JP2020156348A

JP2020156348A - 多能性幹細胞の分化誘導方法

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Publication number: JP2020156348A
Application number: JP2019056996A
Authority: JP
Inventors: 直也市村; Naoya Ichimura; 千裕鍋屋; Chihiro Nabeya
Original assignee: Nippon Zeon Co Ltd
Current assignee: Zeon Corp
Priority date: 2019-03-25
Filing date: 2019-03-25
Publication date: 2020-10-01
Anticipated expiration: 2039-03-25
Also published as: JP7268439B2

Abstract

【課題】多能性幹細胞を効率よく心筋細胞へと分化誘導できる分化誘導方法を提供する。【解決手段】少なくとも培養面が脂環構造含有重合体で構成される培養容器に多能性幹細胞を接着させて心筋細胞へと分化誘導させる、多能性幹細胞の分化誘導方法。【選択図】図１

Description

本発明は、多能性幹細胞の分化誘導方法に関し、特に多能性幹細胞から心筋細胞への分化誘導方法に関する。なお、本発明は、人工多能性幹細胞に適用でき、また、ＥＳ細胞などの生体由来幹細胞にも適用できる。

受精卵より発生分化した初期胚から取り出したＥＳ細胞を利用して、幹細胞から中胚葉系細胞への分化条件の研究がおこなわれている（非特許文献１）。上記研究の成果を、多能性幹細胞の分化誘導に適用し、多能性幹細胞から心筋細胞への分化誘導が行われている（特許文献１〜３）。

特表2007-529227号公報特開2016-49099号公報特開2010-213576号公報国際公開第2015/199117号国際公開第2017/115706号

Tomoyuki Sumi、他３名、「Defining early lineage specification of human embryonic stem cells by the orchestrated balance of canonical Wnt/β-catenin, Activin/Nodal and BMP signaling」、2008、Volume 135、p.2969-2979 諫田泰成、他２名、「ヒトｉＰＳ細胞から成熟した心筋細胞の開発と安全性評価への応用」、日薬理誌、2016、Vol．147、p.334−338

多能性幹細胞への分化操作は、多能性幹細胞を培養皿等の培養容器に播種した後、分化誘導因子や化学薬剤を含む培地を添加し、必要に応じて、培養経過途中で培地を交換しながら、目的とする細胞に分化させることが行われる。

ここで、心臓疾患の治療や、開発された新薬の心臓への毒性評価試験等に利用することを目的として、多能性幹細胞に対して分化誘導操作を行い、心筋細胞へと分化させることについて検討がなされている。

心筋細胞は、特徴的な細胞内の構造として、サルコメア構造を有している。このサルコメアの伸縮が心筋細胞の拍動運動の駆動力を発生させている。サルコメアには、繊維状アクチンが形成されており、その繊維状アクチン表面に規則正しくトロポニンが配置されている。サルコメア構造の規則的な構造化と、サルコメアの正しく規則的な収縮を起こすために、このトロポニンが必要である。

分化誘導操作によって多能性幹細胞から心筋細胞へと分化誘導された細胞には、心筋細胞（特にヒト臓器のもの）により近い特性を有することが望まれる。しかしながら、上記分化誘導された細胞は、心筋細胞の特徴的な細胞内構造である、サルコメア構造を構成するタンパク質の発現が低いとされている（非特許文献２）。したがって、サルコメアを構成するタンパク質等に関連する遺伝子（サルコメア関連タンパク質遺伝子）の発現の増強が必要となるものの、これらの発現を増強する方法は知られていない。

特許文献４および特許文献５には、表皮の基底細胞からの表皮細胞への分化誘導や、脂肪幹細胞から脂肪細胞への分化誘導を行うに際し、一般に用いられている表面処理ポリスチレンとは異なる素材で構成される培養容器を用いることが検討されている。

本発明は、上述した背景と技術課題に鑑みてなされたものであり、多能性幹細胞を効率よく心筋細胞へと分化誘導できる分化誘導方法を提供することを目的とする。

かかる技術的背景の下、本発明者は、多能性幹細胞から効率よく心筋細胞を得るべく鋭意検討した結果、脂環構造含有重合体で構成される培養容器内で多能性幹細胞の分化誘導を行うことにより、サルコメアを構成するタンパク質等に関連する遺伝子の発現促進効果が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。

本発明は、上記の知見に基づきなされたものであって、上記課題を有利に解決することを目的とするものであり、本発明の一態様は、少なくとも培養面が脂環構造含有重合体で構成される培養容器に多能性幹細胞を接着させて心筋細胞へと分化誘導させる、多能性幹細胞の分化誘導方法である。
培養容器の少なくとも培養面が脂環構造含有重合体で構成されることにより、当該培養面に接着して培養された細胞の心筋細胞に関連する遺伝子の発現が増強され、多能性幹細胞を効率よく心筋細胞へと分化誘導することができる。これは、脂環構造含有重合体がタンパク質低吸着性であり、溶出不純物が少ないという特性を有することに起因すると考えられる。

また、上記態様では、前記分化誘導によりサルコメア関連タンパク質遺伝子の発現を増加させることが好ましい。
心筋細胞は、特徴的な細胞内の構造として、サルコメア構造を有しており、このサルコメアの伸縮が心筋細胞の拍動運動の駆動力を発生させている。そのため、サルコメア関連タンパク質遺伝子の発現を増加させることにより、多能性幹細胞を効率よく心筋細胞へと分化誘導することができる。また、前記サルコメア関連タンパク質遺伝子は、トロポニン遺伝子であることが好ましい。

本発明によれば、多能性幹細胞を効率よく心筋細胞へと分化誘導できる。

図１は、市販の多能性幹細胞由来の心筋細胞のトロポニン遺伝子の発現量を１として相対量で示した、ｉＰＳ細胞株１を脂環構造含有重合体であるＺＥＯＮＯＲ（登録商標）１０６０Ｒ製プレート上で分化誘導した心筋細胞と、細胞培養用ポリスチレン製プレートで分化誘導した心筋細胞とのトロポニン発現量を比較するグラフである。図２は、市販の多能性幹細胞由来の心筋細胞のトロポニン遺伝子発現量を１として相対量で示した、ｉＰＳ細細胞株２を１０６０Ｒ製プレート上で分化誘導した心筋細胞と、細胞培養用ポリスチレン製プレートで分化誘導した心筋細胞とのトロポニン発現量を比較するグラフである。図３は、１０６０Ｒ製プレート上で心筋細胞への分化誘導を行った細胞の拍動を観察するための、経時的な蛍光強度の変化を示すグラフである。図４は、細胞培養用ポリスチレン製プレート上で心筋細胞への分化誘導を行った細胞の拍動を観察するための、経時的な蛍光強度の変化を示すグラフである。

以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。
本発明の方法は、多能性幹細胞を、心筋細胞へと分化誘導するにあたって、少なくとも細胞が接する面（以下、「培養面」という）が脂環構造含有重合体で構成される培養容器を用いる点に特徴がある。
このような培養容器を用いることで、多能性幹細胞に必要以上のストレスを与えることなく、多能性幹細胞を培養面に接着させることができ、さらに、脂環構造含有重合体のタンパク質低吸着性に起因して、分化誘導を起こすための分化誘導因子（タンパク質）の吸着ロスが少なく、これらの分化誘導因子を効率的に多能性幹細胞に作用させることができる。上記のような要因により、多能性幹細胞を高効率で心筋細胞へと分化誘導できると考えられる。

本明細書において、多能性幹細胞とは、体細胞に初期化因子を作用させることにより、的に分化多能性を獲得させた細胞を指す。

上記多能性幹細胞を培養するための培地は、多能性幹細胞を培養し、維持することができれば、特に限定されるものではなく、例えば、Ｅ８培地（ウィスコンシン大学により開発）、ＳｔｅｍＦｉｔ培地（味の素社製）、ＲｅｐｒｏＦＦ２培地（リプロ社製）、Ｓｔｅｍ-ＰａｒｔｎｅｒＳＦ（極東製薬工業社製）などなどが挙げられる。
上記培地には、添加剤を配合することもできる。添加剤としては、ミネラル、金属、ビタミン成分等が挙げられる。
これらの添加剤は一種単独で、あるいは二種以上を組み合わせて用いることができる。

上記細胞を培養容器に播種する方法に格別な制限はなく、例えば、必要に応じて、少なくとも培養面を細胞外マトリックス等でコートする。その後、培地に懸濁した細胞をピペット等で培養容器内に播種し、必要に応じて容器を揺動させて培養容器内に細胞を均等に散らした後、インキュベータ内で静置する。細胞外マトリックスとしては、例えば、ゼラチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニンなどの天然由来または組換え産生物やペプチド合成などの合成の方法が挙げられる。あるいは、ゲルトレックスなどの細胞分泌物を調製したものが挙げられる。

培養面を細胞外マトリックスでコートする方法は、一般的な細胞基質を培養容器にコートする方法と同様であり、通常、培養容器内に上述のコート剤を入れて、培養温度付近の温度で、通常１０分間〜５時間、好ましくは３０分間〜２時間静置しコート剤を培養面に接触させた後、コート剤を除去する方法が採用される。接触時間が短すぎるとコートが不十分となる。一方、培養面を構成する脂環構造含有重合体へのタンパク質吸着性は低く、ポリスチレンなどのように多層吸着しないため、接触時間を長くしても、吸着量が増えることはない。従って、上記の時間以上に接触時間を長くする必要はない。なお、コート剤除去後、乾燥を防ぐために、速やかに培地を添加することが望ましい。

脂環構造含有重合体で構成される培養面は水性溶液をはじきやすいため、培養容器に添加するコート剤の量は、一般的なポリスチレン製細胞培養容器に添加するコート剤量より１．５〜３倍程度多く添加することが望ましく、具体的には培養面１ｃｍ^２に対して、０．１５〜０．２５ｍｌを添加するのが好ましい。

本発明において、多能性幹細胞を心筋細胞へ分化誘導するためには、公知のプロトコールに従って心筋細胞への分化誘導を行えばよく、また、市販の分化誘導培地や分化キットを用いてもよく、特に限定されない。

本発明に用いる培養容器は、脂環構造含有重合体を培養容器として用いることが可能な任意の形状に成形してなるものである。培養容器のうち、少なくとも細胞や培養液と接する培養面が脂環構造含有重合体で構成されていればよい。あるいは、培養容器全体が脂環構造含有重合体からなることとしてもよい。例えば、バッグなどの場合、異なるポリマー材料からなるフィルムの積層体であって、最内層（バッグ内面）が脂環構造含有重合体からなるフィルムにより形成された層であればよい。また、培養ディッシュであれば、必要に応じて添加剤を加えて脂環構造含有重合体を成形し、実質的に容器全体を脂環構造含有重合体で構成することもできる。

培養容器の成形方法は、培養容器の形状に応じて任意に選択することができる。成形方法の具体例としては、射出成形法、押出成形法、キャスト成形法、インフレーション成形法、ブロー成形法、真空成形法、プレス成形法、圧縮成形法、回転成形法、カレンダー成形法、圧延成形法、切削成形法、紡糸等が挙げられ、これらの成形法を組み合わせたり、成形後必要に応じて延伸等の後処理をすることもできる。

上記脂環構造含有重合体は、主鎖および／または側鎖に脂環構造を有する樹脂であり、機械的強度、耐熱性などの観点から、主鎖に脂環構造を含有するものが好ましく、分化誘導効率の観点から、極性基を有しないものがより好ましい。ここで、極性基とは、極性のある原子団を指す。極性基としては、アミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、酸無水物基などが挙げられる。

上記脂環構造としては、飽和環状炭化水素（シクロアルカン）構造、不飽和環状炭化水素（シクロアルケン）構造などが挙げられるが、機械的強度、耐熱性などの観点から、シクロアルカン構造やシクロアルケン構造が好ましく、中でもシクロアルカン構造を有するものが最も好ましい。

脂環構造を構成する炭素原子数は、格別な制限はないが、通常４〜３０個、好ましくは５〜２０個、より好ましくは５〜１５個である。脂環構造を構成する炭素原子数がこの範囲内であるときに、機械的強度、耐熱性、および成形性の特性が高度にバランスされ、好適である。

脂環構造含有重合体中の脂環構造を有する繰り返し単位の割合は、使用目的に応じて適宜選択されればよいが、通常３０重量％以上、好ましくは５０重量％以上、より好ましくは７０重量％以上である。脂環構造含有重合体中の脂環構造を有する繰り返し単位の割合が過度に少ないと耐熱性に劣り好ましくない。脂環構造含有重合体中の脂環構造を有する繰り返し単位以外の残部は、格別な限定はなく、使用目的に応じて適宜選択される。

脂環構造含有重合体の具体例としては、（１）ノルボルネン系重合体、（２）単環の環状オレフィン系重合体、（３）環状共役ジエン系重合体、（４）ビニル脂環式炭化水素系重合体、および（１）〜（４）の水素化物などが挙げられる。これらの中でも、耐熱性、機械的強度等の観点から、ノルボルネン系重合体およびその水素化物が好ましい。

（１）ノルボルネン系重合体
ノルボルネン系重合体は、ノルボルネン骨格を有する単量体であるノルボルネン系単量体を重合してなるものであり、開環重合によって得られるものと、付加重合によって得られるものに大別される。

開環重合によって得られるものとしては、ノルボルネン系単量体の開環重合体およびノルボルネン系単量体とこれと開環共重合可能なその他の単量体との開環重合体、ならびにこれらの水素化物などが挙げられる。付加重合によって得られるものとしては、ノルボルネン系単量体の付加重合体およびノルボルネン系単量体とこれと共重合可能なその他の単量体との付加重合体などが挙げられる。これらの中でも、ノルボルネン系単量体の開環重合体水素化物が、耐熱性、機械的強度等の観点から好ましい。

ノルボルネン系重合体の合成に使用可能なノルボルネン系単量体としては、ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エン（慣用名ノルボルネン）、５−メチル−ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エン、５，５−ジメチル−ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エン、５−エチル−ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エン、５−エチリデン−ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エン、５−ビニル−ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エン、５−プロペニルビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エン、５−メトキシカルボニル−ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エン、５−シアノビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エン、５−メチル−５−メトキシカルボニル−ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エン等の２環式単量体；
トリシクロ［４．３．０^１，６．１^２，５］デカ−３，７−ジエン（慣用名ジシクロペンタジエン）、２−メチルジシクロペンタジエン、２，３−ジメチルジシクロペンタジエン、２，３−ジヒドロキシジシクロペンタジエン等の３環式単量体；
テトラシクロ［４．４．０．１^２，５．１^７，１０］−３−ドデセン（テトラシクロドデセン）、テトラシクロ［４．４．０．１^２，５．１^７，１０］−３−ドデセン、８−メチルテトラシクロ［４．４．０．１^２，５．１^７，１０］−３−ドデセン、８−エチルテトラシクロ［４．４．０．１^２，５．１^７，１０］−３−ドデセン、８−エチリデンテトラシクロ［４．４．０．１^２，５．１^７，１０］−３−ドデセン、８，９−ジメチルテトラシクロ［４．４．０．１^２，５．１^７，１０］−３−ドデセン、８−エチル−９−メチルテトラシクロ［４．４．０．１^２，５．１^７，１０］−３−ドデセン、８−エチリデン−９−メチルテトラシクロ［４．４．０．１^２，５．１^７，１０］−３−ドデセン、８−メチル−８−カルボキシメチルテトラシクロ［４．４．０．１^２，５．１^７，１０］−３−ドデセン、７，８−ベンゾトリシクロ［４．３．０．１^２，５］デカ−３−エン（慣用名メタノテトラヒドロフルオレン：１，４−メタノ−１，４，４ａ，９ａ−テトラヒドロフルオレンともいう）、１，４−メタノ−８−メチル−１，４，４ａ，９ａ−テトラヒドロフルオレン、１，４−メタノ−８−クロロ−１，４，４ａ，９ａ−テトラヒドロフルオレン、１，４−メタノ−８−ブロモ−１，４，４ａ，９ａ−テトラヒドロフルオレン等の４環式単量体；等が挙げられる。

ノルボルネン系単量体と開環共重合可能なその他の単量体としては、シクロヘキセン、シクロヘプテン、シクロオクテン、１，４−シクロヘキサジエン、１，５−シクロオクタジエン、１，５−シクロデカジエン、１，５，９−シクロドデカトリエン、１，５，９，１３−シクロヘキサデカテトラエン等の単環のシクロオレフィン系単量体が挙げられる。
これらの単量体は、置換基を１種または２種以上有していてもよい。置換基としては、アルキル基、アルキレン基、アリール基、シリル基、アルコキシカルボニル基、アルキリデン基等が挙げられる。

ノルボルネン系単量体と付加共重合可能なその他の単量体としては、エチレン、プロピレン、１−ブテン、１−ペンテン、１−ヘキセン等の炭素数２〜２０のα−オレフィン系単量体；シクロブテン、シクロペンテン、シクロヘキセン、シクロオクテン、テトラシクロ［９．２．１．０^２，１０．０^３，８］テトラデカ−３，５，７，１２−テトラエン（３ａ，５，６，７ａ−テトラヒドロ−４，７−メタノ−１Ｈ−インデンとも言う）等のシクロオレフィン系単量体；１，４−ヘキサジエン、４−メチル−１，４−ヘキサジエン、５−メチル−１，４−ヘキサジエン、１，７−オクタジエン等の非共役ジエン系単量体；等が挙げられる。

これらの中でも、ノルボルネン系単量体と付加共重合可能なその他の単量体としては、α−オレフィン系単量体が好ましく、エチレンがより好ましい。
これらの単量体は、置換基を１種または２種以上有していてもよい。置換基としては、アルキル基、アルキレン基、アリール基、シリル基、アルコキシカルボニル基、アルキリデン基等が挙げられる。

ノルボルネン系単量体の開環重合体、またはノルボルネン系単量体とこれと開環共重合可能なその他の単量体との開環重合体は、単量体成分を、公知の開環重合触媒の存在下で重合して得ることができる。開環重合触媒としては、例えば、ルテニウム、オスミウムなどの金属のハロゲン化物と、硝酸塩またはアセチルアセトン化合物、および還元剤とからなる触媒、あるいは、チタン、ジルコニウム、タングステン、モリブデンなどの金属のハロゲン化物またはアセチルアセトン化合物と、有機アルミニウム化合物とからなる触媒を用いることができる。
ノルボルネン系単量体の開環重合体水素化物は、通常、上記開環重合体の重合溶液に、ニッケル、パラジウムなどの遷移金属を含む公知の水素化触媒を添加し、炭素−炭素不飽和結合を水素化することにより得ることができる。

ノルボルネン系単量体の付加重合体、またはノルボルネン系単量体とこれと共重合可能なその他の単量体との付加重合体は、単量体成分を、公知の付加重合触媒の存在下で重合して得ることができる。付加重合触媒としては、例えば、チタン、ジルコニウムまたはバナジウム化合物と有機アルミニウム化合物とからなる触媒を用いることができる。

（２）単環の環状オレフィン系重合体
単環の環状オレフィン系重合体としては、例えば、シクロヘキセン、シクロヘプテン、シクロオクテンなどの、単環の環状オレフィン系単量体の付加重合体を用いることができる。
（３）環状共役ジエン系重合体
環状共役ジエン系重合体としては、例えば、シクロペンタジエン、シクロヘキサジエンなどの環状共役ジエン系単量体を１，２−または１，４−付加重合した重合体およびその水素化物などを用いることができる。
（４）ビニル脂環式炭化水素重合体
ビニル脂環式炭化水素重合体としては、例えば、ビニルシクロヘキセン、ビニルシクロヘキサンなどのビニル脂環式炭化水素系単量体の重合体およびその水素化物；スチレン、α−メチルスチレンなどのビニル芳香族系単量体の重合体の芳香環部分の水素化物；などが挙げられる。ビニル脂環式炭化水素重合体は、これらの単量体と共重合可能な他の単量体との共重合体であってもよい。

脂環構造含有重合体の分子量に格別な制限はないが、シクロヘキサン溶液（重合体が溶解しない場合はトルエン溶液）のゲル・パーミエーション・クロマトグラフィーで測定したポリイソプレン換算の重量平均分子量で、通常５，０００以上であり、好ましくは５，０００〜５００，０００、より好ましくは８，０００〜２００，０００、特に好ましくは１０，０００〜１００，０００である。重量平均分子量がこの範囲内であるときに、機械的強度と成形加工性とが高度にバランスし、好適である。

脂環構造含有重合体のガラス転移温度は、使用目的に応じて適宜選択されればよいが、通常５０〜３００℃、好ましくは８０〜２８０℃、特に好ましくは９０〜２５０℃、さらに好ましくは９０〜２００℃である。ガラス転移温度がこの範囲内であるときに、耐熱性と成形加工性とが高度にバランスし、好適である。
本発明における脂環構造含有重合体のガラス転移温度は、ＪＩＳＫ７１２１に基づいて測定されたものである。

上記脂環構造含有重合体は、それぞれ単独で、あるいは２種以上を組み合わせて用いることができる。
また、脂環構造含有重合体には、熱可塑性樹脂材料で通常用いられている配合剤、例えば、軟質重合体、酸化防止剤、紫外線吸収剤、光安定剤、近赤外線吸収剤、離型剤、染料や顔料などの着色剤、可塑剤、帯電防止剤、蛍光増白剤などの配合剤を、通常採用される量、添加することができる。
また、脂環構造含有重合体には、軟質重合体以外のその他の重合体（以下、単に「その他の重合体」という）を混合しても良い。脂環構造含有重合体に混合されるその他の重合体の量は、脂環構造含有重合体１００質量部に対して、通常２００質量部以下、好ましくは１５０質量部以下、より好ましくは１００質量部以下である。
脂環構造含有重合体に対して配合する各種配合剤やその他の重合体の割合が多すぎると細胞が浮遊し難くなるため、いずれも脂環構造含有重合体の性質を損なわない範囲で配合することが好ましい。
脂環構造含有重合体と配合剤やその他の重合体との混合方法は、ポリマー中に配合剤が十分に分散する方法であれば、特に限定されない。また、配合の順番に格別な制限はない。配合方法としては、例えば、ミキサー、一軸混練機、二軸混練機、ロール、ブラベンダー、押出機などを用いて樹脂を溶融状態で混練する方法、適当な溶剤に溶解して分散させた後、凝固法、キャスト法、または直接乾燥法により溶剤を除去する方法などが挙げられる。
二軸混練機を用いる場合、混練後は、通常は溶融状態で棒状に押出し、ストランドカッターで適当な長さに切り、ペレット化して用いられることが多い。

脂環構造含有重合体で構成される容器の成形方法は、所望される培養容器の形状に応じて任意に選択することができる。成形方法としては、例えば、射出成形法、押出成形法、キャスト成形法、インフレーション成形法、ブロー成形法、真空成形法、プレス成形法、圧縮成形法、回転成形法、カレンダー成形法、圧延成形法、切削成形法、紡糸等が挙げられ、これらの成形法を組み合わせたり、成形後必要に応じて延伸等の後処理をすることもできる。
培養容器の形状としては、ディッシュ、プレート、マイクロ流路チップ、バッグ、チューブ、スキャホールド、カップ、ジャー・ファーメンターなどが挙げられる。

本発明で使用される培養容器は、滅菌処理することが好ましい。
滅菌処理の方法に格別な制限はなく、高圧蒸気法や乾熱法などの加熱法；γ線や電子線などの放射線を照射する放射線法や高周波を照射する照射法；酸化エチレンガス（ＥＯＧ）などのガスを接触させるガス法；滅菌フィルタを用いる濾過法；など、医療分野で一般的に採用される方法から、成形体の形状や用いる細胞に応じて、選択することができる。なかでも、表面の極性状態の変化が少ないことから、ガス法が好ましい。

以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

（実施例Ｉ）
脂環構造含有重合体として、ＺＥＯＮＯＲ（登録商標）１０６０Ｒ（日本ゼオン社製、ノルボルネン系開環重合体水素化物；以下、単に「１０６０Ｒ」という）を用いて、射出形成法により、９６ウェルプレートを得、次いで、エチレンオキサイド滅菌処理を行った。以下、この培養容器を「１０６０Ｒ製プレート」という。

比較例として、細胞培養用に表面を親水化処理した９６ウェルポリスチレンプレート（コーニング社製ＦＡＬＣＯＮ）を培養容器として用いた。以下、この容器を「細胞培養用ポリスチレン製プレート」という。

いわゆる山中４因子であるＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、Ｍｙｃ、およびＫＬＦ４の遺伝子をヒト由来の表皮細胞に導入することにより作製し、核型異常がないことを確認したｉＰＳ細胞株（ｉＰＳ細胞株１、およびｉＰＳ細胞株２）を多能性幹細胞として用いた。

多能性幹細胞から心筋細胞への分化誘導操作の培地試薬は、ＳＴＥＭＣＥＬＬ社製の心筋分化誘導キット（品番＃０５０１０）を用いた。

培養容器として１０６０Ｒ製プレートに、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（コーニング社製）をコーティングしたうえで、濃度１０μＭの薬剤Ｙ２７６３２を含有する培地ＳｔｅｍＦｉｔＡＫ０２Ｎ（味の素社製＃ＡＫ０２）を用いて、１平方センチメートルあたり８８，０００細胞の密度で播種し、３７℃、５％ＣＯ_２環境下で一晩培養した。
一晩培養後に、薬剤Ｙ２７６３２を含まない培地ＳｔｅｍＦｉｔＡＫ０２Ｎに交換をした。続いて、１％濃度のＭａｔｒｉｇｅｌを含有させた心筋分化誘導キットの培地ＡであるSTEMdiff Cardiomyocyte Differentiation Medium Aで培地交換し、２日間培養した。
続いて、心筋分化誘導キットの培地ＢであるSTEMdiff Cardiomyocyte Differentiation Medium Bに培地交換し、２日間培養した。続いて、心筋分化誘導キットの培地ＣであるSTEMdiff Cardiomyocyte Differentiation Medium Cに培地交換し、２日間培養し、培養２日後に、心筋分化誘導キットの培地Ｃに培地交換して、更に２日間培養した。
続いて、心筋分化誘導キットの培地であるSTEMdiff Cardiomyocyte Maintenance Medium に培地交換し、以降２〜３日間おきに同培地で培地交換した。上記培養後に、培養細胞を顕微鏡で観察すると、自動拍動していることが確認できた。

比較例として、同じｉＰＳ細胞株を用い、かつ、細胞培養用ポリスチレン製プレートを用いて、上記の１０６０Ｒ製プレートでの操作条件と同じ培養操作を並行して行った。

ｉＰＳ細胞株１を用いて分化誘導した細胞は、分化誘導開始から１５日目で回収し、ｉＰＳ細胞株２を用いて分化誘導した細胞は、分化誘導開始から１８日目で回収し、その後、両方の細胞からそれぞれｍＲＮＡを抽出して、リアルタイムＰＣＲ分析によりトロポニン遺伝子の発現量を測定した。ｍＲＮＡの抽出操作には、調製キットＲＮｅａｓｙＭｉｎｉＫｉｔ（２５０）（ＱＩＡＧＥＮ社製品番＃７４１０６）を用いた。アルタイムＰＣＲ装置はＢＩＯＲＡＤ社製ＣＦＸ９６を用いた。

トロポニン遺伝子の定量のためのプライマーは、フォワードプライマー配列として、ＴＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＡＧＡＡＧＴＴ（配列番号１）、リバースプライマー配列として、ＣＧＧＧＴＣＴＴＧＧＡＧＡＣＴＴＴＣＴＧ（配列番号２）をＤＮＡ合成して用いた。上述のＲＮＡ試料とプレイマーを用いて、トロポニン発現量を、リアルタイムＰＣＲ法（内部標準遺伝子は、ＧＡＰＤＨ遺伝子）により定量した。

トロポニン遺伝子の発現量の対照としては、市販のｉＰＳ由来心筋細胞であるiCell Cardiomyocytes 2（ＣＤＩ社製）を、細胞試料として用いた。

ｉＰＳ細胞株１を用いて分化誘導した細胞のトロポニン遺伝子の発現量を図１に示す。１０６０Ｒ製プレートで分化誘導を行った心筋細胞は、市販のｉＰＳ由来心筋細胞（「市販心筋細胞」）に比較して、約８倍のトロポニン遺伝子を発現していた。
一方、細胞培養用ポリスチレン製プレートで分化誘導を行った心筋細胞は、市販のｉＰＳ由来心筋細胞に比較して、約半分のトロポニン遺伝子を発現していた。

この結果から、少なくとも培養面が脂環構造含有重合体で構成される培養容器を用いることで、心筋細胞の細胞内特徴構造であるサルコメア関連タンパク質の遺伝子の１つである、トロポニンの発現を増強できるといえる。

ｉＰＳ細胞株２を用いて分化誘導した細胞のトロポニン遺伝子の発現量を図２に示す。
１０６０Ｒ製プレートで分化誘導を行った心筋細胞は、市販のｉＰＳ由来心筋細胞に比較して、約３倍のトロポニン遺伝子を発現していた。
一方、細胞培養用ポリスチレン製プレートで分化誘導を行った心筋細胞は、市販のｉＰＳ由来心筋細胞に比較して、同程度のトロポニン遺伝子を発現していた。
この結果から、異なるｉＰＳ細胞株を用いても、少なくとも培養面が脂環構造含有重合体で構成される培養容器を用いることで、心筋細胞の細胞内特徴構造であるサルコメア関連タンパク質の遺伝子の１つである、トロポニンの発現を増強できるといえる。

（実施例ＩＩ）
実施例ＩのｉＰＳ細胞株１を用いて分化誘導した心筋細胞の拍動を観察した。
カルシウム検出試薬Ｆｌｕｏ８試薬（ＡＡＴＢｉｏｑｕｅｓｔ社製のＦｌｕｏ８ＡＭＣｅｌｌ・ｐｅｒｍｅａｂｌｅ）を最終濃度５μＭで培地に添加することにより、心筋の拍動に伴う細胞内カルシウム濃度変化を観察した。
蛍光顕微鏡は、ＢＺ−Ｘ７００（キーエンス社製）を用いて、ＢＺＸフィルタＧＦＰのフィルタを用いて、励起・蛍光観察を行った。
動画撮影は、８ｆｐｓで行い、撮影画像を画像解析ソフトのＩｍａｇｅＪ（米国ＮＩＨ公開ソフト）を用いて、蛍光変化データを解析した。
１０６０Ｒ製プレートで分化誘導を行った心筋細胞の蛍光変化データを図３に、細胞培養用ポリスチレン製プレートで分化誘導を行った心筋細胞の蛍光変化データを図４に示す。１０６０Ｒ製プレートで分化誘導を行った心筋細胞は、細胞培養用ポリスチレン製プレートで分化誘導を行った心筋細胞に比較して、カルシウム変化が大きく、大きく拍動していることが観察された。

図３〜４の結果から、少なくとも培養面が脂環構造含有重合体で構成される培養容器を用いることにより、多能性幹細胞を効率よく心筋細胞へと分化誘導することができることがわかる。

本発明の多能性幹細胞の分化誘導方法によれば、多能性幹細胞を効率よく心筋細胞へと分化誘導することができ、心筋細胞の細胞内特徴構造であるサルコメア関連タンパク質の遺伝子のうち、特にトロポニンの発現を増強できる。これにより、ヒト臓器の心筋に近い心筋細胞の作製が可能となる。

Claims

少なくとも培養面が脂環構造含有重合体で構成される培養容器に多能性幹細胞を接着させて心筋細胞へと分化誘導させる、多能性幹細胞の分化誘導方法。
前記分化誘導によりサルコメア関連タンパク質遺伝子の発現を増加させる、請求項１の多能性幹細胞の分化誘導方法。
前記サルコメア関連タンパク質遺伝子がトロポニン遺伝子である、請求項２の多能性幹細胞の分化誘導方法。