CN117264515A - 一种蛋白黏附涂层及其制备方法、应用 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及聚合物材料技术领域，特别涉及一种蛋白黏附涂层及其制备方法。本申请提供的蛋白黏附涂层包括树脂Ⅰ和树脂Ⅱ，所述树脂Ⅰ由马来酸酐、聚乙二醇、吡咯与己二醇二丙烯酸酯反应得到，所述树脂Ⅱ由氨基磺酸盐改性聚异氰酸酯与己二醇聚合反应得到；所述树脂Ⅰ和树脂Ⅱ的质量比为6‑9:7‑8。本申请利用树脂I与树脂II固化后形成蛋白黏附涂层，由于这两种树脂含有疏水链段，能与PS培养皿等基材产生疏水相互作用及π‑π堆积增强附着力，使基材能在水中不脱落；同时，这两种树脂含有大量的酰胺键及两性离子，能与蛋白产生氢键及静电吸附作用，促进细胞贴壁。

Description

一种蛋白黏附涂层及其制备方法、应用
技术领域
本申请涉及聚合物材料技术领域，特别涉及一种蛋白黏附涂层及其制备方法、应用。
背景技术
现代生物医学快速发展，干细胞培养成为很多研究及应用领域中十分重要的基础性工作。贴壁细胞(Adherent Cell)指在动物细胞培养过程中，必须有可以贴附的支持物表面，依靠自身分泌或培养基中的粘附因子才能在该表面生长增殖的细胞。当细胞在该支持物表面生长后，一般形成两种形态，即成纤维样细胞或上皮样细胞。贴壁细胞分为：上皮细胞型、成纤维细胞型、游走细胞型和多型细胞型，在显微镜下观察时，贴壁细胞在瓶底伸展并延伸成梭型或不规则的三角形或扇形或其他形态，而且晃动培养液时，细胞不动。
贴附并伸展是多数体外培养细胞的基本生长特点，对于动物细胞的形态形成与稳定具有重要性的作用。当细胞不能很好地贴壁时，细胞的生长状态通常不好，影响后续的应用。细胞贴壁的主要原因是分泌细胞外基质和粘附因子，从而可以改善培养皿或培养瓶的结构，然后细胞很自然就贴附在培养皿或培养瓶上。细胞粘附分子是众多介导细胞间或细胞与细胞外间相互接触和结合分子的统称。细胞外基质是由动物细胞合并分泌到胞外、分布在细胞表面或细胞之间的大分子。二者大多数均为糖蛋白，因此具有较强的亲水性。因此能不能贴壁不仅仅关乎细胞是否有这种能力，也与有无合适的底物(培养皿或培养瓶)有关。一直以来，普遍采用聚苯乙烯(PS)材质的培养皿或培养瓶作为细胞培养的工具。聚苯乙烯透光性能好，具有较好的强度和易塑性，并且没有毒性，成为一次性细胞培养皿和细胞培养板等一次性细胞培养耗材的首选材料。然而聚苯乙烯表面是疏水的，所以需要经过表面的改性处理，变成亲水后才能适用于细胞培养。
TC处理(Tissue culture treated)是聚苯乙烯培养皿的最常见表面亲水改性处理方法，通常采用的是等离子体表面处理技术。等离子体对聚苯乙烯进行改性处理形成的亲水表面达到的亲水性接触角为60°。专利US11608447B2公开了一种细胞图案化用材料，具体公开了利用具有聚乙二醇链段的组分A和具有三烷氧基甲硅烷基的组分B作为可光改性聚合物，该聚合物对基板处理后，在紫外光(360-370nm)照射区域基板的接触角为42.9°-50.5°，未照射区域基板的接触角为40.7°-46.8°。
而对于生长条件苛刻的细胞贴壁生长需要亲水性接触角保持在30°以下，因此，提供一种能够使基材的亲水性接触角保持在合理范围的涂层十分重要。
发明内容
本申请实施例提供一种蛋白黏附涂层，以解决相关技术中基材经等离子体表面处理或经光改性聚合物处理后亲水性接触角较大的问题。
第一方面，本申请提供了一种蛋白黏附涂层，包括树脂Ⅰ和树脂Ⅱ，所述树脂Ⅰ由马来酸酐、聚乙二醇、吡咯与己二醇二丙烯酸酯反应得到，所述树脂Ⅱ由氨基磺酸盐改性聚异氰酸酯与己二醇聚合反应得到；所述树脂Ⅰ和树脂Ⅱ的质量比为6-9:7-8。
一些实施例中，所述树脂Ⅰ的结构式为：
式中，n的取值为9-45。
一些实施例中，所述树脂Ⅱ的结构式为：
式中，X为C1-C16的烷基。
一些实施例中，先利用马来酸酐与聚乙二醇反应得到聚乙二醇丙烯酸，之后利用聚乙二醇丙烯酸与吡咯反应得到聚乙二醇-吡咯桥环-丙烯酸，再使聚乙二醇-吡咯桥环-丙烯酸与己二醇二丙烯酸酯反应，即得到树脂Ⅰ。
一些实施例中，马来酸酐与聚乙二醇的摩尔比为1：1-1.3；聚乙二醇丙烯酸与吡咯的摩尔比为1：1-1.3；聚乙二醇-吡咯桥环-丙烯酸与己二醇二丙烯酸酯的摩尔比为1：1.5-2。
一些实施例中，氨基磺酸盐改性聚异氰酸酯与己二醇的摩尔比为1：1.3-1.7。
一些实施例中，所述蛋白黏附涂层还包括光引发剂，所述光引发剂选用2-羟基-2-甲基-1-苯基丙酮(1173)、1-羟基环己基苯基甲酮(184)、2,4,6-三甲基苯甲酰基-二苯基氧化膦(TPO)中的一种或多种。光引发剂能在紫外光区(250-420nm)吸收一定波长的能量，产生自由基、阳离子等，从而引发单体聚合交联固化。
一些实施例中，所述蛋白黏附涂层还包括表面活性剂，所述表面活性剂选用壬基酚聚氧乙烯醚(NPE)、辛基酚聚氧乙烯醚(OPE)、聚乙烯醇(PVA)中的一种或多种。表面活性剂能够降低涂层的表面张力，加强细胞在涂层表面的贴壁能力。
一些实施例中，所述蛋白黏附涂层还包括流平剂，所述流平剂选用分子量8000-15000的丙烯酸酯类流平剂。流平剂能有效降低涂料表面张力，提高其流平性和均匀性，能促使涂料在干燥成膜过程中形成一个平整、光滑、均匀的涂膜。
一些实施例中，所述蛋白黏附涂层还包括可光固化稀释剂，所述可光固化稀释剂包括丙烯酸、衣康酸、丙烯酸羟乙酯中的一种或多种。
一些实施例中，所述蛋白黏附涂层还包括溶剂A，所述溶剂A选用乙酸乙酯、乙酸丁酯、异丙醇、乙醇中的一种或多种。
第二方面，本申请提供了一种蛋白黏附涂层的制备方法，包括以下步骤：
按质量份计，将3-5份表面活性剂、30-45份树脂I、35-40份树脂II、10-25份可光固化稀释剂混合，加入溶剂A混合搅拌0.5-1h，再加入3-5份光引发剂和1-2份流平剂，混合搅拌，得到蛋白黏附涂液，将蛋白黏附涂液涂覆在基材上，经过光固化处理，即得到蛋白黏附涂层。
一些实施例中，所述树脂I通过以下过程制备：
(1)将马来酸酐和聚乙二醇加入溶剂B中，加热反应，得到聚乙二醇丙烯酸；
(2)将聚乙二醇丙烯酸和吡咯加入溶剂B中，加热反应，得到聚乙二醇-吡咯桥环-丙烯酸；
(3)将聚乙二醇-吡咯桥环-丙烯酸与己二醇二丙烯酸酯加入溶剂B中，加热反应，反应结束后，水洗、过滤，得到光固化树脂。
一些实施例中，所述溶剂B选用乙酸乙酯、丙二醇甲醚、乙酸丁酯中的一种或多种的混合。
一些实施例中，马来酸酐、聚乙二醇、溶剂B的摩尔比为1：1-1.3：15-25。
一些实施例中，聚乙二醇-吡咯桥环-丙烯酸、己二醇二丙烯酸酯、溶剂B的摩尔比为1：1.5-2：30-40。
一些实施例中，步骤(1)中，加热反应的温度为40-70℃，反应时间为6-10h；步骤(2)中，加热反应的温度为60-90℃，反应时间为8-12h；步骤(3)中，加热反应的温度为60-80℃，反应时间为6-10h。
一些实施例中，所述树脂Ⅱ通过以下过程制备：将氨基磺酸盐改性聚异氰酸酯和己二醇加入溶剂C中，加热反应，反应完成后除去溶剂，经水洗、过滤后即可得树脂II。
一些实施例中，树脂II的分子量为2000～3000。
一些实施例中，树脂Ⅱ制备过程中的加热温度为80-120℃，加热时间为8-16h。
一些实施例中，氨基磺酸盐改性聚异氰酸酯、己二醇、溶剂C的摩尔比为1：1.3-1.7：30-40。
一些实施例中，溶剂C选用乙酸乙酯、丙二醇甲醚、乙酸丁酯中的任一种或多种。
一些实施例中，溶剂A的加入量为表面活性剂、树脂I、树脂II、可光固化稀释剂、光引发剂和流平剂总质量的0.3-3倍。
一些实施例中，光固化处理的过程为：先在60-80℃预烘2-3min，之后紫外LED灯光固化30-60s，紫外LED灯的能量为500-1000mJ/cm2。
一些实施例中，涂覆的方式为喷涂、淋涂、滴涂、刮涂或滚涂中的任一种。
一些实施例中，蛋白黏附涂层的厚度为5-40μm。
第三方面，本申请还提供了上述蛋白黏附涂层的应用，所述蛋白黏附涂层能够用来进行细胞贴壁培养，具体为将细胞种植在含有蛋白黏附涂层的PS培养皿/培养瓶/培养板上进行培养，细胞可以为小鼠胚胎成纤维细胞、小鼠脂肪成体干细胞等难养细胞。
本申请提供的树脂I分子结构中包含碳链、桥环等疏水结构以及乙二醇链段等亲水结构。树脂I整体呈现出亲水性。由于树脂I具有疏水结构，因此能在疏水的PS培养皿上很好地附着。此外树脂I侧链含有大量羧基，有助于黏附蛋白。树脂I是一种光固化树脂，可在UV光照射下迅速交联固化。
本申请提供的树脂Ⅱ以碳链为骨架，含有异氰脲酸酯等基团，因此能与PS培养皿产生疏水相互作用及π-π堆积。同时，树脂II含有大量的酰胺键及两性离子，能与蛋白产生氢键及静电吸附作用。
本申请提供的树脂I与树脂II同为线性结构，树脂I在光固化交联的同时与树脂II通过氢键、疏水等相互作用进行拓扑缠绕，形成异质网络结构，从而提升了树脂的机械性能。
本申请提供的技术方案带来的有益效果包括：
1、本申请利用树脂I与树脂II固化后形成蛋白黏附涂层，由于这两种树脂含有疏水链段，能与PS培养皿等基材产生疏水相互作用及π-π堆积增强附着力，使基材能在水中不脱落；同时，这两种树脂含有大量的酰胺键及两性离子，能与蛋白产生氢键及静电吸附作用，促进细胞贴壁；
2、本申请提供的蛋白黏附涂层的水接触角在14-30°之间，有利于细胞贴壁；利用含有本申请提供的蛋白黏附涂层的PS培养皿培养细胞时，细胞贴壁率可达89％～92％且细胞生长状态良好，而用普通TC处理培养皿贴壁率仅为40％～45％，未经处理的培养皿贴壁率仅为15％～20％；
3、本申请提供的蛋白黏附涂层表现出优异的耐水性能和耐老化性能，将涂覆有蛋白黏附涂层的培养皿放置在培养基中浸泡72h-120h后，涂层无明显脱落、剥离、起皱现象；将涂覆有蛋白黏附涂层的培养皿放置于露天环境1-2年，老化前后涂层无明显脱落、剥离、起皱现象；
4、本申请提供的蛋白黏附涂层的附着力为0级，涂层细胞毒性低，细胞在含有蛋白黏附涂层的培养皿上培养48h后细胞存活率均在96％以上；
5、本申请提供的蛋白黏附涂层用简单的UV照射即可快速固化，操作简便，成本较低，适合大规模工业生产。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本申请实施例1制备树脂I的化学反应过程示意图；
图2为本申请实施例1制备树脂II的化学反应过程示意图；
图3为实施例1制得的蛋白黏附涂层的水接触角图；
图4为牛乳清糖蛋白黏附率结果示意图；
图5为人肾上皮细胞(293T)的活死染色图；
图6为成纤维细胞和成体干细胞贴壁率结果示意图。
具体实施方式
为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
本申请提供一种蛋白黏附涂层，按质量份计，包括以下原料：3-5份表面活性剂、30-45份树脂I、35-40份树脂II、10-25份可光固化稀释剂、3-5份光引发剂、1-2份流平剂。
申请人经过大量试验发现，光引发剂的质量份若高于5份，紫外光照下会产生大量自由基，导致所得涂料固化后形成的最终聚合物网络分子量低，导致涂膜较脆，附着力会变差，同时还会提高涂料成本；若光引发剂低于1份，紫外光照下会产生自由基不充分，导致残留没有光聚合的树脂和单体含量较多，引起最终涂膜表干不好，发粘，根本不能使用。
本申请提供的蛋白黏附涂层的原料还包括溶剂A，溶剂A选用乙酸乙酯、乙酸丁酯、异丙醇、乙醇中的一种或多种，溶剂A的加入量为其他组分总质量的0.3-3倍。溶剂A的加入量高于其他组分总重量3倍时，涂料太稀，涂膜厚度太低，导致最终涂膜的硬度太低，耐磨变差。若溶剂A的加入量低于其他组分总重量0.3倍时，涂料粘度太大，容易导致涂膜流平不好，涂膜厚度太厚，也会带来固化不完全的问题。
以下实施例中使用的氨基磺酸盐改性聚异氰酸酯的型号为科思创BayhydurXP2655。
实施例1：
制备树脂Ⅰ：将1mol马来酸酐与1mol聚乙二醇600加入三口烧瓶中，之后加入15mol乙酸乙酯，搅拌溶解，在40℃下反应6h后除去溶剂，得到聚乙二醇丙烯酸；向1mol聚乙二醇丙烯酸中加入1mol吡咯和20mol乙酸乙酯，在60℃下反应8h，反应完成后除去溶剂，水洗、过滤，得到聚乙二醇-吡咯桥环-丙烯酸；向1mol聚乙二醇-吡咯桥环-丙烯酸中加入1.5mol己二醇二丙烯酸酯和30mol乙酸乙酯，在60℃反应9h，反应完成后除去溶剂，经水洗、过滤，即得到树脂Ⅰ。
实施例1制备树脂Ⅰ的化学反应过程见图1。
制备树脂Ⅱ：将1mol氨基磺酸盐改性聚异氰酸酯与1.3mol己二醇加入圆底烧瓶中，之后加入30mol乙酸乙酯，搅拌溶解，80℃下反应8h后除去溶剂，经水洗、过滤后即可得树脂II。
实施例1制备树脂II的化学反应过程见图2。
制备蛋白黏附涂层：按照每1g为1质量份，称取5g NPE、30g树脂Ⅰ、40g树脂II、21g丙烯酸，加入乙酸丁酯、异丙醇、乙醇按照体积比4：3：3混合构成的溶液后混合搅拌0.5h，再加入3g光引发剂1173和1g丙烯酸酯，混合搅拌0.5h，得到蛋白黏附涂液；将蛋白黏附涂液喷涂在PS培养皿上，60℃预烘2min，紫外LED灯光固化40s，能量为600mJ/cm2，即得到厚度15μm的蛋白黏附涂层。
制备蛋白黏附涂层过程中，乙酸丁酯、异丙醇、乙醇的混合溶液的加入量为其他原料总质量的0.5倍。
实施例2：
制备树脂Ⅰ：将1mol马来酸酐与1.3mol聚乙二醇600加入三口烧瓶中，之后加入25mol乙酸乙酯，搅拌溶解，在70℃下反应10h后除去溶剂，得到聚乙二醇丙烯酸；向1mol聚乙二醇丙烯酸中加入1.3mol吡咯和40mol乙酸乙酯，在90℃下反应12h，反应完成后除去溶剂，经水洗、过滤，得到聚乙二醇-吡咯桥环-丙烯酸；向1mol聚乙二醇-吡咯桥环-丙烯酸中加入2mol己二醇二丙烯酸酯和40mol乙酸乙酯，在80℃反应10h，反应完成后除去溶剂，经水洗、过滤，即可得到树脂Ⅰ。
制备树脂Ⅱ：将1mol氨基磺酸盐改性聚异氰酸酯与1.5mol己二醇加入圆底烧瓶中，之后加入35mol乙酸乙酯，搅拌溶解，在100℃下反应12h后除去溶剂，经水洗、过滤后即可得树脂II。
制备蛋白黏附涂层：按照每1g为1质量份，称取4g NPE、45g树脂Ⅰ、35g树脂II、12g衣康酸，加入乙酸丁酯、异丙醇、乙醇按照体积比4：3：3混合构成的溶液后混合搅拌1h，再加入3g光引发剂184和1g丙烯酸酯，混合搅拌0.5h，得到蛋白黏附涂液；将蛋白黏附涂液浸涂在PS培养皿上，70℃预烘2min，紫外LED灯光固化30s，能量为500mJ/cm2，即得到厚度10μm的蛋白黏附涂层。
制备蛋白黏附涂层过程中，乙酸乙酯、异丙醇和乙醇的混合溶液的加入量为其他原料总量的1倍。
实施例3：
制备树脂Ⅰ：将1mol马来酸酐与1.2mol聚乙二醇600加入三口烧瓶中，之后加入20mol乙酸乙酯，搅拌溶解，在50℃下反应8h后除去溶剂，得到聚乙二醇丙烯酸；向1mol聚乙二醇丙烯酸中加入1.1mol吡咯和30mol乙酸乙酯，在70℃下反应10h，反应完成后除去溶剂，经水洗、过滤，得到聚乙二醇-吡咯桥环-丙烯酸；向1mol聚乙二醇-吡咯桥环-丙烯酸中加入1.7mol己二醇二丙烯酸酯和35mol乙酸乙酯，在70℃反应8h，反应完成后除去溶剂，经水洗、过滤，即可得到树脂Ⅰ。
制备树脂Ⅱ：将1mol氨基磺酸盐改性聚异氰酸酯与1.7mol己二醇加入圆底烧瓶中，之后加入40mol乙酸乙酯，搅拌溶解，在120℃下反应16h后除去溶剂，经水洗、过滤后即可得树脂II。
制备蛋白黏附涂层：按照每1g为1质量份，称取3g OPE、40g树脂Ⅰ、38g树脂II、13g丙烯酸羟乙酯，加入乙酸丁酯、异丙醇、乙醇按照体积比4：3：3混合构成的溶液后混合搅拌1h，再加入4g光引发剂TPO和2g丙烯酸酯，混合搅拌0.5h，得到蛋白黏附涂液；将蛋白黏附涂液淋涂在PS培养皿上，70℃预烘2min，紫外LED灯光固化35s，能量为800mJ/cm2，即得到厚度5μm的蛋白黏附涂层。
制备蛋白黏附涂层过程中，乙酸丁酯、异丙醇、乙醇的混合溶液的加入量为其他原料总质量的1.5倍。
实施例4：
制备树脂Ⅰ：将1mol马来酸酐与1.1mol聚乙二醇600加入三口烧瓶中，之后加入18mol丙二醇甲醚，搅拌溶解，在60℃下反应9h后除去溶剂，得到聚乙二醇丙烯酸；向1mol聚乙二醇丙烯酸中加入1.2mol吡咯和25mol丙二醇甲醚，在80℃下反应11h，反应完成后除去溶剂，经水洗、过滤，得到聚乙二醇-吡咯桥环-丙烯酸；向1mol聚乙二醇-吡咯桥环-丙烯酸中加入1.8mol己二醇二丙烯酸酯和38mol丙二醇甲醚，在70℃反应9h，反应完成后除去溶剂，经水洗、过滤，即可得到树脂Ⅰ。
制备树脂Ⅱ：将1mol氨基磺酸盐改性聚异氰酸酯与1.4mol己二醇加入圆底烧瓶中，之后加入35mol乙酸丁酯，搅拌溶解，在100℃下反应15h后除去溶剂，经水洗、过滤后即可得树脂II。
制备蛋白黏附涂层：按照每1g为1质量份，称取5g OPE、35g树脂Ⅰ、40g树脂II、14g丙烯酸，加入乙酸丁酯、异丙醇、乙醇按照体积比4：3：3混合构成的溶液后混合搅拌1h，再加入3g光引发剂1173和2g丙烯酸酯，混合搅拌0.5h，得到蛋白黏附涂液；将蛋白黏附涂液喷涂在PS培养皿上，70℃预烘3min，紫外LED灯光固化50s，能量为600mJ/cm2，即得到厚度21μm的蛋白黏附涂层。
制备蛋白黏附涂层过程中，乙酸乙酯、异丙醇和乙醇的混合溶液的加入量为其他原料总质量的1.5倍。
实施例5：
制备树脂Ⅰ：将1mol马来酸酐与1.1mol聚乙二醇600加入三口烧瓶中，之后加入22mol乙酸丁酯，搅拌溶解，在60℃下反应7h后除去溶剂，得到聚乙二醇丙烯酸；向1mol聚乙二醇丙烯酸中加入1.2mol吡咯和25mol乙酸丁酯，在80℃下反应11h，反应完成后除去溶剂，经水洗、过滤，得到聚乙二醇-吡咯桥环-丙烯酸；向1mol聚乙二醇-吡咯桥环-丙烯酸中加入1.9mol己二醇二丙烯酸酯和32mol乙酸丁酯，在70℃反应9h，反应完成后除去溶剂，经水洗、过滤，即可得到树脂Ⅰ。
制备树脂Ⅱ：将1mol氨基磺酸盐改性聚异氰酸酯与1.6mol己二醇加入圆底烧瓶中，之后加入32mol乙酸丁酯，搅拌溶解，在95℃下反应12h后除去溶剂，经水洗、过滤后即可得树脂II。
制备蛋白黏附涂层：按照每1g为1质量份，称取4g PVA、32g树脂Ⅰ、36g树脂II、22g衣康酸，加入乙酸丁酯、异丙醇、乙醇按照体积比4：3：3混合构成的溶液后混合搅拌1h，再加入5g光引发剂184和1g丙烯酸酯，混合搅拌0.5h，得到蛋白黏附涂液；将蛋白黏附涂液喷涂在PS培养皿上，75℃预烘2min，紫外LED灯光固化50s，能量为800mJ/cm2，即得到厚度30μm的蛋白黏附涂层。
制备蛋白黏附涂层过程中，乙酸丁酯、异丙醇和乙醇的混合溶液的加入量为其他原料总质量的2倍。
实施例6：
制备树脂I：将1mol马来酸酐与1.1mol聚乙二醇600加入三口烧瓶中，之后加入20mol乙酸丁酯，搅拌溶解，在55℃下反应8h后除去溶剂，得到聚乙二醇丙烯酸；向1mol聚乙二醇丙烯酸中加入1.2mol吡咯和22mol乙酸丁酯，在85℃下反应10h，反应完成后除去溶剂，经水洗、过滤，得到聚乙二醇-吡咯桥环-丙烯酸；向1mol聚乙二醇-吡咯桥环-丙烯酸中加入1.8mol己二醇二丙烯酸酯和33mol乙酸丁酯，在75℃反应8h，反应完成后除去溶剂，经水洗、过滤，即可得到树脂Ⅰ。
制备树脂Ⅱ：将1mol氨基磺酸盐改性聚异氰酸酯与1.5mol己二醇加入圆底烧瓶中，之后加入36mol丙二醇甲醚，搅拌溶解，在100℃下反应10h后除去溶剂，经水洗、过滤后即可得树脂II。
制备蛋白黏附涂层：按照每1g为1质量份，称取3g PVA、42g树脂Ⅰ、37g树脂II、12g丙烯酸羟乙酯，加入乙酸丁酯、异丙醇、乙醇按照体积比4：3：3混合构成的溶液后混合搅拌1h，再加入5g光引发剂TPO和1g丙烯酸酯，混合搅拌0.5h，得到蛋白黏附涂液；将蛋白黏附涂液喷涂在PS培养皿上，80℃预烘2min，紫外LED灯光固化40s，能量为600mJ/cm2，即得到厚度40μm的蛋白黏附涂层。
制备蛋白黏附涂层过程中，乙酸乙酯、异丙醇和乙醇的混合溶液的加入量为其他原料总质量的2.5倍。
性能测试：
对实施例1-实施例6获得的蛋白黏附涂层进行性能测试，具体测试结果和测试过程如下：
一、亲水性测试
利用水接触角测试仪对实施例1-实施例6获得的蛋白黏附涂层进行水接触角测试：水接触角均在14-30°之间，说明蛋白黏附涂层具有亲水性。图3为实施例1制得的蛋白黏附涂层的水接触角图，图3中的水接触角为14°。
二、耐水性测试
将六个分别涂覆实施例1-实施例6的蛋白黏附涂层的PS培养皿放置在培养基中浸泡72h-120h后，测试老化前后涂层无明显脱落、剥离、起皱现象。
三、附着力测试
对实施例1-实施例6获得的蛋白黏附涂层进行附着力测试，采用百格测试法测得涂层的附着力为0级。
四、老化测试
对实施例1-实施例6获得的蛋白黏附涂层进行环境老化测试，将样品放置于露天环境1-2年，老化前后涂层无明显脱落、剥离、起皱现象。
五、糖蛋白黏附测试
分别将含有实施例1制得的蛋白黏附涂层的培养皿和不含有涂层的PS培养皿加入荧光标记的牛乳清糖蛋白进行培养，之后除去培养基，用PBS溶液(pH)清洗两次后溶解细胞。用酶标仪测试其荧光强度。结果表明：含有涂层的培养皿的牛乳清糖蛋白黏附率为88％，不含涂层的培养皿的牛乳清糖蛋白黏附率为21％。说明蛋白黏附涂层提高了细胞黏附率。图4为牛乳清糖蛋白黏附率结果示意图。
六、细胞毒性评估
通过CCK8试剂盒检测细胞毒性与钙黄绿素/碘化丙啶(Calcein-AM/PI)染色法检测细胞毒性。所用细胞为人肾上皮细胞(293T)、小鼠腹腔巨噬细胞(RAW264.7)以及人非小细胞肺癌细胞(A549)。
实验结果表明，上述细胞在含有实施例1制得的蛋白黏附涂层的PS培养皿上培养48h后细胞存活率均在96％以上，说明涂层细胞毒性低。图5为人肾上皮细胞(293T)的活死染色图。
七、成纤维细胞贴壁率测试
将小鼠胚胎成纤维细胞(MEF细胞)悬液以1500rpm离心5分钟收集细胞，再用30ml生长培养基洗涤两次。细胞沉淀用15ml生长培养基重悬后分别加入含实施例1制得的蛋白黏附涂层、TC处理以及未处理的PS培养皿中，之后在37℃细胞培养箱中培养，24小时后更换新鲜的生长培养基。细胞长满后，先用D-PBS冲洗，倒掉后加胰酶消化，按1:5传代。将每一代细胞进行计数以及用荧光显微镜观察贴壁情况。含蛋白黏附涂层的PS培养皿细胞贴壁率为89％。而TC处理的PS培养皿细胞贴壁率为40％，未处理的PS培养皿细胞贴壁率15％。说明蛋白黏附涂层提高了成纤维细胞贴壁率。
八、成体干细胞贴壁率测试
将小鼠的脂肪成体干细胞(ADAS细胞)分别在含实施例1制得的蛋白黏附涂层、TC处理以及未处理的PS培养皿中培养，含蛋白黏附涂层的PS培养皿的细胞贴壁率为92％。而TC处理的PS培养皿细胞贴壁率为45％，未处理的PS培养皿细胞贴壁率20％。结果如图6所示。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例/方式”、“一些实施例/方式”、“示例”、“具体示例”或“一些示例”等的描述意指结合该实施例/方式或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本申请的至少一个实施例/方式或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例/方式或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例/方式或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例/方式或示例以及不同实施例/方式或示例的特征进行结合和组合。
需要说明的是，在本申请中，诸如“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。在本申请中，“多个”的含义是至少两个，例如两个、三个等，除非另有明确具体的规定。
以上所述仅是本申请的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本申请。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本申请的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本申请将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所申请的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.一种蛋白黏附涂层，其特征在于，包括树脂Ⅰ和树脂Ⅱ，所述树脂Ⅰ由马来酸酐、聚乙二醇、吡咯与己二醇二丙烯酸酯反应得到，所述树脂Ⅱ由氨基磺酸盐改性聚异氰酸酯与己二醇聚合反应得到；所述树脂Ⅰ和树脂Ⅱ的质量比为6-9:7-8。
2.根据权利要求1所述的蛋白黏附涂层，其特征在于，先利用马来酸酐与聚乙二醇反应得到聚乙二醇丙烯酸，之后利用聚乙二醇丙烯酸与吡咯反应得到聚乙二醇-吡咯桥环-丙烯酸，再使聚乙二醇-吡咯桥环-丙烯酸与己二醇二丙烯酸酯反应，即得到树脂Ⅰ。
3.根据权利要求2所述的蛋白黏附涂层，其特征在于，马来酸酐与聚乙二醇的摩尔比为1：1-1.3；聚乙二醇丙烯酸与吡咯的摩尔比为1：1-1.3；聚乙二醇-吡咯桥环-丙烯酸与己二醇二丙烯酸酯的摩尔比为1：1.5-2。
4.根据权利要求1所述的蛋白黏附涂层，其特征在于，氨基磺酸盐改性聚异氰酸酯与己二醇的摩尔比为1：1.3-1.7。
5.根据权利要求1所述的蛋白黏附涂层，其特征在于，所述蛋白黏附涂层还包括光引发剂，所述光引发剂选用2-羟基-2-甲基-1-苯基丙酮、1-羟基环己基苯基甲酮、2,4,6-三甲基苯甲酰基-二苯基氧化膦中的一种或多种。
6.根据权利要求1所述的蛋白黏附涂层，其特征在于，所述蛋白黏附涂层还包括表面活性剂，所述表面活性剂选用壬基酚聚氧乙烯醚、辛基酚聚氧乙烯醚、聚乙烯醇中的一种或多种。
7.根据权利要求1所述的蛋白黏附涂层，其特征在于，所述蛋白黏附涂层还包括流平剂，所述流平剂选用丙烯酸酯类流平剂；所述蛋白黏附涂层还包括可光固化稀释剂，所述可光固化稀释剂包括丙烯酸、衣康酸、丙烯酸羟乙酯中的一种或多种；所述蛋白黏附涂层还包括溶剂A，所述溶剂A选用乙酸乙酯、乙酸丁酯、异丙醇、乙醇中的一种或多种。
8.权利要求1-7任一项所述蛋白黏附涂层的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：按质量份计，将3-5份表面活性剂、30-45份树脂I、35-40份树脂II、10-25份可光固化稀释剂混合，加入溶剂A混合搅拌0.5-1h，再加入3-5份光引发剂和1-2份流平剂，混合搅拌，得到蛋白黏附涂液，将蛋白黏附涂液涂覆在基材上，经过光固化处理，即得到蛋白黏附涂层。
9.根据权利要求8所述的蛋白黏附涂层的制备方法，其特征在于，溶剂A的加入量为表面活性剂、树脂I、树脂II、可光固化稀释剂、光引发剂和流平剂总质量的0.3-3倍。
10.权利要求1-7任一项所述蛋白黏附涂层或利用权利要求8-9任一项所述制备方法制得的蛋白黏附涂层在细胞贴壁培养上的应用。
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