JPWO2016158039A1 - 医療器具、フッ素含有環状オレフィンポリマー、フッ素含有環状オレフィンポリマー組成物、および細胞培養方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)
一般式(1)で表される構造単位を含有するフッ素含有環状オレフィンポリマーを使用した基材を備える医療器具であって、
上記基材は、該基材と細胞とを接触させる一面を有するものであり、かつ、該基材は、上記一面に凹凸構造を備え、
上記凹凸構造から構成される凸凸間の幅(L1)と、上記細胞中のひとつあたりの播種細胞の最大径(L2)の比(L1/L2)が1〜300であり、上記細胞が上記凹凸構造を備えた上記一面に接着または付着せず、細胞増殖を促進することを特徴とする医療器具。
(2)
上記L1/L2が1〜100である(1)に記載の医療器具。
(3)
上記凹凸構造の凸凸間の幅が10μm〜1000μmである(1)または(2)に記載の医療器具。
(4)
上記一面の水接触角が70°〜160°である(1)ないし(3)のいずれか一つに記載の医療器具。
(5)
上記一面は、上記フッ素含有環状オレフィンポリマーと、光硬化性化合物と、光硬化開始剤と、を含むフッ素含有環状オレフィンポリマー組成物により構成される(1)ないし(4)のいずれか一つに記載の医療器具。
(6)
上記フッ素含有環状オレフィンポリマー組成物中における上記フッ素含有環状オレフィンポリマーと上記光硬化性化合物の質量比(フッ素含有環状オレフィンポリマー/光硬化性化合物)が、99.9/0.1〜50/50である(5)に記載の医療器具。
(7)
上記一面に接触させて細胞を培養するために用いられる(1)ないし(6)のいずれか一つに記載の医療器具。
(8)
上記細胞からの培養細胞が細胞シート、スフェロイドまたはコロニーから選択される成長細胞の群体を形成しながら浮遊増殖する(7)に記載の医療器具。
(9)
成長細胞の群体を緩衝液により遊離して上記一面から離脱させる(7)または(8)に記載の医療器具。
(10)
基材の凹凸構造を有する一面に細胞を接触させる医療器具の上記一面を形成するために用いられるフッ素含有環状オレフィンポリマーであって、下記一般式(1)で表される構造単位を含有するフッ素含有環状オレフィンポリマー。
(11)
基材の凹凸構造を有する一面に細胞を接触させる医療器具の上記一面を形成するために用いられるフッ素含有環状オレフィンポリマー組成物であって、
下記一般式(1)で表される構造単位を含有するフッ素含有環状オレフィンポリマーと、
光硬化性化合物と、
光硬化開始剤と、
を含むフッ素含有環状オレフィンポリマー組成物。
(12)
(1)ないし(9)のいずれか一つに記載の医療器具の一面上に接触させるように細胞を播種する工程と、
上記細胞を培養して培養細胞を得る工程と、
該一面上に緩衝液を添加して、該一面から培養細胞を浮遊させる工程と、
を備える細胞培養方法。
本発明における医療器具は以下に示される。
一般式(1)で表される構造単位を含有するフッ素含有環状オレフィンポリマーを使用した基材を備える医療器具であって、上記基材は、該基材と細胞とを接触させる一面を有し、かつ、該基材は、上記一面に凹凸構造を備え、上記凹凸構造から構成される凸凸間の幅(L1)と、上記細胞中のひとつあたりの播種細胞の最大径(L2)の比(L1/L2)が1〜300であり、上記細胞が上記凹凸構造を備えた上記一面に接着または付着せず、細胞増殖を促進することを特徴とする医療器具である。
ここで、「上記細胞が上記凹凸構造を備えた上記一面に接着または付着せず」とは、培養細胞が保持された一面上に培養液または緩衝液を添加したときに、該一面から培養細胞が浮遊し、剥離する状態をいう。
また、本実施形態において、基材の一面に接触させる細胞は幹細胞を含んでもよい。
また、培養後の形態で均一な細胞密度の細胞塊や均一な厚みの細胞シート、スフェロイド、コロニーなどの群体を形成し、該一面に保持した細胞を、リン酸緩衝生理食塩水などの緩衝液によって容易に浮遊させることができることを見出した。これにより、成長細胞を損傷させること無く基材から離脱させることが可能となる。
本発明における医療器具は、凹凸構造を形成した基材を備え、基材の一面のうち少なくとも凹部底面に細胞と培養液が接触または保持される形態で使用される医療器具である。このような医療器具は、例えば凹凸構造を形成した基材の一面の少なくとも凹部底面に接触または保持させた細胞を培養し増殖させ、成長細胞を利用することを目的としてもよく、または、凹凸構造を形成した基材の一面の少なくとも凹部底面に接触または保持させた成長細胞を利用した検査を行うために利用してもよい。
一方、細胞を培養するための医療器具においては、凹凸構造を形成した一面の少なくとも凹部底面を、細胞を培養するための培養面とすることもできる。
これに合わせ、上記一般式(1)で表される構造単位を含有するフッ素含有環状オレフィンポリマーによって形成される凹凸構造の凸凸間の幅は、好ましくは10μm〜1000μmである。より好ましくは15μm〜1000μm、さらに好ましくは20μm〜1000μmである。ここでの凸凸間の幅は、パターンを上方から観察したときの計測値であり、例えば、正方形や長方形などのパターンでは対角、円形のパターンでは直径、不定形のパターンでは最大幅を示し、形状は特に限定されない。この範囲とすることで、細胞を効果的に凹凸構造の凹部底面に接触または保持させることが可能になり、上記したように培養した形態で均一な密度の細胞塊や均一な厚みの細胞シート、スフェロイド、コロニーを作製することができる。
一方、細胞の形状は、特に限定する必要は無いが、例示するならば、例えば、シート状細胞、スフェロイド状細胞、コロニー状細胞、神経系形態細胞などである。特に、再生医療の分野では、本発明のように生体細胞と同様な薬物代謝系酵素活性を維持していることが望まれており、本発明の培養細胞は好適に生産できることが、重要な訴求点になる。また、本発明の培養細胞は、創薬やバイオ薬品、美容においても同様の機能を長期間維持することができ、本発明は世界的な潮流となりうる発明である。
本発明における基材の凹凸構造を有する一面に細胞を接触させる医療器具の上記一面を形成するために用いられるフッ素含有環状オレフィンポリマーは、下記一般式(1)で表される構造単位を含有する。
さらに、フッ素を含有しないその他のR1〜R4は、水素;メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、2−メチルイソプロピル基、n−ブチル基、n−ペンチル基、シクロペンチル基等の炭素数1〜10のアルキル基;メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ブトキシ基、ペントキシ基等の炭素数1〜10のアルコキシ基;またはメトキシメチル基、エトキシメチル基、プロポキシメチル基、ブトキシメチル基、ペントキシメチル基等の炭素数2〜10のアルコキシアルキル基が例示できる。好ましくは、式(1)中のR1〜R4は、それぞれが、フッ素またはフッ素原子を含む置換基である。
2−(2',2',3',3',4',4',5',5',6',6',6'−ウンデカフルオロヘプトキシ)−3,5−シクロペンチレンエチレン)、ポリ(1−(2',2',3',3',4',4',5',5',6',6',7',7',7'−トリデカフルオロヘプトキシ)−3,5−シクロペンチレンエチレン)、ポリ(1−(2',2',3',3',4',4',5',5',6',6',7',7',8',8',8'−ペンタデカフルオロオクトキシ)−3,5−シクロペンチレンエチレン)、ポリ(1−(2',2',3',3',4',4',5',5',6',6',7',7',8',8',9',9',9'−ヘプタデカフルオロデシロキシ)−3,5−シクロペンチレンエチレン)、ポリ(1,1,2−トリフルオロ−2−(1',1',1'−トリフルオロ−iso−プロポキシ)−3,5−シクロペンチレンエチレン)、ポリ(1,2−ジフルオロ−1−トリフルオロメトキシ−2−(2',2',3',3',4',4',4'−ヘプタフルオロブトキシ)−3,5−シクロペンチレンエチレン)、ポリ(1,1,2−トリフルオロ−(2',2',3',3',4',4',5',5',6',6',6'−ウンデカフルオロヘプトキシ)−3,5−シクロペンチレンエチレン)、ポリ(1,2−ビス(2',2',3',3',4',4',4'−ヘプタフルオロブトキシ)−3,5−シクロペンチレンエチレン)、ポリ(1,2−ビス(2',2',3',3',4',4',5',5',6',6',6'−ウンデカフルオロヘプトキシ)−3,5−シクロペンチレンエチレン)等が挙げられる。
次に、フッ素含有環状オレフィンポリマーの製造方法について説明する。
以下に記載の製造方法によって得られるフッ素含有環状オレフィンポリマーからなる凹凸構造を形成した成形物を、本発明の医療器具における基材として用いることにより、細胞の接着、または付着が抑制されることを特徴とする医療器具を好適に得ることができる。
本発明におけるフッ素含有環状オレフィンポリマーまたはフッ素含有環状オレフィンポリマー組成物を利用した医療器具は、医療用または細胞培養、または細胞の検査のため等に用いることができる。ここで医療器具を作製する方法について記載する。本発明における医療器具は、例えば、凹凸構造を形成したフィルムやシート状の単層膜からなる基材や、他の材料の上に凹凸構造を形成したフィルムやシート状の単層膜を接着剤または粘着剤などで本発明の樹脂または他樹脂または他材料に貼り付けて形成してしてもよい。さらに、押出しフィルム成型や射出成型のような方法でロールまたは金型に凹凸構造をつけて凹凸構造を形成してもよい。
これにより、モールドの形状やサイズを精度良く転写しながら、各種部材との強固な密着性を発現しつつ、細胞培養バッグ、またはプレートなどの各種培養器具の特性等を改質することができ、細胞の接着、または付着を抑制しつつ増殖させることが可能な医療器具を提供することができる。
さらに、本発明におけるフッ素含有環状オレフィンポリマー組成物は、例えばフッ素含有環状オレフィンポリマーを任意の濃度で光硬化性化合物と、光硬化開始剤と混合することで得られる。
これらのうちから、特に、製膜性の観点からは、大気圧下で70℃以上の沸点をもつ溶剤が好ましい。これにより、蒸発速度が速くなりすぎることを確実に抑えることができる。このため、塗布する際に部分的に溶剤が乾き始めてしまう等に起因して膜厚精度の悪化や膜表面におけるムラが生じてしまうことを、確実に抑制することができる。
その他、オキセタニル基を2個以上有する化合物としてビス(3−エチル−3−オキセタニルメチル)エーテル(3−エチル−3{[(3−エチルオキセタン−3−イル)メトキシ]メチル}オキセタン)、1,2−ビス[(3−エチル−3−オキセタニルメトキシ)]エタン、1,3−ビス[(3−エチル−3−オキセタニルメトキシ)]プロパン、1,3−ビス[(3−エチル−3−オキセタニルメトキシ)]−2,2−ジメチル−プロパン、1,4−ビス(3−エチル−3−オキセタニルメトキシ)ブタン、1,6−ビス(3−エチル−3−オキセタニルメトキシ)ヘキサン、1,4−ビス[(3−メチル−3−オキセタニル)メトキシ]ベンゼン、1,3−ビス[(3−メチル−3−オキセタニル)メトキシ]ベンゼン、1,4−ビス{[(3−メチル−3−オキセタニル)メトキシ]メチル}ベンゼン、1,4−ビス{[(3−メチル−3−オキセタニル)メトキシ]メチル}シクロヘキサン、4,4´−ビス{[(3−メチル−3−オキセタニル)メトキシ]メチル}ビフェニル、4,4´−ビス{[(3−メチル−3−オキセタニル)メトキシ]メチル}ビシクロヘキサン、2,3−ビス[(3−メチル−3−オキセタニル)メトキシ]ビシクロ[2.2.1]ヘプタン、2,5−ビス[(3−メチル−3−オキセタニル)メトキシ]ビシクロ[2.2.1]ヘプタン、2,6−ビス[(3−メチル−3−オキセタニル)メトキシ]ビシクロ[2.2.1]ヘプタン、1,4−ビス[(3−エチル−3−オキセタニル)メトキシ]ベンゼン、1,3−ビス[(3−エチル−3−オキセタニル)メトキシ]ベンゼン、1,4−ビス{[(3−エチル−3−オキセタニル)メトキシ]メチル}ベンゼン、1,4−ビス{[(3−エチル−3−オキセタニル)メトキシ]メチル}シクロヘキサン、4,4´−ビス{[(3−エチル−3−オキセタニル)メトキシ]メチル}ビフェニル、4,4'−ビス{[(3−エチル−3−オキセタニル)メトキシ]メチル}ビシクロヘキサン、2,3−ビス[(3−エチル−3−オキセタニル)メトキシ]ビシクロ[2.2.1]ヘプタン、2,5−ビス[(3−エチル−3−オキセタニル)メトキシ]ビシクロ[2.2.1]ヘプタン、2,6−ビス[(3−エチル−3−オキセタニル)メトキシ]ビシクロ[2.2.1]ヘプタン等のオキセタン化合物類が挙げられる。これらは、単独で用いても、2種以上組み合わせで用いてもよい。
本発明のフッ素含有環状オレフィンポリマー組成物は硬化後の形態で、光硬化性化合物が3次元の網目構造を形成することができ表面硬度を硬く改質することができる。このため、医療器具等に実装した場合の傷付き性を改善でき、細胞培養や細胞の検査のための基材として用いる際に、利便性良く使用することができる。
次に、上記の一般式(1)で表される構造単位を含有するフッ素含有環状オレフィンポリマーと、光硬化性化合物と、光硬化開始剤とを含む光硬化性組成物からなるワニスを用い、基材の凹凸構造を形成する方法は、上述したフッ素含有環状オレフィンポリマーワニスと同様な塗布工程を経た後に、UV照射硬化することによってモールドのパターンを転写することにより得ることができる。
本発明における細胞培養方法は、本発明における医療器具を構成する基材の凹凸構造を形成した一面に、接触または保持させるよう細胞を播種する工程と、上記細胞を培養して培養細胞を得る工程と、上記一面上にリン酸緩衝生理食塩水などの緩衝液を添加して、上記一面から上記培養細胞を浮遊させる工程とを備える。これにより、培養細胞を損傷なく基材から離脱させることができ、かつ効率的な増殖で細胞培養することができる。
これは、基材の細胞を接触または保持する一面が本発明における水接触角が70°以上の疎水な表面性状を有するフッ素含有環状オレフィンポリマー、またはフッ素含有環状オレフィンポリマー組成物により構成されていることにより実現される。また、培養環境を一定に保つために、播種した後にタッピングにより気泡を抜いてもよく、細胞の形態や増殖性を考慮して振動を与えて培養してもよく、培養液を流動させながら培養してもよく、撹拌しながら培養してもよく、特に制限はない。これらの中から、細胞の特性、装置の形態、生産性を考慮して好適に選ばれる。何れの形態であっても、本発明における医療器具で細胞を培養することにより、細胞を培養器具に付着、または密着を抑制しつつ、細胞シート、スフェロイド、コロニーなどの群体を形成させながら増殖させることができる。
さらに好ましくは、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水、トリス塩酸緩衝液、エチレンジアミン四酢酸緩衝液、トリスEDTA緩衝液、トリス酢酸EDTA緩衝液、トリスホウ酸EDTA緩衝液、濃縮SSC緩衝液、濃縮SSPE緩衝液、クエン酸ナトリウム緩衝液、炭酸重炭酸緩衝液、ホウ酸ナトリウム緩衝液などを単独もしくはトリプシン、ペプシン、レンネット、キモトリプシン、エラスターゼ、NADPHデハイドロゲナアゼまたはNADHデハイドロゲナアゼなどの酵素を含有させて用いてもよい。
下記の条件下でゲルパーミュエーションクロマトグラフィー(GPC)を使用して、テトラヒドロフラン(THF)または、トリフルオロトルエン(TFT)に溶解したポリマーの重量平均分子量(Mw)および数平均分子量(Mn)を、ポリスチレンスタンダードによって分子量を較正して測定した。
検出器:日本分光社製RI−2031および875−UVまたはViscotec社製Model270、直列連結カラム:Shodex K−806M、804、803、802.5、カラム温度:40℃、流量:1.0ml/分、試料濃度:3.0〜9.0 mg/ml
島津製作所社製DSC−50を用い、測定試料を窒素雰囲下で10℃/分の昇温速度で加熱し測定した。
協和界面科学社製固体表面エナジー解析装置CA−XE型を使用してJIS R3257(基板ガラス表面のぬれ性試験方法)に準拠し、2μlの水滴を基材表面に滴下し、静滴法により、基材表面に水滴が接触してから1分以内に接触角を測定した。
塗布膜の硬化には光源として、SCIVAX社製UVインプリント装置(X−100U)を用いて、培養フィルムとモールドを無圧着もしくは圧着した状態で、波長365nmのLED光を照射して硬化した。
日本分光社製 走査型電子顕微鏡 JSM−6701F(以下、SEMとも表記する。)を使用し、SEMの写真から任意の9点の凸凸間の幅を計測し平均値により算出した。
マウス胚繊維芽細胞(以下、BALB/3T3細胞と略す)を用い、10%仔ウシ血清(Calf Bovine Serum、CBS)と、高グルコースと、D−MEM培地(L-グルタミン、フェノールレッド、ピルビン酸ナトリウム含有)と、を含む溶液(以下、BALB/3T3細胞液と記載する。)中で、すべての継代培養および細胞増殖性試験を行った。また、ヒト皮膚繊維芽細胞(以下、Hs−68細胞と略す)のすべての継代培養および細胞増殖性試験についても同様に行った。
凍結したBALB/3T3細胞、またはHs−68細胞の細胞懸濁液を37℃ウォーターバスに浸けて解凍し、解凍した細胞懸濁液に氷上冷却した10%仔ウシ血清D−MEM培地を添加して遠心分離した。遠心後、上澄み液を除去して細胞塊をタッピングによりほぐした後、37℃ウォーターバスで保温した10%仔ウシ血清D−MEM培地を添加した。血球計算盤で細胞数を計数し、ウォーターバスで保温した10%仔ウシ血清D−MEM培地を用いて細胞懸濁液を調製し培養フラスコに細胞を播種した後、加湿インキュベーターで培養した。
加湿インキュベーターから培養フラスコを取り出して培地をアスピレーターで除去し、37℃ウォーターバス中で保温したダルベッコPBS(−)を加え、上澄みをアスピレーターで除去した。再度、同様な操作行った後、37℃ウォーターバス中で保温した0.025w/v%トリプシン−EDTA溶液を加えて加湿インキュベーター内で静置した後、10%仔ウシ血清D−MEM培地を加えて剥がれた細胞を回収して遠沈管に移し遠心分離して上澄み液を除去し、タッピングにより細胞塊をほぐした後、10%仔ウシ血清D−MEM培地を加えた。血球計算盤で細胞数を計数した後、10%仔ウシ血清D−MEM培地で細胞懸濁液を調製し、培養フラスコに細胞を播種して、加湿インキュベーターで培養した。
直径15mmに切り出した円形の培養フィルムをTCPSマルチウェルプレート(コーニング社製)穴部に置き、70%エタノール水溶液を加えて40分〜1時間浸漬した後、70%エタノール水溶液を除去してダルベッコPBS(−)に15分〜40分間浸漬した。次に、PBS(−)を除去して、培養器具をひっくり返し、同様な操作を行い、培養器具の表裏面を滅菌処理した。滅菌処理終了後、クリーンベンチ内で一晩乾燥させた。
25cm2培養フラスコで約60%コンフルエント状態になったBALB/3T3細胞を、上記、細胞の継代操作と同様な方法で0.025w/v%トリプシン−EDTAで処理して剥がした。血球計算盤で細胞数を計数して、10%仔ウシ血清D−MEM培地で7300〜7600cells/mLのBALB/3T3細胞、またはHs−68細胞の細胞懸濁液を調製した。また、実施例10ではHs−68細胞を1500cells/mLに調整した細胞懸濁液を使用した。
顕微鏡観察によるひとつあたりの細胞の平均計測から、細胞の最大径(L2)は25μmであった。または、同様な方法で調整したHs−68細胞の顕微鏡観察によるひとつあたりの細胞の平均計測から、細胞の最大径(L2)は20μmであった。
BALB/3T3細胞、またはHs−68細胞を凹凸構造の細胞を培養する面に播種し、加湿インキュベーターに入れた直後から4時間後のサンプルを加湿インキュベーターから取り出し、顕微鏡観察して、基材一面の任意の凹部30ヵ所に沈降している細胞の数をカウントし、ひとつあたりの凹部底面に沈降した細胞の数を平均値(=細胞数/30)として示した。
培養開始後1、3、7、および14日経過後の培養容器を加湿インキュベーターから取り出して培地を除去し、10%WST−8(Cell Counting Kit−8)/10%仔ウシ血清D−MEM培地の混合溶液を添加して、加湿インキュベーターで3時間インキュベートした。その後、培地200μlを96ウェルプレートに移し、プレートリーダー(SPECTRA max PLUS384、Molecular Devices社製)で波長450nmの吸光度を測定した。各培養容器の細胞増殖性は、吸光度の経時変化により確認した。
各種培養容器について、細胞を播種したサンプルを9検体準備して培養し、吸光度の測定結果をPrism 6 for Windows 6.01(エムデーエフ社製)により数値解析して、結果の平均値を吸光度として算出し、標準偏差に±の符号を付しバラツキの範囲とした。
所定期間細胞を培養した容器から培地を除去して、4%グルタルアルデヒド/リン酸緩衝液を添加し1時間静置した後、4%グルタルアルデヒド/リン酸緩衝液を除去した。その後、滅菌水で洗浄し、Image−iT Fixation/Permeabilizationキット(ライフサイエンス製)を使用し細胞核、および細胞骨格タンパクを染色して蛍光顕微鏡観察に用いる試料を調製した。蛍光顕微鏡観察は、オールインワン蛍光顕微鏡BZ−X700(キーエンス製)を使用した。
5,5,6−トリフルオロ−6−(トリフルオロメチル)ビシクロ[2.2.1]ヘプト−2−エン(100g)と1−ヘキセン(0.268g)のテトラヒドロフラン溶液に、Mo(N−2,6−Pri 2C6H3)(CHCMe2Ph)(OBut)2(50mg)のテトラヒドロフラン溶液を添加し、70℃で開環メタセシス重合を行った。得られたポリマーのオレフィン部を、パラジウムアルミナ(5g)存在下160℃で水素添加反応を行い、ポリ(1,1,2−トリフルオロ−2−トリフルオロメチル−3,5−シクロペンチレンエチレン)のテトラヒドロフラン溶液を得た。その溶液を孔径5μmのフィルターで加圧ろ過しパラジウムアルミナを除去した溶液をメタノールに加え、白色のポリマーをろ別、乾燥し99gのポリマー1を得た。得られたポリマー1は、上記一般式(1)により表される構造単位を含有していた。また、水素添加率は100%、重量平均分子量(Mw)は83000、分子量分布(Mw/Mn)は1.73、ガラス転移温度は109℃であった。
製造例1で合成したポリマー1をメチルイソブチルケトンに30質量%濃度で溶解し、その溶液を孔径1μmのフィルターで加圧ろ過し、次いで0.1μmのフィルターでろ過してポリマー1のメチルイソブチルケトン溶液を調製した。次いで、凸部の幅100μm、パターンピッチ130μm、パターン深さ40μmの格子形状を有する石英モールドにポリマー1のメチルイソブチルケトン溶液を塗布し、アプリケーターを用いて均一にコートした後、140℃で60分乾燥して剥離することで、厚み80μmの格子形状の培養フィルム1を作製した。
培養フィルム1の凸凸間の幅(L1)は100μmであり、BALB/3T3細胞の最大径(L2=25μm)との比(L1/L2)は4であった。また、水接触角(15秒経過時)は126.0°であった。
製造例2で使用したポリマー1のメチルイソブチルケトン溶液を、凸部の幅500μm、パターンピッチ570μm、パターン深さ70μmの格子形状を有するニッケルモールドに塗布し、アプリケーターを用いて均一にコートした後、140℃で60分乾燥して剥離することで、厚み110μmの格子形状の培養フィルム2を作製した。
培養フィルム2の凸凸間の幅(L1)は500μmであり、BALB/3T3細胞の最大径(L2=25μm)との比(L1/L2)は20であった。また、水接触角(15秒経過時)は134.1°であった。
製造例1で合成したフッ素含有環状オレフィンポリマー1(A)を30質量%濃度で溶解したメチルイソブチルケトン溶液100gに、光硬化性化合物(B)として3−エチル−3{[(3−エチルオキセタン−3−イル)メトキシ]メチル}オキセタンと1,7−オクタジエンジエポキシドの質量比9/1の混合物を20g、および光硬化開始剤としてアデカオプトマーSP−172(ADEKA社製)を0.8g加えた溶液を調製し、孔径1μmのフィルターで加圧ろ過し、次いで0.1μmのフィルターでろ過して光硬化性組成物1を調製した(成分(A)と成分(B)の比:[(A)/(B)=60/40])。次いで、凸部の幅300μm、パターンピッチ350μm、パターン深さ50μmの格子形状を有する石英モールドに、光硬化性組成物1をアプリケーターを用いて均一にコートした後、140℃で30分乾燥し、コート面の背面から波長365nmのUV光を200mJ/cm2の積算光量で照射し、その後モールドから剥離することで、厚み90μmの格子形状の培養フィルム3を作製した。
培養フィルム3の凸凸間の幅(L1)は300μmであり、BALB/3T3細胞の最大径(L2=25μm)との比(L1/L2)は12であった。また、水接触角(15秒経過時)は128.1°であった。
製造例1で合成したフッ素含有環状オレフィンポリマー1(A)を30質量%濃度で溶解したシクロヘキサノン溶液100gに、光硬化性化合物(B)として3−エチル−3{[(3−エチルオキセタン−3−イル)メトキシ]メチル}オキセタンと1,7−オクタジエンジエポキシドの質量比9/1の混合物を3g、および光硬化開始剤としてCPI−100P(サンアプロ社製)を0.1g加えた溶液を調製し、孔径1μmのフィルターで加圧ろ過し、次いで0.1μmのフィルターでろ過して光硬化性組成物2を調製した(成分(A)と成分(B)の比:[(A)/(B)=90/10])。次いで、製造例3で使用したニッケルモールドに光硬化性組成物2をアプリケーターを用いて均一にコートした後、140℃で50分乾燥し、コート面の背面から波長365nmのUV光を200mJ/cm2の積算光量で照射し、その後モールドから剥離することで、厚み105μmの格子形状の培養フィルム4を作製した。
培養フィルム4の凸凸間の幅(L1)は500μmであり、BALB/3T3細胞の最大径(L2=25μm)との比(L1/L2)は20であった。また、水接触角(15秒経過時)は129.4°であった。
製造例2で作製した培養フィルム1を滅菌し、パターン面を上方に24穴TCPSマルチウェルプレートの穴部底面に置き、滅菌グリース(東レ・ダウコーニング社製)でSUS製O−リング(内径11mm)と密着させて固定した後、BALB/3T3細胞液(1mL)を培養フィルム1のパターン面に播種した。同操作を9回実施して、検体数で9個のサンプルを準備した。その後、蓋をして加湿インキュベーターに移動し、庫内温度37℃、炭酸ガス濃度5%の滅菌空気下で培養を開始した。次いで、4時間経過後のサンプルを顕微鏡観察し培養フィルム1の凹凸構造の任意の30ヵ所の凹部底面に沈降したBALB/3T3細胞の数をカウントして平均を算出した。その結果、ひとつあたりの凹部底面に1.3個の細胞が存在することが確認された。
WST−8法による細胞増殖性の評価では、1日経過後の吸光度が0.31±0.02であり、3日経過後で0.95±0.05であり、7日経過後で2.37±0.08であった。経過日数に対して吸光度は直線的に増大しており、7日経過しても増殖性に変化は見られなかった。また、7日間培養した細胞を顕微鏡観察すると、細胞は厚み方向に対して細胞シートの群体を形成した状態で増殖しており、リン酸緩衝生理食塩水を添加すると細胞シートの群体形成の形態を保った状態で浮遊した(図1参照)。
製造例3で作製した培養フィルム2を滅菌し、実施例1と同様な方法で24穴TCPSマルチウェルプレートに固定し、解凍済みのBALB/3T3細胞液(1mL)を培養フィルム2のパターン面に播種した。同操作を9回繰り返し、検体数で9個のサンプルを準備した。その後、蓋をしてインキュベーターに移動し庫内温度37℃、炭酸ガス濃度5%の滅菌空気下で培養を開始した。次いで、4時間経過後のサンプルを顕微鏡観察し培養フィルム2の凹凸構造の任意の30ヵ所の凹部底面に沈降したBALB/3T3細胞の数をカウントして平均を算出した。その結果、ひとつあたりの凹部底面に26個の細胞が存在することが確認された。
WST−8法による細胞増殖性の評価では、1日経過後の吸光度が0.24±0.02であり、3日経過後で0.73±0.05であり、7日経過後で1.89±0.09であった。経過日数に対して吸光度は直線的に増大しており、7日経過しても増殖性に変化は見られなかった。また、7日間培養した細胞を顕微鏡観察すると、細胞は厚み方向に対して細胞シートの群体を形成した状態で増殖しており、リン酸緩衝生理食塩水を添加すると細胞シートの群体形成の形態を保った状態で浮遊した。
製造例4で作製した培養フィルム3を滅菌し、実施例1と同様な方法で24穴TCPSマルチウェルプレートに固定し、解凍済みのBALB/3T3細胞液(1mL)を培養フィルム3のパターン面に播種した。同操作を9回繰り返し、検体数で9個のサンプルを準備した。その後、蓋をしてインキュベーターに移動し庫内温度37℃、炭酸ガス濃度5%の滅菌空気下で培養を開始した。次いで、4時間経過後のサンプルを顕微鏡観察し培養フィルム3の凹凸構造の任意の30ヵ所の凹部底面に沈降したBALB/3T3細胞の数をカウントして平均値を算出した。その結果、ひとつあたりの凹部底面に9.7個の細胞が存在することが確認された。
WST−8法による細胞増殖性の評価では、1日経過後の吸光度が0.28±0.01であり、3日経過後で0.89±0.02であり、7日経過後で2.26±0.07であった。経過日数に対して吸光度は直線的に増大しており、7日経過しても増殖性に変化は見られなかった。また、7日間培養した細胞を顕微鏡観察すると、細胞は厚み方向に対して細胞シートの群体を形成した状態で増殖しており、リン酸緩衝生理食塩水を添加すると細胞シートの群体形成の形態を保った状態で浮遊した。
製造例5で作製した培養フィルム4を滅菌し、実施例1と同様な方法で24穴TCPSマルチウェルプレートに固定し、解凍済みのBALB/3T3細胞液(1mL)を培養フィルム4のパターン面に播種した。同操作を9回繰り返し、検体数で9個のサンプルを準備した。その後、蓋をしてインキュベーターに移動し庫内温度37℃、炭酸ガス濃度5%の滅菌空気下で培養を開始した。次いで、4時間経過後のサンプルを顕微鏡観察し培養フィルム4の凹凸構造の任意の30ヵ所の凹部底面に沈降したBALB/3T3細胞の数をカウントして平均値を算出した。その結果、ひとつあたりの凹部底面に26個の細胞が存在することが確認された。
WST−8法による細胞増殖性の評価では、1日経過後の吸光度が0.24±0.03であり、3日経過後で0.70±0.04であり、7日経過後で1.75±0.06であった。経過日数に対して吸光度は直線的に増大しており、7日経過しても増殖性に変化は見られなかった。また、7日間培養した細胞を顕微鏡観察すると、細胞は厚み方向に対して細胞シートの群体を形成した状態で増殖しており、リン酸緩衝生理食塩水を添加すると細胞シートの群体形成の形態を保った状態で浮遊した。
フッ素含有環状オレフィンモノマーの種類を5,6−ジフルオロ−5−ペンタフルオロエチル−6−トリフルオロメチルビシクロ[2.2.1]ヘプト−2−エンに変更したこと以外は、製造例1と同様な方法により97gのポリマー2を得た。得られたポリマー2は、一般式(1)により表される構造単位を含有していた。また、水素添加率は100%、重量平均分子量(Mw)は91000、分子量分布(Mw/Mn)は1.93、ガラス転移温度は104℃であった。
次に、製造例2と同様な方法により厚み85μmの格子形状の培養フィルム5を作製した。培養フィルム5の凸凸間の幅(L1)は100μmであり、BALB/3T3細胞の最大径(L2=25μm)との比(L1/L2)は4であった。また、水接触角(15秒経過時)は128.1°であった。
培養フィルム5による実施例1と同様な方法で実施したBALB/3T3細胞の培養では、4時間経過後のサンプルを顕微鏡観察し培養フィルム5の凹凸構造の任意の30ヵ所の凹部底面に沈降したBALB/3T3細胞の数をカウントして平均値を算出すると、ひとつあたりの凹部底面に1.3個の細胞が存在することが確認された。
WST−8法による細胞増殖性の評価では、1日経過後の吸光度が0.30±0.03であり、3日経過後で0.99±0.03であり、7日経過後で2.28±0.11であった。経過日数に対して吸光度は直線的に増大しており、7日経過しても増殖性に変化は見られなかった。また、7日間培養した細胞を顕微鏡観察すると、細胞は厚み方向に対して細胞シートの群体を形成した状態で増殖しており、リン酸緩衝生理食塩水を添加すると細胞シートの群体形成の形態を保った状態で浮遊した。
フッ素含有環状オレフィンモノマーの種類を5,6−ジフルオロ−5−へプタフルオロ−iso−プロピル−6−トリフルオロメチルビシクロ[2.2.1]ヘプト−2−エンに変更したこと以外は、製造例1と同様な方法により98gのポリマー3を得た。得られたポリマー3は、一般式(1)により表される構造単位を含有していた。また、水素添加率は100%、重量平均分子量(Mw)は142000、分子量分布(Mw/Mn)は1.40、ガラス転移温度は137℃であった。
次に、モールドを製造例3で使用した格子形状のニッケルモールドに変更したこと以外は、製造例2と同様な方法により厚み103μmの格子形状の培養フィルム6を作製した。培養フィルム6の凸凸間の幅(L1)は500μmであり、BALB/3T3細胞の最大径(L2=25μm)との比(L1/L2)は20であった。また、水接触角(15秒経過時)は136.3°であった。
培養フィルム6による実施例1と同様な方法で実施したBALB/3T3細胞の培養では、4時間経過後のサンプルを顕微鏡観察し培養フィルム6の凹凸構造の任意の30ヵ所の凹部底面に沈降したBALB/3T3細胞の数をカウントして平均値を算出すると、ひとつあたりの凹部底面に26個の細胞が存在することが確認された。
WST−8法による細胞増殖性の評価では、1日経過後の吸光度が0.21±0.03であり、3日経過後で0.68±0.03であり、7日経過後で1.56±0.15であった。経過日数に対して吸光度は直線的に増大しており、7日経過しても増殖性に変化は見られなかった。また、7日間培養した細胞を顕微鏡観察すると、細胞は厚み方向に対して細胞シートの群体を形成した状態で増殖しており、リン酸緩衝生理食塩水を添加すると細胞シートの群体形成の形態を保った状態で浮遊した。
製造例4で調製した光硬化性組成物1[(A)/(B)=60/40]をPETフィルムにスピンコートして、100℃で1分間加熱した後に、製造例2で使用した格子形状の石英モールドのパターン面と光硬化性組成物1のコート面が接触するようにPETフィルムを被せ、0.3MPaの圧力で圧着しながら波長365nmのUV光を200mJ/cm2の積算光量で照射した。次いで、石英モールドからPETフィルムを剥離して、PETフィルムの表面に格子形状を形成した培養フィルム7を作製した。培養フィルム7の凸凸間の幅(L1)は100μmであり、BALB/3T3細胞の最大径(L2=25μm)との比(L1/L2)は4であった。また、水接触角(15秒経過時)は127.3°であった。
培養フィルム7による実施例1と同様な方法で実施したBALB/3T3細胞の培養では、4時間経過後のサンプルを顕微鏡観察し培養フィルム7の凹凸構造の任意の30ヵ所の凹部底面に沈降したBALB/3T3細胞の数をカウントして平均値を算出すると、ひとつあたりの凹部底面に1.3個の細胞が存在することが確認された。
WST−8法による細胞増殖性の評価で1日経過後の吸光度が0.27±0.01であり、3日経過後で0.85±0.02であり、7日経過後で2.14±0.09であった。経過日数に対して吸光度は直線的に増大しており、7日経過しても増殖性に変化は見られなかった。また、7日間培養した細胞を顕微鏡観察すると、細胞は厚み方向に対して細胞シートの群体を形成した状態で増殖しており、リン酸緩衝生理食塩水を添加すると細胞シートの群体形成の形態を保った状態で浮遊した。
細胞種をHs−68細胞に変更した以外は、BALB/3T3細胞と同様な方法により細胞の解凍、継代、懸濁液を調製し、10%仔ウシ血清D−MEM培地で7500cells/mLの細胞懸濁液を調製した。
培養フィルムの作製は、モールドを製造例4で使用した石英モールド(凸部の幅300μm、パターンピッチ350μm、パターン深さ50μm)に変更した以外は、製造例2と同様な方法で培養フィルム9を作製した。培養フィルム9の凸凸間の幅(L1)は300μmであり、Hs−68細胞の最大径(L2=20μm)との比(L1/L2)は15であった。また、水接触角(15秒経過時)は124.2°であった。
次いで、滅菌済みの培養フィルム9を用いて実施例1と同様な方法により、解凍済みのHs−68細胞液(1mL)を播種した。同操作を9回繰り返し、検体数で9個のサンプルを準備した。その後、蓋をしてインキュベーターに移動し庫内温度37℃、炭酸ガス濃度5%の滅菌空気下で培養を開始した。4時間経過後のサンプルを顕微鏡観察し培養フィルム9の凹凸構造の任意の30ヵ所の凹部底面に沈降したHs−68細胞の数をカウントして平均値を算出すると、ひとつあたりの凹部底面に9.7個の細胞が存在することを確認した。
WST−8法による細胞増殖性の評価では、1日経過後の吸光度が0.27±0.05であり、3日経過後で0.82±0.09であり、7日経過後で1.69±0.11であり、14日経過後で3.21±0.13であった。経過日数に対して吸光度は直線的に増大しており、14日経過しても増殖性に変化は見られなかった。また、14日間培養した細胞を顕微鏡観察すると、細胞はスフェロイドまたはコロニー状に群体を形成した状態(図2参照)で増殖しており、トリプシン含有リン酸緩衝生理食塩水を添加するとスフェロイドまたはコロニー状の形態を保った状態で浮遊した。
この培養細胞のNADPHデハイドロゲナアゼで薬物代謝系酵素活性評価を行うとほぼ100%が、生態系と同様の薬物代謝系酵素活性があることが分かった。さらに、自家蛍光を観察すると同様に100%の培養細胞が生細胞であることを確認した。
滅菌済みの培養フィルム1(L1/L2=5)を用いて実施例8と同様な方法により、解凍済みのHs−68細胞液(1mL)を播種した。同操作を9回繰り返し、検体数で9個のサンプルを準備した。その後、蓋をしてインキュベーターに移動し庫内温度37℃、炭酸ガス濃度5%の滅菌空気下で培養を開始した。4時間経過後のサンプルを顕微鏡観察し培養フィルム1の凹凸構造の任意の30ヵ所の凹部底面に沈降したHs−68細胞の数をカウントして平均値を算出すると、ひとつあたりの凹部底面に1.3個の細胞が存在することを確認した。
WST−8法による細胞増殖性の評価では、1日経過後の吸光度が0.28±0.04であり、3日経過後で1.83±0.05であり、7日経過後で1.79±0.10であった。経過日数に対して吸光度は直線的に増大しており、7日経過しても増殖性に変化は見られなかった。また、7日間培養した細胞を顕微鏡観察すると、細胞はシート状に、厚み方向に対して細胞シートの群体を形成した状態で増殖しており、トリプシン含有リン酸緩衝生理食塩水を添加するとシート状の形態を保った状態で浮遊した。
この培養細胞のNADPHデハイドロゲナアゼで薬物代謝系酵素活性評価を行うとほぼ100%が、生態系と同様の薬物代謝系酵素活性があることが分かった。さらに、自家蛍光を観察すると同様に99.8%の培養細胞が生細胞であることを確認した。
滅菌済みの培養フィルム9(L1/L2=15)を用いて、細胞数を1500cells/mLに変更した以外は実施例8と同様な方法で調整した解凍済みのHs−68細胞液(1mL)を播種した。同操作を9回繰り返し、検体数で9個のサンプルを準備した。その後、蓋をしてインキュベーターに移動し庫内温度37℃、炭酸ガス濃度5%の滅菌空気下で培養を開始した。4時間経過後のサンプルを顕微鏡観察し培養フィルム9の凹凸構造の任意の30ヵ所の凹部底面に沈降したHs−68細胞の数をカウントして平均値を算出すると、ひとつあたりの凹部底面に1.9個の細胞が存在することを確認した。
WST−8法による細胞増殖性の評価では、1日経過後の吸光度が0.06±0.01であり、3日経過後で0.17±0.09であり、7日経過後で0.36±0.12であった。経過日数に対して吸光度は直線的に増大しており、7日経過しても増殖性に変化は見られなかった。また、7日間培養した細胞を顕微鏡観察すると、細胞はスフェロイドまたはコロニーを形成した状態で増殖しており、トリプシン含有リン酸緩衝生理食塩水を添加するとスフェロイドまたはコロニー状の形態を保った状態で浮遊した。
この培養細胞のNADPHデハイドロゲナアゼで薬物代謝系酵素活性評価を行うとほぼ100%が、生態系と同様の薬物代謝系酵素活性があることが分かった。さらに、自家蛍光を観察すると同様に100%の培養細胞が生細胞であることを確認した。
滅菌済みの培養フィルム3(L1/L2=15)を用いて実施例8と同様な方法により、解凍済みのHs−68細胞液(1mL)を播種した。同操作を9回繰り返し、検体数で9個のサンプルを準備した。その後、蓋をしてインキュベーターに移動し庫内温度37℃、炭酸ガス濃度5%の滅菌空気下で培養を開始した。4時間経過後のサンプルを顕微鏡観察し培養フィルム3の凹凸構造の任意の30ヵ所の凹部底面に沈降したHs−68細胞の数をカウントして平均値を算出すると、ひとつあたりの凹部底面に9.6個の細胞が存在することを確認した。
WST−8法による細胞増殖性の評価では、1日経過後の吸光度が0.21±0.04であり、3日経過後で0.74±0.09であり、7日経過後で1.60±0.11であった。経過日数に対して吸光度は直線的に増大しており、7日経過しても増殖性に変化は見られなかった。また、7日間培養した細胞を顕微鏡観察すると、細胞はシート状に、厚み方向に対して細胞シートの群体を形成した状態で増殖しており、トリプシン含有リン酸緩衝生理食塩水を添加するとシート状の形態を保った状態で浮遊した。
この培養細胞のNADPHデハイドロゲナアゼで薬物代謝系酵素活性評価を行うとほぼ100%が、生態系と同様の薬物代謝系酵素活性があることが分かった。さらに、自家蛍光を観察すると同様に99.9%の培養細胞が生細胞であることを確認した。
実施例6で作製した滅菌済みの培養フィルム6(L1/L2=25)を用いて実施例8と同様な方法により、解凍済みのHs−68細胞液(1mL)を播種した。同操作を9回繰り返し、検体数で9個のサンプルを準備した。その後、蓋をしてインキュベーターに移動し庫内温度37℃、炭酸ガス濃度5%の滅菌空気下で培養を開始した。4時間経過後のサンプルを顕微鏡観察し培養フィルム6の凹凸構造の任意の30ヵ所の凹部底面に沈降したHs−68細胞の数をカウントして平均値を算出すると、ひとつあたりの凹部底面に26個の細胞が存在することを確認した。
WST−8法による細胞増殖性の評価では、1日経過後の吸光度が0.23±0.05であり、3日経過後で0.65±0.08であり、7日経過後で1.55±0.11であった。経過日数に対して吸光度は直線的に増大しており、7日経過しても増殖性に変化は見られなかった。また、7日間培養した細胞を顕微鏡観察すると、細胞はスフェロイドを形成した状態で増殖しており、トリプシン含有リン酸緩衝生理食塩水を添加するとスフェロイド状の形態を保った状態で浮遊した。
この培養細胞のNADPHデハイドロゲナアゼで薬物代謝系酵素活性評価を行うとほぼ100%が、生態系と同様の薬物代謝系酵素活性があることが分かった。さらに、自家蛍光を観察すると同様に100%の培養細胞が生細胞であることを確認した。
製造例2で使用したポリマー1のメチルイソブチルケトン溶液から溶液キャスト法にて、厚み120μmのポリマー1のフィルムを作製した。次いで、加熱板の上でポリマー1のフィルムと製造例4で使用した石英モールド(凸部の幅300μm、パターンピッチ350μm、パターン深さ50μm)のパターン面を接触させ、加熱板に置き150℃に加熱して、10MPaで熱圧着しそのまま5秒間保持した。70℃に冷却後、モールドを離脱して培養フィルム10を作製した。培養フィルム10の凸凸間の幅(L1)は300μmであり、Hs−68細胞の最大径(L2=20μm)との比(L1/L2)は15であった。また、水接触角(15秒経過時)は124.9°であった。
次いで、滅菌済みの培養フィルム10を用いて実施例1と同様な方法により、解凍済みのHs−68細胞液(1mL)を播種した。同操作を9回繰り返し、検体数で9個のサンプルを準備した。その後、蓋をしてインキュベーターに移動し庫内温度37℃、炭酸ガス濃度5%の滅菌空気下で培養を開始した。4時間経過後のサンプルを顕微鏡観察し培養フィルム10の凹凸構造の任意の30ヵ所の凹部底面に沈降したHs−68細胞の数をカウントして平均値を算出すると、ひとつあたりの凹部底面に9.8個の細胞が存在することを確認した。
WST−8法による細胞増殖性の評価では、1日経過後の吸光度が0.26±0.04であり、3日経過後で0.87±0.03であり、7日経過後で1.70±0.10であった。経過日数に対して吸光度は直線的に増大しており、7日経過しても増殖性に変化は見られなかった。また、7日間培養した細胞を顕微鏡観察すると、細胞はスフェロイドまたはコロニーを形成した状態で増殖しており、トリプシン含有リン酸緩衝生理食塩水を添加するとスフェロイドまたはコロニー状の形態を保った状態で浮遊した。
この培養細胞のNADPHデハイドロゲナアゼで薬物代謝系酵素活性評価を行うとほぼ100%が、生態系と同様の薬物代謝系酵素活性があることが分かった。さらに、自家蛍光を観察すると同様に100%の培養細胞が生細胞であることを確認した。
6穴TCPSマルチウェルプレート(コーニング製)の凹部底面を切り抜き、製造例2で作製した凸凸間の幅(L1)が100μmでありヒト胚繊維芽細胞の最大径(L2=20μm)との比(L1/L2)が5であるフィルム1を6穴全ての凹部底面に容器の裏面から貼り付け細胞培養容器を作製し、エタノールにより滅菌処理した。
次いで、細胞液の量を10mLに変更したこと以外は、実施例8と同様な方法により、解凍済みのHs−68細胞液を播種した。同操作を9回繰り返し、検体数で9個のサンプルを準備した。その後、蓋をしてインキュベーターに移動し庫内温度37℃、炭酸ガス濃度5%の滅菌空気下で培養を開始した。4時間経過後のサンプルを顕微鏡観察し培養フィルム1の凹凸構造の任意の30ヵ所の凹部底面に沈降したHs−68細胞の数をカウントして平均値を算出すると、ひとつあたりの凹部底面に1.3個の細胞が存在することを確認した。
WST−8法による細胞増殖性の評価では、1日経過後の吸光度が0.29±0.01であり、3日経過後で0.83±0.01であり、7日経過後で1.79±0.05であった。経過日数に対して吸光度は直線的に増大しており、7日経過しても増殖性に変化は見られなかった。また、7日間培養した細胞を顕微鏡観察すると、細胞はシート状に、厚み方向に対して群体を形成した状態で増殖しており、トリプシン含有リン酸緩衝生理食塩水を添加するとシート状の形態を保った状態で浮遊した。
この培養細胞のNADPHデハイドロゲナアゼで薬物代謝系酵素活性評価を行うとほぼ100%が、生態系と同様の薬物代謝系酵素活性があることが分かった。さらに、自家蛍光を観察しても、殆ど蛍光が観察されないことから、同様に100%の培養細胞が生細胞であることを確認した。
製造例2で使用したポリマー1のメチルイソブチルケトン溶液を、直径150nm、ピッチ250nmのピラー形状を有するニッケルモールドに塗布し、アプリケーターを用いて均一にコートした後、140℃で60分乾燥して剥離することで、厚み50μmのホール形状の培養フィルム11を作製した。培養フィルム11の水接触角(15秒経過時)は124.3°であった。
次いで、滅菌済み培養フィルム11を用いて、実施例1と同様な方法で24穴TCPSマルチウェルプレートに固定し、解凍済みのBALB/3T3細胞液(1mL)を培養フィルム11のパターン面に播種した。同操作を9回繰り返し、検体数で9個のサンプルを準備した。その後、蓋をしてインキュベーターに移動し庫内温度37℃、炭酸ガス濃度5%の滅菌空気下で培養を開始した。
WST−8法による細胞増殖性の評価では、1日経過後の吸光度が0.10±0.02であり、3日経過後で0.34±0.03であり、7日経過後で0.70±0.09であった。経過日数に対して吸光度は直線的に増大しており、7日経過しても増殖性に変化は見られなかった。また、7日間培養した細胞を顕微鏡観察すると、細胞は厚み方向に対して細胞シートの群体を形成した状態で増殖しており、リン酸緩衝生理食塩水を添加すると細胞シートの群体形成の形態を保った状態で浮遊した。
さらに、7日間培養したBALB/3T3細胞の培養液を除去して、脱水処理、乾燥してSEM観察用の試料を調整し、細胞と培養フィルム11の界面の状態を観察すると、培養フィルム11のパターン面の最大径150nmのホール(凹部)に絡みつくように細胞から伸びた糸状の足場形成は見られなかった。
γ線滅菌済み24穴TCPSマルチウェルプレート(コーニング製、水接触角は15秒後で46.1°)の穴部底面に解凍済みのBALB/3T3細胞液(1mL)を播種した。同操作を9回繰り返し、検体数9個のサンプルを準備した。その後、蓋をしてインキュベーターに移動し庫内温度37℃、炭酸ガス濃度5%の滅菌空気下で培養を開始した。4時間経過後のサンプルを顕微鏡観察しマルチウェルプレートの底部を観察すると、まばらに点在したBALB/3T3細胞が観察され、中には凝集塊の状態で沈降したものもあり全体的に培養面に対して不均一な状態で沈降していた。
WST−8法による細胞増殖性の評価では、1日経過後の吸光度が0.27±0.03であり、3日経過後で1.08±0.11であり、7日経過後で1.51±0.23であった。経過日数に対して吸光度の増加割合は徐々に減衰する傾向を示し、経過日数に応じて細胞増殖の程度は小さくなった。また、7日間培養した細胞を顕微鏡観察すると、細胞はシート状に、厚み方向に対して厚みムラのある平面状態で増殖しており、リン酸緩衝生理食塩水を添加しても形態に変化なく浮遊しなかった。
エタノール滅菌済みアペルTMフィルム(三井化学社製)を使用して、実施例1と同様な方法でBALB/3T3細胞の培養を開始した。4時間経過後のサンプルを顕微鏡観察すると、まばらに点在したBALB/3T3細胞が観察され、中には凝集塊の状態で沈降したものもあり全体的に培養面に対して不均一な状態で沈降していた。
WST−8法による細胞増殖性の評価では、1日経過後の吸光度が0.11±0.01であり、3日経過後で1.22±0.10であり、7日経過後で1.71±0.19であった。経過日数に対して吸光度の増加割合は徐々に減衰する傾向を示し、経過日数に応じて細胞増殖の程度は小さくなった。また、7日間培養した細胞を顕微鏡観察すると、細胞はシート状に、厚み方向に対して厚みムラのある平面状態で増殖しており、リン酸緩衝生理食塩水を添加しても形態に変化なく浮遊しなかった。
製造例1に記載のモノマーを5−メチル−ビシクロ[2.2.1]ヘプト−2−エンに、溶剤をシクロヘキサンに変更した以外は製造例1と同様な方法により49gのポリマー4を得た。また、水素添加率は100%、重量平均分子量(Mw)は129000、分子量分布(Mw/Mn)は2.26、ガラス転移温度は67℃であった。
次に、ポリマー4を30質量%で溶解したシクロヘキサノン溶液をガラス基板に塗工して、150℃で3時間乾燥し厚み75μmのフィルムを作製した。その後、製造例2で使用した格子形状の石英モールドを用いて加熱溶融圧着ナノインプリント法により、厚み73μmの格子形状の培養フィルム8を作製した。培養フィルム8の凸凸間の幅(L1)は100μmであり、BALB/3T3細胞の最大径(L2=25μm)との比(L1/L2)は4であった。また、水接触角(15秒経過時)は101.2°であった。
培養フィルム8による実施例1と同様な方法で実施したBALB/3T3細胞の培養では、4時間経過後のサンプルを顕微鏡観察し培養フィルム4の凹凸構造の任意の30ヵ所の凹部底面に沈降したBALB/3T3細胞の数をカウントして平均値を算出すると、ひとつあたりの凹部底面に1.4個の細胞が存在することが確認された。
WST−8法による細胞増殖性の評価で1日経過後の吸光度が0.07±0.01であり、3日経過後で0.15±0.02であり、7日経過後で0.18±0.11であった。経過日数に応じて細胞増殖の程度は小さくなった。また、7日間培養した細胞を顕微鏡観察すると、細胞はシート状に、厚み方向に対して厚みムラのある平面状態で増殖しており、リン酸緩衝生理食塩水を添加しても形態に変化なく浮遊しなかった。
細胞懸濁液をHs−68細胞液(10mL)に変更したこと以外は、比較例1と同様にインキュベーターの庫内温度37℃、炭酸ガス濃度5%の滅菌空気下で培養を開始した。
WST−8法による細胞増殖性の評価では、1日経過後の吸光度が0.33±0.06であり、3日経過後で1.49±0.11であり、7日経過後で3.10±0.13であった。経過日数に対して吸光度は徐々に減衰する傾向を示し、経過日数に応じて細胞増殖の程度は小さくなった。また、7日間培養した細胞を顕微鏡観察すると、シート状に細胞は増殖しており、トリプシン含有リン酸緩衝生理食塩水を添加しても形態に変化なく浮遊しなかった(図3参照)。
さらに、7日間培養した細胞を蛍光発光試薬で染色して細胞核、および細胞骨格タンパクの形態を蛍光顕微鏡観察すると、青色蛍光発光した細胞核、および緑色蛍光発光した細胞骨格タンパクは、二次元的に広がったシート形状の蛍光発光分布で観察され細胞が厚み方向に重なった細胞シートの群体形成は確認できなかった。
この培養細胞のNADPHデハイドロゲナアゼで薬物代謝系酵素活性評価を行うとほぼ0%が、生態系と同様の薬物代謝系酵素活性があることが分かった。さらに、自家蛍光観察は、γ線滅菌済み24穴TCPSマルチウェルプレートの蛍光吸収で測定することができなかった。
パターンピッチ4μmの六方最密充填配列を付形した滅菌済み24穴ナノカルチャープレート(SCIVAX社製、水接触角(15秒経過時)は125°、L1/L2=0.16)の穴部底面のパターン面に解凍済みのBALB/3T3細胞液(1mL)を播種した。同操作を9回繰り返し、検体数9個のサンプルを準備した。その後、蓋をしてインキュベーターに移動し庫内温度37℃、炭酸ガス濃度5%の滅菌空気下で培養を開始した。
4時間経過後のサンプルを顕微鏡観察し凹凸構造の任意の30ヵ所の凹部底面を観察するとひとつの凹部にも沈降したBALB/3T3細胞は入っていなかった。
WST−8法による細胞増殖性の評価では、1日経過後の吸光度が0.07±0.03であり、3日経過後で0.09±0.02であり、7日経過後で0.10±0.09であった。経過日数に対して吸光度の増加割合は徐々に減衰する傾向を示し、経過日数に応じて細胞増殖の程度は小さくなった。また、7日間培養した細胞を顕微鏡観察すると、細胞は厚み方向に対してスフェロイドの群体を形成して増殖しサイズ、形状は不揃いで、リン酸緩衝生理食塩水を添加しても形態に変化なく浮遊しなかった。
さらに、7日間培養したBALB/3T3細胞の培養液を除去して、脱水処理、乾燥してSEM観察用の試料を調整し、細胞とナノカルチャープレート界面の状態を観察すると、ナノカルチャープレートのパターン面の凹部に絡みつくように細胞の足場が形成されている様子が観察された。
口径500μmのホール形状を付形した滅菌済み6穴スフェロイド形成培養用容器(IWAKI社製、L1/L2=25)の穴部底面のパターン面に実施例8と同様にHs−68細胞の細胞懸濁液を播種した。同操作を9回繰り返し、検体数9個のサンプルを準備した。その後、蓋をしてインキュベーターに移動し庫内温度37℃、炭酸ガス濃度5%の滅菌空気下で培養を開始した。
4時間経過後のサンプルを顕微鏡観察し、凹凸構造の任意の30ヵ所の凹部底面に沈降したHs−68細胞の数をカウントして平均値を算出すると、ひとつあたりの凹部底面に25個の細胞が存在することを確認した。
WST−8法による細胞増殖性の評価では、1日経過後の吸光度が0.08±0.01であり、3日経過後で0.11±0.04であり、7日経過後で0.15±0.06であった。また、7日間培養した細胞を顕微鏡観察すると、細胞は厚み方向に対してスフェロイドの群体を形成して増殖したがサイズ、形状は不揃いで、リン酸緩衝生理食塩水を添加しても形態に変化なく浮遊しなかった。
<1>
基材を備える医療器具であって、
上記基材は細胞を接触させる一面を有するものであり、
上記基材の上記細胞と接触する上記一面が、下記一般式(1)で表される構造単位を含有するフッ素含有環状オレフィンポリマーにより構成された凹凸構造を備え、
当該凹凸構造から構成される凸凸間の幅(L1)と、ひとつあたりの上記細胞の直径(L2)の比(L1/L2)が1〜100であり、上記細胞が凹凸構造を備えた上記一面に接着しないことを特徴とする医療器具。
<2>
上記細胞を接触させる上記一面が備える凹凸構造の凸凸間の幅が10μm〜1000μmである<1>に記載の医療器具。
<3>
上記細胞を接触させる上記一面の水接触角が70°〜160°である<1>または<2>に記載の医療器具。
<4>
上記基材の備える上記一面は、上記フッ素含有環状オレフィンポリマーと、光硬化性化合物と、光硬化開始剤と、を含むフッ素含有環状オレフィンポリマー組成物により構成される<1>ないし<3>のいずれか一つに記載の医療器具。
<5>
上記フッ素含有環状オレフィンポリマー組成物中における上記フッ素含有環状オレフィンポリマーと上記光硬化性化合物の質量比(フッ素含有環状オレフィンポリマー/光硬化性化合物)が、99.9/0.1〜50/50である<4>に記載の医療器具。
<6>
上記一面に接触させた上記細胞を培養するために用いられる<1>ないし<5>のいずれか一つに記載の医療器具。
<7>
細胞培養において、上記細胞が群体を形成しながら浮遊増殖する<6>に記載の医療器具。
<8>
培養した上記細胞をリン酸緩衝生理食塩水により浮遊して上記一面から離脱させる<6>または<7>に記載の医療器具。
<9>
基材の凹凸構造を有する一面に細胞を接触させる医療器具の、上記一面を形成するために用いられるフッ素含有環状オレフィンポリマーであって、下記一般式(1)で表される構造単位を含有するフッ素含有環状オレフィンポリマー。
<10>
基材の凹凸構造を有する一面に細胞を接触させる医療器具の、上記一面を形成するために用いられるフッ素含有環状オレフィンポリマー組成物であって、
下記一般式(1)で表される構造単位を含有するフッ素含有環状オレフィンポリマーと、
光硬化性化合物と、
光硬化開始剤と、
を含むフッ素含有環状オレフィンポリマー組成物。
<11>
<1>ないし<8>のいずれか一つに記載の医療器具の上記一面上に、上記一面に接触させるように上記細胞を播種する工程と、
上記細胞を培養して培養細胞を得る工程と、
上記一面上にリン酸緩衝生理食塩水を添加して、上記一面から上記培養細胞を浮遊させる工程と、
を備える細胞培養方法。
Claims (12)
- 一般式(1)で表される構造単位を含有するフッ素含有環状オレフィンポリマーを使用した基材を備える医療器具であって、
前記基材は、該基材と細胞とを接触させる一面を有するものであり、かつ、該基材は、前記一面に凹凸構造を備え、
前記凹凸構造から構成される凸凸間の幅(L1)と、前記細胞中のひとつあたりの播種細胞の最大径(L2)の比(L1/L2)が1〜300であり、前記細胞が前記凹凸構造を備えた前記一面に接着または付着せず、細胞増殖を促進することを特徴とする医療器具。
- 前記L1/L2が1〜100である請求項1に記載の医療器具。
- 前記凹凸構造の凸凸間の幅が10μm〜1000μmである請求項1または2に記載の医療器具。
- 前記一面の水接触角が70°〜160°である請求項1ないし3のいずれか一項に記載の医療器具。
- 前記一面は、前記フッ素含有環状オレフィンポリマーと、光硬化性化合物と、光硬化開始剤と、を含むフッ素含有環状オレフィンポリマー組成物により構成される請求項1ないし4のいずれか一項に記載の医療器具。
- 前記フッ素含有環状オレフィンポリマー組成物中における前記フッ素含有環状オレフィンポリマーと前記光硬化性化合物の質量比(フッ素含有環状オレフィンポリマー/光硬化性化合物)が、99.9/0.1〜50/50である請求項5に記載の医療器具。
- 前記一面に接触させて細胞を培養するために用いられる請求項1ないし6のいずれか一項に記載の医療器具。
- 前記細胞からの培養細胞が細胞シート、スフェロイドまたはコロニーから選択される成長細胞の群体を形成しながら浮遊増殖する請求項7に記載の医療器具。
- 成長細胞の群体を緩衝液により遊離して前記一面から離脱させる請求項7または8に記載の医療器具。
- 基材の凹凸構造を有する一面に細胞を接触させる医療器具の前記一面を形成するために用いられるフッ素含有環状オレフィンポリマーであって、下記一般式(1)で表される構造単位を含有するフッ素含有環状オレフィンポリマー。
- 基材の凹凸構造を有する一面に細胞を接触させる医療器具の前記一面を形成するために用いられるフッ素含有環状オレフィンポリマー組成物であって、
下記一般式(1)で表される構造単位を含有するフッ素含有環状オレフィンポリマーと、
光硬化性化合物と、
光硬化開始剤と、
を含むフッ素含有環状オレフィンポリマー組成物。
- 請求項1ないし9のいずれか一項に記載の医療器具の一面上に接触させるように細胞を播種する工程と、
前記細胞を培養して培養細胞を得る工程と、
該一面上に緩衝液を添加して、該一面から培養細胞を浮遊させる工程と、
を備える細胞培養方法。
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