観察用容器。
8. 第１面及び当該第１面に対向する第２面を有し、前記第１面側にナノ凹凸パターンが形成されてなる透明基材を準備する工程と、
   前記第１面側の前記ナノ凹凸パターンを被覆する金属含有膜を形成する工程と、
   前記金属含有膜上に有機膜を形成する工程と、
   前記有機膜が形成された前記透明基材を前記第２面側から研磨する工程と
   を含み、
   前記第２面側から研磨された後の前記透明基材の厚みが０．５ｍｍ以下であることを特徴とする研磨方法。
9. 前記ナノ凹凸パターンの寸法が１００〜５００ｎｍであることを特徴とする請求項８に記載の研磨方法。
10. 前記金属含有膜の厚みが５０ｎｍ以上であることを特徴とする請求項８又は９に記載の研磨方法。
11. 前記透明基材は、前記ナノ凹凸パターンの形成されている領域が複数割り付けられていることを特徴とする請求項８〜１０のいずれかに記載の研磨方法。
12. 貫通孔が形成されてなる底部及び前記底部の外周縁に連続する周壁部を有する容器本体と、第１面及び当該第１面に対向する第２面を有し、前記第１面上の観察対象物を前記第２面側から観察するために用いられる観察用透明基板とを備え、前記観察用透明基板が前記底部に取り付けられている観察用容器を製造する方法であって、
    第１面及び当該第１面に対向する第２面を有し、当該第１面側にナノ凹凸パターンが形成されてなる透明基材を、当該第２面側から研磨することで作製された前記観察用透明基板を、前記容器本体の平面視において前記観察用透明基板の前記ナノ凹凸パターンが前記貫通孔に重なるようにして前記容器本体内に位置し、かつ前記貫通孔を塞ぐように前記容器本体の底面に取り付ける工程を含み、
    前記観察用透明基板は、請求項８〜１１のいずれかに記載の研磨方法により前記透明基材を研磨して作製されたものであることを特徴とする観察用容器の製造方法。
13. 前記容器本体の平面視において前記ナノ凹凸パターンが前記貫通孔に物理的に包含されるようにして、前記容器本体の前記底部に前記観察用透明基板を取り付けることを特徴とする請求項１２に記載の観察用容器の製造方法。
14. 前記貫通孔から前記ナノ凹凸パターンを露出させるようにして、前記容器本体の前記底部の外面に前記観察用透明基板を取り付けることを特徴とする請求項１２又は１３に記載の観察用容器の製造方法。
15. 前記観察用透明基板を、接着剤を介して前記底部に取り付けることを特徴とする請求項１２〜１４のいずれかに記載の観察用容器の製造方法。
16. 前記観察対象物が、細胞又は前記細胞を構成する細胞構成要素であることを特徴とする請求項１２〜１５のいずれかに記載の観察用容器の製造方法。
17. 請求項４〜７のいずれかに記載の観察用容器内に観察対象物を収容し、
    前記ナノ凹凸パターン上の前記観察対象物を、前記観察用透明基板の前記第２面側から観察することを特徴とする観察方法。
18. 倒立顕微鏡を用いて前記観察対象物を観察することを特徴とする請求項１７に記載の観察方法。

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