JP7045447B2 - 顕微鏡用スライドの製造方法、観察方法及び分析方法 - Google Patents

Description

本発明は、顕微鏡用スライド、顕微鏡用スライドの製造方法、観察方法及び分析方法に関する。

スライドガラスと標本切片が剥離しにくいように、従来、スライドガラスにはシランコーティングがなされている。特許文献１には、スライドガラスのフロスト部を除く透明部に、標本切片位置決めマークを印して、この標本切片位置決めマークを基準に標本切片をスライドガラスに載置する技術が開示されている。また、特許文献１には、スライドガラスにはシランコーティングがなされているため、標本切片が剥離しにくいことが示されている。

非特許文献１には、反応性イオンエッチングを施すことで、サブミクロンサイズのポリスチレン粒子の表面に１０ナノスケールのランダムな凹凸の構造が導入されることが開示されている。

特開平１０－３３３０５１号公報

Ｔｏｒｕ Ｆｕｊｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，"Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｐｈｏｔｏｎｉｃ ｂａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｌａｙｅｒｓ ｂｙ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｉｏｎ ｅｔｃｈｉｎｇ"、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ、２００１年３月、第７８巻１１号、１４７８－１４８０頁

切片の顕微鏡用スライドからの剥離を防ぐために、従来から用いられている材料以外の材料を用いることは、仮に接着性が向上したとしても、染色などの工程への影響を排除しなければならず、好まれない。

本発明の目的は、追加の材料を適用することなく、切片の剥離を抑制する技術を提供することにある。

発明者は、非特許文献１に示されたポリスチレン粒子表面に導入された凹凸と同様の構造を顕微鏡用スライドの表面に導入することで、切片の接着性が高められることを期待して試み、良好な接着性を得ることに成功した。

本発明では、基板の表面の少なくとも一部の領域を、反応性イオンでエッチングすることで、上述の課題を解決する。

本発明により、切片の剥離を抑制する技術を提供することができる。

本発明の実施例である顕微鏡用スライドの製造方法のフロー図である。 本発明の第１の実施例で準備するスライドガラスを説明するための図である。 本発明の実施例で使用する反応性イオンエッチング装置を説明するための図である。 本発明の第１の実施例の顕微鏡用スライドを説明するための図である。 本発明の第１の実施例の顕微鏡用スライドの使用状態を説明するための図である。 本発明の実施例である顕微鏡用スライドの製造方法のフロー図である。 本発明の第２の実施例で準備するスライドガラスを説明するための図である。 本発明の第２の実施例の顕微鏡用スライドの製造工程を説明するための図である。 本発明の第２の実施例の顕微鏡用スライドを説明するための図である。 本発明の第２の実施例の顕微鏡用スライドの使用状態を説明するための図である。 本発明の第２の実施例の顕微鏡用スライドの使用状態を説明するための図である。 本発明の第３の実施例で準備するスライドガラスを説明するための図である。 本発明の第３の実施例の顕微鏡用スライドの製造工程を説明するための図である。 本発明の第３の実施例の顕微鏡用スライドを説明するための図である。 本発明の第３の実施例の顕微鏡用スライドの使用状態を説明するための図である。 本発明の第３の実施例の顕微鏡用スライドの使用状態を説明するための図である。 本発明の第４の実施例で準備する基板を説明するための図である。 本発明の第４の実施例で準備する基板の変形例を説明するための図である。 本発明の観察システムの実施例を示す図である。 本発明の顕微鏡用スライドの実施例の表面の原子間力顕微鏡像である。 本発明の顕微鏡用スライドの実施例の表面の原子間力顕微鏡像の凸部に三角印を入れた図である。 本発明の実施例の反応性イオンエッチングの処理を施す前のスライドガラスの表面の原子間力顕微鏡像である。 本発明の第６の実施例で準備するスライドガラスを説明するための図である。 本発明の第６の実施例の顕微鏡用スライドの製造工程を説明するための図である。 本発明の第６の実施例の顕微鏡用スライドを説明するための図である。 本発明の第６の実施例の顕微鏡用スライドの使用状態を説明するための図である。 本発明の第７の実施例で準備する基板を説明するための図である。 本発明の第７の実施例の顕微鏡用スライドの製造工程を説明するための図である。 本発明の第７の実施例の顕微鏡用スライドを説明するための図である。 本発明の第７の実施例の顕微鏡用スライドの使用状態を説明するための図である。 本発明の第７の実施例の顕微鏡用スライドの変形例の使用状態を説明するための図である。 本発明の第７の実施例の顕微鏡用スライドの変形例の使用状態を説明するための図である。 本発明の第６の実施例の顕微鏡用スライドの変形例を説明するための図である。 本発明の顕微鏡用スライドの表面に導入される凹凸の例を示す模式図である。 図３１（ａ）の一点鎖線の箇所での断面の模式図である。 本発明の第１の実施例の顕微鏡用スライドの製造方法の変形例を示す図である。

以下の実施の形態において、便宜上その必要があるときは、複数のセクションまたは実施の形態に分割して説明するが、特に明示した場合を除き、それらはお互いに無関係なものではなく、一方は他方の一部または全部の変形例、詳細、補足説明等の関係にある。

また、以下の実施の形態で用いる図面においては、平面図であっても図面を見易くするためにハッチングを付す場合もある。また、以下の実施の形態を説明するための全図において、同一機能を有するものは原則として同一の符号を付し、その繰り返しの説明は省略する。以下、本発明の実施の形態を図面に基づいて詳細に説明する。

図１は、本発明の第１の実施例である顕微鏡用スライドの製造方法のフロー図である。本実施例では、基板として、図２に示したスライドガラス２０１を準備する。スライドガラス２０１は、二酸化珪素を主成分とする。スライドガラス２０１は、長さが７６ｍｍ、幅が２６ｍｍ、厚さが１ｍｍのサイズである。スライドガラス２０１は、片面にフロスト部２０２を有する。フロスト部２０２は、樹脂製フロストが印刷されたものであり、例えばカラーウレタン印刷で着色剤とフロスト剤とを含む樹脂膜として形成されたものである。フロスト部２０２は、着色剤で着色されており、例えばピンクの着色である。スライドガラス２０１は、フロスト部２０２を除いて透明である。

図３に、本実施例で使用される平行平板型のドライエッチング装置である、反応性イオンエッチング（ＲＩＥ）装置３０１の模式図を示す。ＲＩＥ装置３０１は、チャンバ３０２内を高真空に排気した後に、エッチングガスを導入し、チャンバ３０２内にある上部電極３０３ａと下部電極３０３ｂとで構成される並行平板間に高周波電力を印加してプラズマを発生させ、下部電極３０３ｂ上にある対象物をドライエッチングする。

図１のステップＳ１０１では、基板として準備したスライドガラス２０１を、ＲＩＥ装置３０１のチャンバ３０２内に置く。具体的には、スライドガラス２０１は、フロスト部２０２が無い側が下部電極３０３ｂに向き合うように置かれる。これにより、フロスト部２０２のある側が、ドライエッチングされる。図３では説明の分かり易さのために、スライドガラス２０１が１枚だけ、チャンバ３０２内に置かれているが、複数のスライドガラス２０１をチャンバ３０２内に置くことができる。

次に、ステップＳ１０２では、スライドガラス２０１の主成分である二酸化珪素を反応性イオンでエッチングするために、ＲＩＥ装置３０１のチャンバ３０２内にエッチングガスとしてＣＨＦ_３ガスを導入し、上部電極３０３ａと下部電極３０３ｂの間に高周波電力を印加してプラズマを発生させ、スライドガラス２０１の表面を反応性イオンでエッチングする。反応性イオンエッチングの条件は、例えば、０．６Ｗ／ｃｍ^２、１３Ｐａでエッチング時間を１分間とすることができる。また、反応性イオンエッチングによりスライドガラス２０１の表面に表面の荒れとして導入される凹凸の形状は、反応性イオンエッチングの条件によって制御することができる。例えば、上述のＣＨＦ_３ガスを導入した例で、エッチング時間を長くすることで、表面の荒れを大きくして、凹凸を大きくすることができ、逆にエッチング時間を短くすることで、表面の荒れを小さくして、凹凸を小さくすることができる。この際に、反応性イオンエッチングによりスライドガラス２０１の表面に表面の荒れとして導入される凹凸が可視光の波長よりも十分に小さくなるように、二酸化珪素を可視光の波長よりも短い０．４μｍ未満の平均的な深さでエッチングする条件にすることが望ましく、例えば、エッチング前のスライドガラス２０１の表面の位置からの平均的な深さとして０．１μｍほど深さ方向にエッチングする条件にすることができる。反応性イオンエッチングによりスライドガラス２０１の表面に表面の荒れとして導入される凹凸が可視光の波長よりも十分に小さくなるようにすることで、少なくとも通常の光学顕微鏡観察の際に影響しないレベルの凹凸にすることができる。走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）などの高い分解能を有する装置での観察に用いる場合には、表面の荒れを小さくして、導入される凹凸を小さくするほうが望ましい。ここで本実施例の顕微鏡用スライドの製造方法では、切片の観察に用いられる顕微鏡の空間分解能に応じて、ステップＳ１０２の反応性イオンエッチングの条件を変更することで、導入される凹凸の大きさを変えることができる。例えば、切片の観察に用いられる顕微鏡の空間分解能が高いほど、ステップＳ１０２の反応性イオンエッチングのエッチング時間を短くすることで、表面の荒れを小さくして、導入される凹凸を小さくする。導入するガス種、圧力、または反応性イオンエッチング装置の出力によっても、表面の荒れとして導入される凹凸の形状を制御することができる。

次に、ステップＳ１０３では、スライドガラス２０１の表面に残った残留物を取り除くために、ＲＩＥ装置３０１のチャンバ３０２内に酸素ガスを導入し、上部電極３０３ａと下部電極３０３ｂの間に高周波電力を印加してプラズマを発生させ、ステップＳ１０２でエッチングしたスライドガラス２０１の表面をアッシングする。ステップＳ１０３のアッシングの条件は、例えば、酸素ガスを導入し、０．５Ｗ／ｃｍ^２、４０Ｐａ、アッシングの時間を１０分間にすることができる。

以上で、本実施例の顕微鏡用スライドであるスライドガラスを製造することができる。図４に、本実施例で製造されたスライドガラス４０１を示す。本実施例で製造されたスライドガラス４０１では、反応性イオンでエッチングされた結果、フロスト部４０２がある側の表面４０３に可視光の波長よりも十分に細かい凹凸が導入されている。図１９（ａ）に、本実施例の反応性イオンエッチングの処理を施したスライドガラスの表面の１．５５６×１．５５６μｍ^２の領域の原子間力顕微鏡像を示す。図１９（ａ）から、可視光の波長よりも十分に細かい凹凸が表面に導入されているのが見て取れる。また、図１９（ａ）から、導入される凹凸の表面形状は、凸部が充填された凹凸の表面形状と分かる。ステップＳ１０２の反応性イオンエッチングの際に、スライドガラス２０１の表面では、隣り合う凸部と凸部の間の領域でエッチングが凸部よりも進行するために、隣り合う凸部と凸部の間に溝が形成され、形成される溝が各凸部の周囲の凹みになり、スライドガラス４０１の表面４０３には、凸部が充填された凹凸の表面形状が導入されると考えられる。図１９（ｂ）に、図１９（ａ）の原子間力顕微鏡像に対して、導入された細かい凹凸の凸部と見られる位置に三角印を重ねた像を示す。図１９（ｂ）に三角印をした凸部は、１．５５６×１．５５６μｍ^２の領域に１５１個存在する。

図３１（ａ）に、本実施例で顕微鏡用スライドの表面に導入される凹凸の模式図３１０１を示す。模式図３１０１に示したように、本実施例の顕微鏡用スライドの表面には、三角印で示した凸部３１０２ａ～ｉの各々を囲むように、実線で強調して示した溝３１０３が形成される。図３１（ａ）の一点鎖線の内のＡ－Ａ’間の箇所での断面の模式図を図３１（ｂ）に示す。図３１（ｂ）に示すように、隣り合う凸部３１０２ｄと凸部３１０２ｅの間、および隣り合う凸部３１０２ｅと凸部３１０２ｆの間、のそれぞれに溝３１０３があり、溝３１０３が凹みを形成する。したがって、本実施例で顕微鏡用スライドの表面に導入される凹凸の表面形状は、凸部が充填された凹凸の表面形状になる。

このように、本実施例の反応性イオンエッチングによる処理によって、凸部が充填している凹凸の表面形状を得ることができる。導入される凸部の密度は、平面視で１μｍ^２当たり２５個よりも高いことが望ましい。可視光が０．４μｍ以上の波長の光として、光学顕微鏡の分解能の限界は約０．２μｍである。光学顕微鏡の分解能の限界では、仮に凸部が平面視で縦０．２μｍで横も０．２μｍの大きさであったとすると、１μｍ^２の中に２５個の凸部が入ることになる。したがって、平面視で１μｍ^２当たり２５個よりも高い密度で凸部を形成することで、光学顕微鏡の分解能の限界を超えるために、導入された凹凸の表面形状が光学顕微鏡での観察に影響を与えることを著しく抑えることができる。図３１（ａ）に示した溝３１０３で説明すると、溝３１０３で囲まれた凸部を含む領域の平面視での面積の平均を０．０４μｍ^２よりも小さくすることで、光学顕微鏡の分解能の限界を超えるために、導入された凹凸の表面形状が光学顕微鏡での観察に影響を与えることを著しく抑えることができる。例えば、溝３１０３で囲まれた凸部を含む領域の平面視での面積の平均を、０．００００１μｍ^２から０．０３μｍ^２の範囲で、上述のエッチング条件により調整する。また、図３１（ｂ）に示した断面の方向についても、溝３１０３の平均的な深さに対応する凹凸の平均の厚さ３１０５の光学膜厚が、可視光が０．４μｍ以上の波長の光として、０．４μｍの４分の１よりも薄くなるようにすることで、光の干渉効果の影響が抑えられ、導入された凹凸が光学顕微鏡での観察に影響を与えることを著しく抑えることができる。したがって、凹凸の平均の厚さ３１０５は、平均屈折率を１．４として、０．０７μｍ以下が望ましい。例えば、凹凸の平均の厚さ３１０５を、０．０１μｍから０．０７μｍの範囲で、ステップＳ１０２のエッチング条件の内の例えばエッチング時間により調整する。図１９（ｃ）に、本実施例の反応性イオンエッチングによる処理を施す前のスライドガラス表面の１．５５６×１．５５６μｍ^２の領域の原子間力顕微鏡像を示す。本実施例の反応性イオンエッチングによる処理を施す前のスライドガラスの表面は平坦であるために、図１９（ｃ）には、図１９（ａ）で見られた凸部が充填された凹凸の表面形状は見られない。

反応性イオンでエッチングされた表面４０３は、水に対する接触角が１０度程度または１０度よりも小さい角度の高い親水性を示す。表面４０３が高い親水性を示すことで、図５のようにパラフィン５０１で包埋されている組織切片５０２を反応性イオンでエッチングされた表面４０３に載置することが容易になる。フロスト部４０２は、製造のため準備したスライドガラス２０１のフロスト部２０２よりも、上述の反応性イオンエッチング処理の結果、着色が薄くなる。フロスト部４０２の着色が薄くなることで、上述の反応性イオンエッチングの処理がなされた顕微鏡用スライドであることを識別することができる。特に、ステップＳ１０３のアッシングは、フロスト部２０２の着色剤の脱色に効果があると考えられる。また、本実施例の反応性イオンエッチングの処理の結果、着色が薄くなるのはフロスト部４０２の表面であるため、フロスト部４０２を裏面から観た場合には、フロスト部４０２は、製造のため準備したスライドガラス２０１のフロスト部２０２の着色を保っている。すなわち、フロスト部４０２が形成されている面とは反対側から見た場合のフロスト部４０２の着色よりも、フロスト部４０２が形成されている面の側から観た場合のフロスト部４０２の着色が薄い。したがって、フロスト部４０２を両面から見た比較から、本実施例の反応性イオンエッチングの処理がなされた顕微鏡用スライドであることをより明確に識別することができる。

本実施例の方法で製造されたスライドガラスと、アミノシランでコートされたスライドガラスとで、マウスの肝臓のパラフィン包埋切片の接着性を比較したところ、本実施例の方法で製造されたスライドガラスでは、アミノシランでコートされたスライドガラスと同様に切片の剥離を防ぐことができた。剥離の防止の効果は、脱パラフィン、親水化、ＨＥ染色、脱水、および封入の工程を施すことで行われた。また、アミノシランでコートされたスライドガラスの水に対する接触角は２５～６０度程度になる。したがって、アミノシランでコートされたスライドガラスでは、疎水性のために伸展の際に切片の周囲のパラフィン５０１のところに水がなくなり、切片にしわが入りやすいのに対し、本実施例の製造方法による顕微鏡用スライドでは、高い親水性を有するために、切片の周囲のパラフィン５０１の周りに水を保持できるので伸展をし易く、切片にしわが寄りにくい。このように、本実施例の顕微鏡用スライドは、切片の貼り付けに適している。さらに、本実施例の製造方法では、基板として準備したスライドガラスの表面をエッチングしているので、接着性や親水性の向上のために、追加の材料を要しない。

本実施例では、二酸化珪素の基板としてスライドガラス２０１を準備したが、スライドガラス２０１の代わりに石英ガラス基板やカバーガラスなどを準備することができる。例えば、スライドガラス２０１の代わりに、長さおよび幅が１８ｍｍで厚さが０．１５ｍｍのカバーガラスを準備する基板として用いることができる。このように、スライドガラス２０１の代わりに、長さ７６ｍｍ以内、幅２６ｍｍ以内、および厚さ１ｍｍ以内の大きさの基板を本実施例の顕微鏡用スライドの製造に用いた場合、一般的なスライドガラスの大きさである長さ７６ｍｍ、幅２６ｍｍ、厚さが１ｍｍのホルダに製造した顕微鏡用スライドを搭載することで、載置した切片の観察を容易にすることができる。

また、ステップＳ１０１で基板として二酸化珪素のガラスウェハを下部電極３０３ｂ上に置いて、上述のステップＳ１０２およびステップＳ１０３のＲＩＥ装置３０１による処理を施した後に、処理を施したウェハをダイシングソーで切削してチップを切り出すことにより、所望の大きさのチップで顕微鏡用スライドを得ることができる。これにより、より大量生産に向いた顕微鏡用スライドを得ることができる。図３２に、例として、ウェハの模式図を示す。上述のステップＳ１０２およびステップＳ１０３のＲＩＥ装置３０１による処理を施したガラスウェハ３２０１は、縦横のスクライブライン３２０２に沿ってダイシングソーで切削される。顕微鏡用スライドとなる切削により切り出された各チップ３２０３は、上述のステップＳ１０２およびステップＳ１０３のＲＩＥ装置３０１による処理を施した面に、上述の樹脂製のフロスト部３２０４を有している。フロスト部３２０４は、準備するウェハに予めウレタン印刷などでスクライブライン３２０２に沿って樹脂膜を片面に印刷しておき、印刷した面とは反対側の面が下部電極３０３ｂに向き合うようにステップＳ１０１でウェハを置くことで形成することができる。または、ステップＳ１０３の後に、ウレタン印刷などでスクライブライン３２０２に沿って樹脂膜を印刷した後に、ダイシングソーで切削して各チップ３２０３を切り出して、フロスト部３２０４を得ることもできる。または、ダイシングソーで切削して各チップ３２０３を切り出した後に、ウレタン印刷などで各チップ３２０３に樹脂膜を形成し、フロスト部３２０４を形成することもできる。各チップ３２０３の一辺の長さ、例えば長辺の長さを２６ｍｍとすることで、一般的なスライドガラス用の染色瓶等を用いることが出来、作業性を向上させることができる。また、顕微鏡用スライドとなる各チップ３２０３の大きさを、長さ７６ｍｍ以内、幅２６ｍｍ以内、および厚さ１ｍｍ以内とすることで、一般的なスライドガラスの大きさである長さ７６ｍｍ、幅２６ｍｍ、厚さが１ｍｍのホルダに製造した顕微鏡用スライドを搭載して、載置した切片の観察を容易にすることができる。

本実施例では、動物組織のパラフィン包埋切片の貼り付けの例を示したが、本実施例の顕微鏡用スライドは、植物試料であるエンドウの凍結切片でも、良好な接着性が得られた。酵母や幹細胞などの細胞の基板表面への付着や、樹脂包埋切片の顕微鏡用スライドへの貼り付けに対しても、本発明を適用することができる。

本実施例では、ステップＳ１０２で、ＲＩＥ装置３０１のチャンバ３０２内に、スライドガラス２０１の主成分である二酸化珪素を反応性イオンでエッチングするためにＣＨＦ_３ガスを導入したが、他の弗素系のガスを導入することもできる。例えば、フロロカーボンのＣＦ_４にＨ_２を混合したガスをＣＨＦ_３ガスの代わりに用いることができる。エッチングガスには、他に、Ｃ_２Ｆ_６、Ｃ_３Ｆ_８、Ｃ_４Ｆ_８、Ｃ_５Ｆ_８などのフロロカーボンを用いることができる。また、本実施例では、ＲＩＥ装置を使用しているが、他のドライエッチング装置を用いることもできる。

本実施例では、フロスト部２０２として、カラーウレタン印刷によるものを示したが、フロスト調が必要ではない場合には、カラーウレタン印刷の際にフロスト剤を含めないで着色剤を含んだ樹脂を印刷することもできる。また、フロスト部２０２を、ガラスを削って粗面化することで得た場合には、反応性イオンエッチングによる着色の変化は見ることができないが、フロスト部がある側に対して本実施例の反応性イオンエッチングの処理を行うことで、本実施例の反応性イオンエッチングの処理を施した面を特定することができる。

図６から図１１を用いて、本発明の第２の実施例を説明する。本実施例は、上述の第１の実施例とは、基板としてシランコートされたスライドガラスを準備する点と、反応性イオンエッチングを施す領域を制限している点と、複数の装置で観察または分析する際に用いられる位置合わせのマーカを形成している点が異なる。ここで、複数の装置の組合せは、例えば、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）と蛍光顕微鏡（ＦＯＭ）の組合せや、ＳＥＭと共焦点レーザ顕微鏡（ＣＬＭ）の組合せである。これらの組合せにより、例えば、荷電粒子線装置であるＳＥＭで高精細に形態観察した像と、光学顕微鏡であるＦＯＭまたはＣＬＭで蛍光観察した像と、を重ね合わせて、観察または分析をすることができる。

図６は、本発明の実施例である顕微鏡用スライドの製造方法のフロー図である。図６のステップＳ６０１では、図７に示したスライドガラス７０１を準備し、ＲＩＥ装置３０１のチャンバ３０２内に置く。具体的には、第１の実施例と同様に、スライドガラス７０１は、フロスト部７０２が無い側が下部電極３０３ｂに向き合うように置かれる。これにより、フロスト部７０２のある側が、ドライエッチングされる。ここで、スライドガラス７０１は、二酸化珪素を主成分とする。

スライドガラス７０１の表面は、シランコートされている。本実施例では、スライドガラス７０１の表面は、アミノ基を有するシランカップリング剤の３－アミノプロピルトリメトキシシランでコートされている。スライドガラス７０１は、第１の実施例と同様に、片面にフロスト部７０２を有する。また、フロスト部７０２は着色されている。フロスト部７０２の着色は、例えばピンクの着色である。

また、スライドガラス７０１のフロスト部７０２が設けられている側の表面には、位置合わせマーカ７０３－１および位置合わせマーカ７０３－２が設けられている。位置合わせマーカ７０３－１および位置合わせマーカ７０３－２のそれぞれには、マーカを特定するための“１”、“２”の数字が付して設けられている。位置合わせマーカ７０３－１および位置合わせマーカ７０３－２は、スライドガラス７０１のフロスト部７０２が設けられている側の表面に、例えば、レーザマーキング、集束イオンビーム（ＦＩＢ）によるエッチング、またはＦＩＢによる材料の堆積により設けることができる。また、例えば、位置合わせマーカ７０３－１および位置合わせマーカ７０３－２は、フロスト部７０２をカラーウレタンなどの樹脂で印刷する際に併せて樹脂を印刷することで形成することができる。または、位置合わせマーカ７０３－１および位置合わせマーカ７０３－２を蛍光材料を用いて形成することで、蛍光観察の像での位置合わせに適するようにすることもできる。

さらに、図８に示したように、フロスト部７０２の一部、位置合わせマーカ７０３－１、および位置合わせマーカ７０３－２を覆うように、スライドガラス７０１上にマスク部材８０１を配置する。マスク部材８０１で準備した基板であるスライドガラス７０１の表面の一部を覆うことで、第１の実施例で述べた凹凸の表面形状が導入される領域を制限する。マスク部材８０１は、例えば、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）の板で形成することができる。または、マスク部材８０１を、透明なシリコーンゴムであるポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）のシートで形成することができる。ＰＤＭＳのシートでマスク部材８０１を形成することで、ＰＤＭＳシートの自己吸着作用により、スライドガラス７０１とマスク部材８０１とを固定する治具が不要となる。また、ＰＤＭＳのシートは容易にカットすることができるので、任意の形のマスク部材８０１を容易に形成することができる。

次に、ステップＳ６０２では、スライドガラス７０１のマスク部材８０１で覆われていない部分のシランコートを除去するために、ＲＩＥ装置３０１のチャンバ３０２内に、酸素ガスを導入し、上部電極３０３ａと下部電極３０３ｂの間に高周波電力を印加してプラズマを発生させ、スライドガラス７０１表面のマスク部材８０１で覆われていない部分をアッシングする。ステップＳ６０２のアッシングの条件は、例えば、酸素ガスを導入し、０．５Ｗ／ｃｍ^２、４０Ｐａ、アッシングの時間を１０分間にすることができる。

続くステップＳ６０３では、第１の実施例と同様に、エッチングガスとしてＣＨＦ_３ガスを導入し、上部電極３０３ａと下部電極３０３ｂの間にプラズマを発生させ、スライドガラス７０１表面のマスク部材８０１で覆われていない部分を反応性イオンでエッチングする。

次に、ステップＳ６０４では、第１の実施例と同様に、ＲＩＥ装置３０１のチャンバ３０２内に、スライドガラス７０１の表面に残った残留物を取り除くために酸素ガスを導入し、上部電極３０３ａと下部電極３０３ｂの間にプラズマを発生させ、ステップＳ６０３でエッチングしたスライドガラス７０１の表面をアッシングする。ステップＳ６０４の処理の後に、マスク部材８０１を顕微鏡用スライドから取り除く。

以上で、本実施例の顕微鏡用スライドであるスライドガラスを製造することができる。図９に、本実施例で製造されたスライドガラス９０１を示す。本実施例により製造されたスライドガラス９０１は、マスク部材８０１に覆われなかった表面の領域９０３ａには、反応性イオンでエッチングされた結果、第１の実施例と同様に凹凸が導入される。第１の実施例と同様に、反応性イオンでエッチングされた領域９０３ａは、水に対する接触角が１０度程度または１０度よりも小さい角度の高い親水性を示す。それに対して、マスク部材８０１に覆われた表面の領域９０３ｂは、３－アミノプロピルトリメトキシシランによるシランコートが維持されているために、水に対する接触角が領域９０３ａの水に対する接触角よりも大きい。本実施例の顕微鏡用スライドであるスライドガラス９０１は、シランコートが維持され、疎水性を示す領域９０３ｂと、ドライエッチングされ、親水性を示す領域９０３ａとの間に水に対する濡れ性の境界９０４を有する。一様に処理を施すことが容易なウェットプロセスであるシランコーティングで、基板の表面全体を処理した後に、マスクプロセスによる所望の領域への処理が容易なドライエッチングプロセスで切片を載置する領域を形成することで、再現性良く本実施例の顕微鏡用スライドを製造することができる。

マスク部材８０１に覆われなかったフロスト部９０２ａは、製造のため準備したスライドガラス７０１のフロスト部７０２よりも、上述の反応性イオンによる処理の結果、第１の実施例と同様に着色が薄くなる。フロスト部９０２ａの着色が薄くなることで、上述の反応性イオンエッチングの処理がなされたスライドガラスであることを識別することができる。また、マスク部材８０１に覆われていたフロスト部９０２ｂは、元々の着色を保っているので、フロスト部９０２ａとは目視で識別できる。このように、着色されたフロスト部の一部をマスクすることで、上述の反応性イオンエッチングの処理がなされた顕微鏡用スライドであることをより容易に識別することができる。

図１０に、水面１００１に浮かべた切片１００２をスライドガラス９０１に載置する様子を示した。図９の境界９０４に相当する位置を破線の矢印１００３で示した。水面１００１は、領域９０３ａの高い親水性と、領域９０３ａとシランコートが維持された領域９０３ｂの親水性の差により、表面張力で矢印１００３の位置まで上昇する。これにより、矢印１００３の位置が切片１００２を矢印１００５の方向に寄せる際の目標になり、作業者の技量に寄らず、図１１に示したように、パラフィン１１０１で包埋されている組織切片１００２を再現性良くスライドガラス９０１の所望の位置に載置することができる。また、本実施例では、さらに境界９０４に沿って領域９０３ｂ上に位置合わせマーカ７０３－１および位置合わせマーカ７０３－２が形成されているので、位置合わせマーカ７０３－１および位置合わせマーカ７０３－２を用いて、異なる顕微鏡観察の間での観察領域の位置合わせが可能であり、例えば、光学顕微鏡である透過型顕微鏡、落射型顕微鏡、または位相差顕微鏡で形態観察した像や、荷電粒子線装置であるＳＥＭで高精細に形態観察した像と、光学顕微鏡であるＦＯＭまたはＣＬＭで蛍光観察した像と、を容易に重ね合わせて、観察または分析をすることができる。

本実施例では、準備したスライドガラス７０１のシランコーティングには、３－アミノプロピルトリメトキシシランを用いる例を示したが、例えば、シランコーティングにアルキル基を有するシランカップリング剤のオクタデシルトリメトキシシランを用いることで、シランコートが維持された領域９０３ｂの水に対する接触角を、３－アミノプロピルトリメトキシシランを用いる場合よりもさらに大きくして、領域９０３ｂを撥水性にすることができる。シランコートが維持された領域９０３ｂを撥水性とすることで、より容易に水面から目視で領域９０３ａと領域９０３ｂとの境界９０４を認識することができる。また、シランコートされたスライドガラスを準備する代わりに、ポリエチレンイミンやポリリジンなどのポリマーで表面がコーティングされた基板を準備することでも、上述と同様に反応性イオンでエッチングされた領域９０３ａとポリエチレンイミンやポリリジンなどのポリマーコーティングがマスク部材８０１によって維持された表面とで親水性に差を持たせることができ、境界９０４の表面張力を利用した目視による認識や、位置合わせマーカ７０３－１および位置合わせマーカ７０３－２を用いた像の重ね合わせによる観察または分析をすることができる。

図１２から図１６を用いて、本発明の第３の実施例を説明する。本実施例は、上述の第２の実施例とは、主に、マスク部材を配置する方向が異なる。

本実施例の顕微鏡用スライドの製造方法のフローも、第２の実施例の図６で説明する。本実施例では、ステップＳ６０１では、図１２に示したスライドガラス１２０１を準備し、ＲＩＥ装置３０１のチャンバ３０２内に置く。具体的には、第１の実施例と同様に、スライドガラス１２０１は、フロスト部１２０２が無い側が下部電極３０３ｂに向き合うように置かれる。これにより、フロスト部１２０２のある側が、ドライエッチングされる。ここで、スライドガラス１２０１は、二酸化珪素を主成分とする。

スライドガラス１２０１の表面は、第２の実施例と同様にシランコートされている。本実施例では、スライドガラス１２０１の表面は、３－アミノプロピルトリメトキシシランでコートされている。スライドガラス１２０１は、第１の実施例と同様に、片面にフロスト部１２０２を有し、フロスト部１２０２は着色されている。フロスト部１２０２の着色は、例えばピンクの着色である。

また、スライドガラス１２０１のフロスト部１２０２が設けられている側の表面には、二点鎖線で囲んだ領域に位置合わせマーカ列１２０３が設けられている。位置合わせマーカ列１２０３は、スライドガラス１２０１のフロスト部１２０２が設けられている側の表面に、例えば、レーザマーキング、ＦＩＢによるエッチング、またはＦＩＢによる材料の堆積により設けることができる。また、例えば、位置合わせマーカ列１２０３は、フロスト部１２０２をカラーウレタンなどの樹脂で印刷する際に併せて樹脂を印刷することで形成することができる。または、位置合わせマーカ列１２０３を蛍光材料を用いて形成することで、蛍光観察の像での位置合わせに適するようにすることもできる。

さらに、図１３に示したように、フロスト部１２０２の一部および位置合わせマーカ列１２０３を覆うように、上述の第２の実施例と同様に、スライドガラス１２０１上にマスク部材１３０１を配置する。ここで、マスク部材１３０１の辺の一つを利用して、マスクされた部分とマスクされない部分の境界を直線状とする。

次に、ステップＳ６０２では、第２の実施例と同様に、スライドガラス１２０１のマスク部材１３０１によって覆われていない部分のシランコートを除去するために、ＲＩＥ装置３０１のチャンバ３０２内に、酸素ガスを導入し、上部電極３０３ａと下部電極３０３ｂの間にプラズマを発生させ、スライドガラス１２０１表面のマスク部材１３０１によって覆われていない部分の表面をアッシングする。

続くステップＳ６０３では、第１の実施例と同様に、ＣＨＦ_３ガスを導入し、上部電極３０３ａと下部電極３０３ｂの間にプラズマを発生させ、スライドガラス１２０１表面のマスク部材１３０１で覆われていない部分を反応性イオンでエッチングする。

次に、ステップＳ６０４では、第１の実施例と同様に、ＲＩＥ装置３０１のチャンバ３０２内に、スライドガラス１２０１の表面に残った残留物を取り除くために酸素ガスを導入し、上部電極３０３ａと下部電極３０３ｂの間にプラズマを発生させ、ステップＳ６０３でエッチングしたスライドガラス１２０１の表面をアッシングする。ステップＳ６０４の処理の後に、マスク部材１３０１を顕微鏡用スライドから取り除く。

以上で、本実施例の顕微鏡用スライドであるスライドガラスを製造することができる。図１４に、本実施例で製造されたスライドガラス１４０１を示す。本実施例で製造されたスライドガラス１４０１は、マスク部材１３０１に覆われなかった領域１４０３ａには、反応性イオンでエッチングされた結果、第１の実施例と同様に凹凸が導入されている。第１の実施例と同様に、反応性イオンでエッチングされた領域１４０３ａは、水に対する接触角が１０度程度または１０度よりも小さい角度の高い親水性を示す。それに対して、マスク部材１３０１に覆われた領域１４０３ｂは、３－アミノプロピルトリメトキシシランによるシランコートが維持されているために、水に対する接触角が領域１４０３ａの水に対する接触角よりも大きい。マスク部材１３０１に覆われなかったフロスト部１４０２ａは、製造のため準備したスライドガラス１２０１のフロスト部１２０２よりも、上述の反応性イオンによる処理の結果、着色が薄くなる。フロスト部１４０２ａの着色が薄くなることで、上述の反応性イオンエッチングの処理がなされたスライドガラスであることを識別することができる。また、マスク部材１３０１に覆われていたフロスト部１４０２ｂは、元々の着色を保っているので、フロスト部１４０２ａとは目視で識別できる。さらに、反応性イオンでエッチングされた領域１４０３ａとマスク部材１３０１に覆われた領域１４０３ｂとの境界１４０４を、フロスト部１４０２ａとフロスト部１４０２ｂとの境界から目視で推測できる。

図１５に、水面１５０１に浮かべた連続切片１５０２をスライドガラス１５０１に載置する様子を示した。図１４の境界１４０４に相当する位置を破線の矢印１５０３で示した。水面１５０１は、第２の実施例と同様に、領域１４０３ａの高い親水性と、表面１４０３ａとシランコートが維持された領域１４０３ｂの親水性の差により、表面張力で矢印１５０３の位置まで上昇する。これにより、矢印１５０３の位置が連続切片１５０２を矢印１５０５の方向に寄せる際の目標になり、作業者の技量に寄らず、図１６に示したように、連続切片１５０２を再現性良くスライドガラス１４０１の所望の位置に載置することができる。また、本実施例では、さらに境界１４０４に沿って領域１４０３ｂ上に位置合わせマーカ列１２０３が形成されているので、位置合わせマーカ列１２０３を用いて、異なる顕微鏡観察の間での観察領域の位置合わせが可能であり、例えば、連続切片１５０２の内の所望の切片について、光学顕微鏡である透過型顕微鏡、落射型顕微鏡、または位相差顕微鏡で形態観察した像や、荷電粒子線装置であるＳＥＭで高精細に形態観察した像と、光学顕微鏡であるＦＯＭまたはＣＬＭで蛍光観察した像と、を容易に重ね合わせて、観察または分析をすることができる。

本実施例では、準備する基板のシランコーティングに３－アミノプロピルトリメトキシシランを用いる例を示したが、実施例２と同様に撥水性を得るために、アルキル基を有するシランカップリング剤のオクタデシルトリメトキシシランを用いることができる。

本発明の第４の実施例は、上述の各実施例とは、主に、準備する基板に上述の反応性イオンによるエッチングを施す層を有している点が異なる。図１７（ａ）は、準備する基板１７０１が酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）層１７０２を有している例を示す基板の側面図の模式図である。基板１７０１は、二酸化珪素のガラス板の上面にＩＴＯ層１７０２を有している。ここで、準備するＩＴＯ層１７０２の厚さは、後述する反応性イオンによるエッチングでＩＴＯ層１７０２がエッチングされる厚さよりも厚い。したがって、本実施例の反応性イオンによるエッチングを施して表面に凹凸を導入した後でもＩＴＯ層１７０２が残るために、導電性が確保され、製造した顕微鏡用スライドで残ったＩＴＯ層１７０２上に載置した切片の荷電粒子線装置であるＳＥＭによる観察を容易にすることができる。

本実施例では、上述の実施例の図１および図６で説明した製造方法において、基板１７０１は、ＩＴＯ層１７０２が形成された側とは反対側が下部電極３０３ｂに向き合うように置かれ、ＲＩＥ装置３０１のチャンバ３０２内にＣＨＦ_３ガスを導入する代わりに、エッチングガスとして、ヨウ化水素（ＨＩ）ガス、またはＣＨ_４ガス及びＨ_２ガスを導入することで、ＩＴＯ層１７０２を反応性イオンでエッチングし、ＩＴＯ層１７０２に第１の実施例１と同様に凹凸の表面形状を導入する。

本実施例では、基板１７０１は、ガラス板にＩＴＯ層１７０２を形成したものであるが、ガラス板として、例えば、ガラスウェハを用いることができる。

また、本実施例のＩＴＯ層１７０２の代わりに、二酸化珪素のガラス板に反応性イオンエッチングされる厚さよりも厚い窒化珪素層１７０４を有する基板１７０３を準備する変形例の基板の側面図の模式図を図１７（ｂ）に示す。窒化珪素層１７０４をエッチングするためのエッチングガスとして、例えば弗素系のガスを使用して窒化珪素層を反応性イオンでエッチングして第１の実施例と同様の凹凸の表面形状を導入することで、エッチング後も残っている窒化珪素層により、顕微鏡用スライドに耐薬品性を付与することができる。さらに、図１７（ｂ）に示したように、基板１７０３が窒化珪素層１７０４を有する側とは反対側にも窒化珪素層１７０５を有することで、顕微鏡用スライドにさらに高い耐薬品性を与えることができる。窒化珪素層１７０５の厚さは、例えば、エッチング前の窒化珪素層１７０４の厚さと同程度にすることができる。

図１８を用いて、本発明の第５の実施例を説明する。本実施例では、各実施例で示した位置合わせマーカを利用した、観察および分析方法を説明する。図１８は、本実施例で用いられる、観察システム１８０１を示す図である。

観察システム１８０１は、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）１８０２と、共焦点レーザ顕微鏡（ＣＬＭ）１８０３と、蛍光顕微鏡（ＦＯＭ）１８０４と、サーバ１８０５と、を有する。ＳＥＭ１８０２、ＣＬＭ１８０３、ＦＯＭ１８０４、およびサーバ１８０５は、それぞれがインタフェース１８０６を有しており、ネットワーク１８０７で互いに接続されている。

ＳＥＭ１８０２、ＣＬＭ１８０３、およびＦＯＭ１８０４は、それぞれ試料の観察位置または分析位置を変えるためのＸＹステージ１８０８およびＸＹステージ１８０８の動作を制御するステージコントローラ１８０９を有しており、上述の実施例の位置合わせマーカと切片上の観察の対象または分析の対象との位置関係をステージコントローラ１８０９に取り込み、また、取り込まれた位置関係に基づいてＸＹステージ１８０８で位置合わせを行うことができる。

サーバ１８０５は、バス１８１３に接続された中央演算装置（ＣＰＵ）１８１０、メモリ１８１１、およびストレージ１８１２を有する。各ステージコントローラ１８０９で取り込まれた位置関係は、サーバ１８０５に転送され、サーバ１８０５はストレージ１８１２に取り込まれた位置関係を保存する。各位置関係は、観察対象または分析対象のサンプルの情報と、取得された画像データまたは分析結果に関連付けられてストレージ１８１２に保存される。ストレージ１８１２に保存された位置関係は、ＳＥＭ１８０２、ＣＬＭ１８０３、またはＦＯＭ１８０４に呼び出され、呼び出された位置関係を再現した撮像または分析が行われ、観察対象または分析対象のサンプルの情報と、新たに取得された画像データまたは分析結果と、再現した位置関係とが、ストレージ１８１２に保存される。

サーバ１８０５は、同じサンプルで位置関係を再現して撮像された画像を重ね合わせて出力することができる。これにより、例えば、荷電粒子線装置であるＳＥＭで高精細に形態観察した切片の像と、光学顕微鏡であるＦＯＭまたはＣＬＭで蛍光観察した切片の像と、を容易に重ね合わせて、観察または分析をすることができる。

本実施例では、ＳＥＭ１８０２、ＣＬＭ１８０３、およびＦＯＭ１８０４をサーバ１８０５に接続した例を示したが、透過型顕微鏡、落射型顕微鏡、または位相差顕微鏡なども同様にして、サーバ１８０５に接続することができる。

図２０から図２３を用いて、本発明の第６の実施例を説明する。本実施例は、上述の第２の実施例とは、主に、マスク部材のスライドガラスの長手方向および短手方向の両方に構造を設ける点が異なる。

本実施例の顕微鏡用スライドの製造方法のフローも、第２の実施例の図６で説明する。本実施例では、ステップＳ６０１では、図２０に示したスライドガラス２００１を準備し、ＲＩＥ装置３０１のチャンバ３０２内に置く。具体的には、第１の実施例と同様に、スライドガラス２００１は、フロスト部２００２が無い側が下部電極３０３ｂに向き合うように置かれる。これにより、フロスト部２００２のある側が、ドライエッチングされる。ここで、スライドガラス２００１は、二酸化珪素を主成分とする。

スライドガラス２００１の表面は、第２の実施例と同様にシランコートされている。本実施例では、スライドガラス２００１の表面は、３－アミノプロピルトリメトキシシランでコートされている。スライドガラス２００１は、第１の実施例と同様に片面にフロスト部２００２を有する。また、フロスト部２００２は着色されている。フロスト部２００２の着色は、例えばピンクの着色である。また、スライドガラス２００１のフロスト部２００２が設けられている側の表面には、第２の実施例と同様に位置合わせマーカ２００３－１～４が設けられている。

さらに、図２１に示したように、フロスト部２００２の一部および位置合わせマーカ２００３―１～４を覆うように、上述の第２の実施例と同様に、スライドガラス２００１上にマスク部材２１０１を配置する。ここで、マスク部材２１０１のフロスト部２００２上の辺と、ガラス上の辺の一つを、図２１に示すように位置を合わせて直線上に配置する。

次に、ステップＳ６０２では、第２の実施例と同様に、スライドガラス２００１のマスク部材２１０１で覆われていない部分のシランコートを除去するために、ＲＩＥ装置３０１のチャンバ３０２内に、酸素ガスを導入し、上部電極３０３ａと下部電極３０３ｂの間にプラズマを発生させ、スライドガラス２００１表面のマスク部材２１０１で覆われていない部分の表面をアッシングする。

続くステップＳ６０３では、第１の実施例と同様に、ＣＨＦ_３ガスを導入し、上部電極３０３ａと下部電極３０３ｂの間にプラズマを発生させ、スライドガラス２００１表面のマスク部材２１０１で覆われていない部分を反応性イオンでエッチングする。

次に、ステップＳ６０４では、第１の実施例と同様に、ＲＩＥ装置３０１のチャンバ３０２内に、スライドガラス２００１の表面に残った残留物を取り除くために酸素ガスを導入し、上部電極３０３ａと下部電極３０３ｂの間にプラズマを発生させ、ステップＳ６０３でエッチングしたスライドガラス２００１の表面をアッシングする。ステップＳ６０４の処理の後に、マスク部材２１０１を顕微鏡用スライドから取り除く。

以上で、本実施例の顕微鏡用スライドであるスライドガラスを製造するこ
とができる。図２２に、本実施例で製造されたスライドガラス２２０１を示
す。本実施例で製造されたスライドガラス２２０１は、マスク部材２１０１
に覆われなかった領域２２０３ａには、反応性イオンでエッチングされた結
果、第１の実施例と同様に凹凸が導入されている。第１の実施例と同様に、
反応性イオンでエッチングされた領域２２０３ａは、水に対する接触角が１
０度程度または１０度よりも小さい角度の高い親水性を示す。それに対して
、マスク部材２１０１に覆われた領域２２０３ｂは、３－アミノプロピルト
リメトキシシランによるシランコートが維持されているために、水に対する
接触角が領域２２０３ａの水に対する接触角よりも大きい。マスク部材２１
０１に覆われなかったフロスト部２２０２ａは、製造のため準備したスライ
ドガラス２００１のフロスト部２００２よりも、上述の反応性イオンエッチ
ング処理の結果、着色が薄くなる。フロスト部２２０２ａの着色が薄くなる
ことで、上述の反応性イオンによる処理がなされたスライドガラスであるこ
とを識別することができる。また、マスク部材２１０１に覆われていたフロ
スト部２２０２ｂは、元々の着色を保っているので、フロスト部２２０２ａ
とは目視で識別できる。さらに、第３の実施例と同様に、反応性イオンでエ
ッチングされた領域２２０３ａとマスク部材２１０１に覆われた領域２２０
３ｂとの境界２２０４をフロスト部２２０２ａとフロスト部２２０２ｂの境
界から目視で推測できる。

本実施例では、水面に浮かべた切片を、周辺の領域２２０３ｂよりも高い
親水性のために濡れ易い領域２２０３ａに誘導することが容易になる。これ
により、作業者の技量に寄らず、図２３に示したように、切片２３０１を再
現性良くスライドガラス２２０１の領域２２０３ａに載置することができる
。また、本実施例では、さらに境界２２０４に沿って領域２２０３ｂ上に位
置合わせマーカ２００３－１～４が形成されているので、位置合わせマーカ
２００３－１～４を用いて、異なる顕微鏡観察の間での観察領域の位置合わ
せが可能であり、例えば、光学顕微鏡である透過型顕微鏡、落射型顕微鏡、
または位相差顕微鏡で形態観察した像や、荷電粒子線装置であるＳＥＭで高
精細に形態観察した像と、光学顕微鏡であるＦＯＭまたはＣＬＭで蛍光観察
した像と、を容易に重ね合わせて、観察または分析をすることができる。

本実施例では、準備する基板のシランコーティングに３－アミノプロピルトリメトキシシランを用いる例を示したが、実施例２と同様に撥水性を得るために、アルキル基を有するシランカップリング剤のオクタデシルトリメトキシシランを用いることができる。

図３０に、マスク部材２１０１の形状を変えて、マスクされない部分の方向を変えて製造された顕微鏡用スライド３００１を示す。マスク部材２１０１の形状を変えることで、顕微鏡用スライド３００１では、マスクされて反応性イオンでエッチングされなかった領域２２０３ｂに境界２２０４でコの字状に囲まれたマスクされず反応性イオンでエッチングされた領域２２０３ａの長手方向を、顕微鏡用スライド３００１の長手方向に合わせている。顕微鏡用スライド３００１は、上述に加えて、連続切片の貼り付けにも好適である。

図２４から図２９を用いて、本発明の第７の実施例を説明する。本実施例は、上述の第２の実施例とは、主に、マスク部材に開口を設ける点が異なる。

本実施例の顕微鏡用スライドの製造方法のフローも、第２の実施例の図６で説明する。本実施例では、ステップＳ６０１では、図２４に示したスライドガラス２４０１を準備し、ＲＩＥ装置３０１のチャンバ３０２内に置く。具体的には、第１の実施例と同様に、スライドガラス２４０１は、フロスト部２４０２が無い側が下部電極３０３ｂに向き合うように置かれる。これにより、フロスト部２４０２のある側が、ドライエッチングされる。ここで、スライドガラス２４０１は、二酸化珪素を主成分とする。

スライドガラス２４０１の表面は、第２の実施例と同様にシランコートされている。本実施例では、スライドガラス２４０１の表面は、３－アミノプロピルトリメトキシシランでコートされている。スライドガラス２４０１は、第１の実施例と同様に片面にフロスト部２４０２を有する。また、フロスト部２４０２は着色されている。フロスト部２４０２の着色は、例えばピンクの着色である。

また、スライドガラス２４０１のフロスト部２４０２が設けられている側の表面には、第１の実施例と同様に、位置合わせマーカ２４０３－１～８が設けられている。

さらに、図２５に示したように、フロスト部２４０２の一部および位置合わせマーカ２４０３―１～８を覆うように、上述の実施例２と同様に、スライドガラス２４０１上にマスク部材２５０１を配置する。

次に、ステップＳ６０２では、スライドガラス２４０１のマスク部材２５０１で覆われていない部分のシランコートを除去するために、ＲＩＥ装置３０１のチャンバ３０２内に、酸素ガスを導入し、上部電極３０３ａと下部電極３０３ｂの間にプラズマを発生させ、スライドガラス２４０１表面のマスク部材２５０１で覆われていない部分の表面をアッシングする。

続くステップＳ６０３では、第１の実施例と同様に、ＣＨＦ_３ガスを導入し、上部電極３０３ａと下部電極３０３ｂの間にプラズマを発生させ、スライドガラス２４０１表面のマスク部材２５０１がなされていない部分を反応性イオンでエッチングする。

次に、ステップＳ６０４では、第１の実施例と同様に、ＲＩＥ装置３０１のチャンバ３０２内に、スライドガラス２４０１の表面に残った残留物を取り除くために酸素ガスを導入し、上部電極３０３ａと下部電極３０３ｂの間にプラズマを発生させ、ステップＳ６０３でエッチングしたスライドガラス２４０１の表面をアッシングする。ステップＳ６０４の処理の後に、マスク部材２５０１を顕微鏡用スライドから取り除く。

以上で、本実施例の顕微鏡用スライドであるスライドガラスを製造することができる。図２６に、本実施例で製造されたスライドガラス２６０１を示す。本実施例で製造されたスライドガラス２６０１は、マスク部材２５０１に覆われなかった領域２６０３ａには、反応性イオンでエッチングされた結果、第１の実施例と同様に凹凸の表面形状が導入されている。第１の実施例と同様に、反応性イオンでエッチングされた領域２６０３ａは、水に対する接触角が１０度程度または１０度よりも小さい角度の高い親水性を示す。それに対して、マスク部材２５０１に覆われた領域２６０３ｂは、３－アミノプロピルトリメトキシシランによるシランコートが維持されているために、水に対する接触角が領域２６０３ａの水に対する接触角よりも大きい。したがって、本実施例では、切片が載置される領域２６０３ａは、領域２６０３ａよりも水に対する接触角が大きい領域に囲まれる。マスク部材２５０１に覆われなかったフロスト部２６０２ａは、製造のため準備したスライドガラス２４０１のフロスト部２４０２よりも、上述の反応性イオンによる処理の結果、着色が薄くなる。フロスト部２６０２ａの着色が薄くなることで、上述の反応性イオンエッチングの処理がなされたスライドガラスであることを識別することができる。また、マスク部材２５０１に覆われていたフロスト部２６０２ｂは、元々の着色を保っているので、フロスト部２６０２ａとは目視で識別できる。さらに、第３の実施例と同様に、反応性イオンでエッチングされた領域２６０３ａとマスク部材２５０１に覆われた領域２６０３ｂとの境界２６０４をフロスト部２６０２ａとフロスト部２６０２ｂの境界から目視で推測できる。

本実施例では、例えば、反応性イオンエッチングの処理がなされた領域２６０３ａに、水に対する濡れ性の境界２６０４を利用して予め水を張り、薄切片標本作製装置の搬送テープから切片を移して載置することができる。４箇所の領域２６０３ａに切片２７０１を載置した状態を、図２７に示した。また、領域２６０３ａに境界２６０４を利用して、薬液を載せることで切片への染色や標識を効率よく行うことができる。ここで、本実施例では、準備する基板のシランコーティングに３－アミノプロピルトリメトキシシランを用いる例を示したが、実施例２と同様に撥水性を得るために、アルキル基を有するシランカップリング剤のオクタデシルトリメトキシシランを用いることができる。これにより、境界２６０４を利用した領域２６０３ａでの水の保持をより容易にすることができる。また、準備する基板に予めシランコート等の疎水性のコーティングをする代わりに、上述の反応性イオンエッチングの処理による凹凸の表面形状の導入が行われた表面の領域を囲むように、疎水性の材料を塗布または印刷することで、上述の反応性イオンエッチングの処理による凹凸の表面形状の導入が行われた表面の切片が載置される領域の周囲に、上述の反応性イオンエッチングの処理による凹凸の表面形状の導入が行われた表面よりも水に対する接触角が大きくなるコーティングを施すこともできる。

さらに、本実施例では、境界２６０４に沿って領域２６０３ｂ上に位置合わせマーカ２６０３－１～８が形成されているので、位置合わせマーカ２６０３―１～８を用いて、異なる顕微鏡観察の間での観察領域の位置合わせが可能であり、例えば、光学顕微鏡である透過型顕微鏡、落射型顕微鏡、または位相差顕微鏡で形態観察した像や、荷電粒子線装置であるＳＥＭで高精細に形態観察した像と、光学顕微鏡であるＦＯＭまたはＣＬＭで蛍光観察した像と、を容易に重ね合わせて、観察または分析をすることができる。

本実施例では、パラフィン包埋切片の例を示したが、図２８に示したように、樹脂包埋切片２８０２でも境界２６０４を利用して切片を所望の位置に貼り付けることができる。図２８に示した顕微鏡用スライド２８０１のように、領域２６０３ａのそれぞれの面積を、切片のサイズに応じて小さくすることで、切片の載置の位置精度を向上させることができる。また、逆に、図２９に示した顕微鏡用スライド２９０１のように、より大きいパラフィン包埋切片２９０２のために、マスク部材２５０１の形状を変えることで、境界２６０４で領域２６０３ｂに囲まれた領域２６０３ａを大きくすることができる。

３０１：反応性イオンエッチング（ＲＩＥ）装置、３０２：チャンバ、３０３ａ：上部電極、３０３ｂ：下部電極、４０１：スライドガラス、４０２：フロスト部、４０３：反応性イオンでエッチングされた表面、５０２：組織切片、１８０２：走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）、１８０３：共焦点レーザ顕微鏡（ＣＬＭ）、１８０４：蛍光顕微鏡（ＦＯＭ）。

Claims (20)

1. 着色された樹脂膜が一部に形成された面を有する透明な基板を準備する第１の工程と、
   前記基板の前記樹脂膜が形成された側の表面の少なくとも一部の第１の領域を前記基板の材料をエッチングする反応性イオンでエッチングし、前記第１の領域に平面視で１μｍ^２当たり２５個よりも高い密度で凸部を有する表面形状を導入する第２の工程と、
   前記第２の工程の後に、前記樹脂膜の少なくとも一部および前記第１の領域を酸素の反応性イオンでアッシングする第３の工程と、を有し、
   前記酸素の反応性イオンでアッシングされた樹脂膜の部分は、前記樹脂膜を有する面とは反対側から見た場合の前記樹脂膜の着色よりも、着色が薄くなることを特徴とする顕微鏡用スライドの製造方法。
2. 請求項１に記載の顕微鏡用スライドの製造方法において、
   前記第２の工程では、前記第１の領域の表面で、隣り合う前記凸部の間の溝となる凹みの領域の方が前記凸部よりも前記反応性イオンによるエッチングが進行することを特徴とする顕微鏡用スライドの製造方法。
3. 基板を準備する第１の工程と、
   前記基板の表面の少なくとも一部である第１の領域を反応性イオンでエッチングし、前記第１の領域に平面視で１μｍ ^２ 当たり２５個よりも高い密度で凸部を有する表面形状を導入する第２の工程と、
   前記第２の工程の後に、前記第１の領域を酸素の反応性イオンでアッシングする第３の工程と、を有し、
   少なくとも前記第１の領域には、前記第２の工程および前記第３の工程でマスクがされておらず、
   前記第２の工程では、前記第１の領域の表面で、隣り合う前記凸部の間の溝となる凹みの領域の方が前記凸部よりも前記反応性イオンによるエッチングが進行することを特徴とする顕微鏡用スライドの製造方法。
4. 請求項２または３に記載の顕微鏡用スライドの製造方法において、
   前記基板は酸化珪素の基板であり、
   前記第２の工程の前記反応性イオンは、弗素系のガスを含むガスを導入して得られ、
   前記第２の工程では、前記基板の酸化珪素の表面に前記凸部を有する荒れを導入することで、前記凸部が不規則に充填された凹凸の前記表面形状を導入することを特徴とする顕微鏡用スライドの製造方法。
5. 請求項１または３に記載の顕微鏡用スライドの製造方法において、
   前記第１の工程で、前記基板を準備する際に、コーティングがなされ、且つ前記第１の領域を残して前記第１の領域と隣り合っている第２の領域にマスクがなされている基板を準備し、
   前記第１の工程と前記第２の工程の間に、酸素の反応性イオンによるアッシングにより、前記マスクがなされている第２の領域の前記コーティングは残しつつ、前記第１の領域の前記コーティングを除去し、
   前記コーティングよりも前記第１の領域の水に対する接触角を小さくすることによって、前記第１の領域と前記第２の領域の境界に水に対する濡れ性の境界を形成することを特徴とする顕微鏡用スライドの製造方法。
6. 請求項５に記載の顕微鏡用スライドの製造方法において、
   前記コーティングは、アミノ基を有するシランカップリング剤、アルキル基を有するシランカップリング剤、ポリエチレンイミン、またはポリリジンで形成されることを特徴とする顕微鏡用スライドの製造方法。
7. 請求項５に記載の顕微鏡用スライドの製造方法において、
   前記第１の工程で、前記第１の領域を除き、且つ前記第２の領域を含む前記基板の少なくとも一部の表面に、ポリジメチルシロキサンのシートを自己吸着させることで前記マスクをすることを特徴とする顕微鏡用スライドの製造方法。
8. 請求項５に記載の顕微鏡用スライドの製造方法において、
   前記第１の工程で、前記基板として、位置合わせの際に用いられるマーカが前記第２の領域に設けられている基板を準備することを特徴とする顕微鏡用スライドの製造方法。
9. 請求項１または３に記載の顕微鏡用スライドの製造方法において、
   追加の材料を適用することなく、前記第１の領域へ貼り付けられる生体組織の切片の剥離を防ぐことを特徴とする顕微鏡用スライドの製造方法。
10. 請求項１または３に記載の顕微鏡用スライドの製造方法において、
    前記第１の領域が、生体組織のパラフィン包埋切片が貼り付けられる領域であることを特徴とする顕微鏡用スライドの製造方法。
11. 請求項１または３に記載の顕微鏡用スライドの製造方法において、
    前記第２の工程で、前記第１の領域は酸化インジウムスズ層の表面であり、
    前記第１の工程で準備する基板は、前記第２の工程でエッチングされる厚さよりも厚い前記酸化インジウムスズ層を有することを特徴とする顕微鏡用スライドの製造方法。
12. 請求項４に記載の顕微鏡用スライドの製造方法において、
    前記第１の工程で準備する前記基板はガラス基板であり、
    前記基板の酸化珪素の表面は前記ガラス基板の表面であることを特徴とする顕微鏡用スライドの製造方法。
13. 請求項１２に記載の顕微鏡用スライドの製造方法において、
    前記第１の工程で準備する前記ガラス基板がスライドガラスであることを特徴とする顕微鏡用スライドの製造方法。
14. 請求項１に記載の顕微鏡用スライドの製造方法において、
    前記第１の工程で準備する前記基板がスライドガラスであり、前記樹脂膜はフロスト部であることを特徴とする顕微鏡用スライドの製造方法。
15. 請求項１３または１４に記載の顕微鏡用スライドの製造方法において、
    前記第１の領域は、前記スライドガラスの縁に接するように設けられることを特徴とする顕微鏡用スライドの製造方法。
16. 請求項１または３に記載の顕微鏡用スライドの製造方法で製造された顕微鏡用スライドの前記第１の領域に、生体組織のパラフィン包埋切片を貼り付けることを特徴とする観察方法。
17. 請求項８に記載の顕微鏡用スライドの製造方法で製造された顕微鏡用スライドの前記第１の領域に切片を載置し、前記マーカに基づき画像を重ね合わせることを特徴とする観察方法。
18. 請求項１７に記載の観察方法において、
    前記マーカに基づき光学顕微鏡による画像と荷電粒子線装置による画像とを重ね合わせることを特徴とする観察方法。
19. 請求項１８に記載の観察方法において、
    前記荷電粒子線装置は走査型電子顕微鏡であることを特徴とする観察方法。
20. 請求項１または３に記載の顕微鏡用スライドの製造方法で製造された顕微鏡用スライドの前記第１の領域に、生体組織のパラフィン包埋切片を貼り付けることを特徴とする分析方法。

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