WO2019202650A1 - 顕微鏡用スライド、顕微鏡用スライドの製造方法、観察方法及び分析方法 - Google Patents

顕微鏡用スライド、顕微鏡用スライドの製造方法、観察方法及び分析方法 Download PDF

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    • C03C2218/30—Aspects of methods for coating glass not covered above
    • C03C2218/32—After-treatment

Definitions

  • the present invention relates to a microscope slide, a method for manufacturing a microscope slide, an observation method, and an analysis method.
  • Patent Document 1 discloses a technique in which a specimen section positioning mark is marked on a transparent portion excluding a frosted portion of a slide glass, and the specimen section is placed on the slide glass based on the specimen section positioning mark. Further, Patent Document 1 shows that the specimen slice is difficult to peel off because the slide glass is coated with silane.
  • Non-Patent Document 1 discloses that by performing reactive ion etching, a random uneven structure of 10 nanoscales is introduced on the surface of polystyrene particles of submicron size.
  • An object of the present invention is to provide a technique for suppressing exfoliation of a section without applying an additional material.
  • the inventor attempted by hoping that the adhesiveness of the section could be improved by introducing the same structure as the unevenness introduced on the polystyrene particle surface shown in Non-Patent Document 1 to the surface of the microscope slide, Succeeded in obtaining good adhesion.
  • the above-mentioned problem is solved by etching at least a part of the surface of the substrate with reactive ions.
  • the present invention can provide a technique for suppressing exfoliation of a section.
  • FIG. 1 is a flowchart of a method for manufacturing a microscope slide according to the first embodiment of the present invention.
  • the slide glass 201 shown in FIG. 2 is prepared as a substrate.
  • the slide glass 201 contains silicon dioxide as a main component.
  • the slide glass 201 has a length of 76 mm, a width of 26 mm, and a thickness of 1 mm.
  • the slide glass 201 has a frost portion 202 on one side.
  • the frost portion 202 is printed with a resin frost, and is formed, for example, as a resin film containing a colorant and a frost agent by color urethane printing.
  • the frost portion 202 is colored with a colorant, for example, pink.
  • the slide glass 201 is transparent except for the frost portion 202.
  • FIG. 3 shows a schematic diagram of a reactive ion etching (RIE) apparatus 301 which is a parallel plate type dry etching apparatus used in this embodiment.
  • the RIE apparatus 301 evacuates the chamber 302 to a high vacuum, introduces an etching gas, and applies high-frequency power between parallel plates composed of the upper electrode 303a and the lower electrode 303b in the chamber 302 to generate plasma. And the object on the lower electrode 303b is dry-etched.
  • RIE reactive ion etching
  • the slide glass 201 prepared as a substrate is placed in the chamber 302 of the RIE apparatus 301. Specifically, the slide glass 201 is placed so that the side without the frost portion 202 faces the lower electrode 303b. Thereby, the side where the frost part 202 exists is dry-etched.
  • the side where the frost part 202 exists is dry-etched.
  • FIG. 3 for ease of explanation, only one slide glass 201 is placed in the chamber 302, but a plurality of slide glasses 201 can be placed in the chamber 302.
  • step S102 CHF 3 gas is introduced as an etching gas into the chamber 302 of the RIE apparatus 301 in order to etch silicon dioxide, which is the main component of the slide glass 201, with reactive ions, High frequency power is applied between the electrodes 303b to generate plasma, and the surface of the slide glass 201 is etched with reactive ions.
  • the reactive ion etching conditions are, for example, 0.6 W / cm 2 and 13 Pa, and the etching time can be 1 minute.
  • the shape of the unevenness introduced as surface roughness on the surface of the slide glass 201 by reactive ion etching can be controlled by the conditions of reactive ion etching.
  • the surface roughness can be increased and the unevenness can be increased, and conversely, by reducing the etching time, the surface roughness can be increased. Can be reduced to reduce the unevenness.
  • silicon dioxide is 0.4 ⁇ m shorter than the wavelength of visible light so that unevenness introduced as surface roughness on the surface of the slide glass 201 by reactive ion etching is sufficiently smaller than the wavelength of visible light. It is desirable to make the etching conditions with an average depth of less than, for example, an etching condition in the depth direction of about 0.1 ⁇ m as the average depth from the position of the surface of the slide glass 201 before etching.
  • the unevenness introduced as a rough surface on the surface of the slide glass 201 by reactive ion etching sufficiently smaller than the wavelength of visible light, at least a level of unevenness that does not affect the observation with a normal optical microscope Can be.
  • an apparatus having a high resolution such as a scanning electron microscope (SEM)
  • SEM scanning electron microscope
  • the size of the unevenness introduced by changing the reactive ion etching conditions in step S102 according to the spatial resolution of the microscope used for observing the section. can be changed.
  • the surface roughness is reduced by reducing the etching time of the reactive ion etching in step S102, and the introduced unevenness is reduced.
  • the shape of the unevenness introduced as surface roughness can also be controlled by the type of gas to be introduced, the pressure, or the output of the reactive ion etching apparatus.
  • step S103 in order to remove the residue remaining on the surface of the slide glass 201, oxygen gas is introduced into the chamber 302 of the RIE apparatus 301, and high frequency power is applied between the upper electrode 303a and the lower electrode 303b. Then, plasma is generated, and the surface of the slide glass 201 etched in step S102 is ashed.
  • oxygen gas is introduced, 0.5 W / cm 2 , 40 Pa, and the ashing time can be 10 minutes.
  • FIG. 4 shows a slide glass 401 manufactured in this example.
  • the slide glass 401 manufactured in this example as a result of etching with reactive ions, unevenness sufficiently finer than the wavelength of visible light is introduced into the surface 403 on the side where the frost portion 402 is present.
  • FIG. 19A shows an atomic force microscope image of a 1.556 ⁇ 1.556 ⁇ m 2 region of the surface of the slide glass that has been subjected to the reactive ion etching treatment of this example. It can be seen from FIG. 19A that irregularities sufficiently finer than the wavelength of visible light are introduced on the surface. Further, from FIG.
  • the surface shape of the unevenness introduced is the surface shape of the unevenness filled with the convex portions.
  • the etching proceeds on the surface of the slide glass 201 in the region between the adjacent convex portions, compared to the convex portions, and therefore, between the adjacent convex portions. It is considered that a groove is formed on the surface of the glass slide 401, and the surface 403 of the slide glass 401 is introduced with an uneven surface shape filled with the protrusion.
  • FIG. 19B shows an image obtained by superimposing triangular marks on the positions where it is considered to be the convex portions of the fine irregularities introduced with respect to the atomic force microscope image of FIG. 19A. There are 151 convex portions with triangular marks in FIG. 19B in a 1.556 ⁇ 1.556 ⁇ m 2 region.
  • FIG. 31 (a) shows a schematic diagram 3101 of unevenness introduced into the surface of the microscope slide in this embodiment.
  • a groove 3103 highlighted by a solid line is formed on the surface of the microscope slide of the present embodiment so as to surround each of the convex portions 3102 a to i indicated by triangular marks.
  • the FIG. 31B is a schematic diagram of a cross section taken along the line A-A ′ in the alternate long and short dash line in FIG.
  • the surface shape of the unevenness introduced into the surface of the microscope slide in this embodiment is the surface shape of the unevenness filled with the convex portions.
  • the surface shape of the unevenness which the convex part has filled can be obtained by the process by the reactive ion etching of a present Example.
  • the density of the convex portions to be introduced is desirably higher than 25 per 1 ⁇ m 2 in plan view.
  • the limit of resolution of the optical microscope is about 0.2 ⁇ m. At the limit of the resolution of the optical microscope, if the convex portions are 0.2 ⁇ m long and 0.2 ⁇ m wide in plan view, 25 convex portions are included in 1 ⁇ m 2 .
  • the surface shape of the introduced unevenness affects the observation with the optical microscope in order to exceed the resolution limit of the optical microscope. Giving can be significantly suppressed.
  • the groove 3103 shown in FIG. 31A will be described. By making the average area in a plan view of the region including the convex portion surrounded by the groove 3103 smaller than 0.04 ⁇ m 2 , the resolution of the optical microscope can be reduced. In order to exceed the limit, it is possible to remarkably suppress that the surface shape of the introduced unevenness affects the observation with an optical microscope.
  • the average of the area in plan view of the area including the convex portion surrounded by the groove 3103 in the range of 0.00001 2 of 0.03 .mu.m 2, adjusted by etching conditions described above.
  • the optical film thickness of the average thickness 3105 of the unevenness corresponding to the average depth of the groove 3103 has a wavelength of visible light of 0.4 ⁇ m or more.
  • the average thickness 3105 of the unevenness is preferably 0.07 ⁇ m or less, with the average refractive index being 1.4.
  • the average thickness 3105 of the unevenness is adjusted in the range of 0.01 ⁇ m to 0.07 ⁇ m by, for example, the etching time in the etching conditions in step S102.
  • FIG. 19C shows an atomic force microscope image of a 1.556 ⁇ 1.556 ⁇ m 2 region on the surface of the slide glass before the treatment by the reactive ion etching of this example. Since the surface of the slide glass before the treatment by the reactive ion etching of this example is flat, FIG. 19C shows the unevenness filled with the protrusions seen in FIG. No surface shape is seen.
  • the surface 403 etched with reactive ions exhibits high hydrophilicity with an angle of contact with water of about 10 degrees or less than 10 degrees. Since the surface 403 exhibits high hydrophilicity, it becomes easy to place the tissue section 502 embedded in paraffin 501 on the surface 403 etched with reactive ions as shown in FIG. As a result of the above-described reactive ion etching process, the frosted portion 402 becomes lighter than the frosted portion 202 of the slide glass 201 prepared for manufacturing. By reducing the coloration of the frosted portion 402, it is possible to identify the microscope slide that has been subjected to the reactive ion etching process described above.
  • the ashing in step S103 is considered to be effective in decolorizing the colorant in the frosted portion 202.
  • the front surface of the frost portion 402 that is lightly colored. Therefore, when the frost portion 402 is viewed from the back surface, the frost portion 402 is manufactured.
  • the coloring of the frost part 202 of the prepared slide glass 201 is maintained. That is, the coloring of the frosted portion 402 when viewed from the side where the frosted portion 402 is formed is more colored than the coloring of the frosted portion 402 when viewed from the side opposite to the surface where the frosted portion 402 is formed. thin. Therefore, it is possible to more clearly identify the microscope slide that has been subjected to the reactive ion etching process of this embodiment from the comparison of the frosted portion 402 viewed from both sides.
  • the slide glass produced by the method of this example was compared with the slide glass produced by the method of this example and the slide glass coated with aminosilane, and the adhesion of paraffin-embedded sections of mouse liver was compared. Then, like the glass slide coated with aminosilane, it was possible to prevent the exfoliation of the section.
  • the effect of preventing exfoliation was performed by performing steps of deparaffinization, hydrophilization, HE staining, dehydration, and encapsulation. Further, the contact angle of water with the slide glass coated with aminosilane is about 25 to 60 degrees.
  • the microscope slide of this example is suitable for attaching a section. Furthermore, in the manufacturing method of the present embodiment, since the surface of the slide glass prepared as the substrate is etched, no additional material is required for improving the adhesion and hydrophilicity.
  • the slide glass 201 is prepared as a silicon dioxide substrate, but a quartz glass substrate, a cover glass, or the like can be prepared instead of the slide glass 201.
  • the slide glass 201 instead of the slide glass 201, it can be used as a substrate for preparing a cover glass having a length and width of 18 mm and a thickness of 0.15 mm.
  • a general slide glass is used instead of the slide glass 201.
  • step S101 a glass wafer made of silicon dioxide is placed on the lower electrode 303b as a substrate.
  • the processed wafer is cut with a dicing saw.
  • a microscope slide can be obtained with a tip having a desired size.
  • FIG. 32 shows a schematic diagram of a wafer as an example.
  • the glass wafer 3201 that has been processed by the RIE apparatus 301 in steps S102 and S103 described above is cut with a dicing saw along vertical and horizontal scribe lines 3202.
  • Each chip 3203 cut out by cutting to become a microscope slide has the above-described resin frosted portion 3204 on the surface processed by the RIE apparatus 301 in steps S102 and S103.
  • the frost unit 3204 prints a resin film on one side of the wafer to be prepared in advance along the scribe line 3202 by urethane printing or the like in step S101 so that the surface opposite to the printed surface faces the lower electrode 303b. It can be formed by placing a wafer.
  • a resin film can be printed along the scribe line 3202 by urethane printing or the like, and then cut with a dicing saw to cut out each chip 3203 to obtain the frosted portion 3204.
  • a resin film may be formed on each chip 3203 by urethane printing or the like to form the frost portion 3204.
  • a general dyeing bottle for a slide glass or the like can be used, and workability can be improved.
  • a general slide glass has a length of 76 mm and a width of 26 mm. The manufactured slide can be mounted on a holder having a thickness of 1 mm to facilitate observation of the placed section.
  • the microscope slide of the present example showed good adhesion even with a frozen section of a pea, which is a plant sample.
  • the present invention can also be applied to adhesion of cells such as yeast and stem cells to the surface of a substrate and application of a resin-embedded section to a microscope slide.
  • step S102 CHF 3 gas was introduced into the chamber 302 of the RIE apparatus 301 in order to etch silicon dioxide, which is the main component of the slide glass 201, with reactive ions.
  • Gas can also be introduced.
  • a gas obtained by mixing fluorocarbon CF 4 with H 2 can be used instead of CHF 3 gas.
  • fluorocarbons such as C 2 F 6 , C 3 F 8 , C 4 F 8 , and C 5 F 8 can be used as the etching gas.
  • the RIE apparatus is used, but other dry etching apparatuses can also be used.
  • the frost portion 202 is shown by color urethane printing.
  • the resin containing the colorant is printed without including the frost agent in the color urethane printing.
  • the surface subjected to the reactive ion etching process of the present embodiment can be specified.
  • a second embodiment of the present invention will be described with reference to FIGS.
  • This example is different from the first example described above in that a silane-coated slide glass is prepared as a substrate, a region where reactive ion etching is performed, and a plurality of apparatuses are used for observation or The difference is that an alignment marker used in the analysis is formed.
  • the combination of a plurality of apparatuses is, for example, a combination of a scanning electron microscope (SEM) and a fluorescence microscope (FOM), or a combination of an SEM and a confocal laser microscope (CLM).
  • SEM scanning electron microscope
  • FOM fluorescence microscope
  • CLM confocal laser microscope
  • FIG. 6 is a flowchart of a method for manufacturing a microscope slide that is an embodiment of the present invention.
  • step S ⁇ b> 601 of FIG. 6 the slide glass 701 shown in FIG. 7 is prepared and placed in the chamber 302 of the RIE apparatus 301. Specifically, as in the first embodiment, the slide glass 701 is placed so that the side without the frost portion 702 faces the lower electrode 303b. Thereby, the side where the frost portion 702 is present is dry-etched.
  • the slide glass 701 contains silicon dioxide as a main component.
  • the surface of the slide glass 701 is silane coated.
  • the surface of the slide glass 701 is coated with 3-aminopropyltrimethoxysilane, which is a silane coupling agent having an amino group.
  • the slide glass 701 has a frost portion 702 on one side. Further, the frost portion 702 is colored. The frost portion 702 is colored, for example, pink.
  • an alignment marker 703-1 and an alignment marker 703-2 are provided on the surface of the slide glass 701 on the side where the frost portion 702 is provided.
  • Each of the alignment marker 703-1 and the alignment marker 703-2 is provided with numbers “1” and “2” for specifying the marker.
  • the alignment marker 703-1 and the alignment marker 703-2 are formed on the surface of the slide glass 701 on the side where the frost portion 702 is provided, for example, laser marking, etching with a focused ion beam (FIB), or a material using FIB. It can be provided by depositing.
  • the alignment marker 703-1 and the alignment marker 703-2 can be formed by printing a resin when printing the frost portion 702 with a resin such as color urethane.
  • the alignment marker 703-1 and the alignment marker 703-2 may be formed using a fluorescent material so as to be suitable for alignment in a fluorescence observation image.
  • a mask member 801 is arranged on the slide glass 701 so as to cover a part of the frost portion 702, the alignment marker 703-1, and the alignment marker 703-2.
  • the mask member 801 can be formed of, for example, a polytetrafluoroethylene (PTFE) plate.
  • the mask member 801 can be formed of a sheet of polydimethylsiloxane (PDMS) which is a transparent silicone rubber.
  • the mask member 801 By forming the mask member 801 with a PDMS sheet, a jig for fixing the slide glass 701 and the mask member 801 becomes unnecessary due to the self-adsorption action of the PDMS sheet. In addition, since the PDMS sheet can be easily cut, a mask member 801 having an arbitrary shape can be easily formed.
  • step S602 oxygen gas is introduced into the chamber 302 of the RIE apparatus 301 in order to remove the portion of the slide glass 701 that is not covered with the mask member 801, and the upper electrode 303a and the lower electrode are removed. Plasma is generated by applying high-frequency power between 303b, and the portion of the surface of the slide glass 701 not covered with the mask member 801 is ashed.
  • oxygen gas can be introduced, 0.5 W / cm 2 , 40 Pa, and the ashing time can be 10 minutes.
  • CHF 3 gas is introduced as an etching gas, plasma is generated between the upper electrode 303a and the lower electrode 303b, and is covered with the mask member 801 on the surface of the slide glass 701. Etch unreacted parts with reactive ions.
  • step S604 as in the first embodiment, oxygen gas is introduced into the chamber 302 of the RIE apparatus 301 in order to remove the residue remaining on the surface of the slide glass 701, and the upper electrode 303a and the lower electrode are removed. Plasma is generated between the electrodes 303b, and the surface of the slide glass 701 etched in step S603 is ashed. After the process of step S604, the mask member 801 is removed from the microscope slide.
  • FIG. 9 shows a slide glass 901 manufactured in this example.
  • the surface region 903a not covered with the mask member 801 is etched with reactive ions, and as a result, unevenness is introduced as in the first embodiment. Similar to the first embodiment, the region 903a etched with reactive ions exhibits high hydrophilicity with an angle of contact with water of about 10 degrees or less than 10 degrees.
  • the surface area 903b covered with the mask member 801 has a contact angle with water larger than the contact angle with water in the area 903a because the silane coating with 3-aminopropyltrimethoxysilane is maintained. .
  • a slide glass 901 which is a microscope slide of this embodiment has a wettability boundary 904 between a region 903b where the silane coat is maintained and hydrophobic, and a region 903a which is dry-etched and hydrophilic, 903b.
  • a silane coating which is a wet process that is easy to apply uniformly
  • the area on which the section is placed by a dry etching process that allows easy processing to the desired area by the mask process.
  • the frosted portion 902a not covered with the mask member 801 is less colored than the frosted portion 702 of the slide glass 701 prepared for manufacturing, as a result of the treatment with the reactive ions described above, as in the first embodiment. .
  • By reducing the color of the frosted portion 902a it is possible to identify that the glass is a slide glass that has been subjected to the reactive ion etching process described above.
  • the frosted portion 902b covered with the mask member 801 maintains the original coloring, it can be visually distinguished from the frosted portion 902a. In this way, by masking a part of the colored frost portion, it is possible to more easily identify the microscope slide that has been subjected to the above-described reactive ion etching treatment.
  • FIG. 10 shows a state in which the section 1002 floated on the water surface 1001 is placed on the slide glass 901.
  • a position corresponding to the boundary 904 in FIG. 9 is indicated by a dashed arrow 1003.
  • the water surface 1001 rises to the position of the arrow 1003 due to surface tension due to the difference in hydrophilicity between the region 903a and the hydrophilicity between the region 903a and the region 903b where the silane coat is maintained.
  • the position of the arrow 1003 becomes a target when the section 1002 is moved in the direction of the arrow 1005, and the tissue section 1002 embedded in the paraffin 1101 as shown in FIG. 11 without depending on the skill of the operator.
  • the alignment marker 703-1 and the alignment marker 703-2 are further formed on the region 903b along the boundary 904, the alignment marker 703-1 and the alignment marker 703-2 are formed.
  • 3-aminopropyltrimethoxysilane is used for the silane coating of the prepared slide glass 701 .
  • octadecyltrimethoxysilane which is a silane coupling agent having an alkyl group in the silane coating.
  • the contact angle of the region 903b where the silane coat is maintained with respect to water can be made larger than when 3-aminopropyltrimethoxysilane is used, and the region 903b can be made water repellent.
  • the boundary 904 between the region 903a and the region 903b can be more easily recognized visually from the water surface.
  • a substrate whose surface is coated with a polymer such as polyethyleneimine or polylysine may be prepared, and the region 903a etched with reactive ions and the polyethyleneimine as described above.
  • the polymer coating such as polylysine or the like can have a difference in hydrophilicity from the surface maintained by the mask member 801, and can be visually recognized using the surface tension of the boundary 904, the alignment marker 703-1 and the alignment. Observation or analysis can be performed by overlaying images using the marker 703-2.
  • a third embodiment of the present invention will be described with reference to FIGS. This embodiment is mainly different from the second embodiment described above in the direction in which the mask member is arranged.
  • step S601 the slide glass 1201 shown in FIG. 12 is prepared and placed in the chamber 302 of the RIE apparatus 301. Specifically, as in the first embodiment, the slide glass 1201 is placed so that the side without the frost portion 1202 faces the lower electrode 303b. Thereby, the side where the frost part 1202 exists is dry-etched.
  • the slide glass 1201 contains silicon dioxide as a main component.
  • the surface of the slide glass 1201 is silane-coated as in the second embodiment.
  • the surface of the slide glass 1201 is coated with 3-aminopropyltrimethoxysilane.
  • the slide glass 1201 has a frost portion 1202 on one side, and the frost portion 1202 is colored.
  • the frost portion 1202 is colored, for example, pink.
  • an alignment marker row 1203 is provided in a region surrounded by a two-dot chain line.
  • the alignment marker row 1203 can be provided on the surface of the slide glass 1201 on the side where the frost portion 1202 is provided by, for example, laser marking, etching by FIB, or deposition of material by FIB.
  • the alignment marker row 1203 can be formed by printing a resin together with the frosted portion 1202 printed with a resin such as color urethane.
  • a fluorescent material it is possible to make the alignment marker row 1203 suitable for alignment in a fluorescence observation image.
  • a mask member 1301 is arranged on the slide glass 1201 so as to cover a part of the frost portion 1202 and the alignment marker row 1203 as in the second embodiment.
  • the boundary between the masked portion and the non-masked portion is made a straight line.
  • step S602 oxygen gas is introduced into the chamber 302 of the RIE apparatus 301 in order to remove the silane coat of the portion of the slide glass 1201 that is not covered by the mask member 1301. Then, plasma is generated between the upper electrode 303a and the lower electrode 303b, and the surface of the surface of the slide glass 1201 that is not covered with the mask member 1301 is ashed.
  • step S603 as in the first embodiment, CHF 3 gas is introduced, plasma is generated between the upper electrode 303a and the lower electrode 303b, and the portion not covered with the mask member 1301 on the surface of the slide glass 1201 Are etched with reactive ions.
  • step S604 as in the first embodiment, oxygen gas is introduced into the chamber 302 of the RIE apparatus 301 in order to remove the residue remaining on the surface of the slide glass 1201, and the upper electrode 303a and the lower electrode are removed. Plasma is generated between the electrodes 303b, and the surface of the slide glass 1201 etched in step S603 is ashed. After the process of step S604, the mask member 1301 is removed from the microscope slide.
  • FIG. 14 shows a slide glass 1401 manufactured in this example.
  • the region 1403a not covered with the mask member 1301 is etched with reactive ions, and as a result, unevenness is introduced as in the first embodiment.
  • the region 1403a etched with reactive ions exhibits high hydrophilicity with an angle of contact with water of about 10 degrees or less than 10 degrees.
  • the region 1403b covered with the mask member 1301 has a contact angle with water larger than the contact angle with water in the region 1403a because the silane coating with 3-aminopropyltrimethoxysilane is maintained.
  • the frosted portion 1402a that is not covered with the mask member 1301 is lighter in color than the frosted portion 1202 of the slide glass 1201 prepared for manufacturing as a result of the above-described treatment with reactive ions.
  • the color of the frosted portion 1402a it is possible to identify that the glass is a slide glass that has been subjected to the reactive ion etching process described above.
  • the frosted portion 1402b covered with the mask member 1301 maintains the original coloring, it can be visually distinguished from the frosted portion 1402a.
  • the boundary 1404 between the region 1403a etched with reactive ions and the region 1403b covered with the mask member 1301 can be estimated visually from the boundary between the frost portion 1402a and the frost portion 1402b.
  • FIG. 15 shows a state in which the continuous section 1502 floated on the water surface 1501 is placed on the slide glass 1501.
  • a position corresponding to the boundary 1404 in FIG. 14 is indicated by a dashed arrow 1503.
  • the water surface 1501 rises to the position of the arrow 1503 due to the surface tension due to the difference in hydrophilicity between the region 1403a and the hydrophilicity between the surface 1403a and the region 1403b where the silane coat is maintained.
  • the position of the arrow 1503 becomes a target when the continuous section 1502 is moved in the direction of the arrow 1505, and the continuous section 1502 is reproducibly slide glass 1401 as shown in FIG. 16 without depending on the skill of the operator. Can be placed at a desired position.
  • the alignment marker row 1203 is further formed on the region 1403b along the boundary 1404, the alignment of the observation regions between different microscopic observations using the alignment marker row 1203.
  • an image obtained by observing the shape of a desired section of the continuous section 1502 with a transmission microscope, an episcopic microscope, or a phase contrast microscope, which is an optical microscope, or an SEM, which is a charged particle beam apparatus is high. It is possible to easily superimpose an image obtained by finely morphologically observing an image and an image obtained by fluorescence observation using an optical microscope such as FOM or CLM for observation or analysis.
  • FIG. 17A is a schematic diagram of a side view of a substrate showing an example in which the prepared substrate 1701 has an indium tin oxide (ITO) layer 1702.
  • the substrate 1701 has an ITO layer 1702 on the upper surface of a silicon dioxide glass plate.
  • the thickness of the ITO layer 1702 to be prepared is thicker than the thickness at which the ITO layer 1702 is etched by etching with reactive ions described later.
  • the ITO layer 1702 remains even after the surface is roughened by etching with the reactive ions of this embodiment, the conductivity is ensured and the ITO layer 1702 remaining on the manufactured microscope slide is mounted. Observation of the placed section with an SEM that is a charged particle beam apparatus can be facilitated.
  • the substrate 1701 is placed so that the side opposite to the side on which the ITO layer 1702 is formed faces the lower electrode 303b.
  • Etching the ITO layer 1702 with reactive ions by introducing hydrogen iodide (HI) gas or CH 4 gas and H 2 gas as an etching gas instead of introducing CHF 3 gas into the chamber 302 of 301. Then, an uneven surface shape is introduced into the ITO layer 1702 in the same manner as in the first embodiment.
  • HI hydrogen iodide
  • CH 4 gas and H 2 gas as an etching gas
  • the substrate 1701 is formed by forming an ITO layer 1702 on a glass plate, but for example, a glass wafer can be used as the glass plate.
  • an etching gas for etching the silicon nitride layer 1704 for example, a fluorine-based gas is used to etch the silicon nitride layer with reactive ions, thereby introducing the same uneven surface shape as in the first embodiment.
  • the silicon nitride layer remaining after etching can impart chemical resistance to the microscope slide.
  • the substrate 1703 has the silicon nitride layer 1705 on the side opposite to the side having the silicon nitride layer 1704, thereby giving the microscope slide even higher chemical resistance. Can do.
  • the thickness of the silicon nitride layer 1705 can be, for example, approximately the same as the thickness of the silicon nitride layer 1704 before etching.
  • FIG. 18 is a diagram showing an observation system 1801 used in this embodiment.
  • the observation system 1801 includes a scanning electron microscope (SEM) 1802, a confocal laser microscope (CLM) 1803, a fluorescence microscope (FOM) 1804, and a server 1805.
  • SEM scanning electron microscope
  • CLM confocal laser microscope
  • FOM fluorescence microscope
  • server 1805 each have an interface 1806 and are connected to each other via a network 1807.
  • Each of the SEM 1802, the CLM 1803, and the FOM 1804 has a stage controller 1809 for controlling the operation of the XY stage 1808 and the XY stage 1808 for changing the observation position or analysis position of the sample, respectively.
  • a positional relationship with an observation target or an analysis target on the section can be captured by the stage controller 1809, and alignment can be performed by the XY stage 1808 based on the captured positional relationship.
  • the server 1805 includes a central processing unit (CPU) 1810, a memory 1811, and a storage 1812 connected to the bus 1813.
  • the positional relationship captured by each stage controller 1809 is transferred to the server 1805, and the server 1805 stores the positional relationship captured in the storage 1812.
  • Each positional relationship is stored in the storage 1812 in association with the information of the sample to be observed or analyzed and the acquired image data or analysis result.
  • the positional relationship stored in the storage 1812 is called by the SEM 1802, CLM 1803, or FOM 1804, and imaging or analysis reproducing the called positional relationship is performed, and information about the sample to be observed or analyzed is newly acquired.
  • the image data or analysis result and the reproduced positional relationship are stored in the storage 1812.
  • the server 1805 can superimpose and output images captured by reproducing the positional relationship with the same sample.
  • an image of a section whose form is observed with high precision by an SEM that is a charged particle beam apparatus and an image of a section that is observed by fluorescence with an FOM or CLM that is an optical microscope can be easily overlapped for observation or analysis. Can do.
  • a sixth embodiment of the present invention will be described with reference to FIGS.
  • the present embodiment is different from the second embodiment described above in that structures are mainly provided in both the longitudinal direction and the short direction of the slide glass of the mask member.
  • step S601 the slide glass 2001 shown in FIG. 20 is prepared and placed in the chamber 302 of the RIE apparatus 301. Specifically, as in the first embodiment, the slide glass 2001 is placed so that the side without the frost portion 2002 faces the lower electrode 303b. Thereby, the side where the frost portion 2002 is provided is dry-etched.
  • the slide glass 2001 contains silicon dioxide as a main component.
  • the surface of the slide glass 2001 is silane coated as in the second embodiment.
  • the surface of the slide glass 2001 is coated with 3-aminopropyltrimethoxysilane.
  • the slide glass 2001 has a frost portion 2002 on one side as in the first embodiment.
  • the frost portion 2002 is colored.
  • the frost portion 2002 is colored, for example, pink.
  • alignment markers 2003-1 to 2003-1 to 4 are provided as in the second embodiment.
  • a mask member 2101 is placed on the slide glass 2001 so as to cover a part of the frost portion 2002 and the alignment markers 2003-1 to 2003-4 similarly to the second embodiment. Deploy.
  • one side of the mask member 2101 on the frost portion 2002 and one of the sides on the glass are aligned on a straight line as shown in FIG.
  • step S602 oxygen gas is introduced into the chamber 302 of the RIE apparatus 301 in order to remove the portion of the slide glass 2001 that is not covered with the mask member 2101. Then, plasma is generated between the upper electrode 303a and the lower electrode 303b, and the surface of the surface of the slide glass 2001 not covered with the mask member 2101 is ashed.
  • step S603 as in the first embodiment, CHF 3 gas is introduced, plasma is generated between the upper electrode 303a and the lower electrode 303b, and the portion not covered with the mask member 2101 on the surface of the slide glass 2001 Are etched with reactive ions.
  • step S604 as in the first embodiment, oxygen gas is introduced into the chamber 302 of the RIE apparatus 301 in order to remove the residue remaining on the surface of the slide glass 2001, and the upper electrode 303a and the lower electrode are removed. Plasma is generated between the electrodes 303b, and the surface of the slide glass 2001 etched in step S603 is ashed. After the process of step S604, the mask member 2101 is removed from the microscope slide.
  • FIG. 22 shows a slide glass 2201 manufactured in this example.
  • the region 2203a not covered with the mask member 2101 is etched with reactive ions, and as a result, unevenness is introduced as in the first embodiment.
  • the region 2203a etched with reactive ions exhibits high hydrophilicity with an angle of contact with water of about 10 degrees or less than 10 degrees.
  • the area 2103b covered with the mask member 2101 has a contact angle with water larger than the contact angle with water in the area 2203a because the silane coating with 3-aminopropyltrimethoxysilane is maintained.
  • the frosted portion 2202a that is not covered with the mask member 2101 is lighter in color than the frosted portion 2002 of the slide glass 2001 prepared for manufacturing as a result of the reactive ion etching process described above.
  • By reducing the color of the frosted portion 2202a it is possible to identify the glass slide that has been treated with the above-described reactive ions.
  • the frosted portion 2202b covered with the mask member 2101 maintains the original coloring, it can be visually identified from the frosted portion 2202a.
  • the boundary 2204 between the region 2203a etched with reactive ions and the region 2203b covered with the mask member 2101 can be estimated visually from the boundary between the frosted portion 2202a and the frosted portion 2202b.
  • the slice 2301 can be placed on the region 2203a of the slide glass 2201 with high reproducibility as shown in FIG. 23 regardless of the skill of the operator.
  • the alignment markers 2203-1 to 220-4 are further formed on the region 2203b along the boundary 2204, the alignment markers 2203-1 to 4 are used for different microscopic observations.
  • the observation region can be aligned, for example, an image observed with a transmission microscope, an epi-illumination microscope, or a phase contrast microscope, which is an optical microscope, or a high-definition observation with a SEM, which is a charged particle beam device.
  • the image can be easily overlapped with the image observed with the fluorescence microscope FOM or CLM for observation or analysis.
  • FIG. 30 shows a microscope slide 3001 manufactured by changing the shape of the mask member 2101 and changing the direction of the unmasked portion.
  • the region 2203 b that is masked and not etched with reactive ions is etched with reactive ions instead of being masked by a boundary 2204.
  • the longitudinal direction of the region 2203a is aligned with the longitudinal direction of the microscope slide 3001.
  • the microscope slide 3001 is also suitable for pasting continuous sections.
  • a seventh embodiment of the present invention will be described with reference to FIGS. This embodiment is different from the second embodiment described above mainly in that an opening is provided in the mask member.
  • step S601 the slide glass 2401 shown in FIG. 24 is prepared and placed in the chamber 302 of the RIE apparatus 301. Specifically, as in the first embodiment, the slide glass 2401 is placed so that the side without the frost portion 2402 faces the lower electrode 303b. Thereby, the side with the frosted portion 2402 is dry-etched.
  • the slide glass 2401 contains silicon dioxide as a main component.
  • the surface of the slide glass 2401 is silane-coated as in the second embodiment.
  • the surface of the slide glass 2401 is coated with 3-aminopropyltrimethoxysilane.
  • the slide glass 2401 has a frost portion 2402 on one side as in the first embodiment. Further, the frosted portion 2402 is colored. The frosted portion 2402 is colored, for example, pink.
  • alignment markers 2403-1 to 2403-1 are provided on the surface of the slide glass 2401 on the side where the frost portion 2402 is provided, as in the first embodiment.
  • a mask member 2501 is arranged on the slide glass 2401 so as to cover a part of the frosted portion 2402 and the alignment markers 2403-1 to 240-3 as in the second embodiment. .
  • step S602 oxygen gas is introduced into the chamber 302 of the RIE apparatus 301 in order to remove the silane coat of the slide glass 2401 that is not covered with the mask member 2501, and the upper electrode 303a and the lower electrode are removed. Plasma is generated during 303b to ash the surface of the surface of the slide glass 2401 that is not covered with the mask member 2501.
  • step S603 as in the first embodiment, CHF 3 gas is introduced, plasma is generated between the upper electrode 303a and the lower electrode 303b, and a portion of the surface of the slide glass 2401 where the mask member 2501 is not formed is formed. Etch with reactive ions.
  • step S604 as in the first embodiment, oxygen gas is introduced into the chamber 302 of the RIE apparatus 301 in order to remove the residue remaining on the surface of the slide glass 2401, and the upper electrode 303a and the lower electrode are removed. Plasma is generated between the electrodes 303b, and the surface of the slide glass 2401 etched in step S603 is ashed. After the process of step S604, the mask member 2501 is removed from the microscope slide.
  • FIG. 26 shows a slide glass 2601 manufactured in this example.
  • the slide glass 2601 manufactured in this embodiment is etched with reactive ions in the region 2603a that is not covered with the mask member 2501, and as a result, the uneven surface shape is introduced as in the first embodiment. Yes.
  • the region 2603a etched with reactive ions exhibits high hydrophilicity with an angle of contact with water of about 10 degrees or less than 10 degrees.
  • the contact angle with water is larger than the contact angle with water in the region 2603a.
  • the region 2603a where the section is placed is surrounded by a region having a larger contact angle with water than the region 2603a.
  • the frosted portion 2602a that is not covered with the mask member 2501 is lighter in color than the frosted portion 2402 of the slide glass 2401 prepared for manufacturing as a result of the above-described treatment with reactive ions.
  • the frosted portion 2602b covered with the mask member 2501 maintains the original coloring, and thus can be visually identified from the frosted portion 2602a.
  • the boundary 2604 between the region 2603a etched with reactive ions and the region 2603b covered with the mask member 2501 can be estimated visually from the boundary between the frost portion 2602a and the frost portion 2602b.
  • FIG. 27 shows a state where the sections 2701 are placed in the four regions 2603a.
  • the boundary 2604 in the region 2603a and placing a chemical solution the section can be efficiently stained and labeled.
  • 3-aminopropyltrimethoxysilane is used for the silane coating of the substrate to be prepared has been shown.
  • a silane coupling having an alkyl group is used.
  • the agent octadecyltrimethoxysilane can be used. This makes it easier to hold water in the region 2603a using the boundary 2604.
  • a hydrophobic coating such as a silane coat to the substrate to be prepared in advance
  • the hydrophobic surface is surrounded so as to surround the surface area where the surface shape of the unevenness is introduced by the reactive ion etching process described above.
  • the above-described reactive ion etching process is performed around the region where the surface section on which the uneven surface shape is introduced by the above-described reactive ion etching process is placed. It is also possible to apply a coating having a larger contact angle with water than the surface on which the uneven surface shape is introduced.
  • the alignment markers 2603-1 to 2603-1 to 8-3 are formed on the region 2603b along the boundary 2604, the alignment markers 2603-1 to 8-8 are used between different microscopic observations.
  • the observation area can be aligned, for example, an image observed with a transmission microscope, epi-illumination microscope, or phase contrast microscope, which is an optical microscope, or a high-definition image observed with an SEM, which is a charged particle beam device.
  • an image observed with fluorescence using an optical microscope such as FOM or CLM can be easily overlapped for observation or analysis.
  • an example of a paraffin-embedded section is shown, but as shown in FIG. 28, the section can be pasted to a desired position using the boundary 2604 even in the resin-embedded section 2802.
  • the area accuracy of the placement of the section can be improved by reducing the area of each region 2603a in accordance with the size of the section.
  • the microscope slide 2901 shown in FIG. 29 by changing the shape of the mask member 2501 for a larger paraffin-embedded section 2902, a region 2603a surrounded by the region 2603b at the boundary 2604 is obtained. Can be increased.
  • RIE Reactive ion etching
  • 302 Chamber
  • 303a Upper electrode
  • 303b Lower electrode
  • 401 Glass slide
  • 402 Frost part
  • 403 Surface etched with reactive ions
  • 502 Tissue section 1802: Scanning electron microscope (SEM)
  • 1803 Confocal laser microscope (CLM)
  • 1804 Fluorescence microscope (FOM).

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Abstract

切片の顕微鏡用スライドからの剥離を防ぐために、従来から用いられている材料以外の材料を用いることは、仮に接着性が向上したとしても、染色などの工程への影響を排除しなければならず、好まれない。本発明の目的は、追加の材料を適用することなく、切片の剥離を抑制する技術を提供することにある。　本発明では、基板の表面の少なくとも一部の領域を、反応性イオンでエッチングすることで、上述の課題を解決する。

Description

顕微鏡用スライド、顕微鏡用スライドの製造方法、観察方法及び分析方法
　本発明は、顕微鏡用スライド、顕微鏡用スライドの製造方法、観察方法及び分析方法に関する。
　スライドガラスと標本切片が剥離しにくいように、従来、スライドガラスにはシランコーティングがなされている。特許文献１には、スライドガラスのフロスト部を除く透明部に、標本切片位置決めマークを印して、この標本切片位置決めマークを基準に標本切片をスライドガラスに載置する技術が開示されている。また、特許文献１には、スライドガラスにはシランコーティングがなされているため、標本切片が剥離しにくいことが示されている。
　非特許文献１には、反応性イオンエッチングを施すことで、サブミクロンサイズのポリスチレン粒子の表面に１０ナノスケールのランダムな凹凸の構造が導入されることが開示されている。
特開平１０－３３３０５１号公報
Ｔｏｒｕ　Ｆｕｊｉｍｕｒａ　ｅｔ　ａｌ．，"Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　ｐｈｏｔｏｎｉｃ　ｂａｎｄ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ　ｐａｒｔｉｃｌｅ　ｌａｙｅｒｓ　ｂｙ　ｒｅａｃｔｉｖｅ　ｉｏｎ　ｅｔｃｈｉｎｇ"、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｐｈｙｓｉｃｓ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、２００１年３月、第７８巻１１号、１４７８－１４８０頁
　切片の顕微鏡用スライドからの剥離を防ぐために、従来から用いられている材料以外の材料を用いることは、仮に接着性が向上したとしても、染色などの工程への影響を排除しなければならず、好まれない。
　本発明の目的は、追加の材料を適用することなく、切片の剥離を抑制する技術を提供することにある。
　発明者は、非特許文献１に示されたポリスチレン粒子表面に導入された凹凸と同様の構造を顕微鏡用スライドの表面に導入することで、切片の接着性が高められることを期待して試み、良好な接着性を得ることに成功した。
　本発明では、基板の表面の少なくとも一部の領域を、反応性イオンでエッチングすることで、上述の課題を解決する。
　本発明により、切片の剥離を抑制する技術を提供することができる。
本発明の実施例である顕微鏡用スライドの製造方法のフロー図である。 本発明の第１の実施例で準備するスライドガラスを説明するための図である。 本発明の実施例で使用する反応性イオンエッチング装置を説明するための図である。 本発明の第１の実施例の顕微鏡用スライドを説明するための図である。 本発明の第１の実施例の顕微鏡用スライドの使用状態を説明するための図である。 本発明の実施例である顕微鏡用スライドの製造方法のフロー図である。 本発明の第２の実施例で準備するスライドガラスを説明するための図である。 本発明の第２の実施例の顕微鏡用スライドの製造工程を説明するための図である。 本発明の第２の実施例の顕微鏡用スライドを説明するための図である。 本発明の第２の実施例の顕微鏡用スライドの使用状態を説明するための図である。 本発明の第２の実施例の顕微鏡用スライドの使用状態を説明するための図である。 本発明の第３の実施例で準備するスライドガラスを説明するための図である。 本発明の第３の実施例の顕微鏡用スライドの製造工程を説明するための図である。 本発明の第３の実施例の顕微鏡用スライドを説明するための図である。 本発明の第３の実施例の顕微鏡用スライドの使用状態を説明するための図である。 本発明の第３の実施例の顕微鏡用スライドの使用状態を説明するための図である。 本発明の第４の実施例で準備する基板を説明するための図である。 本発明の第４の実施例で準備する基板の変形例を説明するための図である。 本発明の観察システムの実施例を示す図である。 本発明の顕微鏡用スライドの実施例の表面の原子間力顕微鏡像である。 本発明の顕微鏡用スライドの実施例の表面の原子間力顕微鏡像の凸部に三角印を入れた図である。 本発明の実施例の反応性イオンエッチングの処理を施す前のスライドガラスの表面の原子間力顕微鏡像である。 本発明の第６の実施例で準備するスライドガラスを説明するための図である。 本発明の第６の実施例の顕微鏡用スライドの製造工程を説明するための図である。 本発明の第６の実施例の顕微鏡用スライドを説明するための図である。 本発明の第６の実施例の顕微鏡用スライドの使用状態を説明するための図である。 本発明の第７の実施例で準備する基板を説明するための図である。 本発明の第７の実施例の顕微鏡用スライドの製造工程を説明するための図である。 本発明の第７の実施例の顕微鏡用スライドを説明するための図である。 本発明の第７の実施例の顕微鏡用スライドの使用状態を説明するための図である。 本発明の第７の実施例の顕微鏡用スライドの変形例の使用状態を説明するための図である。 本発明の第７の実施例の顕微鏡用スライドの変形例の使用状態を説明するための図である。 本発明の第６の実施例の顕微鏡用スライドの変形例を説明するための図である。 本発明の顕微鏡用スライドの表面に導入される凹凸の例を示す模式図である。 図３１（ａ）の一点鎖線の箇所での断面の模式図である。 本発明の第１の実施例の顕微鏡用スライドの製造方法の変形例を示す図である。
　以下の実施の形態において、便宜上その必要があるときは、複数のセクションまたは実施の形態に分割して説明するが、特に明示した場合を除き、それらはお互いに無関係なものではなく、一方は他方の一部または全部の変形例、詳細、補足説明等の関係にある。
　また、以下の実施の形態で用いる図面においては、平面図であっても図面を見易くするためにハッチングを付す場合もある。また、以下の実施の形態を説明するための全図において、同一機能を有するものは原則として同一の符号を付し、その繰り返しの説明は省略する。以下、本発明の実施の形態を図面に基づいて詳細に説明する。
　図１は、本発明の第１の実施例である顕微鏡用スライドの製造方法のフロー図である。本実施例では、基板として、図２に示したスライドガラス２０１を準備する。スライドガラス２０１は、二酸化珪素を主成分とする。スライドガラス２０１は、長さが７６ｍｍ、幅が２６ｍｍ、厚さが１ｍｍのサイズである。スライドガラス２０１は、片面にフロスト部２０２を有する。フロスト部２０２は、樹脂製フロストが印刷されたものであり、例えばカラーウレタン印刷で着色剤とフロスト剤とを含む樹脂膜として形成されたものである。フロスト部２０２は、着色剤で着色されており、例えばピンクの着色である。スライドガラス２０１は、フロスト部２０２を除いて透明である。
　図３に、本実施例で使用される平行平板型のドライエッチング装置である、反応性イオンエッチング（ＲＩＥ）装置３０１の模式図を示す。ＲＩＥ装置３０１は、チャンバ３０２内を高真空に排気した後に、エッチングガスを導入し、チャンバ３０２内にある上部電極３０３ａと下部電極３０３ｂとで構成される並行平板間に高周波電力を印加してプラズマを発生させ、下部電極３０３ｂ上にある対象物をドライエッチングする。
　図１のステップＳ１０１では、基板として準備したスライドガラス２０１を、ＲＩＥ装置３０１のチャンバ３０２内に置く。具体的には、スライドガラス２０１は、フロスト部２０２が無い側が下部電極３０３ｂに向き合うように置かれる。これにより、フロスト部２０２のある側が、ドライエッチングされる。図３では説明の分かり易さのために、スライドガラス２０１が１枚だけ、チャンバ３０２内に置かれているが、複数のスライドガラス２０１をチャンバ３０２内に置くことができる。
　次に、ステップＳ１０２では、スライドガラス２０１の主成分である二酸化珪素を反応性イオンでエッチングするために、ＲＩＥ装置３０１のチャンバ３０２内にエッチングガスとしてＣＨＦ３ガスを導入し、上部電極３０３ａと下部電極３０３ｂの間に高周波電力を印加してプラズマを発生させ、スライドガラス２０１の表面を反応性イオンでエッチングする。反応性イオンエッチングの条件は、例えば、０．６Ｗ／ｃｍ２、１３Ｐａでエッチング時間を１分間とすることができる。また、反応性イオンエッチングによりスライドガラス２０１の表面に表面の荒れとして導入される凹凸の形状は、反応性イオンエッチングの条件によって制御することができる。例えば、上述のＣＨＦ３ガスを導入した例で、エッチング時間を長くすることで、表面の荒れを大きくして、凹凸を大きくすることができ、逆にエッチング時間を短くすることで、表面の荒れを小さくして、凹凸を小さくすることができる。この際に、反応性イオンエッチングによりスライドガラス２０１の表面に表面の荒れとして導入される凹凸が可視光の波長よりも十分に小さくなるように、二酸化珪素を可視光の波長よりも短い０．４μｍ未満の平均的な深さでエッチングする条件にすることが望ましく、例えば、エッチング前のスライドガラス２０１の表面の位置からの平均的な深さとして０．１μｍほど深さ方向にエッチングする条件にすることができる。反応性イオンエッチングによりスライドガラス２０１の表面に表面の荒れとして導入される凹凸が可視光の波長よりも十分に小さくなるようにすることで、少なくとも通常の光学顕微鏡観察の際に影響しないレベルの凹凸にすることができる。走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）などの高い分解能を有する装置での観察に用いる場合には、表面の荒れを小さくして、導入される凹凸を小さくするほうが望ましい。ここで本実施例の顕微鏡用スライドの製造方法では、切片の観察に用いられる顕微鏡の空間分解能に応じて、ステップＳ１０２の反応性イオンエッチングの条件を変更することで、導入される凹凸の大きさを変えることができる。例えば、切片の観察に用いられる顕微鏡の空間分解能が高いほど、ステップＳ１０２の反応性イオンエッチングのエッチング時間を短くすることで、表面の荒れを小さくして、導入される凹凸を小さくする。導入するガス種、圧力、または反応性イオンエッチング装置の出力によっても、表面の荒れとして導入される凹凸の形状を制御することができる。
　次に、ステップＳ１０３では、スライドガラス２０１の表面に残った残留物を取り除くために、ＲＩＥ装置３０１のチャンバ３０２内に酸素ガスを導入し、上部電極３０３ａと下部電極３０３ｂの間に高周波電力を印加してプラズマを発生させ、ステップＳ１０２でエッチングしたスライドガラス２０１の表面をアッシングする。ステップＳ１０３のアッシングの条件は、例えば、酸素ガスを導入し、０．５Ｗ／ｃｍ２、４０Ｐａ、アッシングの時間を１０分間にすることができる。
　以上で、本実施例の顕微鏡用スライドであるスライドガラスを製造することができる。図４に、本実施例で製造されたスライドガラス４０１を示す。本実施例で製造されたスライドガラス４０１では、反応性イオンでエッチングされた結果、フロスト部４０２がある側の表面４０３に可視光の波長よりも十分に細かい凹凸が導入されている。図１９（ａ）に、本実施例の反応性イオンエッチングの処理を施したスライドガラスの表面の１．５５６×１．５５６μｍ２の領域の原子間力顕微鏡像を示す。図１９（ａ）から、可視光の波長よりも十分に細かい凹凸が表面に導入されているのが見て取れる。また、図１９（ａ）から、導入される凹凸の表面形状は、凸部が充填された凹凸の表面形状と分かる。ステップＳ１０２の反応性イオンエッチングの際に、スライドガラス２０１の表面では、隣り合う凸部と凸部の間の領域でエッチングが凸部よりも進行するために、隣り合う凸部と凸部の間に溝が形成され、形成される溝が各凸部の周囲の凹みになり、スライドガラス４０１の表面４０３には、凸部が充填された凹凸の表面形状が導入されると考えられる。図１９（ｂ）に、図１９（ａ）の原子間力顕微鏡像に対して、導入された細かい凹凸の凸部と見られる位置に三角印を重ねた像を示す。図１９（ｂ）に三角印をした凸部は、１．５５６×１．５５６μｍ２の領域に１５１個存在する。
　図３１（ａ）に、本実施例で顕微鏡用スライドの表面に導入される凹凸の模式図３１０１を示す。模式図３１０１に示したように、本実施例の顕微鏡用スライドの表面には、三角印で示した凸部３１０２ａ～ｉの各々を囲むように、実線で強調して示した溝３１０３が形成される。図３１（ａ）の一点鎖線の内のＡ－Ａ’間の箇所での断面の模式図を図３１（ｂ）に示す。図３１（ｂ）に示すように、隣り合う凸部３１０２ｄと凸部３１０２ｅの間、および隣り合う凸部３１０２ｅと凸部３１０２ｆの間、のそれぞれに溝３１０３があり、溝３１０３が凹みを形成する。したがって、本実施例で顕微鏡用スライドの表面に導入される凹凸の表面形状は、凸部が充填された凹凸の表面形状になる。
　このように、本実施例の反応性イオンエッチングによる処理によって、凸部が充填している凹凸の表面形状を得ることができる。導入される凸部の密度は、平面視で１μｍ２当たり２５個よりも高いことが望ましい。可視光が０．４μｍ以上の波長の光として、光学顕微鏡の分解能の限界は約０．２μｍである。光学顕微鏡の分解能の限界では、仮に凸部が平面視で縦０．２μｍで横も０．２μｍの大きさであったとすると、１μｍ２の中に２５個の凸部が入ることになる。したがって、平面視で１μｍ２当たり２５個よりも高い密度で凸部を形成することで、光学顕微鏡の分解能の限界を超えるために、導入された凹凸の表面形状が光学顕微鏡での観察に影響を与えることを著しく抑えることができる。図３１（ａ）に示した溝３１０３で説明すると、溝３１０３で囲まれた凸部を含む領域の平面視での面積の平均を０．０４μｍ２よりも小さくすることで、光学顕微鏡の分解能の限界を超えるために、導入された凹凸の表面形状が光学顕微鏡での観察に影響を与えることを著しく抑えることができる。例えば、溝３１０３で囲まれた凸部を含む領域の平面視での面積の平均を、０．００００１μｍ２から０．０３μｍ２の範囲で、上述のエッチング条件により調整する。また、図３１（ｂ）に示した断面の方向についても、溝３１０３の平均的な深さに対応する凹凸の平均の厚さ３１０５の光学膜厚が、可視光が０．４μｍ以上の波長の光として、０．４μｍの４分の１よりも薄くなるようにすることで、光の干渉効果の影響が抑えられ、導入された凹凸が光学顕微鏡での観察に影響を与えることを著しく抑えることができる。したがって、凹凸の平均の厚さ３１０５は、平均屈折率を１．４として、０．０７μｍ以下が望ましい。例えば、凹凸の平均の厚さ３１０５を、０．０１μｍから０．０７μｍの範囲で、ステップＳ１０２のエッチング条件の内の例えばエッチング時間により調整する。図１９（ｃ）に、本実施例の反応性イオンエッチングによる処理を施す前のスライドガラス表面の１．５５６×１．５５６μｍ２の領域の原子間力顕微鏡像を示す。本実施例の反応性イオンエッチングによる処理を施す前のスライドガラスの表面は平坦であるために、図１９（ｃ）には、図１９（ａ）で見られた凸部が充填された凹凸の表面形状は見られない。
　反応性イオンでエッチングされた表面４０３は、水に対する接触角が１０度程度または１０度よりも小さい角度の高い親水性を示す。表面４０３が高い親水性を示すことで、図５のようにパラフィン５０１で包埋されている組織切片５０２を反応性イオンでエッチングされた表面４０３に載置することが容易になる。フロスト部４０２は、製造のため準備したスライドガラス２０１のフロスト部２０２よりも、上述の反応性イオンエッチング処理の結果、着色が薄くなる。フロスト部４０２の着色が薄くなることで、上述の反応性イオンエッチングの処理がなされた顕微鏡用スライドであることを識別することができる。特に、ステップＳ１０３のアッシングは、フロスト部２０２の着色剤の脱色に効果があると考えられる。また、本実施例の反応性イオンエッチングの処理の結果、着色が薄くなるのはフロスト部４０２の表面であるため、フロスト部４０２を裏面から観た場合には、フロスト部４０２は、製造のため準備したスライドガラス２０１のフロスト部２０２の着色を保っている。すなわち、フロスト部４０２が形成されている面とは反対側から見た場合のフロスト部４０２の着色よりも、フロスト部４０２が形成されている面の側から観た場合のフロスト部４０２の着色が薄い。したがって、フロスト部４０２を両面から見た比較から、本実施例の反応性イオンエッチングの処理がなされた顕微鏡用スライドであることをより明確に識別することができる。
　本実施例の方法で製造されたスライドガラスと、アミノシランでコートされたスライドガラスとで、マウスの肝臓のパラフィン包埋切片の接着性を比較したところ、本実施例の方法で製造されたスライドガラスでは、アミノシランでコートされたスライドガラスと同様に切片の剥離を防ぐことができた。剥離の防止の効果は、脱パラフィン、親水化、ＨＥ染色、脱水、および封入の工程を施すことで行われた。また、アミノシランでコートされたスライドガラスの水に対する接触角は２５～６０度程度になる。したがって、アミノシランでコートされたスライドガラスでは、疎水性のために伸展の際に切片の周囲のパラフィン５０１のところに水がなくなり、切片にしわが入りやすいのに対し、本実施例の製造方法による顕微鏡用スライドでは、高い親水性を有するために、切片の周囲のパラフィン５０１の周りに水を保持できるので伸展をし易く、切片にしわが寄りにくい。このように、本実施例の顕微鏡用スライドは、切片の貼り付けに適している。さらに、本実施例の製造方法では、基板として準備したスライドガラスの表面をエッチングしているので、接着性や親水性の向上のために、追加の材料を要しない。
　本実施例では、二酸化珪素の基板としてスライドガラス２０１を準備したが、スライドガラス２０１の代わりに石英ガラス基板やカバーガラスなどを準備することができる。例えば、スライドガラス２０１の代わりに、長さおよび幅が１８ｍｍで厚さが０．１５ｍｍのカバーガラスを準備する基板として用いることができる。このように、スライドガラス２０１の代わりに、長さ７６ｍｍ以内、幅２６ｍｍ以内、および厚さ１ｍｍ以内の大きさの基板を本実施例の顕微鏡用スライドの製造に用いた場合、一般的なスライドガラスの大きさである長さ７６ｍｍ、幅２６ｍｍ、厚さが１ｍｍのホルダに製造した顕微鏡用スライドを搭載することで、載置した切片の観察を容易にすることができる。
　また、ステップＳ１０１で基板として二酸化珪素のガラスウェハを下部電極３０３ｂ上に置いて、上述のステップＳ１０２およびステップＳ１０３のＲＩＥ装置３０１による処理を施した後に、処理を施したウェハをダイシングソーで切削してチップを切り出すことにより、所望の大きさのチップで顕微鏡用スライドを得ることができる。これにより、より大量生産に向いた顕微鏡用スライドを得ることができる。図３２に、例として、ウェハの模式図を示す。上述のステップＳ１０２およびステップＳ１０３のＲＩＥ装置３０１による処理を施したガラスウェハ３２０１は、縦横のスクライブライン３２０２に沿ってダイシングソーで切削される。顕微鏡用スライドとなる切削により切り出された各チップ３２０３は、上述のステップＳ１０２およびステップＳ１０３のＲＩＥ装置３０１による処理を施した面に、上述の樹脂製のフロスト部３２０４を有している。フロスト部３２０４は、準備するウェハに予めウレタン印刷などでスクライブライン３２０２に沿って樹脂膜を片面に印刷しておき、印刷した面とは反対側の面が下部電極３０３ｂに向き合うようにステップＳ１０１でウェハを置くことで形成することができる。または、ステップＳ１０３の後に、ウレタン印刷などでスクライブライン３２０２に沿って樹脂膜を印刷した後に、ダイシングソーで切削して各チップ３２０３を切り出して、フロスト部３２０４を得ることもできる。または、ダイシングソーで切削して各チップ３２０３を切り出した後に、ウレタン印刷などで各チップ３２０３に樹脂膜を形成し、フロスト部３２０４を形成することもできる。各チップ３２０３の一辺の長さ、例えば長辺の長さを２６ｍｍとすることで、一般的なスライドガラス用の染色瓶等を用いることが出来、作業性を向上させることができる。また、顕微鏡用スライドとなる各チップ３２０３の大きさを、長さ７６ｍｍ以内、幅２６ｍｍ以内、および厚さ１ｍｍ以内とすることで、一般的なスライドガラスの大きさである長さ７６ｍｍ、幅２６ｍｍ、厚さが１ｍｍのホルダに製造した顕微鏡用スライドを搭載して、載置した切片の観察を容易にすることができる。
　本実施例では、動物組織のパラフィン包埋切片の貼り付けの例を示したが、本実施例の顕微鏡用スライドは、植物試料であるエンドウの凍結切片でも、良好な接着性が得られた。酵母や幹細胞などの細胞の基板表面への付着や、樹脂包埋切片の顕微鏡用スライドへの貼り付けに対しても、本発明を適用することができる。
　本実施例では、ステップＳ１０２で、ＲＩＥ装置３０１のチャンバ３０２内に、スライドガラス２０１の主成分である二酸化珪素を反応性イオンでエッチングするためにＣＨＦ３ガスを導入したが、他の弗素系のガスを導入することもできる。例えば、フロロカーボンのＣＦ４にＨ２を混合したガスをＣＨＦ３ガスの代わりに用いることができる。エッチングガスには、他に、Ｃ２Ｆ６、Ｃ３Ｆ８、Ｃ４Ｆ８、Ｃ５Ｆ８などのフロロカーボンを用いることができる。また、本実施例では、ＲＩＥ装置を使用しているが、他のドライエッチング装置を用いることもできる。
　本実施例では、フロスト部２０２として、カラーウレタン印刷によるものを示したが、フロスト調が必要ではない場合には、カラーウレタン印刷の際にフロスト剤を含めないで着色剤を含んだ樹脂を印刷することもできる。また、フロスト部２０２を、ガラスを削って粗面化することで得た場合には、反応性イオンエッチングによる着色の変化は見ることができないが、フロスト部がある側に対して本実施例の反応性イオンエッチングの処理を行うことで、本実施例の反応性イオンエッチングの処理を施した面を特定することができる。
　図６から図１１を用いて、本発明の第２の実施例を説明する。本実施例は、上述の第１の実施例とは、基板としてシランコートされたスライドガラスを準備する点と、反応性イオンエッチングを施す領域を制限している点と、複数の装置で観察または分析する際に用いられる位置合わせのマーカを形成している点が異なる。ここで、複数の装置の組合せは、例えば、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）と蛍光顕微鏡（ＦＯＭ）の組合せや、ＳＥＭと共焦点レーザ顕微鏡（ＣＬＭ）の組合せである。これらの組合せにより、例えば、荷電粒子線装置であるＳＥＭで高精細に形態観察した像と、光学顕微鏡であるＦＯＭまたはＣＬＭで蛍光観察した像と、を重ね合わせて、観察または分析をすることができる。
　図６は、本発明の実施例である顕微鏡用スライドの製造方法のフロー図である。図６のステップＳ６０１では、図７に示したスライドガラス７０１を準備し、ＲＩＥ装置３０１のチャンバ３０２内に置く。具体的には、第１の実施例と同様に、スライドガラス７０１は、フロスト部７０２が無い側が下部電極３０３ｂに向き合うように置かれる。これにより、フロスト部７０２のある側が、ドライエッチングされる。ここで、スライドガラス７０１は、二酸化珪素を主成分とする。
　スライドガラス７０１の表面は、シランコートされている。本実施例では、スライドガラス７０１の表面は、アミノ基を有するシランカップリング剤の３－アミノプロピルトリメトキシシランでコートされている。スライドガラス７０１は、第１の実施例と同様に、片面にフロスト部７０２を有する。また、フロスト部７０２は着色されている。フロスト部７０２の着色は、例えばピンクの着色である。
　また、スライドガラス７０１のフロスト部７０２が設けられている側の表面には、位置合わせマーカ７０３－１および位置合わせマーカ７０３－２が設けられている。位置合わせマーカ７０３－１および位置合わせマーカ７０３－２のそれぞれには、マーカを特定するための“１”、“２”の数字が付して設けられている。位置合わせマーカ７０３－１および位置合わせマーカ７０３－２は、スライドガラス７０１のフロスト部７０２が設けられている側の表面に、例えば、レーザマーキング、集束イオンビーム（ＦＩＢ）によるエッチング、またはＦＩＢによる材料の堆積により設けることができる。また、例えば、位置合わせマーカ７０３－１および位置合わせマーカ７０３－２は、フロスト部７０２をカラーウレタンなどの樹脂で印刷する際に併せて樹脂を印刷することで形成することができる。または、位置合わせマーカ７０３－１および位置合わせマーカ７０３－２を蛍光材料を用いて形成することで、蛍光観察の像での位置合わせに適するようにすることもできる。
　さらに、図８に示したように、フロスト部７０２の一部、位置合わせマーカ７０３－１、および位置合わせマーカ７０３－２を覆うように、スライドガラス７０１上にマスク部材８０１を配置する。マスク部材８０１で準備した基板であるスライドガラス７０１の表面の一部を覆うことで、第１の実施例で述べた凹凸の表面形状が導入される領域を制限する。マスク部材８０１は、例えば、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）の板で形成することができる。または、マスク部材８０１を、透明なシリコーンゴムであるポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）のシートで形成することができる。ＰＤＭＳのシートでマスク部材８０１を形成することで、ＰＤＭＳシートの自己吸着作用により、スライドガラス７０１とマスク部材８０１とを固定する治具が不要となる。また、ＰＤＭＳのシートは容易にカットすることができるので、任意の形のマスク部材８０１を容易に形成することができる。
　次に、ステップＳ６０２では、スライドガラス７０１のマスク部材８０１で覆われていない部分のシランコートを除去するために、ＲＩＥ装置３０１のチャンバ３０２内に、酸素ガスを導入し、上部電極３０３ａと下部電極３０３ｂの間に高周波電力を印加してプラズマを発生させ、スライドガラス７０１表面のマスク部材８０１で覆われていない部分をアッシングする。ステップＳ６０２のアッシングの条件は、例えば、酸素ガスを導入し、０．５Ｗ／ｃｍ２、４０Ｐａ、アッシングの時間を１０分間にすることができる。
　続くステップＳ６０３では、第１の実施例と同様に、エッチングガスとしてＣＨＦ３ガスを導入し、上部電極３０３ａと下部電極３０３ｂの間にプラズマを発生させ、スライドガラス７０１表面のマスク部材８０１で覆われていない部分を反応性イオンでエッチングする。
　次に、ステップＳ６０４では、第１の実施例と同様に、ＲＩＥ装置３０１のチャンバ３０２内に、スライドガラス７０１の表面に残った残留物を取り除くために酸素ガスを導入し、上部電極３０３ａと下部電極３０３ｂの間にプラズマを発生させ、ステップＳ６０３でエッチングしたスライドガラス７０１の表面をアッシングする。ステップＳ６０４の処理の後に、マスク部材８０１を顕微鏡用スライドから取り除く。
　以上で、本実施例の顕微鏡用スライドであるスライドガラスを製造することができる。図９に、本実施例で製造されたスライドガラス９０１を示す。本実施例により製造されたスライドガラス９０１は、マスク部材８０１に覆われなかった表面の領域９０３ａには、反応性イオンでエッチングされた結果、第１の実施例と同様に凹凸が導入される。第１の実施例と同様に、反応性イオンでエッチングされた領域９０３ａは、水に対する接触角が１０度程度または１０度よりも小さい角度の高い親水性を示す。それに対して、マスク部材８０１に覆われた表面の領域９０３ｂは、３－アミノプロピルトリメトキシシランによるシランコートが維持されているために、水に対する接触角が領域９０３ａの水に対する接触角よりも大きい。本実施例の顕微鏡用スライドであるスライドガラス９０１は、シランコートが維持され、疎水性を示す領域９０３ｂと、ドライエッチングされ、親水性を示す領域９０３ａとの間に水に対する濡れ性の境界９０４を有する。一様に処理を施すことが容易なウェットプロセスであるシランコーティングで、基板の表面全体を処理した後に、マスクプロセスによる所望の領域への処理が容易なドライエッチングプロセスで切片を載置する領域を形成することで、再現性良く本実施例の顕微鏡用スライドを製造することができる。
　マスク部材８０１に覆われなかったフロスト部９０２ａは、製造のため準備したスライドガラス７０１のフロスト部７０２よりも、上述の反応性イオンによる処理の結果、第１の実施例と同様に着色が薄くなる。フロスト部９０２ａの着色が薄くなることで、上述の反応性イオンエッチングの処理がなされたスライドガラスであることを識別することができる。また、マスク部材８０１に覆われていたフロスト部９０２ｂは、元々の着色を保っているので、フロスト部９０２ａとは目視で識別できる。このように、着色されたフロスト部の一部をマスクすることで、上述の反応性イオンエッチングの処理がなされた顕微鏡用スライドであることをより容易に識別することができる。
　図１０に、水面１００１に浮かべた切片１００２をスライドガラス９０１に載置する様子を示した。図９の境界９０４に相当する位置を破線の矢印１００３で示した。水面１００１は、領域９０３ａの高い親水性と、領域９０３ａとシランコートが維持された領域９０３ｂの親水性の差により、表面張力で矢印１００３の位置まで上昇する。これにより、矢印１００３の位置が切片１００２を矢印１００５の方向に寄せる際の目標になり、作業者の技量に寄らず、図１１に示したように、パラフィン１１０１で包埋されている組織切片１００２を再現性良くスライドガラス９０１の所望の位置に載置することができる。また、本実施例では、さらに境界９０４に沿って領域９０３ｂ上に位置合わせマーカ７０３－１および位置合わせマーカ７０３－２が形成されているので、位置合わせマーカ７０３－１および位置合わせマーカ７０３－２を用いて、異なる顕微鏡観察の間での観察領域の位置合わせが可能であり、例えば、光学顕微鏡である透過型顕微鏡、落射型顕微鏡、または位相差顕微鏡で形態観察した像や、荷電粒子線装置であるＳＥＭで高精細に形態観察した像と、光学顕微鏡であるＦＯＭまたはＣＬＭで蛍光観察した像と、を容易に重ね合わせて、観察または分析をすることができる。
　本実施例では、準備したスライドガラス７０１のシランコーティングには、３－アミノプロピルトリメトキシシランを用いる例を示したが、例えば、シランコーティングにアルキル基を有するシランカップリング剤のオクタデシルトリメトキシシランを用いることで、シランコートが維持された領域９０３ｂの水に対する接触角を、３－アミノプロピルトリメトキシシランを用いる場合よりもさらに大きくして、領域９０３ｂを撥水性にすることができる。シランコートが維持された領域９０３ｂを撥水性とすることで、より容易に水面から目視で領域９０３ａと領域９０３ｂとの境界９０４を認識することができる。また、シランコートされたスライドガラスを準備する代わりに、ポリエチレンイミンやポリリジンなどのポリマーで表面がコーティングされた基板を準備することでも、上述と同様に反応性イオンでエッチングされた領域９０３ａとポリエチレンイミンやポリリジンなどのポリマーコーティングがマスク部材８０１によって維持された表面とで親水性に差を持たせることができ、境界９０４の表面張力を利用した目視による認識や、位置合わせマーカ７０３－１および位置合わせマーカ７０３－２を用いた像の重ね合わせによる観察または分析をすることができる。
　図１２から図１６を用いて、本発明の第３の実施例を説明する。本実施例は、上述の第２の実施例とは、主に、マスク部材を配置する方向が異なる。
　本実施例の顕微鏡用スライドの製造方法のフローも、第２の実施例の図６で説明する。本実施例では、ステップＳ６０１では、図１２に示したスライドガラス１２０１を準備し、ＲＩＥ装置３０１のチャンバ３０２内に置く。具体的には、第１の実施例と同様に、スライドガラス１２０１は、フロスト部１２０２が無い側が下部電極３０３ｂに向き合うように置かれる。これにより、フロスト部１２０２のある側が、ドライエッチングされる。ここで、スライドガラス１２０１は、二酸化珪素を主成分とする。
　スライドガラス１２０１の表面は、第２の実施例と同様にシランコートされている。本実施例では、スライドガラス１２０１の表面は、３－アミノプロピルトリメトキシシランでコートされている。スライドガラス１２０１は、第１の実施例と同様に、片面にフロスト部１２０２を有し、フロスト部１２０２は着色されている。フロスト部１２０２の着色は、例えばピンクの着色である。
　また、スライドガラス１２０１のフロスト部１２０２が設けられている側の表面には、二点鎖線で囲んだ領域に位置合わせマーカ列１２０３が設けられている。位置合わせマーカ列１２０３は、スライドガラス１２０１のフロスト部１２０２が設けられている側の表面に、例えば、レーザマーキング、ＦＩＢによるエッチング、またはＦＩＢによる材料の堆積により設けることができる。また、例えば、位置合わせマーカ列１２０３は、フロスト部１２０２をカラーウレタンなどの樹脂で印刷する際に併せて樹脂を印刷することで形成することができる。または、位置合わせマーカ列１２０３を蛍光材料を用いて形成することで、蛍光観察の像での位置合わせに適するようにすることもできる。
　さらに、図１３に示したように、フロスト部１２０２の一部および位置合わせマーカ列１２０３を覆うように、上述の第２の実施例と同様に、スライドガラス１２０１上にマスク部材１３０１を配置する。ここで、マスク部材１３０１の辺の一つを利用して、マスクされた部分とマスクされない部分の境界を直線状とする。
　次に、ステップＳ６０２では、第２の実施例と同様に、スライドガラス１２０１のマスク部材１３０１によって覆われていない部分のシランコートを除去するために、ＲＩＥ装置３０１のチャンバ３０２内に、酸素ガスを導入し、上部電極３０３ａと下部電極３０３ｂの間にプラズマを発生させ、スライドガラス１２０１表面のマスク部材１３０１によって覆われていない部分の表面をアッシングする。
　続くステップＳ６０３では、第１の実施例と同様に、ＣＨＦ３ガスを導入し、上部電極３０３ａと下部電極３０３ｂの間にプラズマを発生させ、スライドガラス１２０１表面のマスク部材１３０１で覆われていない部分を反応性イオンでエッチングする。
　次に、ステップＳ６０４では、第１の実施例と同様に、ＲＩＥ装置３０１のチャンバ３０２内に、スライドガラス１２０１の表面に残った残留物を取り除くために酸素ガスを導入し、上部電極３０３ａと下部電極３０３ｂの間にプラズマを発生させ、ステップＳ６０３でエッチングしたスライドガラス１２０１の表面をアッシングする。ステップＳ６０４の処理の後に、マスク部材１３０１を顕微鏡用スライドから取り除く。
　以上で、本実施例の顕微鏡用スライドであるスライドガラスを製造することができる。図１４に、本実施例で製造されたスライドガラス１４０１を示す。本実施例で製造されたスライドガラス１４０１は、マスク部材１３０１に覆われなかった領域１４０３ａには、反応性イオンでエッチングされた結果、第１の実施例と同様に凹凸が導入されている。第１の実施例と同様に、反応性イオンでエッチングされた領域１４０３ａは、水に対する接触角が１０度程度または１０度よりも小さい角度の高い親水性を示す。それに対して、マスク部材１３０１に覆われた領域１４０３ｂは、３－アミノプロピルトリメトキシシランによるシランコートが維持されているために、水に対する接触角が領域１４０３ａの水に対する接触角よりも大きい。マスク部材１３０１に覆われなかったフロスト部１４０２ａは、製造のため準備したスライドガラス１２０１のフロスト部１２０２よりも、上述の反応性イオンによる処理の結果、着色が薄くなる。フロスト部１４０２ａの着色が薄くなることで、上述の反応性イオンエッチングの処理がなされたスライドガラスであることを識別することができる。また、マスク部材１３０１に覆われていたフロスト部１４０２ｂは、元々の着色を保っているので、フロスト部１４０２ａとは目視で識別できる。さらに、反応性イオンでエッチングされた領域１４０３ａとマスク部材１３０１に覆われた領域１４０３ｂとの境界１４０４を、フロスト部１４０２ａとフロスト部１４０２ｂとの境界から目視で推測できる。
　図１５に、水面１５０１に浮かべた連続切片１５０２をスライドガラス１５０１に載置する様子を示した。図１４の境界１４０４に相当する位置を破線の矢印１５０３で示した。水面１５０１は、第２の実施例と同様に、領域１４０３ａの高い親水性と、表面１４０３ａとシランコートが維持された領域１４０３ｂの親水性の差により、表面張力で矢印１５０３の位置まで上昇する。これにより、矢印１５０３の位置が連続切片１５０２を矢印１５０５の方向に寄せる際の目標になり、作業者の技量に寄らず、図１６に示したように、連続切片１５０２を再現性良くスライドガラス１４０１の所望の位置に載置することができる。また、本実施例では、さらに境界１４０４に沿って領域１４０３ｂ上に位置合わせマーカ列１２０３が形成されているので、位置合わせマーカ列１２０３を用いて、異なる顕微鏡観察の間での観察領域の位置合わせが可能であり、例えば、連続切片１５０２の内の所望の切片について、光学顕微鏡である透過型顕微鏡、落射型顕微鏡、または位相差顕微鏡で形態観察した像や、荷電粒子線装置であるＳＥＭで高精細に形態観察した像と、光学顕微鏡であるＦＯＭまたはＣＬＭで蛍光観察した像と、を容易に重ね合わせて、観察または分析をすることができる。
　本実施例では、準備する基板のシランコーティングに３－アミノプロピルトリメトキシシランを用いる例を示したが、実施例２と同様に撥水性を得るために、アルキル基を有するシランカップリング剤のオクタデシルトリメトキシシランを用いることができる。
　本発明の第４の実施例は、上述の各実施例とは、主に、準備する基板に上述の反応性イオンによるエッチングを施す層を有している点が異なる。図１７（ａ）は、準備する基板１７０１が酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）層１７０２を有している例を示す基板の側面図の模式図である。基板１７０１は、二酸化珪素のガラス板の上面にＩＴＯ層１７０２を有している。ここで、準備するＩＴＯ層１７０２の厚さは、後述する反応性イオンによるエッチングでＩＴＯ層１７０２がエッチングされる厚さよりも厚い。したがって、本実施例の反応性イオンによるエッチングを施して表面に凹凸を導入した後でもＩＴＯ層１７０２が残るために、導電性が確保され、製造した顕微鏡用スライドで残ったＩＴＯ層１７０２上に載置した切片の荷電粒子線装置であるＳＥＭによる観察を容易にすることができる。
　本実施例では、上述の実施例の図１および図６で説明した製造方法において、基板１７０１は、ＩＴＯ層１７０２が形成された側とは反対側が下部電極３０３ｂに向き合うように置かれ、ＲＩＥ装置３０１のチャンバ３０２内にＣＨＦ３ガスを導入する代わりに、エッチングガスとして、ヨウ化水素（ＨＩ）ガス、またはＣＨ４ガス及びＨ２ガスを導入することで、ＩＴＯ層１７０２を反応性イオンでエッチングし、ＩＴＯ層１７０２に第１の実施例１と同様に凹凸の表面形状を導入する。
　本実施例では、基板１７０１は、ガラス板にＩＴＯ層１７０２を形成したものであるが、ガラス板として、例えば、ガラスウェハを用いることができる。
　また、本実施例のＩＴＯ層１７０２の代わりに、二酸化珪素のガラス板に反応性イオンエッチングされる厚さよりも厚い窒化珪素層１７０４を有する基板１７０３を準備する変形例の基板の側面図の模式図を図１７（ｂ）に示す。窒化珪素層１７０４をエッチングするためのエッチングガスとして、例えば弗素系のガスを使用して窒化珪素層を反応性イオンでエッチングして第１の実施例と同様の凹凸の表面形状を導入することで、エッチング後も残っている窒化珪素層により、顕微鏡用スライドに耐薬品性を付与することができる。さらに、図１７（ｂ）に示したように、基板１７０３が窒化珪素層１７０４を有する側とは反対側にも窒化珪素層１７０５を有することで、顕微鏡用スライドにさらに高い耐薬品性を与えることができる。窒化珪素層１７０５の厚さは、例えば、エッチング前の窒化珪素層１７０４の厚さと同程度にすることができる。
　図１８を用いて、本発明の第５の実施例を説明する。本実施例では、各実施例で示した位置合わせマーカを利用した、観察および分析方法を説明する。図１８は、本実施例で用いられる、観察システム１８０１を示す図である。
　観察システム１８０１は、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）１８０２と、共焦点レーザ顕微鏡（ＣＬＭ）１８０３と、蛍光顕微鏡（ＦＯＭ）１８０４と、サーバ１８０５と、を有する。ＳＥＭ１８０２、ＣＬＭ１８０３、ＦＯＭ１８０４、およびサーバ１８０５は、それぞれがインタフェース１８０６を有しており、ネットワーク１８０７で互いに接続されている。
　ＳＥＭ１８０２、ＣＬＭ１８０３、およびＦＯＭ１８０４は、それぞれ試料の観察位置または分析位置を変えるためのＸＹステージ１８０８およびＸＹステージ１８０８の動作を制御するステージコントローラ１８０９を有しており、上述の実施例の位置合わせマーカと切片上の観察の対象または分析の対象との位置関係をステージコントローラ１８０９に取り込み、また、取り込まれた位置関係に基づいてＸＹステージ１８０８で位置合わせを行うことができる。
　サーバ１８０５は、バス１８１３に接続された中央演算装置（ＣＰＵ）１８１０、メモリ１８１１、およびストレージ１８１２を有する。各ステージコントローラ１８０９で取り込まれた位置関係は、サーバ１８０５に転送され、サーバ１８０５はストレージ１８１２に取り込まれた位置関係を保存する。各位置関係は、観察対象または分析対象のサンプルの情報と、取得された画像データまたは分析結果に関連付けられてストレージ１８１２に保存される。ストレージ１８１２に保存された位置関係は、ＳＥＭ１８０２、ＣＬＭ１８０３、またはＦＯＭ１８０４に呼び出され、呼び出された位置関係を再現した撮像または分析が行われ、観察対象または分析対象のサンプルの情報と、新たに取得された画像データまたは分析結果と、再現した位置関係とが、ストレージ１８１２に保存される。
　サーバ１８０５は、同じサンプルで位置関係を再現して撮像された画像を重ね合わせて出力することができる。これにより、例えば、荷電粒子線装置であるＳＥＭで高精細に形態観察した切片の像と、光学顕微鏡であるＦＯＭまたはＣＬＭで蛍光観察した切片の像と、を容易に重ね合わせて、観察または分析をすることができる。
　本実施例では、ＳＥＭ１８０２、ＣＬＭ１８０３、およびＦＯＭ１８０４をサーバ１８０５に接続した例を示したが、透過型顕微鏡、落射型顕微鏡、または位相差顕微鏡なども同様にして、サーバ１８０５に接続することができる。
　図２０から図２３を用いて、本発明の第６の実施例を説明する。本実施例は、上述の第２の実施例とは、主に、マスク部材のスライドガラスの長手方向および短手方向の両方に構造を設ける点が異なる。
　本実施例の顕微鏡用スライドの製造方法のフローも、第２の実施例の図６で説明する。本実施例では、ステップＳ６０１では、図２０に示したスライドガラス２００１を準備し、ＲＩＥ装置３０１のチャンバ３０２内に置く。具体的には、第１の実施例と同様に、スライドガラス２００１は、フロスト部２００２が無い側が下部電極３０３ｂに向き合うように置かれる。これにより、フロスト部２００２のある側が、ドライエッチングされる。ここで、スライドガラス２００１は、二酸化珪素を主成分とする。
　スライドガラス２００１の表面は、第２の実施例と同様にシランコートされている。本実施例では、スライドガラス２００１の表面は、３－アミノプロピルトリメトキシシランでコートされている。スライドガラス２００１は、第１の実施例と同様に片面にフロスト部２００２を有する。また、フロスト部２００２は着色されている。フロスト部２００２の着色は、例えばピンクの着色である。また、スライドガラス２００１のフロスト部２００２が設けられている側の表面には、第２の実施例と同様に位置合わせマーカ２００３－１～４が設けられている。
　さらに、図２１に示したように、フロスト部２００２の一部および位置合わせマーカ２００３―１～４を覆うように、上述の第２の実施例と同様に、スライドガラス２００１上にマスク部材２１０１を配置する。ここで、マスク部材２１０１のフロスト部２００２上の辺と、ガラス上の辺の一つを、図２１に示すように位置を合わせて直線上に配置する。
　次に、ステップＳ６０２では、第２の実施例と同様に、スライドガラス２００１のマスク部材２１０１で覆われていない部分のシランコートを除去するために、ＲＩＥ装置３０１のチャンバ３０２内に、酸素ガスを導入し、上部電極３０３ａと下部電極３０３ｂの間にプラズマを発生させ、スライドガラス２００１表面のマスク部材２１０１で覆われていない部分の表面をアッシングする。
　続くステップＳ６０３では、第１の実施例と同様に、ＣＨＦ３ガスを導入し、上部電極３０３ａと下部電極３０３ｂの間にプラズマを発生させ、スライドガラス２００１表面のマスク部材２１０１で覆われていない部分を反応性イオンでエッチングする。
　次に、ステップＳ６０４では、第１の実施例と同様に、ＲＩＥ装置３０１のチャンバ３０２内に、スライドガラス２００１の表面に残った残留物を取り除くために酸素ガスを導入し、上部電極３０３ａと下部電極３０３ｂの間にプラズマを発生させ、ステップＳ６０３でエッチングしたスライドガラス２００１の表面をアッシングする。ステップＳ６０４の処理の後に、マスク部材２１０１を顕微鏡用スライドから取り除く。
　以上で、本実施例の顕微鏡用スライドであるスライドガラスを製造することができる。図２２に、本実施例で製造されたスライドガラス２２０１を示す。本実施例で製造されたスライドガラス２２０１は、マスク部材２１０１に覆われなかった領域２２０３ａには、反応性イオンでエッチングされた結果、第１の実施例と同様に凹凸が導入されている。第１の実施例と同様に、反応性イオンでエッチングされた領域２２０３ａは、水に対する接触角が１０度程度または１０度よりも小さい角度の高い親水性を示す。それに対して、マスク部材２１０１に覆われた領域２１０３ｂは、３－アミノプロピルトリメトキシシランによるシランコートが維持されているために、水に対する接触角が領域２２０３ａの水に対する接触角よりも大きい。マスク部材２１０１に覆われなかったフロスト部２２０２ａは、製造のため準備したスライドガラス２００１のフロスト部２００２よりも、上述の反応性イオンエッチング処理の結果、着色が薄くなる。フロスト部２２０２ａの着色が薄くなることで、上述の反応性イオンによる処理がなされたスライドガラスであることを識別することができる。また、マスク部材２１０１に覆われていたフロスト部２２０２ｂは、元々の着色を保っているので、フロスト部２２０２ａとは目視で識別できる。さらに、第３の実施例と同様に、反応性イオンでエッチングされた領域２２０３ａとマスク部材２１０１に覆われた領域２２０３ｂとの境界２２０４をフロスト部２２０２ａとフロスト部２２０２ｂの境界から目視で推測できる。
　本実施例では、水面に浮かべた切片を、周辺の領域２２０３ｂよりも高い親水性のために濡れ易い領域２２０３ａに誘導することが容易になる。これにより、作業者の技量に寄らず、図２３に示したように、切片２３０１を再現性良くスライドガラス２２０１の領域２２０３ａに載置することができる。また、本実施例では、さらに境界２２０４に沿って領域２２０３ｂ上に位置合わせマーカ２２０３－１～４が形成されているので、位置合わせマーカ２２０３－１～４を用いて、異なる顕微鏡観察の間での観察領域の位置合わせが可能であり、例えば、光学顕微鏡である透過型顕微鏡、落射型顕微鏡、または位相差顕微鏡で形態観察した像や、荷電粒子線装置であるＳＥＭで高精細に形態観察した像と、光学顕微鏡であるＦＯＭまたはＣＬＭで蛍光観察した像と、を容易に重ね合わせて、観察または分析をすることができる。
　本実施例では、準備する基板のシランコーティングに３－アミノプロピルトリメトキシシランを用いる例を示したが、実施例２と同様に撥水性を得るために、アルキル基を有するシランカップリング剤のオクタデシルトリメトキシシランを用いることができる。
　図３０に、マスク部材２１０１の形状を変えて、マスクされない部分の方向を変えて製造された顕微鏡用スライド３００１を示す。マスク部材２１０１の形状を変えることで、顕微鏡用スライド３００１では、マスクされて反応性イオンでエッチングされなかった領域２２０３ｂに境界２２０４でコの字状に囲まれたマスクされず反応性イオンでエッチングされた領域２２０３ａの長手方向を、顕微鏡用スライド３００１の長手方向に合わせている。顕微鏡用スライド３００１は、上述に加えて、連続切片の貼り付けにも好適である。
　図２４から図２９を用いて、本発明の第７の実施例を説明する。本実施例は、上述の第２の実施例とは、主に、マスク部材に開口を設ける点が異なる。
　本実施例の顕微鏡用スライドの製造方法のフローも、第２の実施例の図６で説明する。本実施例では、ステップＳ６０１では、図２４に示したスライドガラス２４０１を準備し、ＲＩＥ装置３０１のチャンバ３０２内に置く。具体的には、第１の実施例と同様に、スライドガラス２４０１は、フロスト部２４０２が無い側が下部電極３０３ｂに向き合うように置かれる。これにより、フロスト部２４０２のある側が、ドライエッチングされる。ここで、スライドガラス２４０１は、二酸化珪素を主成分とする。
　スライドガラス２４０１の表面は、第２の実施例と同様にシランコートされている。本実施例では、スライドガラス２４０１の表面は、３－アミノプロピルトリメトキシシランでコートされている。スライドガラス２４０１は、第１の実施例と同様に片面にフロスト部２４０２を有する。また、フロスト部２４０２は着色されている。フロスト部２４０２の着色は、例えばピンクの着色である。
　また、スライドガラス２４０１のフロスト部２４０２が設けられている側の表面には、第１の実施例と同様に、位置合わせマーカ２４０３－１～８が設けられている。
　さらに、図２５に示したように、フロスト部２４０２の一部および位置合わせマーカ２４０３―１～８を覆うように、上述の実施例２と同様に、スライドガラス２４０１上にマスク部材２５０１を配置する。
　次に、ステップＳ６０２では、スライドガラス２４０１のマスク部材２５０１で覆われていない部分のシランコートを除去するために、ＲＩＥ装置３０１のチャンバ３０２内に、酸素ガスを導入し、上部電極３０３ａと下部電極３０３ｂの間にプラズマを発生させ、スライドガラス２４０１表面のマスク部材２５０１で覆われていない部分の表面をアッシングする。
　続くステップＳ６０３では、第１の実施例と同様に、ＣＨＦ３ガスを導入し、上部電極３０３ａと下部電極３０３ｂの間にプラズマを発生させ、スライドガラス２４０１表面のマスク部材２５０１がなされていない部分を反応性イオンでエッチングする。
　次に、ステップＳ６０４では、第１の実施例と同様に、ＲＩＥ装置３０１のチャンバ３０２内に、スライドガラス２４０１の表面に残った残留物を取り除くために酸素ガスを導入し、上部電極３０３ａと下部電極３０３ｂの間にプラズマを発生させ、ステップＳ６０３でエッチングしたスライドガラス２４０１の表面をアッシングする。ステップＳ６０４の処理の後に、マスク部材２５０１を顕微鏡用スライドから取り除く。
　以上で、本実施例の顕微鏡用スライドであるスライドガラスを製造することができる。図２６に、本実施例で製造されたスライドガラス２６０１を示す。本実施例で製造されたスライドガラス２６０１は、マスク部材２５０１に覆われなかった領域２６０３ａには、反応性イオンでエッチングされた結果、第１の実施例と同様に凹凸の表面形状が導入されている。第１の実施例と同様に、反応性イオンでエッチングされた領域２６０３ａは、水に対する接触角が１０度程度または１０度よりも小さい角度の高い親水性を示す。それに対して、マスク部材２５０１に覆われた領域２６０３ｂは、３－アミノプロピルトリメトキシシランによるシランコートが維持されているために、水に対する接触角が領域２６０３ａの水に対する接触角よりも大きい。したがって、本実施例では、切片が載置される領域２６０３ａは、領域２６０３ａよりも水に対する接触角が大きい領域に囲まれる。マスク部材２５０１に覆われなかったフロスト部２６０２ａは、製造のため準備したスライドガラス２４０１のフロスト部２４０２よりも、上述の反応性イオンによる処理の結果、着色が薄くなる。フロスト部２６０２ａの着色が薄くなることで、上述の反応性イオンエッチングの処理がなされたスライドガラスであることを識別することができる。また、マスク部材２５０１に覆われていたフロスト部２６０２ｂは、元々の着色を保っているので、フロスト部２６０２ａとは目視で識別できる。さらに、第３の実施例と同様に、反応性イオンでエッチングされた領域２６０３ａとマスク部材２５０１に覆われた領域２６０３ｂとの境界２６０４をフロスト部２６０２ａとフロスト部２６０２ｂの境界から目視で推測できる。
　本実施例では、例えば、反応性イオンエッチングの処理がなされた領域２６０３ａに、水に対する濡れ性の境界２６０４を利用して予め水を張り、薄切片標本作製装置の搬送テープから切片を移して載置することができる。４箇所の領域２６０３ａに切片２７０１を載置した状態を、図２７に示した。また、領域２６０３ａに境界２６０４を利用して、薬液を載せることで切片への染色や標識を効率よく行うことができる。ここで、本実施例では、準備する基板のシランコーティングに３－アミノプロピルトリメトキシシランを用いる例を示したが、実施例２と同様に撥水性を得るために、アルキル基を有するシランカップリング剤のオクタデシルトリメトキシシランを用いることができる。これにより、境界２６０４を利用した領域２６０３ａでの水の保持をより容易にすることができる。また、準備する基板に予めシランコート等の疎水性のコーティングをする代わりに、上述の反応性イオンエッチングの処理による凹凸の表面形状の導入が行われた表面の領域を囲むように、疎水性の材料を塗布または印刷することで、上述の反応性イオンエッチングの処理による凹凸の表面形状の導入が行われた表面の切片が載置される領域の周囲に、上述の反応性イオンエッチングの処理による凹凸の表面形状の導入が行われた表面よりも水に対する接触角が大きくなるコーティングを施すこともできる。
　さらに、本実施例では、境界２６０４に沿って領域２６０３ｂ上に位置合わせマーカ２６０３－１～８が形成されているので、位置合わせマーカ２６０３―１～８を用いて、異なる顕微鏡観察の間での観察領域の位置合わせが可能であり、例えば、光学顕微鏡である透過型顕微鏡、落射型顕微鏡、または位相差顕微鏡で形態観察した像や、荷電粒子線装置であるＳＥＭで高精細に形態観察した像と、光学顕微鏡であるＦＯＭまたはＣＬＭで蛍光観察した像と、を容易に重ね合わせて、観察または分析をすることができる。
　本実施例では、パラフィン包埋切片の例を示したが、図２８に示したように、樹脂包埋切片２８０２でも境界２６０４を利用して切片を所望の位置に貼り付けることができる。図２８に示した顕微鏡用スライド２８０１のように、領域２６０３ａのそれぞれの面積を、切片のサイズに応じて小さくすることで、切片の載置の位置精度を向上させることができる。また、逆に、図２９に示した顕微鏡用スライド２９０１のように、より大きいパラフィン包埋切片２９０２のために、マスク部材２５０１の形状を変えることで、境界２６０４で領域２６０３ｂに囲まれた領域２６０３ａを大きくすることができる。
　３０１：反応性イオンエッチング（ＲＩＥ）装置、３０２：チャンバ、３０３ａ：上部電極、３０３ｂ：下部電極、４０１：スライドガラス、４０２：フロスト部、４０３：反応性イオンでエッチングされた表面、５０２：組織切片、１８０２：走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）、１８０３：共焦点レーザ顕微鏡（ＣＬＭ）、１８０４：蛍光顕微鏡（ＦＯＭ）。

Claims (23)

  1. 　基板を準備し、
    　前記基板の表面の少なくとも一部の領域を、反応性イオンでエッチングすることを特徴とする顕微鏡用スライドの製造方法。
  2. 　請求項１に記載の顕微鏡用スライドの製造方法において、
    　前記反応性イオンでエッチングする条件を、観察に用いられる顕微鏡の空間分解能に応じて変更することを特徴とする顕微鏡用スライドの製造方法。
  3. 　請求項２に記載の顕微鏡用スライドの製造方法において、
    　前記空間分解能が高いほど、前記条件の内のエッチング時間を短くすることを特徴とする顕微鏡用スライドの製造方法。
  4. 　請求項１に記載の顕微鏡用スライドの製造方法において、
    　前記領域の表面が酸化インジウムスズ層の表面であることを特徴とする顕微鏡用スライドの製造方法。
  5. 　請求項１に記載の顕微鏡用スライドの製造方法において、
    　前記基板を準備する際に、疎水性または撥水性のコーティングがなされている基板を準備することを特徴とする顕微鏡用スライドの製造方法。
  6. 　請求項１に記載の顕微鏡用スライドの製造方法において、
    　前記領域が、切片が載置される領域であることを特徴とする顕微鏡用スライドの製造方法。
  7. 　請求項１に記載の顕微鏡用スライドの製造方法において、
    　前記準備する基板は二酸化珪素の基板であり、
    　前記反応性イオンは、弗素系のガスを含むガスを導入して得られることを特徴とする顕微鏡用スライドの製造方法。
  8. 　請求項１に記載の顕微鏡用スライドの製造方法において、
    　前記基板は着色された樹脂膜を有し、
    　前記樹脂膜の少なくとも一部も反応性イオンで処理されることを特徴とする顕微鏡用スライドの製造方法。
  9. 　請求項１に記載の顕微鏡用スライドの製造方法において、
    　前記領域に沿って、位置合わせの際に用いられるマーカを形成することを特徴とする顕微鏡用スライドの製造方法。
  10. 　請求項１に記載の顕微鏡用スライドの製造方法において、
    　ＰＤＭＳのシートでマスク部材を形成することを特徴とする顕微鏡用スライドの製造方法。
  11. 　請求項１に記載の顕微鏡用スライドの製造方法において、
    　前記準備する基板はウェハであり、ダイシングソーで顕微鏡用スライドを切り出すことを特徴とする顕微鏡用スライドの製造方法。
  12. 　請求項１に記載の顕微鏡用スライドの製造方法において、
    　前記領域の表面が窒化珪素層の表面であることを特徴とする顕微鏡用スライドの製造方法。
  13. 　請求項１に記載の製造方法で製造された顕微鏡用スライドの前記領域に、切片を載置することを特徴とする観察方法。
  14. 　請求項９に記載の製造方法で製造された顕微鏡用スライドの前記領域に切片を載置し、前記マーカに基づき画像を重ね合わせることを特徴とする観察方法。
  15. 　請求項１４に記載の観察方法において、
    　前記マーカに基づき光学顕微鏡による画像と荷電粒子線装置による画像とを重ね合わせることを特徴とする観察方法。
  16. 　請求項１５に記載の観察方法において、
    　前記荷電粒子線装置は走査型電子顕微鏡であることを特徴とする観察方法。
  17. 　請求項１に記載の製造方法で製造された顕微鏡用スライドの前記領域に切片を載置することを特徴とする分析方法。
  18. 　切片が載置される領域に、隣り合う凸部と凸部の間に溝が形成されている凹凸の表面形状を有し、
    　前記凹凸の表面形状は、平面視で１μｍ２当たり２５個よりも高い密度で凸部を有する表面形状であることを特徴とする顕微鏡用スライド。
  19. 　請求項１８に記載の顕微鏡用スライドにおいて、
    　前記領域の周囲の水に対する接触角が、前記領域の水に対する接触角よりも大きいことを特徴とする顕微鏡用スライド。
  20. 　請求項１８に記載の顕微鏡用スライドにおいて、
    　前記領域の表面が酸化インジウムスズ層の表面であることを特徴とする顕微鏡用スライド。
  21. 　請求項１８に記載の顕微鏡用スライドにおいて、
    　前記領域の表面が二酸化珪素の基板の表面であることを特徴とする顕微鏡用スライド。
  22. 　請求項１８に記載の顕微鏡用スライドにおいて、
    　前記領域の表面が窒化珪素層の表面であることを特徴とする顕微鏡用スライド。
  23. 　請求項１８に記載の顕微鏡用スライドにおいて、
    　着色された樹脂膜を有し、
    　前記樹脂膜を有する面とは反対側から見た場合の前記樹脂膜の着色よりも、前記樹脂膜を有する面の側から観た場合の前記樹脂膜の少なくとも一部の着色が薄いことを特徴とする顕微鏡用スライド。
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