WO2016024566A1 - 医療器具、細胞培養方法、フッ素含有環状オレフィンポリマー、フッ素含有環状オレフィンポリマー組成物、および培養細胞 - Google Patents
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Abstract
Description
また本発明は、薬物代謝系酵素活性を長期間維持可能な培養細胞を提供することを課題とする。薬物代謝系酵素活性維持出来る培養細胞は、再生医療などに好適に展開出来ると考えられるので、本発明の意義は極めて大きい。
(1) 基材を備え、かつ前記基材の一面に細胞を接触または保持させる医療器具であって、前記基材の少なくとも細胞を保持する前記一面は、下記一般式(1)で表される繰返し構造単位を含有するフッ素含有環状オレフィンポリマーにより構成される医療器具。
(2)細胞を接触または保持する前記一面の水接触角が70°以上160°以下である(1)に記載の医療器具。
(3)細胞を接触または保持する前記一面の水接触角が70°以上120°以下である(1)または(2)に記載の医療器具。
(4) 前記基材の少なくとも細胞と接触する前記一面が、凹凸構造を備える(1)に記載の医療器具。
(5) 細胞と接触する前記一面の水接触角が121°以上160°以下である(4)に記載の医療器具。
(6) 前記基材の少なくとも細胞を接触または保持する前記一面は、前記フッ素含有環状オレフィンポリマーと、光硬化性化合物と、光硬化開始剤と、を含むフッ素含有環状オレフィンポリマー組成物により構成される(1)~(5)のいずれか一項に記載の医療器具。
(7) 前記フッ素含有環状オレフィンポリマー組成物中における前記フッ素含有環状オレフィンポリマーと前記光硬化性化合物の質量比(フッ素含有環状オレフィンポリマー/光硬化性化合物)が、99.9/0.1~50/50である(6)に記載の医療器具。
(8) 前記一面に接触または保持させた細胞を培養するために用いられる(1)~(7)のいずれか一項に記載の医療器具。
(9) 細胞培養において、細胞が群体を形成しながら増殖する(8)に記載の医療器具。
(10) 培養した細胞を緩衝液により浮遊して前記一面から離脱させる(8)または(9)に記載の医療器具。
(11) (1)~(10)のいずれか一項に記載の医療器具の前記基材の前記一面上に、前記一面に接触または保持するよう細胞を播種する工程と、
前記細胞を培養して培養細胞を得る工程と、
前記一面上に緩衝液を添加して、前記一面から前記培養細胞を浮遊させる工程と、
を備える細胞培養方法。
(12) 基材を備え、かつ前記基材の一面に細胞を接触または保持させる医療器具の、前記基材の少なくとも細胞を保持させる前記一面を構成するフッ素含有環状オレフィンポリマーであって、下記一般式(1)で表される繰返し構造単位を含有するフッ素含有環状オレフィンポリマー。
(13) 基材を備え、かつ前記基材の一面に細胞を接触または保持させる医療器具の、前記基材の少なくとも細胞を保持させる前記一面を構成するフッ素含有環状オレフィンポリマー組成物であって、
下記一般式(1)で表される繰返し構造単位を含有するフッ素含有環状オレフィンポリマーと、
光硬化性化合物と、
光硬化開始剤と、
を含むフッ素含有環状オレフィンポリマー組成物。
(14) 薬物代謝系酵素活性を少なくとも7日間維持した培養細胞。
尚、前記のアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル等の置換基は、本明細書においてはそれぞれアルキル基、アルコキシ基、アルコキシアルキル基と記載することがある。
また、本明細書中の「繰り返し構造単位」について、単に「構造単位」と表現することもできる。
これに対し、本実施形態によれば、上記一般式(1)のフッ素含有環状オレフィンポリマーによって細胞を保持させる基材の一面を構成することにより、増殖した細胞が基材の一面に接着および付着することを抑制することができる。このため、継代操作によらずとも、厚み方向に対して群体を形成するように細胞を増殖させることが可能となる。したがって、細胞の損傷の発生や操作の煩雑化を抑えつつ、より効率的な細胞培養を行うことが可能となる。
また、本実施形態の医療器具を用いて作製した培養細胞は、薬物代謝系酵素活性を少なくとも7日間維持した培養細胞である。すなわち、生体内での細胞増殖とほぼ同じ機能を維持したまま成長させた培養細胞であり、細胞の種類を限定的に選ばない。もしくは、遺伝子変異を起こす確率の高いウイルスまたは細菌などごく限られた細胞の種類を除いて正常に生細胞を培養することができる。その細胞の薬物代謝系酵素活性は、低温下で保存するまたは特別な培養保存操作(例えば、酸素過多で保存するなど)をすることなく、少なくとも7日間維持され、好ましくは、10日間維持した培養細胞である。特に好ましくは14日間維持された培養細胞である。一方、細胞の形状は、特に限定する必要は無いが、例示するならば、例えば、シート状細胞、群生状(含むスフェロイド)細胞、神経系形態細胞などである。特に、再生医療の分野では、短期間で、かつ、生体細胞と同様な薬物代謝系酵素活性を維持していることが望まれており、本実施形態の培養細胞のように好適に生産できることが、重要な訴求点になる。
また、本実施形態の培養細胞は、創薬やバイオ薬品、美容においても同様の機能を長期間維持することが期待でき、世界的な潮流となりうる発明である。
また、他の態様においては、より高い水接触角とすることもでき、たとえば、基材の一面における水接触角を121°~160°の範囲に設定することもできる。このように121°~160°の水接触角を実現するためには、基材の一面に凹凸構造を形成させて制御する方法が好ましく用いられる。細胞の損傷を抑える観点や、効率的な細胞培養を行う観点からは、上記の水接触角が123°以上155°以下であることがより好ましく、125°以上150°以下とすることが特に好ましい。本実施形態においては、上記一般式(1)で表される繰返し構造単位を含有するフッ素含有環状オレフィンポリマーを用いて上記基材の一面を形成することが、水接触角を所望の範囲とするために重要な要素の一つである。
これらの細胞の由来としては各種生物、例えば、ヒト、イヌ、ラット、マウス、トリ、ブタ、ウシ、昆虫等の細胞、または、これらが集合して形成された組織、器官、微生物、ウイルスなどが挙げられ、より具体的には、ヒト子宮頚部癌由来、Chinese hamster卵巣由来、CV-1細胞由来、ヒト骨髄性白血病由来、ヒト乳癌由来、ヒトT細胞白血病由来、Africa green monkey腎由来、ヒト副腎髄褐色細胞種由来、ヒト骨髄性白血病由来、C3Hマウス皮下組織由来、ヒト胎児腎由来、ヒト肝癌由来、ヒト組織球性白血病由来、ヒト大腸癌由来、ヒト肺癌由来、マウスメラノーマ由来、イヌ腎臓由来、Balb/cマウス胎仔由来、Chinese hamster肺由来、Swiss3T3由来、NIH Swissマウス胎仔由来、ヒトバーキットリンパ腫由来、ヒト肺非小細胞癌由来、ヒト皮膚Epidermoid Carcinoid由来、蛾の幼虫卵巣由来、ヒト神経芽細胞腫由来、Sirian golden hamster腎由来、マウスマクロファージ由来、マウス筋組織由来、雑系Swissマウス胎仔由来、ヒト急性T細胞白血病由来、マウスEC細胞OTT6050由来、マウスcalvaria由来、ヒト表皮角化細胞由来、DBA/2マウス胸腺腫瘍由来、ヒト幹細胞癌由来、ラット結合織由来、ヒト骨肉腫由来、ヒト胎児肺由来、ヒト胎児肺由来、ヒト神経芽細胞腫由来、マウスインスリノーマ由来、ヒト胃癌由来、C3Hマウス胎仔由来、ニワトリB細胞白血病由来、マウス自然発生乳癌由来、などが例示される。
フッ素含有環状オレフィンポリマーは、上述したとおり、下記一般式(1)で表される繰返し構造単位を含有するものである。本実施形態においては、このフッ素含有環状オレフィンポリマーを用いて、基材の一面に細胞を接触または保持させる医療器具の当該基材の少なくとも一面を形成することができる。
また、R1~R4が互いに結合して環構造を形成していてもよく、ペルフルオロシクロアルキル、酸素を介したペルフルオロシクロエーテル等の環を形成してもよい。
さらに、フッ素を含有しないその他のR1~R4は、水素;メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、2-メチルイソプロピル、n-ブチル、n-ペンチル、シクロペンチル等の炭素数1~10のアルキル;メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、ペントキシ等の炭素数1~10のアルコキシ;またはメトキシメチル、エトキシメチル、プロポキシメチル、ブトキシメチル、ペントキシメチル等の炭素数2~10のアルコキシアルキルが例示される。
ポリ(1,1-ビス(トリフルオロメトキシ)-3,5-シクロペンチレンエチレン)、ポリ(1,1,2-トリフルオロ-2-トリフルオロメトキシ-3,5-シクロペンチレンエチレン)、ポリ(1,2-ビス(トリフルオロメトキシ)-3,5-シクロペンチレンエチレン)、ポリ(1-ペルフルオロプロポキシ-3,5-シクロペンチレンエチレン)、ポリ(1-メチル-2-ペルフルオロプロポキシ-3,5-シクロペンチレンエチレン)、ポリ(1-ブチル-2-ペルフルオロプロポキシ-3,5-シクロペンチレンエチレン)、ポリ(1-ペルフルオロ-iso-プロポキシ-3,5-シクロペンチレンエチレン)、ポリ(1-メチル-2-ペルフルオロ-iso-プロポキシ-3,5-シクロペンチレンエチレン)、ポリ(1,2-ジフルオロ-1,2-ビス(トリフルオロメトキシ)-3,5-シクロペンチレンエチレン)、ポリ(1-ペルフルオロブトキシ-3,5-シクロペンチレンエチレン)、ポリ(1-ペルフルオロ-iso-ブトキシ-3,5-シクロペンチレンエチレン)、ポリ(1-ペルフルオロ-tert-ブトキシ-3,5-シクロペンチレンエチレン)、ポリ(1-メチル-2-ペルフルオロ-iso-ブトキシ-3,5-シクロペンチレンエチレン)、ポリ(1-ブチル-2-ペルフルオロ-iso-ブトキシ-3,5-シクロペンチレンエチレン)、ポリ(1,2-ジフルオロ-1-トリフルオロメトキシ-2-ペルフルオロエトキシ-3,5-シクロペンチレンエチレン)、ポリ(1,1,2-トリフルオロ-2-ペルフルオロブトキシ-3,5-シクロペンチレンエチレン)、ポリ(1,2-ジフルオロ-1-トリフルオロメトキシ-2-ペルフルオロブトキシ-3,5-シクロペンチレンエチレン)、ポリ(1-フルオロ-1-ペルフルオロエトキシ-2,2-ビス(トリフルオロメトキシ)-3,5-シクロペンチレンエチレン)、ポリ(1,2-ジフルオロ-1-ペルフルオロプロポキシ-2-トリフルオロメトキシ-3,5-シクロペンチレンエチレン)、ポリ(1-ペルフルオロヘトキシ-3,5-シクロペンチレンエチレン)、ポリ(1-メチル-2-ペルフルオロヘトキシ-3,5-シクロペンチレンエチレン)、ポリ(1-ブチル-2-ペルフルオロヘトキシ-3,5-シクロペンチレンエチレン)、ポリ(1-ヘキシル-2-ペルフルオロヘトキシ-3,5-シクロペンチレンエチレン)、ポリ(1-オクチル-2-ペルフルオロヘトキシ-3,5-シクロペンチレンエチレン)、ポリ(1-ペルフルオロヘプトキシ-3,5-シクロペンチレンエチレン)、ポリ(1-ペルフルオロオクトキシ-3,5-シクロペンチレンエチレン)、ポリ(1-ペルフルオロデトキシ-3,5-シクロペンチレンエチレン)、ポリ(1,1,2-トリフルオロ-ペルフルオロペントキシ-3,5-シクロペンチレンエチレン)、ポリ(1,2-ジフルオロ-1-トリフルオロメトキシ-2-ペルフルオロブトキシ-3,5-シクロペンチレンエチレン)、ポリ(1,1,2-トリフルオロ-2-ペルフルオロヘトキシ-3,5-シクロペンチレンエチレン)、ポリ(1,2-ジフルオロ-1-トリフルオロメトキシ-2-ペルフルオロペンチル-3,5-シクロペンチレンエチレン)、ポリ(1,2-ビス(ペルフルオロブトキシ)-3,5-シクロペンチレンエチレン)、ポリ(1,2-ビス(ペルフルオロへトキシ)-3,5-シクロペンチレンエチレン)、ポリ(1-メトキシ-2-トリフルオロメトキシ-3,5-シクロペンチレンエチレン)、ポリ(1-tert-ブトキシメチル-2-トリフルオロメトキシ-3,5-シクロペンチレンエチレン)、ポリ(1-(2´, 2´, 2´-トリフルオロエトキシ)-3,5-シクロペンチレンエチレン)、ポリ(1-(2´, 2´, 3´, 3´ , 3´-ペンタフルオロプロポキシ)-3,5-シクロペンチレンエチレン)、ポリ(1-メチル-2-(2´, 2´, 3´, 3´ , 3´-ペンタフルオロプロポキシ)-3,5-シクロペンチレンエチレン)、ポリ(1-ブチル-2-(2´, 2´, 3´, 3´ , 3´-ペンタフルオロプロポキシ)-3,5-シクロペンチレンエチレン)、ポリ(1-(1´,1´,1´-トリフルオロ-iso-プロポキシ)-3,5-シクロペンチレンエチレン)、ポリ(1-メチル-(1´,1´,1´-トリフルオロ-iso-プロポキシ)-3,5-シクロペンチレンエチレン)、ポリ(1-(2´, 2´, 3´, 3´ , 4´,4´,4´-ヘプタフルオロブトキシ)-3,5-シクロペンチレンエチレン)、ポリ(1-(1´,1´,1´-トリフルオロ-iso-ブトキシ)-3,5-シクロペンチレンエチレン)、ポリ(1-(1´,1´,1´-トリフルオロ-iso-ブトキシ)-3,5-シクロペンチレンエチレン)、ポリ(1-メチル-2-(1´,1´,1´-トリフルオロ-iso-ブトキシ)-3,5-シクロペンチレンエチレン)、ポリ(1-ブチル-2-(1´,1´,1´-トリフルオロ-iso-ブトキシ)-3,5-シクロペンチレンエチレン)、ポリ(1,2-ジフルオロ-1-トリフルオロメトキシ-2-(2´,2´,2´-トリフルオロエトキシ)-3,5-シクロペンチレンエチレン)、ポリ(1,1,2-トリフルオロ-2-(2´, 2´, 3´, 3´ , 4´,4´,4´-ヘプタフルオロブトキシ)-3,5-シクロペンチレンエチレン)、ポリ(1,2-ジフルオロ-1-トリフルオロメトキシ-2-(2´, 2´, 3´, 3´ , 4´,4´,4´-ヘプタフルオロブトキシ)-3,5-シクロペンチレンエチレン)、ポリ(1-フルオロ-1-(2´, 2´, 2´-トリフルオロエトキシ)-2,2-ビス(トリフルオロメトキシ))-3,5-シクロペンチレンエチレン)、ポリ(1,2-ジフルオロ-1-(2´, 2´, 3´, 3´ , 3´-ペンタフルオロプロポキシ)-2-トリフルオロメトキシ-3,5-シクロペンチレンエチレン)、ポリ(1-(2´, 2´, 3´, 3´ , 4´,4´,5´,5´,6´,6´,6´-ウンデカフルオロヘトキシ)-3,5-シクロペンチレンエチレン)、ポリ(1-メチル-2-(2´, 2´, 3´, 3´ , 4´,4´,5´,5´,6´,6´,6´-ウンデカフルオロヘトキシ)-3,5-シクロペンチレンエチレン)、ポリ(1-ブチル-2-(2´, 2´, 3´, 3´ , 4´,4´,5´,5´,6´,6´,6´-ウンデカフルオロヘトキシ)-3,5-シクロペンチレンエチレン)、ポリ(1-ヘキシル-2-(2´, 2´, 3´, 3´ , 4´,4´,5´,5´,6´,6´,6´-ウンデカフルオロヘトキシ)-3,5-シクロペンチレンエチレン)、ポリ(1-オクチル-2-(2´, 2´, 3´, 3´ , 4´,4´,5´,5´,6´,6´,6´-ウンデカフルオロヘトキシ)-3,5-シクロペンチレンエチレン)、ポリ(1-(2´, 2´, 3´, 3´ , 4´,4´,5´,5´,6´,6´,7´,7´,7´-トリデカフルオロヘプトキシ)-3,5-シクロペンチレンエチレン)、ポリ(1-(2´, 2´, 3´, 3´ , 4´,4´,5´,5´,6´,6´,7´,7´,8´,8´,8´-ペンタデカフルオロオクトキシ)-3,5-シクロペンチレンエチレン)、ポリ(1-(2´, 2´, 3´, 3´ , 4´,4´,5´,5´,6´,6´,7´,7´,8´,8´,9´,9´,9´-ヘプタデカフルオロデトキシ)-3,5-シクロペンチレンエチレン)、ポリ(1,1,2-トリフルオロ-2-(1´,1´,1´-トリフルオロ-iso-プロポキシ)-3,5-シクロペンチレンエチレン)、ポリ(1,2-ジフルオロ-1-トリフルオロメトキシ-2-(2´, 2´, 3´, 3´ , 4´,4´,4´-ヘプタフルオロブトキシ)-3,5-シクロペンチレンエチレン)、ポリ(1,1,2-トリフルオロ-(2´, 2´, 3´, 3´ , 4´,4´,5´,5´,6´,6´,6´-ウンデカフルオロヘトキシ)-3,5-シクロペンチレンエチレン)、ポリ(1,2-ビス(2´, 2´, 3´, 3´ , 4´,4´,4´-ヘプタフルオロブトキシ)-3,5-シクロペンチレンエチレン)、ポリ(1,2-ビス(2´, 2´, 3´, 3´ , 4´,4´,5´,5´,6´,6´,6´-ウンデカフルオロヘトキシ)-3,5-シクロペンチレンエチレン)、ポリ(1,2-ジフルオロ-1-ペルフルオロエチル-2-トリフルオロメチル-3,5-シクロペンチレンエチレン)、ポリ(1,2-ジフルオロ-1-ペルフルオロ-iso-プロピル-2-トリフルオロメチル-3,5-シクロペンチレンエチレン)等が挙げられる。
なお、本明細書中において、「~」で示した数値範囲は、その上限値および下限値を含むものとする。
以下に記載の製造方法によって得られるフッ素含有環状オレフィンポリマーからなるフィルム、または成形物を、細胞培養および細胞を利用した検査のための基材として用いる事により、本実施形態の細胞が接着および付着しづらいことを特徴とする医療器具を好適に得ることができる。
本実施形態において、実質的に一般式(1)で表される繰返し構造単位からなるフッ素含有環状オレフィンポリマーは、後述する方法で製造することができる。これにより、本実施形態の細胞の接着または付着が抑制されることを特徴とする細胞培養および細胞を利用した検査のための基材の原料となる、フッ素含有環状オレフィンポリマーを好適に得ることができる。
具体的には、下記一般式(2)で表わされる環状オレフィンモノマーを開環メタセシス重合触媒によって重合し、得られる重合体の主鎖のオレフィン部を水素添加することによって、フッ素含有環状オレフィンポリマーを合成することができる。
環状オレフィンモノマーの開環メタセシス重合において、環状オレフィンモノマーと開環メタセシス重合触媒とのモル比は、タングステン、モリブデン、またはルテニウム等の遷移金属アルキリデン触媒の場合は、遷移金属アルキリデン触媒1モルに対して、該モノマーを100~30,000モルとすることが好ましく、1,000~20,000モルとすることがより好ましい。
本実施形態において上述のように製造したフッ素含有環状オレフィンポリマーから、細胞の培養、または細胞の検査のために用いる医療器具を作製する方法について記載する。たとえば、以下に示す方法により、本実施形態の基材表面の水接触角が70°以上120°以下である医療器具を作製することが可能になる。本実施形態に係る医療器具は、たとえばフィルムやシート状の単層膜からなる基材や、他の材料の上にコート膜を形成して得られる基材を備える。このような基材を作製する方法としては、たとえば上記において例示した一般式(1)で表されるフッ素含有環状オレフィンポリマーを有機溶剤に溶解させて得られるワニスを用いた溶液キャスト法を挙げることができる。
まず、上述したとおり、上記において例示した一般式(1)で表されるフッ素含有環状オレフィンポリマーを有機溶剤に溶解させてワニスを得る。
次に、本実施形態においてはフッ素含有環状オレフィンポリマー組成物から、細胞の培養、または細胞の検査のために用いる医療器具を作製する方法について記載する。たとえば、以下に示す方法により、本実施形態の基材表面の水接触角が70°以上120°以下である医療器具を作製することが可能になる。
これにより、各種部材との強固な密着性を発現しつつ、細胞培養バッグ、またはプレートなどの各種培養器具の細胞を接触または保持する基材表面の性状を改質することができ、細胞の接着および付着を抑制しつつ増殖させることが可能な医療器具を提供することができる。
まず、上述したとおり、フッ素含有環状オレフィンポリマー(A)を含むフッ素含有環状オレフィンポリマー組成物を有機溶剤に溶解させてワニスを得る。
フッ素含有環状オレフィンポリマー組成物において、フッ素含有環状オレフィンポリマー(A)と光硬化性化合物(B)の質量比(A)/(B)は、99.9/0.1~50/50であることが好ましく、99.9/0.1~55/45であることがより好ましく、99.9/0.1~60/40であることがさらに好ましい。光硬化性化合物(B)としては、反応性二重結合基を有する化合物、カチオン重合可能な開環重合性化合物等が挙げられる。好ましくは、コートして用いる際の硬化後の体積収縮にともなう基材の変形の抑制や、フッ素含有環状オレフィンポリマー(A)との相溶性の観点からカチオン重合可能な開環重合性化合物が選ばれる。
光硬化開始剤(光重合開始剤)(C)としては、光の照射によってカチオンを生成する光カチオン開始剤、光の照射によってラジカルを生成する光ラジカル開始剤、などが挙げられる。光硬化開始剤(C)の使用量は、光硬化性化合物(B)100質量部に対して0.05質量部以上であることが好ましく、0.1~10質量部であることがより好ましい。
オニウム陽イオンの具体例としては、ジフェニルヨードニウム、4-メトキシジフェニルヨードニウム、ビス(4-メチルフェニル)ヨードニウム、ビス(4-tert-ブチルフェニル)ヨードニウム、ビス(ドデシルフェニル)ヨードニウム、トリフェニルスルホニウム、ジフェニル-4-チオフェノキシフェニルスルホニウム、ビス〔4-(ジフェニルスルフォニオ)-フェニル〕スルフィド、ビス〔4-(ジ(4-(2-ヒドロキシエチル)フェニル)スルホニオ)-フェニル〕スルフィド、η5-2,4-(シクロペンタジェニル)〔1,2,3,4,5,6-η-(メチルエチル)ベンゼン〕-鉄(1+)等が挙げられる。また、オニウム陽イオン以外に、過塩素酸イオン、トリフルオロメタンスルホン酸イオン、トルエンスルホン酸イオン、トリニトロトルエンスルホン酸イオン等が挙げられる。また、これらの光カチオン開始剤は、単独で用いても、2種以上組み合わせて用いてもよい。
一方、陰イオンの具体例としては、テトラフルオロボレート、ヘキサフルオロホスフェート、ヘキサフルオロアンチモネート、ヘキサフルオロアルセネート、ヘキサクロロアンチモネート、テトラ(フルオロフェニル)ボレート、テトラ(ジフルオロフェニル)ボレート、テトラ(トリフルオロフェニル)ボレート、テトラ(テトラフルオロフェニル)ボレート、テトラ(ペンタフルオロフェニル)ボレート、テトラ(ペルフルオロフェニル)ボレート、テトラ(トリフルオロメチルフェニル)ボレート、テトラ〔ジ(トリフルオロメチル)フェニル〕ボレート等が挙げられる。また、これらの光カチオン開始剤は、単独で用いても、2種以上組み合わせて用いてもよい。
さらに好ましく用いられる光ラジカル開始剤の具体例としては、例えば、イルガキュアー651(BASF社製)、イルガキュアー184(BASF社製)、ダロキュアー1173(BASF社製)、ベンゾフェノン、4-フェニルベンゾフェノン、イルガキュアー500(BASF社製)、イルガキュアー2959(BASF社製)、イルガキュアー127(BASF社製)、イルガキュアー907(BASF社製)、イルガキュアー369(BASF社製)、イルガキュアー1300(BASF社製)、イルガキュアー819(BASF社製)、イルガキュアー1800(BASF社製)、ダロキュアーTPO(BASF社製)、ダロキュアー4265(BASF社製)、イルガキュアーOXE01(BASF社製)、イルガキュアーOXE02(BASF社製)、エサキュアーKT55(ランベルティー社製)、エサキュアーKIP150(ランベルティー社製)、エサキュアーKIP100F(ランベルティー社製)、エサキュアーKT37(ランベルティー社製)、エサキュアーKTO46(ランベルティー社製)、エサキュアー1001M(ランベルティー社製)、エサキュアーKIP/EM(ランベルティー社製)、エサキュアーDP250(ランベルティー社製)、エサキュアーKB1(ランベルティー社製)、2,4-ジエチルチオキサントンが挙げられる。これらの中で、さらに好ましく用いられる光ラジカル重合開始剤としては、イルガキュアー184(BASF社製)、ダロキュアー1173(BASF社製)、イルガキュアー500(BASF社製)、イルガキュアー819(BASF社製)、ダロキュアーTPO(BASF社製)、エサキュアーKIP100F(ランベルティー社製)、エサキュアーKT37(ランベルティー社製)およびエサキュアーKTO46(ランベルティー社製)が挙げられる。また、これらの光ラジカル開始剤は、単独で用いても、2種以上組み合わせて用いてもよい。
また、フッ素含有環状オレフィンポリマー組成物は硬化後の形態で、光硬化性化合物が3次元の網目構造を形成することで、表面硬度を硬く改質することができる。このため、医療器具等に実装した場合の傷付き性を改善でき、細胞培養や細胞の検査のための基材として用いる際に、利便性良く使用することができる。
本実施形態に係る細胞培養方法は、本実施形態に係る医療器具を構成する基材の一面上に、当該一面に接触または保持されるよう細胞を播種する工程と、当該細胞を培養して培養細胞を得る工程と、上記一面上に緩衝液を添加して、前記一面から前記培養細胞を浮遊させる工程と、を備える。これにより、培養細胞を損傷なく基材から離脱させることができ、かつ効率的な増殖が可能な細胞培養を実現することができる。
好ましくは、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水、塩酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酒石酸緩衝液、トリス緩衝液、トリス塩酸緩衝液、エチレンジアミン四酢酸緩衝液、トリスEDTA緩衝液、トリス酢酸EDTA緩衝液、トリスホウ酸EDTA緩衝液、濃縮SSC緩衝液、濃縮SSPE緩衝液、クエン酸ナトリウム緩衝液、炭酸重炭酸緩衝液、ホウ酸ナトリウム緩衝液、マレイン酸緩衝液などが単独もしくはトリプシン、ペプシン、レンネット、キモトリプシン、エラスターゼ、NADPHデハイドロゲナアゼまたはNADHデハイドロゲナアゼなどの酵素を含有させて用いてもよい。
さらに好ましくは、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水、トリス塩酸緩衝液、エチレンジアミン四酢酸緩衝液、トリスEDTA緩衝液、トリス酢酸EDTA緩衝液、トリスホウ酸EDTA緩衝液、濃縮SSC緩衝液、濃縮SSPE緩衝液、クエン酸ナトリウム緩衝液、炭酸重炭酸緩衝液、ホウ酸ナトリウム緩衝液などを単独もしくはトリプシン、ペプシン、レンネット、キモトリプシン、エラスターゼ、NADPHデハイドロゲナアゼまたはNADHデハイドロゲナアゼなどの酵素を含有させて用いてもよい。
下記の条件下でゲルパーミュエーションクロマトグラフィー(GPC)を使用して、テトラヒドロフラン(THF)または、トリフルオロメチルベンゼン(TFT)に溶解したポリマーの重量平均分子量(Mw)および数平均分子量(Mn)を、ポリスチレンスタンダードによって分子量を較正して測定した。
検出器:日本分光社製RI-2031および875-UVまたはViscotec社製Model270、直列連結カラム:Shodex K-806M、804、803、802.5、カラム温度:40℃、流量:1.0ml/分、試料濃度:3.0~9.0 mg/ml
島津製作所社製DSC-50を用い、測定試料を窒素雰囲下で10℃/分の昇温速度で加熱し測定した。
協和界面科学社製固体表面エナジー解析装置CA-XE型を使用してJIS R3257(基板ガラス表面のぬれ性試験方法)に準拠し、2μlの水滴を基材表面に滴下し、静滴法により、基材表面に水滴が接触してから1分以内に接触角を測定した。
塗布膜の硬化には光源として、シーシーエス社製UV照射装置を用いて波長365nmのLED光、またはエンジニアリングシステム社製UV式インプリント装置を用いて375nmのLED光を照射して硬化した。
マウス胚繊維芽細胞(以下、BALB/3T3細胞と略す)を用い、10%仔ウシ血清(Calf Bovine Serum、CBS)と、高グルコースと、D-MEM培地(L-グルタミン、フェノールレッド、ピルビン酸ナトリウム含有)と、を含む溶液(以下、BALB/3T3細胞液とも呼ぶ)中で、すべての継代培養および細胞増殖性試験を行った。
凍結した細胞懸濁液を37℃ウォーターバスに浸けて解凍し、解凍した細胞懸濁液に氷上冷却した10%仔ウシ血清D-MEM培地を添加して遠心分離した。遠心後、上澄み液を除去して細胞塊をタッピングによりほぐした後、37℃ウォーターバスで保温した10%仔ウシ血清D-MEM培地を添加した。血球計算盤で細胞数を計数し、ウォーターバスで保温した10%仔ウシ血清D-MEM培地を用いて細胞懸濁液を調製し培養フラスコに細胞を播種した後、加湿インキュベーターで培養した。
加湿インキュベーターから培養フラスコを取り出して培地をアスピレーターで除去し、37℃ウォーターバス中で保温したダルベッコPBS(-)を加え、上澄みをアスピレーターで除去した。再度、同様な操作行った後、37℃ウォーターバス中で保温した0.025w/v%トリプシン-EDTA溶液を加えて加湿インキュベーター内で静置した後、10%仔ウシ血清D-MEM培地を加えて剥がれた細胞を回収して遠沈管に移し遠心分離して上澄み液を除去し、タッピングにより細胞塊をほぐした後、10%仔ウシ血清D-MEM培地を加えた。血球計算盤で細胞数を計数した後、10%仔ウシ血清D-MEM培地で細胞懸濁液を調製し、培養フラスコに細胞を播種して、加湿インキュベーターで培養した。実施例に記載の細胞胞増殖性評価では、継代数3~20代のものを用いた。
直径15mmに切り出した円形の培養フィルムをTCPSマルチウェルプレート(コーニング社製)穴部に置き、70%エタノール水溶液を加えて40分~1時間浸漬した後、70%エタノール水溶液を除去してダルベッコPBS(-)に15分~40分間浸漬した。次に、PBS(-)を除去して、培養器具をひっくり返し、同様な操作を行い、培養器具の表裏面を滅菌処理した。滅菌処理終了後、クリーンベンチ内で一晩乾燥させた。
25cm2培養フラスコで約60%コンフレント状態になったBALB/3T3細胞を、上記、細胞の継代操作と同様な方法で0.025w/v%トリプシン-EDTAで処理して剥がした。血球計算盤で細胞数を計数して、10%仔ウシ血清D-MEM培地で7500 cells/mLの細胞懸濁液を調製した。
培養開始後1、3、および7日経過後のTCPSマルチウェルプレートを加湿インキュベーターから取り出して培地を除去し、10%WST-8(Cell Counting Kit-8)/10%仔ウシ血清D-MEM培地の混合溶液を添加して、加湿インキュベーターで3時間インキュベートした。その後、培地200μlを96ウェルプレートに移し、プレートリーダー(SPECTRA max PLUS384、Molecular Devices社製)で波長450nmの吸光度を測定した。各培養器具の細胞増殖性は、吸光度の経時変化により確認した。
各種培養器具について、細胞を播種したサンプルを9検体準備して培養し、吸光度の測定結果をPrism 6 for Windows(登録商標) 6.01(エムデーエフ社製)により数値解析して、結果の平均値を吸光度として算出し、標準偏差に±の符号を付しバラツキの範囲とした。
7日間細胞培養した容器から培地を除去して、4%グルタルアルデヒド/リン酸緩衝液を添加し1時間静置した後、4%グルタルアルデヒド/リン酸緩衝液を除去した。その後、滅菌水で洗浄し、Image-iT Fixation/Permeabilizationキット(ライフサイエンス社製)を使用し細胞核、および細胞骨格タンパクを染色して蛍光顕微鏡観察に用いる試料を調製した。蛍光顕微鏡観察は、オールインワン蛍光顕微鏡BZ-X700(キーエンス社製)を使用した。
5,5,6-トリフルオロ-6-(トリフルオロメチル)ビシクロ[2.2.1]ヘプト-2-エン(100g)と1-ヘキセン(0.268g)のテトラヒドロフラン溶液に、Mo(N-2,6-Pri 2C6H3)(CHCMe2Ph)(OBut)2(50mg)のテトラヒドロフラン溶液を添加し、70℃で開環メタセシス重合を行った。得られたポリマーのオレフィン部を、パラジウムアルミナ(5g)によって160℃で水素添加反応を行い、ポリ(1,1,2-トリフルオロ-2-トリフルオロメチル-3,5-シクロペンチレンエチレン)のテトラヒドロフラン溶液を得た。その溶液を孔径5μmのフィルターで加圧ろ過しパラジウムアルミナを除去した溶液をメタノールに加え、白色のポリマーをろ別、乾燥し99gのポリマー1を得た。得られたポリマー1は、上記一般式(1)により表される繰り返し構造単位を含有していた。また、水素添加率は100%、重量平均分子量(Mw)は83000、分子量分布(Mw/Mn)は1.73、ガラス転移温度は109℃であった。
製造例1で合成したポリマー1をメチルイソブチルケトンに30質量%濃度で溶解し、その溶液を孔径1μmのフィルターで加圧ろ過し、次いで0.1μmのフィルターでろ過してポリマー1のメチルイソブチルケトン溶液を調製した。次いで、ポリマー1のメチルイソブチルケトン溶液をガラス基板に塗布し、アプリケーターを用いて均一にコートした後、140℃で60分乾燥して剥離する事で厚み60μmのフィルムを作製した。フィルムの水接触角は15秒で93.6°であった。さらに、10分経過後で88.1°であり水滴が消失するまでの時間において変化は見られなかった。
製造例2で調製したポリマー1のメチルイソブチルケトン溶液を、コート基材であるPETフィルム(ルミラー、東レ)にバーコーターを用いて均一に塗布し、100℃で20分乾燥して室温まで放冷し、コート膜の厚みが5μmの培養フィルム2を作製した。フィルムの水接触角は15秒で93.7°であった。さらに、10分経過後で87.7°であり水滴が消失するまでの時間において変化は見られなかった。
コート基材をアクリルフィルム(アクリプレン、三菱レイヨン)に、コート後の乾燥条件を90℃、40分に変更したこと以外は製造例3と同じ方法で、コート膜の厚みが5μmの培養フィルム3を作製した。フィルムの水接触角は15秒で94.1°であった。さらに、10分経過後で88.0°であり水滴が消失するまでの時間において変化は見られなかった。
製造例1で合成したフッ素含有環状オレフィンポリマー(A)であるポリマー1を30質量%濃度で溶解したメチルイソブチルケトン溶液100gに、光硬化性化合物(B)として3-エチル-3{[(3-エチルオキセタン-3-イル)メトキシ]メチル}オキセタンと1,7-オクタジエンジエポキシドの質量比9/1の混合物を7.5g[(A)/(B)=80/20]、および光重合開始剤(C)として光カチオン開始剤(アデカオプトマーSP-172、旭電化社製)を0.4g加えた溶液を調製し、孔径1μmのフィルターで加圧ろ過し、次いで0.1μmのフィルターでろ過してポリマー1と光硬化性化合物および光硬化開始剤のメチルイソブチルケトン溶液を調製した。次いで、コート基材であるPETフィルム(ルミラー、東レ)に塗布して、バーコーターを用いて均一にコートし、100℃で10分乾燥して室温まで放冷した後、200mJ/cm2の光量でUV照射して硬化樹脂を硬化させコート厚み5μmの培養フィルム4を作製した。コート面の水接触角は15秒で88.1°であった。さらに、10分経過後で84.9°であり水滴が消失するまでの時間において変化は見られなかった。
フッ素含有環状オレフィンポリマー(A)であるポリマー1と、光硬化性化合物(B)である3-エチル-3{[(3-エチルオキセタン-3-イル)メトキシ]メチル}オキセタンと1、7-オクタジエンジエポキシドの質量比9/1の混合物と、の質量比を[(A)/(B)=60/40]に変更した以外は製造例5と同様な方法でコート厚み5μmの培養フィルム5を作製した。コート面の水接触角は15秒で84.2°であった。さらに、10分経過後で81.3°であり水滴が消失するまでの時間において変化は見られなかった。
コート基材をアクリルフィルム(アクリプレン、三菱レイヨン)に、コート後の乾燥条件を90℃、40分に変更したこと以外は製造例6と同じ方法で、コート膜の厚みが5μmの培養フィルム6を作製した。フィルムの水接触角は15秒で84.3°であった。さらに、10分経過後で81.0°であり水滴が消失するまでの時間において変化は見られなかった。
製造例1で合成したポリマー1に耐熱酸化防止剤としてスミライザーGP(住友化学社製)を0.5質量%添加して、ペレタイザーによりペレット化した後、メイホー製小型射出成型機Micro-1を用いて、加熱混練部の温度を260℃、金型の温度を90℃に設定し、射出速度20mm/sec、射出圧力40MPaの条件で直径20mm×厚み3mmの培養フィルム7を作製した。基材表面の水接触角は15秒で94.0°であった。さらに、10分経過後で88.4°であり水滴が消失するまでの時間において変化は見られなかった。
製造例2で作製した滅菌済みの培養フィルム1を24穴TCPSマルチウェルプレートの穴部底面に置き、滅菌グリース(東レ・ダウコーニング社製)でSUS製O-リング(内径11mm)と密着させて固定した後、BALB/3T3細胞液(1mL)を培養フィルム1の上に播種した。同操作を9回実施して、検体数で9個のサンプルを準備した。その後、蓋をして加湿インキュベーターに移動し、庫内温度37℃、炭酸ガス濃度5%の滅菌空気下で培養を開始した。
製造例3で作製した滅菌済みの培養フィルム2を実施例1と同様な方法で24穴TCPSマルチウェルプレートに固定し、解凍済みのBALB/3T3細胞液(1mL)を播種した。同操作を9回繰り返し、検体数で9個のサンプルを準備した。その後、蓋をしてインキュベーターに移動し庫内温度37℃、炭酸ガス濃度5%の滅菌空気下で培養を開始した。
製造例4で作製した滅菌済みの培養フィルム3を実施例1と同様な方法で24穴TCPSマルチウェルプレートに固定し、解凍済みのBALB/3T3細胞液(1mL)を播種した。同操作を9回繰り返し、検体数で9個のサンプルを準備した。その後、蓋をしてインキュベーターに移動し庫内温度37℃、炭酸ガス濃度5%の滅菌空気下で培養を開始した。
製造例5で作製した滅菌済みの培養フィルム4を実施例1と同様な方法で24穴TCPSマルチウェルプレートに固定し、解凍済みのBALB/3T3細胞液(1mL)を播種した。同操作を9回繰り返し、検体数で9個のサンプルを準備した。その後、蓋をしてインキュベーターに移動し庫内温度37℃、炭酸ガス濃度5%の滅菌空気下で培養を開始した。
製造例6で作製した滅菌済みの培養フィルム5を実施例1と同様な方法で24穴TCPSマルチウェルプレートに固定し、解凍済みのBALB/3T3細胞液(1mL)を播種した。同操作を9回繰り返し、検体数で9個のサンプルを準備した。その後、蓋をしてインキュベーターに移動し庫内温度37℃、炭酸ガス濃度5%の滅菌空気下で培養を開始した。
製造例7で作製した滅菌済みの培養フィルム6を実施例1と同様な方法で24穴TCPSマルチウェルプレートに固定し、解凍済みのBALB/3T3細胞液(1mL)を播種した。同操作を9回繰り返し、検体数で9個のサンプルを準備した。その後、蓋をしてインキュベーターに移動し庫内温度37℃、炭酸ガス濃度5%の滅菌空気下で培養を開始した。
製造例8で作製した滅菌済みの培養フィルム7を24穴TCPSマルチウェルプレートの穴部底面に置き、滅菌グリース(東レ・ダウコーニング製)でSUS製O-リング(内径16mm)と密着させて固定した後、解凍済みのBALB/3T3細胞液(1mL)を培養フィルム7の上に播種した。同操作を9回実施して、検体数で9個のサンプルを準備した。その後、蓋をしてインキュベーターに移動し庫内温度37℃、炭酸ガス濃度5%の滅菌空気下で培養を開始した。
フッ素含有環状オレフィンモノマーの種類を5,6-ジフルオロ-5-ペンタフルオロエチル-6-トリフルオロメチルビシクロ[2.2.1]ヘプト-2-エンに変更したこと以外は、製造例1と同様な方法により97gのポリマー2を得た。得られたポリマー2は、上記一般式(1)により表される繰り返し構造単位を含有していた。また、水素添加率は100%、重量平均分子量(Mw)は91000、分子量分布(Mw/Mn)は1.93、ガラス転移温度は104℃であった。
フッ素含有環状オレフィンポリマー(A)である実施例8で製造したポリマー2と、光硬化性化合物(B)として3-エチル-3{[(3-エチルオキセタン-3-イル)メトキシ]メチル}オキセタンと1、7-オクタジエンジエポキシドの質量比9/1の混合物と、を製造例5と同じ方法で混合し、[質量比(A)/(B)=80/20]の組成物を調製した。次に、PETフィルム(ルミラー、東レ)にコートして、培養フィルム9を作製した。フィルムの水接触角は15秒で95.3°であった。さらに、10分経過後で94.9°であり水滴が消失するまでの時間において変化は見られなかった。
フッ素含有環状オレフィンモノマーの種類を5,6-ジフルオロ-5-へプタフルオロ-iso-プロピル-6-トリフルオロメチルビシクロ[2.2.1]ヘプト-2-エンに変更したこと以外は、製造例1と同様な方法により98gのポリマー3を得た。得られたポリマー3は、上記一般式(1)により表される繰り返し構造単位を含有していた。また、水素添加率は100%、重量平均分子量(Mw)は142000、分子量分布(Mw/Mn)は1.40、ガラス転移温度は137℃であった。
製造例1で合成したポリマー1をメチルイソブチルケトンに30質量%濃度で溶解し、その溶液を孔径1μmのフィルターで加圧ろ過し、次いで0.1μmのフィルターでろ過してポリマー1のメチルイソブチルケトン溶液を調製した。次いで、直径150nm、ピッチ250nmのホール形状を有するサイズが4cm×4cmのニッケルモールドにポリマー1のメチルイソブチルケトン溶液を塗布し、アプリケーターを用いて均一にコートした後、140℃で60分乾燥して剥離する事で、厚み50μmのピラー形状の培養フィルム13を作製した。培養フィルム13の水接触角(15秒経過時)は147.0°であった。
製造例9で使用したポリマー1のメチルイソブチルケトン溶液を、ライン幅200nm、ピッチ400nmでラインとスペースが2μm周期で縦横最密充填配列したサイズが5cm×5cmのシリコンモールドに塗布し、アプリケーターを用いて均一にコートした後、140℃で60分乾燥して剥離する事で、厚み50μmのホール形状の培養フィルム14を作製した。培養フィルム14の水接触角(15秒経過時)は136.0°であった。
製造例9で使用したポリマー1のメチルイソブチルケトン溶液を、直径150nm、ピッチ250nmのピラー形状を有するサイズが4cm×4cmのニッケルモールドに塗布し、アプリケーターを用いて均一にコートした後、140℃で60分乾燥して剥離する事で、厚み50μmのホール形状の培養フィルム15を作製した。培養フィルム15の水接触角(15秒経過時)は124.3°であった。
製造例9で使用したポリマー1のメチルイソブチルケトン溶液を、直径が25μmのドーム形状の反転パターンを有するサイズが4cm×4cmの石英モールドにポリマー1のメチルイソブチルケトン溶液を塗布し、アプリケーターを用いて均一にコートした後、140℃で60分乾燥して剥離する事で、厚み60μmのドーム形状の培養フィルム16を作製した。培養フィルム16の水接触角(15秒経過時)は127.3°であった。
製造例1で合成したポリマー1を30質量%濃度で溶解したメチルイソブチルケトン溶液100gに、光硬化性化合物(B)として3-エチル-3{[(3-エチルオキセタン-3-イル)メトキシ]メチル}オキセタンと1,7-オクタジエンジエポキシドの質量比9/1の混合物を20g[(A)/(B)=60/40]、および光硬化開始剤(C)として(アデカオプトマーSP-172、ADEKA社製)を0.8g加えた溶液を調製し、孔径1μmのフィルターで加圧ろ過し、次いで0.1μmのフィルターでろ過して光硬化性組成物1を調製した。次いで、製造例12で使用した石英モールドに光硬化性組成物1をアプリケーターを用いて均一にコートした後、140℃で30分乾燥し、コート面の背面から波長365nmのUV光を200mJ/cm2の積算光量で照射し、その後モールドから剥離する事で、厚み60μmのドーム形状の培養フィルム17を作製した。培養フィルム17の水接触角(15秒経過時)は129.5°であった。
製造例9で作製した培養フィルム13を滅菌し、パターン面を上方に24穴TCPSマルチウェルプレートの穴部底面に置き、滅菌グリース(東レ・ダウコーニング社製)でSUS製O-リング(内径11mm)と密着させて固定した後、BALB/3T3細胞液(1mL)を培養フィルム13のパターン面に播種した。同操作を9回実施して、検体数で9個のサンプルを準備した。その後、蓋をして加湿インキュベーターに移動し、庫内温度37℃、炭酸ガス濃度5%の滅菌空気下で培養を開始した。
WST-8法による細胞増殖性の評価では、1日経過後の吸光度が0.10±0.03であり、3日経過後で0.33±0.06であり、7日経過後で0.68±0.09であった。経過日数に対して吸光度は直線的に増大しており、7日経過しても増殖性に変化は見られなかった。また、7日間培養した細胞を顕微鏡観察すると、細胞は厚み方向に対して群体を形成した状態で増殖しており、リン酸緩衝生理食塩水を添加すると群体形成の形態を保った状態で浮遊した。
製造例10で作製した培養フィルム14を滅菌し、実施例1と同様な方法で24穴TCPSマルチウェルプレートに固定し、解凍済みのBALB/3T3細胞液(1mL)を培養フィルム14のパターン面に播種した。同操作を9回繰り返し、検体数で9個のサンプルを準備した。その後、蓋をしてインキュベーターに移動し庫内温度37℃、炭酸ガス濃度5%の滅菌空気下で培養を開始した。
WST-8法による細胞増殖性の評価では、1日経過後の吸光度が0.10±0.01であり、3日経過後で0.32±0.06であり、7日経過後で0.67±0.10であった。経過日数に対して吸光度は直線的に増大しており、7日経過しても増殖性に変化は見られなかった。また、7日間培養した細胞を顕微鏡観察すると、細胞は厚み方向に対して群体を形成した状態で増殖しており、リン酸緩衝生理食塩水を添加すると群体形成の形態を保った状態で浮遊した。
製造例11で作製した培養フィルム15を滅菌し、実施例1と同様な方法で24穴TCPSマルチウェルプレートに固定し、解凍済みのBALB/3T3細胞液(1mL)を培養フィルム15のパターン面に播種した。同操作を9回繰り返し、検体数で9個のサンプルを準備した。その後、蓋をしてインキュベーターに移動し庫内温度37℃、炭酸ガス濃度5%の滅菌空気下で培養を開始した。
WST-8法による細胞増殖性の評価では、1日経過後の吸光度が0.10±0.02であり、3日経過後で0.34±0.03であり、7日経過後で0.70±0.09であった。経過日数に対して吸光度は直線的に増大しており、7日経過しても増殖性に変化は見られなかった。また、7日間培養した細胞を顕微鏡観察すると、細胞は厚み方向に対して群体を形成した状態で増殖しており、リン酸緩衝生理食塩水を添加すると群体形成の形態を保った状態で浮遊した。
製造例12で作製した培養フィルム16を滅菌し、実施例1と同様な方法で24穴TCPSマルチウェルプレートに固定し、解凍済みのBALB/3T3細胞液(1mL)を培養フィルム16のパターン面に播種した。同操作を9回繰り返し、検体数で9個のサンプルを準備した。その後、蓋をしてインキュベーターに移動し庫内温度37℃、炭酸ガス濃度5%の滅菌空気下で培養を開始した。
WST-8法による細胞増殖性の評価では、1日経過後の吸光度が0.09±0.02であり、3日経過後で0.32±0.03であり、7日経過後で0.66±0.08であった。経過日数に対して吸光度は直線的に増大しており、7日経過しても増殖性に変化は見られなかった。また、7日間培養した細胞を顕微鏡観察すると、細胞は厚み方向に対して群体を形成した状態で増殖しており、リン酸緩衝生理食塩水を添加すると群体形成の形態を保った状態で浮遊した。
製造例13で作製した培養フィルム17を滅菌し、実施例1と同様な方法で24穴TCPSマルチウェルプレートに固定し、解凍済みのBALB/3T3細胞液(1mL)を培養フィルム17のパターン面に播種した。同操作を9回繰り返し、検体数で9個のサンプルを準備した。その後、蓋をしてインキュベーターに移動し庫内温度37℃、炭酸ガス濃度5%の滅菌空気下で培養を開始した。
WST-8法による細胞増殖性の評価では、1日経過後の吸光度が0.10±0.04であり、3日経過後で0.26±0.02であり、7日経過後で0.52±0.12であった。経過日数に対して吸光度は直線的に増大しており、7日経過しても増殖性に変化は見られなかった。また、7日間培養した細胞を顕微鏡観察すると、細胞は厚み方向に対して群体を形成した状態で増殖しており、リン酸緩衝生理食塩水を添加すると群体形成の形態を保った状態で浮遊した。
実施例8で製造したポリマー2を用いて、製造例9と同様な方法により厚み55μmのピラー形状の培養フィルム18を作製した。培養フィルム18の水接触角(15秒経過時)は150.5°であった。
培養フィルム18を用い、実施例1と同様な方法で実施したBALB/3T3細胞の培養は、WST-8法による細胞増殖性の評価で1日経過後の吸光度が0.10±0.03であり、3日経過後で0.32±0.03であり、7日経過後で0.72±0.10であった。経過日数に対して吸光度は直線的に増大しており、7日経過しても増殖性に変化は見られなかった。また、7日間培養した細胞を顕微鏡観察すると、細胞は厚み方向に対して群体を形成した状態で増殖しており、リン酸緩衝生理食塩水を添加すると群体形成の形態を保った状態で浮遊した。
実施例10で製造したポリマー3を用いてモールドを製造例11で使用したピラー形状のニッケルモールドに変更したこと以外は、製造例9と同様な方法により厚み58μmのホール形状の培養フィルム19を作製した。培養フィルム19の水接触角(15秒経過時)は130.3°であった。
培養フィルム19による実施例1と同様な方法で実施したBALB/3T3細胞の培養は、WST-8法による細胞増殖性の評価で1日経過後の吸光度が0.09±0.02であり、3日経過後で0.32±0.04であり、7日経過後で0.78±0.19であった。経過日数に対して吸光度は直線的に増大しており、7日経過しても増殖性に変化は見られなかった。また、7日間培養した細胞を顕微鏡観察すると、細胞は厚み方向に対して群体を形成した状態で増殖しており、リン酸緩衝生理食塩水を添加すると群体形成の形態を保った状態で浮遊した。
製造例1で合成したポリマー1から作製した厚み50μmのフィルムを製造例9で使用したホール形状のニッケルモールドのパターン面に被せ、150℃に加熱し10MPaで熱圧着しそのまま5秒間保持した。50℃に冷却後、モールドを離脱させピラー形状の培養フィルム20を作製した。培養フィルム20の水接触角(15秒経過時)は148.1°であった。
培養フィルム20を用い、実施例1と同様な方法で実施したBALB/3T3細胞の培養は、WST-8法による細胞増殖性の評価で1日経過後の吸光度が0.11±0.03であり、3日経過後で0.39±0.04であり、7日経過後で0.81±0.11であった。経過日数に対して吸光度は直線的に増大しており、7日経過しても増殖性に変化は見られなかった。また、7日間培養した細胞を顕微鏡観察すると、細胞は厚み方向に対して群体を形成した状態で増殖しており、リン酸緩衝生理食塩水を添加すると群体形成の形態を保った状態で浮遊した。
製造例13で調製した光硬化性組成物1[(A)/(B)=60/40]をPETフィルムにスピンコートして、100℃で1分間加熱した後に、製造例9で使用したホール形状のニッケルモールドのパターン面と光硬化性組成物1のコート面が接触するようにPETフィルムを被せ、0.3MPaの圧力で圧着しながら波長375nmのUV光を200mJ/cm2の積算光量で照射した。次いで、ニッケルモールドからPETフィルムを剥離して、PETフィルムの表面にピラー形状を形成した培養フィルム21を作製した。培養フィルム21の水接触角(15秒経過時)は146.9°であった。
培養フィルム21による実施例1と同様な方法で実施したBALB/3T3細胞の培養は、WST-8法による細胞増殖性の評価で1日経過後の吸光度が0.11±0.02であり、3日経過後で0.26±0.03であり、7日経過後で0.53±0.10であった。経過日数に対して吸光度は直線的に増大しており、7日経過しても増殖性に変化は見られなかった。また、7日間培養した細胞を顕微鏡観察すると、細胞は厚み方向に対して群体を形成した状態で増殖しており、リン酸緩衝生理食塩水を添加すると群体形成の形態を保った状態で浮遊した。
細胞種をヒト皮膚繊維芽細胞(以下、Hs-68細胞と略す)に変更し、マウス胚繊維芽細胞と同様な方法により細胞の解凍、継代、懸濁液を調製し、10%仔ウシ血清D-MEM培地で7500 cells/mLの細胞懸濁液を調製した。
次に、製造例2で作製した滅菌済みの培養フィルム1を使用して、実施例1と同様な方法により、解凍済みのHs-68細胞液(1mL)を播種した。同操作を9回繰り返し、検体数で9個のサンプルを準備した。その後、蓋をしてインキュベーターに移動し庫内温度37℃、炭酸ガス濃度5%の滅菌空気下で培養を開始した。
WST-8法による細胞増殖性の評価では、1日経過後の吸光度が0.34±0.07であり、3日経過後で1.55±0.10であり、7日経過後で4.27±0.16であった。経過日数に対して吸光度は直線的に増大しており、7日経過しても増殖性に変化は見られなかった。また、7日間培養した細胞を顕微鏡観察すると、細胞はシート状に、厚み方向に対して群体を形成した状態で増殖しており、トリプシン含有リン酸緩衝生理食塩水を添加するとシート状の形態を保った状態で浮遊した。
この培養細胞のNADPHデハイドロゲナーゼで薬物代謝系酵素活性評価を行うとほぼ100%が、生態系と同様の薬物代謝系酵素活性があることが分かった。さらに、自家蛍光を観察すると同様に100%の培養細胞が生細胞であることを確認した。
製造例6で作製した滅菌済みの培養フィルム5を使用して、実施例20と同様な方法により、解凍済みのHs-68細胞液(1mL)を播種した。同操作を9回繰り返し、検体数で9個のサンプルを準備した。その後、蓋をしてインキュベーターに移動し庫内温度37℃、炭酸ガス濃度5%の滅菌空気下で培養を開始した。
WST-8法による細胞増殖性の評価では、1日経過後の吸光度が0.31±0.03であり、3日経過後で1.49±0.09であり、7日経過後で3.77±0.19であった。経過日数に対して吸光度は直線的に増大しており、7日経過しても増殖性に変化は見られなかった。また、7日間培養した細胞を顕微鏡観察すると、細胞はシート状に、厚み方向に対して群体を形成した状態で増殖しており、トリプシン含有リン酸緩衝生理食塩水を添加するとシート状の形態を保った状態で浮遊した。
この培養細胞のNADPHデハイドロゲナーゼで薬物代謝系酵素活性評価を行うとほぼ100%が、生態系と同様の薬物代謝系酵素活性があることが分かった。さらに、自家蛍光を観察すると同様に100%の培養細胞が生細胞であることを確認した。
実施例10で記載した滅菌済みの培養フィルム10を使用して、実施例20と同様な方法により、解凍済みのHs-68細胞液(1mL)を播種した。同操作を9回繰り返し、検体数で9個のサンプルを準備した。その後、蓋をしてインキュベーターに移動し庫内温度37℃、炭酸ガス濃度5%の滅菌空気下で培養を開始した。
WST-8法による細胞増殖性の評価では、1日経過後の吸光度が0.33±0.04であり、3日経過後で1.53±0.05であり、7日経過後で4.17±0.11であった。経過日数に対して吸光度は直線的に増大しており、7日経過しても増殖性に変化は見られなかった。また、7日間培養した細胞を顕微鏡観察すると、細胞はシート状に、厚み方向に対して群体を形成した状態で増殖しており、トリプシン含有リン酸緩衝生理食塩水を添加するとシート状の形態を保った状態で浮遊した。
この培養細胞のNADPHデハイドロゲナーゼで薬物代謝系酵素活性評価を行うとほぼ100%が、生態系と同様の薬物代謝系酵素活性があることが分かった。さらに、自家蛍光を観察すると同様に100%の培養細胞が生細胞であることを確認した。
6穴TCPSマルチウェルプレート(コーニング社製)の凹部底面を切り抜き、製造例2で作製したフィルム1を6穴全ての凹部底面に貼り付け細胞培養容器を作製し、エタノールにより滅菌処理した。
次いで、細胞液の量を10mLに変更したこと以外は、実施例20と同様な方法により、解凍済みのHs-68細胞液を播種した。同操作を9回繰り返し、検体数で9個のサンプルを準備した。その後、蓋をしてインキュベーターに移動し庫内温度37℃、炭酸ガス濃度5%の滅菌空気下で培養を開始した。
WST-8法による細胞増殖性の評価では、1日経過後の吸光度が0.52±0.03であり、3日経過後で1.70±0.03であり、7日経過後で4.35±0.09であった。経過日数に対して吸光度は直線的に増大しており、7日経過しても増殖性に変化は見られなかった。また、7日間培養した細胞を顕微鏡観察すると、細胞はシート状に、厚み方向に対して群体を形成した状態で増殖しており、トリプシン含有リン酸緩衝生理食塩水を添加するとシート状の形態を保った状態で浮遊した。
さらに、7日間培養した細胞を蛍光発光試薬で染色して細胞核、および細胞骨格タンパクの形態を蛍光顕微鏡観察すると、青色蛍光発光(図2の白色部)した細胞核、および緑色蛍光発光(図2の灰色部)した細胞骨格タンパクは、二次元的に密度斑を伴いながら、三次元的には厚み方向に細胞が重なった状態の群体を形成した形態で観察された(図2参照)。
この培養細胞のNADPHデハイドロゲナーゼで薬物代謝系酵素活性評価を行うとほぼ100%が、生態系と同様の薬物代謝系酵素活性があることが分かった。さらに、自家蛍光を観察しても、殆ど蛍光が観察されないことから、同様に99.98%の培養細胞が生細胞であることを確認した(図4参照)。
実施例13で記載した滅菌済みの培養フィルム15を使用して、実施例20と同様な方法により、解凍済みのHs-68細胞液(1mL)を播種した。同操作を9回繰り返し、検体数で9個のサンプルを準備した。その後、蓋をしてインキュベーターに移動し庫内温度37℃、炭酸ガス濃度5%の滅菌空気下で培養を開始した。
WST-8法による細胞増殖性の評価では、1日経過後の吸光度が0.25±0.02であり、3日経過後で0.78±0.04であり、7日経過後で1.80±0.09であった。経過日数に対して吸光度は直線的に増大しており、7日経過しても増殖性に変化は見られなかった。また、7日間培養した細胞を顕微鏡観察すると、細胞は厚み方向に対して群体を形成した状態で増殖しており、トリプシン含有リン酸緩衝生理食塩水を添加するとシート状の形態を保った状態で浮遊した。
この培養細胞のNADPHデハイドロゲナーゼで薬物代謝系酵素活性評価を行うとほぼ100%が、生態系と同様の薬物代謝系酵素活性があることが分かった。さらに、自家蛍光を観察すると同様に100%の培養細胞が生細胞であることを確認した。
γ線滅菌済み24穴TCPSマルチウェルプレート(コーニング製、水接触角は15秒後で46.1°。さらに、10分後で11.2°)の穴部底面に解凍済みのBALB/3T3細胞液(1mL)を播種した。同操作を9回繰り返し、検体数9個のサンプルを準備した。その後、蓋をしてインキュベーターに移動し庫内温度37℃、炭酸ガス濃度5%の滅菌空気下で培養を開始した。
低密度ポリエチレンフィルム(三井化学製、水接触角は15秒後で96.8°。さらに10分後で59.5°)を実施例の培養フィルムの取扱法と同様に切出して滅菌処理した。次に、実施例1と同様な方法によりBALB/3T3細胞を培養した。
製造例1に記載のモノマーを5-メチル-ビシクロ[2.2.1]ヘプト-2-エン(20.0g)と8-メチル-テトラシクロ[4.4.0.12,5.17,10]-3-ドデセン(32.2g)に、溶媒をシクロヘキサンに変更した以外は製造例1と同様な方法によって、ポリ(1-メチル-シクロペンチレンエチレン)とポリ(3-メチル-トリシクロ[4.3.0.12,5]デカニレンエチレン)のシクロヘキサン溶液を得た。その溶液を孔径5μmのフィルターで加圧ろ過し、溶液をメタノールに加え、白色のポリマーをろ別、乾燥し51gのポリマー4を得た。水素添加率は100%、重量平均分子量(Mw)は82000、分子量分布(Mw/Mn)は2.26、ガラス転移温度は104℃であった。
テフロン(登録商標)AF1600(アルドリッチ製)の粉末を200℃の加熱条件で熱プレスして厚み200μmの培養フィルム12を作製し、実施例の培養フィルムの取扱法と同様に切出して滅菌処理した。基材作製時の水接触角は15秒後で111.6°であった。さらに、10分後で110.3°であった。次に、実施例1と同様な方法によりBALB/3T3細胞を培養した。
滅菌済み24穴ナノカルチャープレート(S社製、水接触角(15秒経過時)は125°)の穴部底面のパターン面に解凍済みのBALB/3T3細胞液(1mL)を播種した。同操作を9回繰り返し、検体数9個のサンプルを準備した。その後、蓋をしてインキュベーターに移動し庫内温度37℃、炭酸ガス濃度5%の滅菌空気下で培養を開始した。
WST-8法による細胞増殖性の評価では、1日経過後の吸光度が0.07±0.03であり、3日経過後で0.09±0.02であり、7日経過後で0.10±0.09であった。経過日数に対して吸光度は徐々に減衰する傾向を示し、経過日数に応じて細胞増殖の程度は小さくなった。また、7日間培養した細胞を顕微鏡観察すると、細胞は厚み方向に対して群体を形成して増殖し、リン酸緩衝生理食塩水を添加しても形態に変化なく浮遊しなかった。
細胞懸濁液をHs-68細胞液(10mL)に変更したこと以外は、比較例1と同様にインキュベーターの庫内温度37℃、炭酸ガス濃度5%の滅菌空気下で培養を開始した。
WST-8法による細胞増殖性の評価では、1日経過後の吸光度が0.33±0.06であり、3日経過後で1.49±0.11であり、7日経過後で3.10±0.13であった。経過日数に対して吸光度は徐々に減衰する傾向を示し、経過日数に応じて細胞増殖の程度は小さくなった。また、7日間培養した細胞を顕微鏡観察すると、シート状に細胞は増殖しており、トリプシン含有リン酸緩衝生理食塩水を添加しても形態に変化なく浮遊しなかった。
さらに、7日間培養した細胞を蛍光発光試薬で染色して細胞核、および細胞骨格タンパクの形態を蛍光顕微鏡観察すると、青色蛍光発光(図3の白色部)した細胞核、および緑色蛍光発光(図3の灰色部)した細胞骨格タンパクは、二次元的に広がったシート形状の蛍光発光分布が観察された(図3参照)。実施例23に記載の細胞培養容器で培養したHs-68細胞に見られる厚み方向に細胞が重なった群体形成は確認できなかった。
この培養細胞のNADPHデハイドロゲナーゼで薬物代謝系酵素活性評価を行うとほぼ0%が、生態系と同様の薬物代謝系酵素活性があることが分かった。さらに、自家蛍光観察は、γ線滅菌済み24穴TCPSマルチウェルプレートの蛍光吸収で測定することができず、酵素活性評価のみで実証した。
Claims (14)
- 基材を備え、かつ前記基材の一面に細胞を接触または保持させる医療器具であって、
前記基材の少なくとも細胞を保持する前記一面は、下記一般式(1)で表される繰返し構造単位を含有するフッ素含有環状オレフィンポリマーにより構成される医療器具。
- 細胞を接触または保持する前記一面の水接触角が70°以上160°以下である請求項1に記載の医療器具。
- 細胞を接触または保持する前記一面の水接触角が70°以上120°以下である請求項1または2に記載の医療器具。
- 前記基材の少なくとも細胞と接触する前記一面が、凹凸構造を備える請求項1に記載の医療器具。
- 細胞と接触する前記一面の水接触角が121°以上160°以下である請求項4に記載の医療器具。
- 前記基材の少なくとも細胞を接触または保持する前記一面は、前記フッ素含有環状オレフィンポリマーと、光硬化性化合物と、光硬化開始剤と、を含むフッ素含有環状オレフィンポリマー組成物により構成される請求項1~5のいずれか一項に記載の医療器具。
- 前記フッ素含有環状オレフィンポリマー組成物中における前記フッ素含有環状オレフィンポリマーと前記光硬化性化合物の質量比(フッ素含有環状オレフィンポリマー/光硬化性化合物)が、99.9/0.1~50/50である請求項6に記載の医療器具。
- 前記一面に接触または保持させた細胞を培養するために用いられる請求項1~7のいずれか一項に記載の医療器具。
- 細胞培養において、細胞が群体を形成しながら増殖する請求項8に記載の医療器具。
- 培養した細胞を緩衝液により浮遊して前記一面から離脱させる請求項8または9に記載の医療器具。
- 請求項1~10のいずれか一項に記載の医療器具の前記基材の前記一面上に、前記一面に接触または保持するよう細胞を播種する工程と、
前記細胞を培養して培養細胞を得る工程と、
前記一面上に緩衝液を添加して、前記一面から前記培養細胞を浮遊させる工程と、
を備える細胞培養方法。 - 基材を備え、かつ前記基材の一面に細胞を接触または保持させる医療器具の、前記基材の少なくとも細胞を保持させる前記一面を構成するフッ素含有環状オレフィンポリマーであって、下記一般式(1)で表される繰返し構造単位を含有するフッ素含有環状オレフィンポリマー。
- 基材を備え、かつ前記基材の一面に細胞を接触または保持させる医療器具の、前記基材の少なくとも細胞を保持させる前記一面を構成するフッ素含有環状オレフィンポリマー組成物であって、
下記一般式(1)で表される繰返し構造単位を含有するフッ素含有環状オレフィンポリマーと、
光硬化性化合物と、
光硬化開始剤と、
を含むフッ素含有環状オレフィンポリマー組成物。
- 薬物代謝系酵素活性を少なくとも7日間維持した培養細胞。
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