KR20170122231A - 의료 기구, 불소 함유 환상 올레핀 폴리머, 불소 함유 환상 올레핀 폴리머 조성물, 및 세포 배양 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명의 의료 기구는, 화학식(1)로 표시되는 구조 단위를 함유하는 불소 함유 환상 올레핀 폴리머를 사용한 기재를 구비하는 의료 기구로서, 상기 기재는, 해당 기재와 세포를 접촉시키는 일면을 갖는 것이고, 또한, 해당 기재는, 상기 일면에 요철 구조를 구비하고, 상기 요철 구조로 구성되는 볼록볼록간의 폭(L1)과, 상기 세포 중의 1개당의 파종 세포의 최대 직경(L2)의 비(L1/L2)가 1∼300이며, 상기 세포가 상기 요철 구조를 구비한 상기 일면에 접착 또는 부착하지 않고, 세포 증식을 촉진하는 것을 특징으로 하는 의료 기구이다.
Figure pct00013

(식(1) 중, R1∼R4 중 적어도 하나는, 불소, 불소를 함유하는 탄소수 1∼10의 알킬기, 불소를 함유하는 탄소수 1∼10의 알콕시기, 또는 불소를 함유하는 탄소수 2∼10의 알콕시알킬기이다. R1∼R4가 불소를 함유하지 않는 기인 경우, R1∼R4는, 수소, 탄소수 1∼10의 알킬기, 탄소수 1∼10의 알콕시기, 또는 탄소수 2∼10의 알콕시알킬기로부터 선택된다. R1∼R4는 서로 동일해도 상이해도 된다. 또한, R1∼R4는 서로 결합하여 환 구조를 형성하고 있어도 된다.)

Description

의료 기구, 불소 함유 환상 올레핀 폴리머, 불소 함유 환상 올레핀 폴리머 조성물, 및 세포 배양 방법
본 발명은, 의료 기구, 불소 함유 환상 올레핀 폴리머, 불소 함유 환상 올레핀 폴리머 조성물, 및 세포 배양 방법에 관한 것이다.
동식물의 세포는, 종래부터 많은 것이 배양되고 있고, 배양 기술도 다양한 형태의 것이 검토되고 있다. 세포 배양 기술은, 특히, 생명과학의 분야에 있어서, 의약품의 개발이나 병태 메커니즘의 해명 등에 빼놓을 수 없는 기술이 되고 있다. 또한, 연구 목적으로서의 세포 배양 기술뿐만 아니라, 생물학, 의학, 약학, 면역학 등의 분야에서의 이용을 목적으로 한 공업 생산적 배양 방법도 여러 가지 검토되고 있다. 더욱이, 근년에는 의료 등의 분야에 있어서, 조직 세포를 배양하고, 이것을 인공 장기(臟器), 인공 치골(齒骨), 인공 피부 등의 대체 조직으로서 이용하는 연구도 활발히 행해지고 있다.
이와 같은 세포 배양은, 통상, 일정한 용기 중에서 배양액과 함께 행해진다. 여기에서, 동물 세포의 대부분은, 물질에 부착하여 육성되는 접착 의존성을 갖고 있어, 이와 같은 접착 의존성을 갖는 세포의 배양에는, 세포가 부착하기 위한 기재(기구)가 필요해진다. 세포 배양용의 기재로서는, 폴리스타이렌을 원료로 하여 성형된 것이 일반적으로 이용된다. 또한, 기재의 표면에 저온 플라즈마 처리, 코로나 방전 처리 등을 실시하여, 친수성을 부여한 것이 샬레, 플라스크, 멀티 플레이트 등의 배양 기구로서 시판되고 있다.
그렇지만, 부착성 세포종에 관련하여, 배양 기구를 이용하여 세포 배양을 한 경우에는, 배양 용기의 배양면을 세포가 다 덮어 버려, 세포 증식이 정지해 버리는 접촉 저해를 일으킬 수 있다는 것이 알려져 있다. 또한, 파종되는 세포 농도가 지나치게 낮으면, 영양분이나 산소 등이 세포에 충분히 공급되고 있는 환경이어도 세포의 접착이나 증식에 영향이 생긴다고 하는 밀도 효과도 알려져 있다. 또한, 조직 배양에 응용되는 세포 증식이 군체를 형성한 상태의 세포 시트나 스페로이드, 콜로니를 제작할 때에, 파종을 반복하여 배양하는 조작(이하, 계대 조작이라고 약칭한다)이 이용되고 있다. 이 조작 과정에 있어서는, 세포가 배양 용기의 배양면에 부착하면서 평면적으로 증식하는 거동을 나타내는 것에 기인하여, 조작이 번잡해져, 세포를 손상 없이 재현 좋게 배양하는 것이 곤란해지는 경우가 있다.
이와 같은 문제를 해결하기 위해서, 겔이나 스펀지상으로 가교한 콜라겐을 배양 기재 상에 배치하여 섬유아세포나 각화세포 등을 파종, 배양함으로써 배양 점막·피부를 제조하는 방법이 개시되어 있지만(특허문헌 1 참조), 이용되는 콜라겐종의 대부분은, 소 또는 돼지의 결합 조직으로부터 가용화하여, 추출된 콜라겐이며, 근년 BSE(소해면상뇌증)나 구제역 등의 문제에 의해, 의료 응용 등을 고려하는 경우에 그 사용이 곤란해지고 있다.
계대 조작에 대해 종래의 기술에서는, 분열을 반복하는 부착성 세포를 배양하기 위해서 배양 용기로 세포를 적당한 시간 배양하여 목적하는 세포 농도까지 증식할 때에, 세포를 배양면으로부터 박리하여, 그 일부를 새로운 배양 용기로 바꿔 옮기는 조작을 계속적으로 행하는 방법이 일반적이었다(예를 들어, 특허문헌 2, 3 참조). 특허문헌 2에서는, 면적이 상이한 복수의 배양면을 갖는 배양 용기를 이용하여 최소 면적을 갖는 배양면으로부터 세포 배양을 개시하고, 증식이 진행됨에 따라 세포를 스크레이퍼로 박리하여 서서히 면적이 큰 배양면으로 세포를 이동하면서 배양을 폐쇄계에서 행하는 방법이 개시되어 있다. 또한, 특허문헌 3에는, 가스 투과성의 수지로 제작된 세포 백끼리를 접속하여, 백 내의 배양액을 혼합시킴으로써, 세포 농도를 조정하는 계대 조작이 개시되어 있다. 그렇지만, 어느 방법이어도, 이 계대 조작은, 액 교환 등의 매우 번잡한 작업을 수반하는 것이고, 또한, 기재에 부착된 세포를 벗겨 새로운 배양 용기로 바꿔 옮기는 조작을 행하기 때문에, 세포를 손상시켜, 증식된 형태를 붕괴시켜 버리는 등의 문제가 잠재하고 있다.
세포를 배양하는 기재 표면의 성상과 증식성에 대해서는, L 세포(위장 내분비 세포)를 배양한 예로, 세포의 증식 형태와 기재의 수접촉각의 관계를 평가한 결과가 개시되어 있다(비특허문헌 1 참조). 이 문헌에 있어서는, 여러 가지 기재를 이용하여, 물에 대한 접촉각과 세포의 접착의 상관에 대한 검토가 이루어지고 있다. 또한, 이 검토 중에서는, 물에 대해서 60∼80°의 접촉각을 갖는 기재가 L 세포의 접착성이 우수하다는 것이 나타나 있다.
또한, 최근에는 세포가 접촉하는 기재의 표면에, 요철 구조를 형성한 기재를 이용한 배양 기술이 제안되고 있다(예를 들어, 특허문헌 4, 5 참조). 이와 같은 요철 구조를 부형한 기재를 이용하는 배양은, 많은 경우, 스페로이드 배양이며 세포는 괴상의 형태로 증식하는 태양을 나타낸다. 그렇지만, 요철 구조를 부형하는 기재의 재료는, 사이클로올레핀 폴리머(특허문헌 4 참조), 폴리다이메틸실록세인(특허문헌 5 참조) 등의 종래부터 알려진 세포 접착성의 재료이며, 기재의 요철 구조에 의한 스페로이드 배양에 있어서, 세포가 기재와 접촉하는 면적이 작아지고 있어도 본질적으로 접착성의 태양은 변함 없고 세포는 토대를 형성한다. 이것에 의해, 배양한 세포를 기재로부터 이탈시킬 때에, 세포를 손상시켜, 증식된 형태를 붕괴시켜 버리는 등 잠재적인 문제가 있다. 여기에서, 요철 구조를 부형한 기재를 이용하는 세포 배양에서는, 세포가 토대를 형성하는데 있어서의 효과적인 요철 구조의 형상이나 사이즈에 대해 보고되어 있지만, 기재 표면의 수접촉각과 접착성 또는 증식성의 관계에 대한 기재는 없다.
일본 특허공개 2004-147585호 공보 일본 특허공개 2004-129558호 공보 일본 특허공개 평7-047105호 공보 국제공개 제2007/097121호 팸플릿 일본 특허공개 2010-88347호 공보
Y. Tamada, Y. Ikada, Journal of Colloid and Interface Science 155, 334-339(1993).
본 발명은, 기재의 일면에 접촉 또는 보지시킨 세포를, 손상시키지 않고 기재로부터 이탈시킬 수 있는 의료 기구를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은, 이하에 나타난다.
(1)
화학식(1)로 표시되는 구조 단위를 함유하는 불소 함유 환상 올레핀 폴리머를 사용한 기재를 구비하는 의료 기구로서,
상기 기재는, 해당 기재와 세포를 접촉시키는 일면을 갖는 것이고, 또한, 해당 기재는, 상기 일면에 요철 구조를 구비하고,
상기 요철 구조로 구성되는 볼록볼록간의 폭(L1)과, 상기 세포 중의 1개당의 파종 세포의 최대 직경(L2)의 비(L1/L2)가 1∼300이며, 상기 세포가 상기 요철 구조를 구비한 상기 일면에 접착 또는 부착하지 않고, 세포 증식을 촉진하는 것을 특징으로 하는 의료 기구.
Figure pct00001
(식(1) 중, R1∼R4 중 적어도 하나는, 불소, 불소를 함유하는 탄소수 1∼10의 알킬기, 불소를 함유하는 탄소수 1∼10의 알콕시기, 또는 불소를 함유하는 탄소수 2∼10의 알콕시알킬기이다. R1∼R4가 불소를 함유하지 않는 기인 경우, R1∼R4는, 수소, 탄소수 1∼10의 알킬기, 탄소수 1∼10의 알콕시기, 또는 탄소수 2∼10의 알콕시알킬기로부터 선택된다. R1∼R4는 서로 동일해도 상이해도 된다. 또한, R1∼R4는 서로 결합하여 환 구조를 형성하고 있어도 된다.)
(2)
상기 L1/L2가 1∼100인 (1)에 기재된 의료 기구.
(3)
상기 요철 구조의 볼록볼록간의 폭이 10μm∼1000μm인 (1) 또는 (2)에 기재된 의료 기구.
(4)
상기 일면의 수접촉각이 70°∼160°인 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 의료 기구.
(5)
상기 일면은, 상기 불소 함유 환상 올레핀 폴리머와, 광경화성 화합물과, 광경화 개시제를 포함하는 불소 함유 환상 올레핀 폴리머 조성물에 의해 구성되는 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 의료 기구.
(6)
상기 불소 함유 환상 올레핀 폴리머 조성물 중에서의 상기 불소 함유 환상 올레핀 폴리머와 상기 광경화성 화합물의 질량비(불소 함유 환상 올레핀 폴리머/광경화성 화합물)가, 99.9/0.1∼50/50인 (5)에 기재된 의료 기구.
(7)
상기 일면에 접촉시켜 세포를 배양하기 위해서 이용되는 (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 기재된 의료 기구.
(8)
상기 세포로부터의 배양 세포가 세포 시트, 스페로이드 또는 콜로니로부터 선택되는 성장 세포의 군체를 형성하면서 부유 증식하는 (7)에 기재된 의료 기구.
(9)
성장 세포의 군체를 완충액에 의해 유리하여 상기 일면으로부터 이탈시키는 (7) 또는 (8)에 기재된 의료 기구.
(10)
기재의 요철 구조를 갖는 일면에 세포를 접촉시키는 의료 기구의 상기 일면을 형성하기 위해서 이용되는 불소 함유 환상 올레핀 폴리머로서, 하기 화학식(1)로 표시되는 구조 단위를 함유하는 불소 함유 환상 올레핀 폴리머.
Figure pct00002
(식(1) 중, R1∼R4 중 적어도 하나는, 불소, 불소를 함유하는 탄소수 1∼10의 알킬기, 불소를 함유하는 탄소수 1∼10의 알콕시기, 또는 불소를 함유하는 탄소수 2∼10의 알콕시알킬기이다. R1∼R4가 불소를 함유하지 않는 기인 경우, R1∼R4는, 수소, 탄소수 1∼10의 알킬기, 탄소수 1∼10의 알콕시기, 또는 탄소수 2∼10의 알콕시알킬기로부터 선택된다. R1∼R4는 서로 동일해도 상이해도 된다. 또한, R1∼R4는 서로 결합하여 환 구조를 형성하고 있어도 된다.)
(11)
기재의 요철 구조를 갖는 일면에 세포를 접촉시키는 의료 기구의 상기 일면을 형성하기 위해서 이용되는 불소 함유 환상 올레핀 폴리머 조성물로서,
하기 화학식(1)로 표시되는 구조 단위를 함유하는 불소 함유 환상 올레핀 폴리머와,
광경화성 화합물과,
광경화 개시제
를 포함하는 불소 함유 환상 올레핀 폴리머 조성물.
Figure pct00003
(식(1) 중, R1∼R4 중 적어도 하나는, 불소, 불소를 함유하는 탄소수 1∼10의 알킬기, 불소를 함유하는 탄소수 1∼10의 알콕시기, 또는 불소를 함유하는 탄소수 2∼10의 알콕시알킬기이다. R1∼R4가 불소를 함유하지 않는 기인 경우, R1∼R4는, 수소, 탄소수 1∼10의 알킬기, 탄소수 1∼10의 알콕시기, 또는 탄소수 2∼10의 알콕시알킬기로부터 선택된다. R1∼R4는 서로 동일해도 상이해도 된다. 또한, R1∼R4는 서로 결합하여 환 구조를 형성하고 있어도 된다.)
(12)
(1) 내지 (9) 중 어느 하나에 기재된 의료 기구의 일면 상에 접촉시키도록 세포를 파종하는 공정과,
상기 세포를 배양하여 배양 세포를 얻는 공정과,
해당 일면 상에 완충액을 첨가하여, 해당 일면으로부터 배양 세포를 부유시키는 공정
을 구비하는 세포 배양 방법.
본 발명에 의하면, 기재의 일면에 접촉 또는 보지시킨 세포를, 손상시키지 않고 기재로부터 이탈시킬 수 있는 의료 기구를 제공할 수 있다.
전술한 목적, 및 그 외의 목적, 특징 및 이점은, 이하에 기술하는 적합한 실시의 형태, 및 그것에 부수하는 이하의 도면에 의해 더욱 명확해진다.
도 1은 실시예 1에 기재된 인산 완충 생리 식염수에 의해 시트상으로 부유한 마우스 배섬유아세포의 명암시 현미경 사진을 나타내는 도면이다.
도 2는 실시예 8에 기재된 14일간 배양한 인간 피부 섬유아세포의 세포 골격 단백의 형광 현미경 사진을 나타내는 도면이다.
도 3은 비교예 4에 기재된 7일간 배양한 인간 피부 섬유아세포의 세포 골격 단백의 형광 현미경 사진을 나타내는 도면이다.
이하, 본 발명을 실시형태에 기초하여 설명한다. 한편, 본 명세서 중에 있어서 「∼」는 특별히 예고가 없으면 이상으로부터 이하를 나타낸다.
(의료 기구)
본 발명에 있어서의 의료 기구는 이하에 나타난다.
화학식(1)로 표시되는 구조 단위를 함유하는 불소 함유 환상 올레핀 폴리머를 사용한 기재를 구비하는 의료 기구로서, 상기 기재는, 해당 기재와 세포를 접촉시키는 일면을 갖고, 또한, 해당 기재는, 상기 일면에 요철 구조를 구비하고, 상기 요철 구조로 구성되는 볼록볼록간의 폭(L1)과, 상기 세포 중의 1개당의 파종 세포의 최대 직경(L2)의 비(L1/L2)가 1∼300이며, 상기 세포가 상기 요철 구조를 구비한 상기 일면에 접착 또는 부착하지 않고, 세포 증식을 촉진하는 것을 특징으로 하는 의료 기구이다.
여기에서, 「상기 세포가 상기 요철 구조를 구비한 상기 일면에 접착 또는 부착하지 않고」란, 배양 세포가 보지된 일면 상에 배양액 또는 완충액을 첨가했을 때에, 해당 일면으로부터 배양 세포가 부유하여, 박리되는 상태를 말한다.
또한, 본 실시형태에 있어서, 기재의 일면에 접촉시키는 세포는 줄기세포를 포함해도 된다.
Figure pct00004
(식(1) 중, R1∼R4 중 적어도 하나는, 불소, 불소를 함유하는 탄소수 1∼10의 알킬기, 불소를 함유하는 탄소수 1∼10의 알콕시기, 또는 불소를 함유하는 탄소수 2∼10의 알콕시알킬기이다. R1∼R4가 불소를 함유하지 않는 기인 경우, R1∼R4는, 수소, 탄소수 1∼10의 알킬기, 탄소수 1∼10의 알콕시기, 또는 탄소수 2∼10의 알콕시알킬기로부터 선택된다. R1∼R4는 서로 동일해도 상이해도 된다. 또한, R1∼R4는 서로 결합하여 환 구조를 형성하고 있어도 된다. 바람직하게는, 식(1) 중의 R1∼R4는, 각각이, 불소 또는 불소 원자를 포함하는 치환기이다.)
본 발명자들은, 의료 기구를 구성하는 기재의 세포를 접촉 또는 보지시키는 일면에, 화학식(1)에 의해 표시되는 구조 단위를 함유하는 불소 함유 환상 올레핀 폴리머, 또는 해당 불소 함유 환상 올레핀 폴리머를 포함하는 조성물로 구성되는 요철 구조가 형성된 기재를 이용하여, 파종한 세포를 적어도 상기 요철 구조의 오목부 저면에 접촉 또는 보지시킴으로써 세포의 밀도를 적절히, 또한 기재 전면에 걸쳐 균일하게 유지할 수 있다는 것을 발명했다.
또한, 배양 후의 형태로 균일한 세포 밀도의 세포괴나 균일한 두께의 세포 시트, 스페로이드, 콜로니 등의 군체를 형성하여, 해당 일면에 보지한 세포를, 인산 완충 생리 식염수 등의 완충액에 의해 용이하게 부유시킬 수 있다는 것을 발견했다. 이것에 의해, 성장 세포를 손상시키지 않고 기재로부터 이탈시키는 것이 가능해진다.
이하, 본 발명에 있어서의 의료 기구에 대해 상세하게 설명한다.
본 발명에 있어서의 의료 기구는, 요철 구조를 형성한 기재를 구비하고, 기재의 일면 중 적어도 오목부 저면에 세포와 배양액이 접촉 또는 보지되는 형태로 사용되는 의료 기구이다. 이와 같은 의료 기구는, 예를 들어 요철 구조를 형성한 기재의 일면의 적어도 오목부 저면에 접촉 또는 보지시킨 세포를 배양하여 증식시켜, 성장 세포를 이용하는 것을 목적으로 해도 되고, 또는, 요철 구조를 형성한 기재의 일면의 적어도 오목부 저면에 접촉 또는 보지시킨 성장 세포를 이용한 검사를 행하기 위해서 이용해도 된다.
한편, 세포를 배양하기 위한 의료 기구에 있어서는, 요철 구조를 형성한 일면의 적어도 오목부 저면을, 세포를 배양하기 위한 배양면으로 할 수도 있다.
본 발명에 있어서의 의료 기구에 있어서, 기재의 세포를 접촉 또는 보지시키는 일면은, 상기 화학식(1)로 표시되는 구조 단위를 함유하는 불소 함유 환상 올레핀 폴리머에 의해 구성된다. 이것에 의해, 의료용 또는 세포 배양의 기재의 일면에 접촉 또는 보지시킨 세포나, 일면 상에서 배양한 세포를, 인산 완충 생리 식염수 등의 완충액을 이용하는 것에 의해 성장 세포의 군체를 기재로부터 부유시킬 수 있는 의료 기구를 얻어도 된다. 이것에 의해, 기재의 요철 구조를 형성한 일면에 접촉 또는 보지시킨 성장 세포를 손상시키지 않고 기재로부터 이탈시키는 것이 가능해진다.
더욱이, 상기 화학식(1)로 표시되는 구조 단위를 함유하는 불소 함유 환상 올레핀 폴리머에 의해 기재의 일면을 구성하는 것에 의해, 일면에 접촉 또는 보지시킨 세포가 당해 일면에 접착 및 부착하지 않는 기재를 실현할 수 있다. 이것에 의해, 세포 배양에 있어서, 세포를 두께 방향으로 군체를 형성시키면서 증식시킨 세포 시트나, 개별적으로 분리하면서 군체를 증식시킨 스페로이드나, 랜덤하게 분산된 군체를 형성시킨 콜로니를 구분하여 만들 수 있다.
통상의 세포를 배양하기 위해서 이용되는 의료 기구에 있어서는, 증식한 세포가 배양면에 접착 또는 부착하면서 증식하기 때문에, 두께 방향에 대해서 균일한 평면 상태, 개별적으로 분리된 구상 상태, 또는 랜덤하게 분산된 콜로니 상태로 세포가 증식한다. 이 경우, 세포가 배양면을 다 덮어 버리면 세포가 접착 또는 부착하는 토대가 없어지기 때문에, 접촉 저해 등의 영향에 의해 세포 성장을 방해된다. 한편, 효율적인 세포 배양을 행하기 위해서 파종을 반복하여 배양하는 계대 조작을 이용하는 것이 고려되지만, 세포를 벗겨서 새로운 배양 용기로 바꿔 옮기는 작업에 의해 세포를 손상시킬 우려가 있다. 또한, 계대 조작은 빈번한 액 교환 등의 매우 번잡한 작업을 수반하는 것이다.
이에 대해, 본 발명에 의하면, 상기 화학식(1)로 표시되는 구조 단위를 함유하는 불소 함유 환상 올레핀 폴리머에 의해 세포를 접촉 또는 보지시키는 기재의 요철 구조를 형성한 일면을 구성하는 것에 의해, 증식한 세포가 기재의 일면에 접착 및 부착하는 것을 억제할 수 있다. 이 때문에, 계대 조작에 의하지 않고도, 두께 방향에 대해서 군체를 형성하도록 세포를 증식시킬 수 있다. 따라서, 세포의 손상의 유발이나 조작의 번잡화를 억제하면서, 보다 효율적인 세포 배양을 행할 수 있다.
또한, 본 발명의 의료 기구에 있어서는, 상기 화학식(1)로 표시되는 구조 단위를 함유하는 불소 함유 환상 올레핀 폴리머에 의해 형성되는 요철 구조의 볼록볼록간의 폭(L1)과 당해 기재와 접촉 또는 보지시키는 세포의 최대 직경(L2)의 비(L1/L2)는 1∼300의 범위이며, 바람직하게는 2∼200, 더 바람직하게는 3∼100이다. 한편, 이 세포의 최대 직경(L2)은, 볼록볼록간의 폭(각 오목부)에 파종한 세포 1개당의 최대 직경을 나타낸다. 여기에서, L2는, 볼록볼록간의 폭에 파종한 복수의 세포의 최대 직경을 각각 측정하여, 그들의 값을 평균한 값이다. 이것에 의해, 세포를 오목부의 저면에 확실히 접촉 또는 보지시킬 수 있어, 세포가 개개의 칸막이 내에서 증식하기 위한 기재 일면 상에서의 세포의 밀도를 적절히, 또한 균일하게 유지함으로써 세포의 증식성을 높이고, 또한, 배양 형태에서 균일한 세포 밀도의 군체상의 세포괴나 균일한 두께의 세포 시트, 스페로이드, 콜로니 등을 제작할 수 있다. 그리고, 배양한 군체 형상의 세포괴나 세포 시트를, 예를 들어, 인산 완충 생리 식염수와 같은 완충액에 의해 용이하게 부유시켜 기재로부터 이탈시킬 수 있다.
여기에서, 세포의 최대 직경이란, 배양액 중에 부유한 상태의 세포를 현미경 관찰하여 계측한 계측치이며, 종류에 따라 크기도 다양하다. 일반적으로, 마우스, 래트, 인간 등의 동물 세포의 대부분은 10μm∼100μm이며, 특히 인간 세포의 경우에서 10μm∼60μm, 종류에 따라서는 정자 세포의 2.5μm나 난세포의 200μm 정도의 것까지 존재한다. 현미경 관찰에 의한 1개당의 세포의 계측으로부터 얻어진 세포의 최대 직경을 L2로 한다.
이것에 맞추어, 상기 화학식(1)로 표시되는 구조 단위를 함유하는 불소 함유 환상 올레핀 폴리머에 의해 형성되는 요철 구조의 볼록볼록간의 폭은, 바람직하게는 10μm∼1000μm이다. 보다 바람직하게는 15μm∼1000μm, 더 바람직하게는 20μm∼1000μm이다. 여기에서의 볼록볼록간의 폭은, 패턴을 상방으로부터 관찰했을 때의 계측치이며, 예를 들어, 정방형이나 장방형 등의 패턴에서는 대각, 원형의 패턴에서는 직경, 부정형의 패턴에서는 최대폭을 나타내고, 형상은 특별히 한정되지 않는다. 이 범위로 함으로써, 세포를 효과적으로 요철 구조의 오목부 저면에 접촉 또는 보지시키는 것이 가능해져, 상기한 바와 같이 배양한 형태에서 균일한 밀도의 세포괴나 균일한 두께의 세포 시트, 스페로이드, 콜로니를 제작할 수 있다.
더욱이, 상기한 요철 구조의 볼록볼록간의 폭(L1)과 당해 기재와 접촉 또는 보지시키는 세포의 최대 직경(L2)의 비(L1/L2)가 1∼300인 기재를 이용하여 세포를 배양할 때의, 세포를 파종한 후의 1개당의 오목부 저면에 접촉 또는 보지되는 세포수는 바람직하게는 1∼100개이며, 보다 바람직하게는 1∼50개, 더 바람직하게는 1∼30개이다. 이것에 의해, 파종한 후의 기재 일면 상에서의 세포의 밀도를 적절히, 또한 균일하게 유지함으로써 세포의 증식성을 높이고, 또한, 배양 후의 형태에서 균일한 세포 밀도의 군체상의 세포괴나 균일한 두께의 세포 시트, 스페로이드, 콜로니를 제작할 수 있다. 한편, 여기에서의 세포수는, 파종한 후의 세포가 오목부 저면에 침강할 때까지의 시간을 고려하여 명암시 현미경 등에 의해, 세포를 관찰하여 카운팅한 세포수이며, 통상, 복수의 오목부에 접촉 또는 보지된 세포를 카운팅한 세포수를 오목부의 수로 나눈 평균치로서 취급한다.
본 발명의 의료 기구를 이용하여 제작한 배양 세포는, 바람직하게는, 약물 대사계 효소 활성을 유지한 배양 세포이다. 즉, 생체 내에서의 세포 증식과 거의 동일한 기능을 유지한 채로 성장시킨 배양 세포이며, 세포의 종류를 한정적으로 선택하지 않는다. 또는, 유전자 변이를 일으킬 확률이 높은 바이러스 또는 세균 등 극히 한정된 세포의 종류를 제외하고 정상적으로 생 세포를 배양할 수 있다. 그 세포의 약물 대사계 효소 활성은, 저온하에서 보존하거나, 또는 특별한 배양 보존 조작(예를 들어, 산소 과다로 보존하는 등)을 하지 않고 유지된 배양 세포이다.
한편, 세포의 형상은, 특별히 한정할 필요는 없지만, 예시한다면, 예를 들어, 시트상 세포, 스페로이드상 세포, 콜로니상 세포, 신경계 형태 세포 등이다. 특히, 재생 의료의 분야에서는, 본 발명과 같이 생체 세포와 마찬가지의 약물 대사계 효소 활성을 유지하고 있는 것이 바람직하여, 본 발명의 배양 세포는 적합하게 생산할 수 있다는 것이, 중요한 소구점이 된다. 또한, 본 발명의 배양 세포는, 창약이나 바이오 약품, 미용에 있어서도 마찬가지의 기능을 장기간 유지할 수 있어, 본 발명은 세계적인 조류가 될 수 있는 발명이다.
또한, 상기 불소 함유 환상 올레핀 폴리머에 의해 기재를 구성하는 것에 의해, 기재의 성형성을 향상시킬 수 있어, 공업적으로 가치가 있는 새로운 의료 기구가 실현된다.
본 발명에 있어서, 배양 세포를 접촉 또는 보지시키는 일면이 상기 불소 함유 환상 올레핀 폴리머에 의해 구성된다는 것은, 예를 들어 플라스틱이나 금속 등의 다른 재료에 의해 형성되는 지지체의 일면 상에 상기 불소 함유 환상 올레핀 폴리머에 의해 구성되는 요철 구조를 형성한 필름이 첩부되어 기재가 구성되는 경우나, 용융 성형으로 기재 전체가 상기 불소 함유 환상 올레핀 폴리머로 구성되어, 세포를 접촉 또는 보지시키는 부분에 요철 구조가 형성되는 경우를 포함해도 된다.
또한, 본 발명의 의료 기구 상에서 제작된 배양 세포를 면, 포, 부직포 등으로 덮어 적층된 적층체도 제공해도 된다. 또는, 이 적층체는, 글리세린 등의 보습제를 함침시켜도 된다. 즉, 본 발명의 의료 기구로 제작된 배양 세포는, 적층체의 덮개를 제거하고, 직접, 재생 의료로서 환부에 첩합시키고, 필름을 이탈시키는 의료 행위를 행해도 된다.
본 발명에 있어서 배양 세포와 접촉 또는 보지하는 요철 구조를 형성한 일면에 있어서의 수접촉각은, 예를 들어 70°∼160°이며, 바람직하게는 75°∼155°, 보다 바람직하게는 80°∼150°로 할 수 있다. 이것에 의해, 일면에 접착 및 부착하지 않고 증식한 세포를, 예를 들어, 인산 완충 생리 식염수 등의 완충액을 이용하여 보다 용이하게 부유시킬 수 있다. 이 때문에, 세포를 기재로부터 이탈시킬 때에, 세포에 손상이 발생하는 것을 보다 확실히 억제하는 것이 가능해진다.
기재의 일면에 있어서의 수접촉각은, 기재의 일면을 구성하는 재료나, 기재의 제작 방법에 있어서의 여러 가지 조건을 적절히 선택하는 것에 의해 제어할 수 있다. 본 발명에 있어서는, 상기 화학식(1)로 표시되는 구조 단위를 함유하는 불소 함유 환상 올레핀 폴리머로 구성되고, 요철 구조를 형성한 기재로 상기 기재의 일면을 형성하는 것이, 수접촉각을 원하는 범위로 하기 위해서 중요한 요소의 하나이다.
수접촉각의 측정은, 일본공업규격 JIS-R3257(기판 유리 표면의 젖음성 시험 방법)에 준하여, 25±5℃, 50±10%의 항온항습 조건하에서 수적(水滴)의 형상을 구형으로 간주할 수 있는 4μl 이하의 용량의 수적을 기재 표면에 적하하고, 정적법에 의해, 기재 표면에 수적이 접촉한 직후부터 1분 이내의 기재와 수적의 접촉 계면의 각도를 계측하는 방법으로 행할 수 있다. 본 발명에 있어서는, 예를 들어 여러 가지 플라스틱 재료의 물성치에 이용되는 수치와 마찬가지로, 상기 방법에 의해 수적이 접촉한 직후부터 1분 이내의 수치를 물성치로서 취급할 수 있다.
본 발명에 있어서의 의료 기구로 취급할 수 있는 세포의 종류로서는, 동물 세포의 경우에서 부유계 세포, 접착계 세포에 관계 없이, 예를 들어, 섬유아세포, 간엽계 줄기세포, 조혈 줄기세포, 신경 줄기세포, 신경 세포, 각막 상피 세포, 구강 점막상 세포, 망막 색소상 세포, 치근막 줄기세포, 근섬유아세포, 심근 세포, 간 세포, 비(脾)내분비 세포, 피부 각화세포, 피부 섬유아세포, 피하지방 유래 전구세포, 신장 세포, 저부 모근초 세포, 비(鼻)점막 상피 세포, 혈관 내피 전구세포, 혈관 내피 세포, 혈관 평활근 세포, 골아세포, 연골 세포, 골격근 세포, 불사화 세포, 암 세포, 각화세포, 배성 줄기세포(ES 세포), EBV 형질 전환 B 세포, 인공 다능성 줄기세포(iPS 세포) 등이 예시되고, 보다 구체적으로는 HeLa 세포, CHO 세포, Cos 세포, HL-60 세포, Hs-68 세포, MCF7 세포, Jurkat 세포, Vero 세포, PC-12 세포, K562 세포, L 세포, 293 세포, HepG2 세포, U-937 세포, Caco-2 세포, HT-29 세포, A549 세포, B16 세포, MDCK 세포, BALB/3T3 세포, V79 세포, 3T3-L1 세포, NIH/3T3 세포, Raji 세포, NSCLC 세포, A431 세포, Sf9 세포, SH-SY5Y 세포, BHK-21 세포, J774 세포, C2C12 세포, 3T3-Swiss albino 세포, MOLT-4 세포, CV-1 세포, F9 세포, MC3T3-E1 세포, HaCaT 세포, L5178Y 세포, HuH-7 세포, Rat1 세포, Saos-2 세포, TIG 세포, CHL 세포, WI-38 세포, MRC-5 세포, Hep3B 세포, SK-N-SH 세포, MIN6 세포, KATO 세포, C3H/10T1/2 세포, DT40 세포, PLC/PRF/5 세포, IMR-90 세포, FM3A 세포 등이 예시된다. 초대(初代) 세포 또는 계대된 세포의 어느 것이어도 된다.
이들 세포의 유래로서는 각종 생물, 예를 들어, 인간, 개, 래트, 마우스, 새, 돼지, 소, 곤충 등의 세포, 또는 이들이 집합하여 형성된 조직, 기관, 미생물, 바이러스 등을 들 수 있고, 보다 구체적으로는, 인간 자궁 경부암 유래, Chinese hamster 난소 유래, CV-1 세포 유래, 인간 골수성 백혈병 유래, 인간 유방암 유래, 인간 T 세포 백혈병 유래, Africa green monkey 신장 유래, 인간 부신골수 갈색세포종 유래, 인간 골수성 백혈병 유래, C3H 마우스 피하 조직 유래, 인간 태아신장 유래, 인간 간암 유래, 인간 조직구성 백혈병 유래, 인간 대장암 유래, 인간 폐암 유래, 마우스 멜라노마 유래, 개 신장 유래, Balb/c 마우스 태자 유래, Chinese hamster 폐 유래, Swiss3T3 유래, NIH Swiss 마우스 태자 유래, 인간 버킷 림프종 유래, 인간 폐비소세포암 유래, 인간 피부 Epidermoid Carcinoid 유래, 나방의 유충 난소 유래, Syrian golden hamster 신장 유래, 마우스 매크로파지 유래, 마우스 근조직 유래, 잡계 Swiss 마우스 태자 유래, 인간 급성 T 세포 백혈병 유래, 마우스 EC 세포 OTT6050 유래, 마우스 calvaria 유래, 인간 표피 각화세포 유래, DBA/2 마우스 흉선 종양 유래, 인간 줄기세포암 유래, 래트 결합 조직 유래, 인간 골육종 유래, 인간 태아폐 유래, 인간 신경아세포종 유래, 마우스 인슐리노마 유래, 인간 위암 유래, C3H 마우스 태자 유래, 닭 B 세포 백혈병 유래, 마우스 자연발생 유방암 유래 등이 예시된다.
(의료 기구에 이용하는 불소 함유 환상 올레핀 폴리머)
본 발명에 있어서의 기재의 요철 구조를 갖는 일면에 세포를 접촉시키는 의료 기구의 상기 일면을 형성하기 위해서 이용되는 불소 함유 환상 올레핀 폴리머는, 하기 화학식(1)로 표시되는 구조 단위를 함유한다.
Figure pct00005
(식(1) 중, R1∼R4 중 적어도 하나는, 불소, 불소를 함유하는 탄소수 1∼10의 알킬기, 불소를 함유하는 탄소수 1∼10의 알콕시기, 또는 불소를 함유하는 탄소수 2∼10의 알콕시알킬기이다. R1∼R4가 불소를 함유하지 않는 기인 경우, R1∼R4는, 수소, 탄소수 1∼10의 알킬기, 탄소수 1∼10의 알콕시기, 또는 탄소수 2∼10의 알콕시알킬기로부터 선택된다. R1∼R4는 서로 동일해도 상이해도 된다. 또한, R1∼R4는 서로 결합하여 환 구조를 형성하고 있어도 된다.)
화학식(1)에 있어서 R1∼R4는, 불소; 플루오로메틸기, 다이플루오로메틸기, 트라이플루오로메틸기, 트라이플루오로에틸기, 펜타플루오로에틸기, 헵타플루오로프로필기, 헥사플루오로아이소프로필기, 헵타플루오로아이소프로필기, 헥사플루오로-2-메틸아이소프로필기, 퍼플루오로-2-메틸아이소프로필기, n-퍼플루오로뷰틸기, n-퍼플루오로펜틸기, 퍼플루오로사이클로펜틸기 등의 알킬기의 수소의 일부 또는 전부가 불소로 치환된 알킬 등의 불소를 함유하는 탄소수 1∼10의 알킬기; 플루오로메톡시기, 다이플루오로메톡시기, 트라이플루오로메톡시기, 트라이플루오로에톡시기, 펜타플루오로에톡시기, 헵타플루오로프로폭시기, 헥사플루오로아이소프로폭시기, 헵타플루오로아이소프로폭시기, 헥사플루오로-2-메틸아이소프로폭시기, 퍼플루오로-2-메틸아이소프로폭시기, n-퍼플루오로뷰톡시기, n-퍼플루오로펜톡시기, 퍼플루오로사이클로펜톡시기 등의 알콕시기의 수소의 일부 또는 전부가 불소로 치환된 알콕시기 등의 불소를 함유하는 탄소수 1∼10의 알콕시기; 또는 플루오로메톡시메틸기, 다이플루오로메톡시메틸기, 트라이플루오로메톡시메틸기, 트라이플루오로에톡시메틸기, 펜타플루오로에톡시메틸기, 헵타플루오로프로폭시메틸기, 헥사플루오로아이소프로폭시메틸기, 헵타플루오로아이소프로폭시메틸기, 헥사플루오로-2-메틸아이소프로폭시메틸기, 퍼플루오로-2-메틸아이소프로폭시메틸기, n-퍼플루오로뷰톡시메틸기, n-퍼플루오로펜톡시메틸기, 퍼플루오로사이클로펜톡시메틸기 등의 알콕시알킬기의 수소의 일부 또는 전부가 불소로 치환된 알콕시알킬기 등의 불소를 함유하는 탄소수 2∼10의 알콕시알킬기가 예시된다.
또한, R1∼R4가 서로 결합하여 환 구조를 형성하고 있어도 되고, 퍼플루오로사이클로알킬, 산소를 개재시킨 퍼플루오로사이클로에터 등의 환을 형성해도 된다.
더욱이, 불소를 함유하지 않는 그 외의 R1∼R4는, 수소; 메틸기, 에틸기, 프로필기, 아이소프로필기, 2-메틸아이소프로필기, n-뷰틸기, n-펜틸기, 사이클로펜틸기 등의 탄소수 1∼10의 알킬기; 메톡시기, 에톡시기, 프로폭시기, 뷰톡시기, 펜톡시 기 등의 탄소수 1∼10의 알콕시기; 또는 메톡시메틸기, 에톡시메틸기, 프로폭시메틸기, 뷰톡시메틸기, 펜톡시메틸기 등의 탄소수 2∼10의 알콕시알킬기를 예시할 수 있다. 바람직하게는, 식(1) 중의 R1∼R4는, 각각이, 불소 또는 불소 원자를 포함하는 치환기이다.
불소 함유 환상 올레핀 폴리머는, 화학식(1)로 표시되는 구조 단위만을 갖는 것이어도 되고, 화학식(1)로 표시되는 구조 단위와 함께 다른 구조 단위를 갖는 것이어도 된다. 또한, 불소 함유 환상 올레핀 폴리머는, 화학식(1)로 표시되는 구조 단위이며, R1∼R4 중 적어도 1개가 서로 상이한 2종류 이상의 구조 단위를 포함하고 있어도 된다.
본 발명에 있어서의 화학식(1)로 표시되는 구조 단위를 함유하는 불소 함유 환상 올레핀 폴리머의 구체적인 예로서, 폴리(1-플루오로-2-트라이플루오로메틸-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1-플루오로-1-트라이플루오로메틸-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1-메틸-1-플루오로-2-트라이플루오로메틸-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1,1-다이플루오로-2-트라이플루오로메틸-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1,2-다이플루오로-2-트라이플루오로메틸-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1-퍼플루오로에틸-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1,1-비스(트라이플루오로메틸)-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1,1,2-트라이플루오로-2-트라이플루오로메틸-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1,2-다이플루오로-1-트라이플루오로에틸-2-트라이플루오로메틸-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1,2-다이플루오로-1-퍼플루오로-iso-프로필-2-트라이플루오로메틸-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1,2-비스(트라이플루오로메틸)-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1-퍼플루오로프로필-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1-메틸-2-퍼플루오로프로필-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1-뷰틸-2-퍼플루오로프로필-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1-퍼플루오로-iso-프로필-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1-메틸-2-퍼플루오로-iso-프로필-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1,2-다이플루오로-1,2-비스(트라이플루오로메틸)-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1,1,2,2,3,3,3a,6a-옥타플루오로사이클로펜틸-4,6-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1,1,2,2,3,3,4,4,3a,7a-데카플루오로사이클로헥실-5,7-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1-퍼플루오로뷰틸-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1-퍼플루오로-iso-뷰틸-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1-퍼플루오로-tert-뷰틸-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1-메틸-2-퍼플루오로-iso-뷰틸-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1-뷰틸-2-퍼플루오로-iso-뷰틸-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1,2-다이플루오로-1-트라이플루오로메틸-2-퍼플루오로에틸-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1-(1-트라이플루오로메틸-2,2,3,3,4,4,5,5-옥타플루오로-사이클로펜틸)-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리((1,1,2-트라이플루오로-2-퍼플루오로뷰틸)-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1,2-다이플루오로-1-트라이플루오로메틸-2-퍼플루오로뷰틸-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1-플루오로-1-퍼플루오로에틸-2,2-비스(트라이플루오로메틸))-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1,2-다이플루오로-1-퍼플루오로프로필-2-트라이플루오로메틸)-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1-퍼플루오로헥실-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1-메틸-2-퍼플루오로헥실-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1-뷰틸-2-퍼플루오로헥실-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1-헥실-2-퍼플루오로헥실-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1-옥틸-2-퍼플루오로헥실-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1-퍼플루오로헵틸-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1-퍼플루오로옥틸-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1-퍼플루오로데칸일-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1,1,2-트라이플루오로-퍼플루오로펜틸-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1,2-다이플루오로-1-트라이플루오로메틸-2-퍼플루오로뷰틸-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1,1,2-트라이플루오로-퍼플루오로헥실-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1,2-다이플루오로-1-트라이플루오로메틸-2-퍼플루오로펜틸-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1,2-비스(퍼플루오로뷰틸)-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1,2-비스(퍼플루오로헥실)-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1-메톡시-2-트라이플루오로메틸-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1-tert-뷰톡시메틸-2-트라이플루오로메틸-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1,1,3,3,3a,6a-헥사플루오로퓨란일-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1-플루오로-2-트라이플루오로메톡시-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1-플루오로-1-트라이플루오로메톡시-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1-메틸-1-플루오로-2-트라이플루오로메톡시-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1,1-다이플루오로-2-트라이플루오로메톡시-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1,2-다이플루오로-2-트라이플루오로메톡시-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1-퍼플루오로에톡시-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1,1-비스(트라이플루오로메톡시)-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1,1,2-트라이플루오로-2-트라이플루오로메톡시-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1,2-비스(트라이플루오로메톡시)-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1-퍼플루오로프로폭시-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1-메틸-2-퍼플루오로프로폭시-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1-뷰틸-2-퍼플루오로프로폭시-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1-퍼플루오로-iso-프로폭시-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1-메틸-2-퍼플루오로-iso-프로폭시-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1,2-다이플루오로-1,2-비스(트라이플루오로메톡시)-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1-퍼플루오로뷰톡시-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1-퍼플루오로-iso-뷰톡시-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1-퍼플루오로-tert-뷰톡시-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1-메틸-2-퍼플루오로-iso-뷰톡시-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1-뷰틸-2-퍼플루오로-iso-뷰톡시-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1,2-다이플루오로-1-트라이플루오로메톡시-2-퍼플루오로에톡시-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1,1,2-트라이플루오로-2-퍼플루오로뷰톡시-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1,2-다이플루오로-1-트라이플루오로메톡시-2-퍼플루오로뷰톡시-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1-플루오로-1-퍼플루오로에톡시-2,2-비스(트라이플루오로메톡시)-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1,2-다이플루오로-1-퍼플루오로프로폭시-2-트라이플루오로메톡시-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1-퍼플루오로헵톡시-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1-메틸-2-퍼플루오로헵톡시-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1-뷰틸-2-퍼플루오로헵톡시-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1-헥실-2-퍼플루오로헵톡시-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1-옥틸-2-퍼플루오로헵톡시-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1-퍼플루오로헵톡시-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1-퍼플루오로옥톡시-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1-퍼플루오로데실옥시-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1,1,2-트라이플루오로-퍼플루오로펜톡시-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1,2-다이플루오로-1-트라이플루오로메톡시-2-퍼플루오로뷰톡시-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1,1,2-트라이플루오로-2-퍼플루오로헵톡시-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1,2-다이플루오로-1-트라이플루오로메톡시-2-퍼플루오로펜틸-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1,2-비스(퍼플루오로뷰톡시)-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1,2-비스(퍼플루오로헵톡시)-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1-메톡시-2-트라이플루오로메톡시-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1-tert-뷰톡시메틸-2-트라이플루오로메톡시-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1-(2',2',2'-트라이플루오로에톡시)-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1-(2',2',3',3',3'-펜타플루오로프로폭시)-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1-메틸-2-(2',2',3',3',3'-펜타플루오로프로폭시)-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1-뷰틸-2-(2',2',3',3',3'-펜타플루오로프로폭시)-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1-(1',1',1'-트라이플루오로-iso-프로폭시)-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1-메틸-(1',1',1'-트라이플루오로-iso-프로폭시)-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1-(2',2',3',3',4',4',4'-헵타플루오로뷰톡시)-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1-(1',1',1'-트라이플루오로-iso-뷰톡시)-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1-(1',1',1'-트라이플루오로-iso-뷰톡시)-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1-메틸-2-(1',1',1'-트라이플루오로-iso-뷰톡시)-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1-뷰틸-2-(1',1',1'-트라이플루오로-iso-뷰톡시)-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1,2-다이플루오로-1-트라이플루오로메톡시-2-(2',2',2'-트라이플루오로에톡시)-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1,1,2-트라이플루오로-2-(2',2',3',3',4',4',4'-헵타플루오로뷰톡시)-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1,2-다이플루오로-1-트라이플루오로메톡시-2-(2',2',3',3',4',4',4'-헵타플루오로뷰톡시)-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1-플루오로-1-(2',2',2'-트라이플루오로에톡시)-2,2-비스(트라이플루오로메톡시))-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1,2-다이플루오로-1-(2',2',3',3',3'-펜타플루오로프로폭시)-2-트라이플루오로메톡시-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1-(2',2',3',3',4',4',5',5',6', 6',6'-운데카플루오로헵톡시)-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1-메틸-2-(2',2',3',3',4',4',5',5',6',6',6'-운데카플루오로헵톡시)-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1-뷰틸-2-(2',2',3',3',4',4',5',5',6',6',6'-운데카플루오로헵톡시)-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1-헥실-2-(2',2',3',3',4',4',5',5',6',6',6'-운데카플루오로헵톡시)-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1-옥틸-2-(2',2',3',3',4',4',5',5',6',6',6'-운데카플루오로헵톡시)-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1-(2',2',3',3',4',4',5',5',6',6',7',7',7'-트라이데카플루오로헵톡시)-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1-(2',2',3',3',4',4',5',5',6',6',7',7',8',8',8'-펜타데카플루오로옥톡시)-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1-(2',2',3',3',4',4',5',5',6',6',7',7',8',8',9',9',9'-헵타데카플루오로데실옥시)-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1,1,2-트라이플루오로-2-(1',1',1'-트라이플루오로-iso-프로폭시)-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1,2-다이플루오로-1-트라이플루오로메톡시-2-(2',2',3',3',4',4',4'-헵타플루오로뷰톡시)-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1,1,2-트라이플루오로-(2',2',3',3',4',4',5',5',6',6',6'-운데카플루오로헵톡시)-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1,2-비스(2',2',3',3',4',4',4'-헵타플루오로뷰톡시)-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌), 폴리(1,2-비스(2',2',3',3',4',4',5',5',6',6',6'-운데카플루오로헵톡시)-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌) 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서의 불소 함유 환상 올레핀 폴리머의 분자량은, 예를 들어 시료 농도 3.0∼9.0mg/ml에서 겔 퍼미에이션 크로마토그래피(GPC)에 의해 측정한 폴리스타이렌 환산의 중량 평균 분자량(Mw)에 있어서, 5,000∼1,000,000인 것이 바람직하고, 10,000∼300,000인 것이 보다 바람직하다. 이 중량 평균 분자량(Mw)을 상기 하한치 이상으로 하는 것에 의해, 용액 캐스팅법에 의해 성형한 성형물, 또는 기재에 코팅한 성형물에 있어서 휨 등의 외부 응력에 기인한 잔금 등이 발생하지 않는, 양호한 상태의 성형물을 보다 확실히 얻을 수 있다. 또한, 중량 평균 분자량(Mw)을 상기 상한치 이하로 하는 것에 의해, 용융 성형이 용이한 유동성을 가질 수 있다.
또한, 중량 평균 분자량(Mw)과 수 평균 분자량(Mn)의 비인 분자량 분포(Mw/Mn)는, 1.3∼5.0으로 하는 것이 바람직하고, 1.5∼4.5로 하는 것이 보다 바람직하고, 1.7∼4.0으로 하는 것이 특히 바람직하다. 이 분자량 분포(Mw/Mn)를 상기 하한치 이상으로 하는 것에 의해, 용액 캐스팅법이나 용융 성형법 등의 각종 성형법으로 제작한 필름 또는 성형물의 인성을 향상시켜, 외부 응력에 기인한 크랙이나 균열의 발생을 보다 효과적으로 억제할 수 있다. 한편으로, 분자량 분포(Mw/Mn)를 상기 상한치 이상으로 하는 것에 의해, 올리고머 등의 특별히 저분자량 성분이 용출되는 것을 억제하여, 요철 구조를 형성한 기재 표면의 수접촉각이 변화하여 세포 증식의 형태가 방해되는 것을 보다 확실히 억제하는 것이 가능해진다. 중량 평균 분자량(Mw), 및 분자량 분포(Mw/Mn)를 상기한 범위로 하는 것에 의해, 의료용 또는 세포 배양 및 세포를 이용한 검사에 이용되는 것으로서 특히 적합한 의료 기구를 얻을 수 있다.
시차 주사 열량 분석에 의한 불소 함유 환상 올레핀 폴리머의 유리전이온도는, 50∼300℃로 하는 것이 바람직하고, 80∼280℃로 하는 것이 보다 바람직하고, 100∼250℃로 하는 것이 더 바람직하다. 유리전이온도가 상기 범위이면, 가열 멸균 처리를 행할 수 있고, 또한 사용 환경하에서 형상을 유지할 수 있으며, 더욱이 용융 성형에 있어서 가열 온도에 대해서 우수한 유동성을 가져 제조 안정성이 좋고, 색상도 우수한 의료용 또는 세포 배양 및 세포를 이용한 검사를 위한 기재로서의 의료 기구를 적합하게 얻을 수 있다.
본 발명에 있어서의 화학식(1)로 표시되는 구조 단위를 함유하는 부분화 불소화 폴리머는, 전불소화 폴리머와는 달리, 주쇄가 탄화수소이고 측쇄에 불소 원자를 갖는 부분적인 불소화 폴리머인 구조이며, 이것에 기인하여 극성이 커진다. 이것에 의해, 폴리머 합성 시의 용제인 통상 시판되고 있는 에터나 케톤 등의 극성 용제에 대해서 잘 용해되고, 광경화성 화합물 등의 극성 화합물에도 우수한 용해성을 나타내면서, 본 발명의 불소 함유 환상 올레핀 폴리머의 성형물은, 배양 기재로서 시판되고 있는 유리제, 폴리스타이렌제, 또는 올레핀 폴리머제의 표면 성상에 대해서 수접촉각이 70°이상의 비교적 소수인 표면 성상을 갖는다. 이것에 의해, 배양한 군체 형상의 스페로이드나 콜로니 등의 세포괴나 세포 시트를, 예를 들어, 인산 완충액에 의해 부유시켜 용이하게 기재로부터 이탈시킬 수 있다.
본 발명에 있어서의 전술한 수지의 이용 형태에 있어서는, 예를 들어, 의료용 또는 세포 배양 백, 플레이트, 샬레, 디쉬, 플라스크, 튜브 등을 예시할 수 있다. 여기에서는, 예를 들어, 세포는, 생체 장기나 혈액 등을 포함하는 세포여도 된다.
(불소 함유 환상 올레핀 폴리머의 제조 방법)
다음에, 불소 함유 환상 올레핀 폴리머의 제조 방법에 대해 설명한다.
이하에 기재된 제조 방법에 의해 얻어지는 불소 함유 환상 올레핀 폴리머로 이루어지는 요철 구조를 형성한 성형물을, 본 발명의 의료 기구에 있어서의 기재로서 이용하는 것에 의해, 세포의 접착, 또는 부착이 억제되는 것을 특징으로 하는 의료 기구를 적합하게 얻을 수 있다.
구체적으로는, 하기 화학식(2)로 표시되는 환상 올레핀 모노머를 개환 메타세시스 중합 촉매에 의해 연쇄 이동 중합하고, 얻어지는 중합체의 주쇄의 올레핀부를 수소 첨가하는 것에 의해, 불소 함유 환상 올레핀 폴리머를 합성할 수 있다.
Figure pct00006
(식(2) 중, R1∼R4는, 화학식(1)의 R1∼R4와 동의이다. 또한, R1∼R4는 서로 결합하여 환 구조를 형성하고 있어도 된다. 바람직하게는, 식(2) 중의 R1∼R4는, 각각이, 불소 또는 불소 원자를 포함하는 치환기이다.)
한편, 본 발명의 효과를 해치지 않는 범위이면, 화학식(2)로 표시되는 환상 올레핀 모노머 이외의 모노머를 포함하고 있어도 된다.
여기에서, 본 발명의 불소 함유 환상 올레핀 폴리머를 합성할 때에, 화학식(2)로 표시되는 모노머는, 중합에 기여하는 화합물 전체 중, 90∼100질량% 이용하는 것이 바람직하고, 95∼100질량% 이용하는 것이 보다 바람직하고, 98∼100질량% 이용하는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 화학식(1)로 표시되는 구조 단위를 함유하는 불소 함유 환상 올레핀 폴리머는, 화학식(2)로 표시되는 모노머를 개환 메타세시스 중합한 후에, 주쇄의 이중 결합을 수소 첨가(수첨)한 불소 함유 폴리머이다. 개환 메타세시스 중합은, Schrock 촉매가 바람직하게 이용되고, Grubbs 촉매를 이용해도 되고, 이것에 의해 극성 모노머에 대한 중합 촉매 활성을 높여 공업적으로 우수한 제조 방법을 실현하는 것이 가능해진다. 한편, 이들 개환 메타세시스 중합 촉매는, 단독으로 이용해도 되고, 2종 이상을 조합하여 이용해도 된다. 또한, 고전적인 유기 전이 금속 착체, 전이 금속 할로젠화물 또는 전이 금속 산화물과 조촉매로서의 루이스산의 조합으로 이루어지는 개환 메타세시스 중합 촉매를 이용할 수도 있다.
또한, 개환 메타세시스 중합을 행할 때는 분자량, 및 그의 분포를 제어하기 위해서, 연쇄 이동제로서 올레핀 또는 다이엔을 사용할 수 있다. 올레핀으로서는, 예를 들어, 에틸렌, 프로필렌, 1-뷰텐, 1-펜텐, 1-헥센, 1-옥텐 등의 α-올레핀 또는 이들의 불소 함유 올레핀을 이용할 수 있다. 또한, 바이닐트라이메틸실레인, 알릴트라이메틸실레인, 알릴트라이에틸실레인, 알릴트라이아이소프로필실레인 등의 규소 함유 올레핀 또는 이들의 불소 및 규소 함유 올레핀 등도 연쇄 이동제로서 이용할 수도 있다. 또한, 다이엔으로서는, 1,4-펜타다이엔, 1,5-헥사다이엔, 1,6-헵타다이엔 등의 비공액계 다이엔 또는 이들의 불소 함유 비공액계 다이엔을 들 수 있다. 이들 올레핀, 불소 함유 올레핀 또는 다이엔은 각각 단독으로 이용해도 되고, 2종류 이상을 병용해도 된다.
또한, 모노머의 개환 메타세시스 중합은, 무용제로 행해도 용제를 사용해도 된다. 용제를 사용하는 경우의 용제로서는, 테트라하이드로퓨란, 다이에틸 에터, 다이뷰틸 에터, 다이메톡시에테인 또는 다이옥세인 등의 에터류; 아세트산 에틸, 아세트산 프로필 또는 아세트산 뷰틸 등의 에스터류; 벤젠, 톨루엔, 자일렌 또는 에틸벤젠 등의 방향족 탄화수소류; 펜테인, 헥세인 또는 헵테인 등의 지방족 탄화수소류; 사이클로펜테인, 사이클로헥세인, 메틸 사이클로헥세인, 다이메틸 사이클로헥세인 또는 데칼린 등의 지방족 환상 탄화수소류; 메틸렌 다이클로라이드, 다이클로로에테인, 다이클로로에틸렌, 테트라클로로에테인, 클로로벤젠 또는 트라이클로로벤젠 등의 할로젠화 탄화수소류; 플루오로벤젠, 다이플루오로벤젠, 헥사플루오로벤젠, 트라이플루오로메틸 벤젠, 메타자일렌 헥사플루오라이드 등의 불소 함유 방향족 탄화수소류; 퍼플루오로헥세인 등의 불소 함유 지방족 탄화수소류; 퍼플루오로사이클로데칼린 등의 불소 함유 지방족 환상 탄화수소류; 또는 퍼플루오로-2-뷰틸테트라하이드로퓨란 등의 불소 함유 에터류를 이용할 수 있다. 이들은, 단독으로 이용해도 되고, 2종류 이상을 조합하여 사용해도 된다.
모노머의 개환 메타세시스 중합에서는, 해당 모노머의 반응성 및 중합 용제에 대한 용해성에 따라서도 상이하지만, 모노머 용액에 대한 모노머의 농도는 5∼100질량%인 것이 바람직하고, 10∼60질량%인 것이 보다 바람직하다. 또한, 반응 온도는, -30∼150℃인 것이 바람직하고, 30∼100℃인 것이 보다 바람직하다. 또한, 반응 시간은, 10분∼120시간인 것이 바람직하고, 30분∼48시간인 것이 보다 바람직하다. 더욱이, 뷰틸알데하이드 등의 알데하이드류, 아세톤 등의 케톤류, 메탄올 등의 알코올류, 물 등의 실활제로 반응을 정지하여, 중합체의 용액을 얻을 수 있다.
개환 메타세시스 중합으로 얻어진 폴리머의 주쇄의 이중 결합부를 수소 첨가하기 위한 촉매는, 수소 첨가할 수 있는 촉매이면, 균일계 금속 착체 촉매여도 불균일계의 금속 담지 촉매의 어느 것이어도 된다. 균일계 금속 착체 촉매로서, 예를 들어, 클로로트리스(트라이페닐포스핀)로듐, 다이클로로트리스(트라이페닐포스핀)오스뮴, 다이클로로하이드라이드 비스(트라이페닐포스핀)이리듐, 다이클로로트리스(트라이페닐포스핀)루테늄, 다이클로로테트라키스(트라이페닐포스핀)루테늄, 클로로하이드라이드 카보닐트리스(트라이페닐포스핀)루테늄, 다이클로로트리스(트라이메틸포스핀)루테늄 등을 들 수 있고, 또한, 불균일계 금속 담지 촉매로서, 예를 들어, 활성탄 담지 팔라듐, 알루미나 담지 팔라듐, 활성탄 담지 로듐, 알루미나 담지 로듐, 활성탄 담지 루테늄, 알루미나 담지 루테늄 등을 들 수 있다. 본 발명에 있어서는 이들 수첨 촉매는, 바람직하게는, 용이하게 분리할 수 있는 불균일계 금속 담지 촉매가 적합하고, 또한, 단독으로 이용해도 되고, 또는 2종류 이상을 조합하여 사용할 수도 있다.
수소 첨가에 이용되는 용제로서는, 폴리머를 용해시키고, 또한 용제 자신이 수소 첨가되지 않는 것이면 특별히 제한은 없고, 예를 들어, 테트라하이드로퓨란, 다이에틸 에터, 다이뷰틸 에터, 다이메톡시에테인 등의 에터류; 아세트산 에틸, 아세트산 프로필 또는 아세트산 뷰틸 등의 에스터류; 벤젠, 톨루엔, 자일렌, 에틸벤젠 등의 방향족 탄화수소류; 펜테인, 헥세인, 헵테인 등의 지방족 탄화수소류; 사이클로펜테인, 사이클로헥세인, 메틸 사이클로헥세인, 다이메틸 사이클로헥세인, 데칼린 등의 지방족 환상 탄화수소류; 메틸렌 다이클로라이드, 클로로폼, 다이클로로에테인, 다이클로로에틸렌, 테트라클로로에테인, 클로로벤젠, 트라이클로로벤젠 등의 할로젠화 탄화수소류; 플루오로벤젠, 다이플루오로벤젠, 헥사플루오로벤젠, 트라이플루오로메틸 벤젠, 메타자일렌 헥사플루오라이드 등의 불소 함유 방향족 탄화수소류; 퍼플루오로헥세인 등의 불소 함유 지방족 탄화수소류; 퍼플루오로사이클로데칼린 등의 불소 함유 지방족 환상 탄화수소류; 퍼플루오로-2-뷰틸테트라하이드로퓨란 등의 불소 함유 에터류 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 이용해도 되고, 2종 이상을 조합하여 사용해도 된다.
상기의 주쇄의 올레핀부의 수소 첨가 반응은, 수소 압력이 상압∼10MPa인 것이 바람직하고, 0.5∼8MPa인 것이 보다 바람직하고, 2∼5MPa인 것이 특히 바람직하다. 또한, 반응 온도는, 0∼200℃의 온도인 것이 바람직하고, 실온∼150℃인 것이 보다 바람직하고, 50∼100℃인 것이 특히 바람직하다. 수소 첨가 반응의 실시 양식은, 특별히 제한은 없지만, 예를 들어, 촉매를 용제 중에 분산 또는 용해하여 행하는 방법, 촉매를 컬럼 등에 충전하여, 고정상으로 하여 폴리머 용액을 유통시켜 행하는 방법 등을 들 수 있다.
더욱이, 주쇄의 올레핀부의 수소 첨가 처리는, 수소 첨가 처리 전의 폴리머의 중합 용액을 빈(貧)용제에 석출시켜 폴리머를 단리한 후에, 다시 용제에 용해하여 수소 첨가 처리를 행해도, 중합 용액으로부터 폴리머를 단리하지 않고, 상기의 수첨 촉매로 수소 첨가 처리를 행해도 되고, 특별히 제한은 없다.
또한, 폴리머의 올레핀부의 수소 첨가율은 80% 이상인 것이 바람직하고, 90∼100%인 것이 바람직하고, 95∼100%인 것이 더욱 바람직하다. 수소 첨가율을 상기 하한치 이상으로 하는 것은, 올레핀부에 있어서, 광흡수에 기인한 열화나 성형 시의 가열에 기인한 산화가 생기는 것을 억제하여, 기재와의 접착성을 양호한 것으로 할 수 있다. 더욱이, 이중 결합의 잔류에 의해 형광 현미경에서의 성장 세포의 관찰을 방해하는 경우가 있다.
수소 첨가 후, 특히, 활성탄 담지 팔라듐, 알루미나 담지 팔라듐 등의 고체 촉매를 바람직하게 이용하는 경우의 폴리머 용액으로부터 폴리머를 취득하는 방법은, 특별히 제한은 없지만, 예를 들어, 여과, 원심 분리, 데칸테이션 등의 방법으로 폴리머를 취득하여, 교반 하의 빈용제에 반응 용액을 배출하는 방법, 반응 용액 중에 스팀을 취입하는 스팀 스트리핑 등의 방법에 의해 폴리머를 석출시키는 방법, 또는, 반응 용액으로부터 용제를 가열 등에 의해 증발 제거하는 방법 등을 들 수 있다.
또한, 불균일계 금속 담지 촉매를 이용하여 수소 첨가 반응을 실시한 경우는, 합성액을 여과하여 금속 담지 촉매를 여과분별한 후에, 상기한 방법으로 폴리머를 취득할 수도 있다. 한편, 입경이 큰 촉매 성분을 미리 데칸테이션, 원심 분리 등의 방법으로 폴리머 용액 중에 침강시키고, 상징을 채취하여, 촉매 성분을 대략 제거한 용액을 여과하여, 상기한 방법으로 폴리머를 취득해도 된다. 특히, 촉매 성분을 정밀 여과하는 것이 적합하고, 여과 필터의 눈크기는, 바람직하게는 10μm∼0.05μm, 특히 바람직하게는 10μm∼0.10μm, 더 바람직하게는 5μm∼0.10μm이다.
(불소 함유 환상 올레핀 폴리머 또는 불소 함유 환상 올레핀 폴리머 조성물을 이용한 의료 기구의 제작 방법)
본 발명에 있어서의 불소 함유 환상 올레핀 폴리머 또는 불소 함유 환상 올레핀 폴리머 조성물을 이용한 의료 기구는, 의료용 또는 세포 배양, 또는 세포의 검사를 위하는 등에 이용할 수 있다. 여기에서 의료 기구를 제작하는 방법에 대해 기재한다. 본 발명에 있어서의 의료 기구는, 예를 들어, 요철 구조를 형성한 필름이나 시트상의 단층막으로 이루어지는 기재나, 다른 재료 상에 요철 구조를 형성한 필름이나 시트상의 단층막을 접착제 또는 점착제 등으로 본 발명의 수지 또는 다른 수지 또는 다른 재료에 첩부하여 형성해도 된다. 더욱이, 압출 필름 성형이나 사출 성형과 같은 방법으로 롤 또는 금형에 요철 구조를 붙여 요철 구조를 형성해도 된다.
더욱이, 구체적으로는, 바니시상의 불소 함유 환상 올레핀 폴리머 또는 불소 함유 환상 올레핀 폴리머 조성물을, 용액 캐스팅법으로 패턴 몰드에 도공하고, 용제 증발 또는 용제 증발 후에 UV 조사하는 임프린트법이나, 미리 필름 성형하고, 열가압 또는 UV 경화로 몰드의 패턴을 전사하는 임프린트 방법, 또는 압출 필름 성형이나 사출 성형과 같은 방법으로 롤 또는 금형의 표면에 요철 구조의 패턴을 붙여 요철 구조를 형성하는 용융 성형, 또는 롤 투 롤에서의 UV 경화로 몰드의 패턴을 부형하는 방법을 들 수 있다.
본 발명에 있어서의 이들 요철 구조의 오목부는 볼록볼록간의 폭(L1)이며, 바람직하게는 10μm∼1000μm의 패턴을 부형한 것이고, 보다 바람직하게는 20μm∼1000μm, 더 바람직하게는 50μm∼1000μm의 패턴을 임프린트 부형한 것으로, 오목부 저면에 안정적으로 세포를 접촉시킬 수 있다. 또한, 요철 구조의 볼록부의 폭은, 바람직하게는 1μm∼300μm의 패턴을 부형한 것이고, 보다 바람직하게는 3μm∼300μm, 더 바람직하게는 5μm∼300μm이며, 볼록부의 높이는, 바람직하게는 10μm∼1000μm의 패턴을 부형한 것이고, 보다 바람직하게는 20μm∼1000μm, 더 바람직하게는 50μm∼1000μm이다. 이것에 의해, 파종한 세포를 적절한 밀도로 기재 전면에 균일하게 접촉 또는 보지시킬 수 있고, 배양한 후의 형상으로, 군체 형상의 스페로이드, 콜로니 등의 세포괴나 세포 시트를 인산 완충 생리 식염수 등의 완충액에 의해 부유시켜 용이하게 기재로부터 이탈시킬 수 있다.
요철 구조의 형상은, 특별히 한정되지 않지만, 이들 요철 구조는, 스크린 인쇄, 엠보싱 가공, 서브마이크론 임프린팅, 나노임프린팅 등 여러 가지 방법으로 형성한 원형, 정방형, 장방형, 정삼각형, 정육각형 등 여러 가지 형상이어도 되고, 볼록볼록간의 폭(L1)은, 그의 최대 길이이다.
본 발명의 의료 기구를 제조하는데 있어서, 화학식(1)로 표시되는 구조 단위를 함유하는 불소 함유 환상 올레핀 폴리머 또는 불소 함유 환상 올레핀 폴리머 조성물은, 다음의 유기 용제를 사용하여 제작해도 된다. 예를 들어, 메타자일렌 헥사플루오라이드, 벤조트라이플루오라이드, 플루오로벤젠, 다이플루오로벤젠, 헥사플루오로벤젠, 트라이플루오로메틸 벤젠, 비스(트라이플루오로메틸)벤젠 등의 불소 함유 방향족 탄화수소류; 퍼플루오로헥세인, 퍼플루오로옥테인 등의 불소 함유 지방족 탄화수소류; 퍼플루오로사이클로데칼린 등의 불소 함유 지방족 환상 탄화수소류; 퍼플루오로-2-뷰틸테트라하이드로퓨란 등의 불소 함유 에터류; 클로로폼, 클로로벤젠, 트라이클로로벤젠 등의 할로젠화 탄화수소류; 테트라하이드로퓨란, 다이뷰틸 에터, 1,2-다이메톡시에테인, 다이옥세인 등의 에터류; 아세트산 에틸, 아세트산 프로필, 아세트산 뷰틸 등의 에스터류; 또는 메틸 에틸 케톤, 메틸 아이소뷰틸 케톤, 사이클로헥산온 등의 케톤류 등을 들 수 있다. 이들 중에서, 용해성이나 제막성을 고려하여 선택할 수 있다. 또한, 이들은 단독으로 이용해도 되고, 2종류 이상을 조합하여 이용해도 된다. 특히, 제막성의 관점에서는, 대기압하에서 70℃ 이상의 비점을 갖는 용제가 바람직하다. 이것에 의해, 증발 속도가 지나치게 빨라지는 것을 확실히 억제할 수 있어, 막 표면에 있어서의 얼룩의 발생을 억제할 수 있고, 또한, 제막 시에 있어서의 막 두께 정밀도의 향상에도 이바지할 수 있다.
화학식(1)로 표시되는 구조 단위를 함유하는 불소 함유 환상 올레핀 폴리머 또는 불소 함유 환상 올레핀 폴리머 조성물을 용해시키는 농도는, 1.0∼99.0질량%인 것이 바람직하고, 5.0∼90.0질량%인 것이 보다 바람직하고, 10.0∼80.0질량%인 것이 특히 바람직하다. 농도는, 폴리머의 용해성이나 여과 프로세스에 대한 적응성, 패턴 성형성, 제막성, 필름의 막 두께를 고려하여 선택해도 된다.
더욱이, 본 발명에 있어서 필름 특성을 해치지 않는 범위이면, 필요에 따라서 다른 공지의 성분을 가해도 된다. 다른 성분으로서는, 노화 방지제, 레벨링제, 젖음성 개량제, 계면활성제, 가소제 등의 개질제, 자외선 흡수제, 방부제, 항균제 등의 안정제, 광증감제, 실레인 커플링제 등을 들 수 있다.
그 다음에, 상기 화학식(1)로 표시되는 구조 단위를 함유하는 불소 함유 환상 올레핀 폴리머 또는 불소 함유 환상 올레핀 폴리머 조성물의 바니시는, 필터를 통과시켜 여과할 수 있다. 이것에 의해, 바니시의 폴리머 불용분이나 겔, 이물 등의 함유량을 크게 저감시킬 수 있어, 세포를 배양하는 배양 기구나, 세포를 이용한 검사를 행하는 검사 기구로서의 기재 표면의 패턴을 안정적으로 형성할 수 있다. 게다가, 소수성을 나타내는 표면 성상을 전면에 걸쳐서 균일하게 형성할 수 있다.
여과 필터의 눈크기는, 바람직하게는 10μm∼0.05μm, 보다 바람직하게는 10μm∼0.1μm, 더 바람직하게는 5μm∼0.1μm이다. 여과의 프로세스는, 공경이 큰 필터로부터 작은 필터로 폴리머 용액을 보내는 다단 프로세스여도, 직접, 공경이 작은 필터에 바니시를 보내는 단일 프로세스여도 된다. 필터의 재질은, 테플론(등록상표), 폴리프로필렌(PP), 폴리에터설폰(PES), 셀룰로스 등의 유기 재료로 이루어지는 것이어도, 유리 섬유, 금속 등의 무기 재료로 이루어지는 것이어도 되고, 세포 배양에 악영향을 주지 않으면 바니시 특성, 프로세스 적응성에서 선택할 수 있다.
또한, 바니시를 필터에 보내는 방법으로서는, 압력차를 이용하는 방법이어도, 스크류 등을 통하여 기계적인 구동에 의해 바니시를 필터에 송액하는 방법이어도 된다. 더욱이, 여과의 온도는, 필터 성능이나, 용액 점도, 폴리머의 용해성을 고려한 범위에서 선택되고, -10∼200℃인 것이 바람직하고, 0℃∼150℃인 것이 보다 바람직하고, 실온∼100℃인 것이 특히 바람직하다.
다음에, 상기의 화학식(1)로 표시되는 구조 단위를 함유하는 불소 함유 환상 올레핀 폴리머를 유기 용제에 용해한 바니시로부터 필름의 일면에 요철 구조를 형성한 기재의 제작 방법의 예를 나타낸다. 본 발명에 있어서는, 여러 가지 임프린트법에 의해 요철 구조가 형성된 기재가 제작된다.
본 발명의 기재의 제작에 이용되는 몰드는, 표면에 미세 패턴이 형성된 것이다. 이 몰드의 기재 재질로서는, 니켈, 철, 스테인레스강, 저마늄, 타이타늄, 실리콘 등의 금속 재료, 유리, 석영, 알루미나 등의 무기 재료, 폴리이미드, 폴리아마이드, 폴리에스터, 폴리카보네이트, 폴리페닐렌 에터, 폴리페닐렌 설파이드, 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 에폭시 수지, 실리콘 수지 등의 수지 재료, 다이아몬드, 흑연 등의 탄소 재료 등을 들 수 있다.
요철 구조가 형성된 기재는, 상기 바니시와 몰드의 패턴면을 접촉시키고, 용제를 증발시키는 것에 의해 몰드의 패턴을 전사하는 것, 또는, 필름을 제작 후에 몰드 패턴을 가열 전사하는 것, 또는, 몰드 패턴에 도공한 본 발명의 조성물을 UV 경화하여 전사하는 것에 의해 얻을 수 있다.
본 발명의 화학식(1)로 표시되는 구조 단위를 함유하는 불소 함유 환상 올레핀 폴리머를 유기 용제에 용해한 바니시와 몰드를 접촉시키는 방법으로서는 특별히 제한은 없지만, 예를 들어, 테이블 코팅, 스핀 코팅, 다이 코팅, 스프레이 코팅, 바 코팅, 롤 코팅 등의 방법으로 몰드의 미세한 패턴면 상에 폴리머 용액(바니시)을 도포하는 방법, 또는 스테인레스강, 실리콘 등의 금속 재료, 유리, 석영 등의 무기 재료, 폴리이미드, 폴리아마이드, 폴리에스터, 폴리카보네이트, 폴리페닐렌 에터, 폴리페닐렌 설파이드, 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 에폭시 수지, 실리콘 수지 등의 수지 재료 등의 기재 상에 테이블 코팅, 스핀 코팅, 다이 코팅, 스프레이 코팅, 바 코팅, 롤 코팅 등의 방법으로 폴리머 용액을 도포하고, 몰드의 미세한 패턴면을 그것에 씌워 접촉시키는 방법의 어느 것이어도 된다.
구체적으로는, (A) 미세 패턴을 갖는 몰드 표면에, 불소 함유 환상 올레핀 폴리머와 유기 용제로 이루어지는 용액(바니시)을 도포하는 공정과, 상기 용액으로부터 용제를 증발시키는 공정을 포함하는 방법, (B) 지지체(기재)에 불소 함유 환상 올레핀 폴리머와 유기 용제로 이루어지는 용액(바니시)을 도포하는 공정과, 도포층의 상면을 미세 패턴이 형성된 몰드 표면으로 압압(壓押)하는 공정과, 상기 도포층으로부터 용제를 증발시키는 공정을 포함하는 방법 등을 들 수 있다. 한편, (B) 방법에 있어서는, 도포층으로부터 용제를 증발시킨 후, 몰드로 압압할 수도 있다.
전사체로부터 용제를 증발시켜, 건조하는 온도는 통상 10∼300℃이고, 바람직하게는 50∼200℃의 범위이며, 압력은 통상 133Pa로부터 대기압의 범위이고, 더욱이 건조 시간은 통상 10분∼120시간이며, 바람직하게는 30분∼48시간의 범위에서 실시할 수 있다. 또한, 건조 온도, 압력 및 시간은 각각의 설정에서 단계적으로 변화시켜도 된다.
본 발명에 있어서는, 용제를 증발시켜 몰드 상에 전사체를 형성시킨 후, 이 전사체를 박리함으로써, 기재가 얻어진다. 전사체의 박리는, 유리전이온도 이하의 온도에서 행하는 것이 바람직하고, 더욱이, (유리전이온도-20℃) 이하의 온도에서 박리하는 것이 보다 바람직하다. 이것에 의해 전사체에 형성된 패턴 형상을 정밀도 좋게 보지하고, 용이하게 박리할 수 있다. 박리의 방법은, 몰드로부터 박리에 의해 이형해도, 또는 몰드와 전사체를 예를 들어 물 등의 매체와 침지나 스프레이 등의 방법으로 접촉시킨 후에 표면 장력을 이용하여 박리할 수 있다. 또한, 전사체 배면에 수지재, 또는 유리 등의 무기재를 첩부하고 해당 기판을 지지체에서 박리해도 된다.
또한, 본 발명의 요철 구조가 형성된 기재는, 화학식(1)로 표시되는 구조 단위를 함유하는 불소 함유 환상 올레핀 폴리머 또는 불소 함유 환상 올레핀 폴리머 조성물로 이루어지는 필름을, 몰드의 패턴면과 접촉시켜 압압하는 것에 의해 몰드의 패턴을 가열 또는 UV 경화 전사시키는 것에 의해 얻을 수도 있다.
예를 들어, 필름에 유리전이온도 이상으로 가열한 몰드를 압착하는 방법, 또는, 필름을 유리전이온도 이상으로 가열하여 몰드를 압착시키는 방법, 또는, 필름 및 몰드를 유리전이온도 이상으로 가열하여, 몰드를 압착하는 방법이 바람직하고, 가열 온도는, 유리전이온도∼(유리전이온도+100℃)의 범위이고, 바람직하게는, (유리전이온도+5℃)∼(유리전이온도+50℃)이며, 또한, 압착 압력은, 통상 1MPa∼100MPa이고, 바람직하게는 1MPa∼60MPa의 범위이다. 이것에 의해, 전사체에 형성된 패턴 형상을 정밀도 좋게 형성할 수 있다.
압착에 의해 몰드 상에 형성시킨 전사체의 박리는, 유리전이온도 이하의 온도에서 행하는 것이 바람직하고, 더욱이, (유리전이온도-20℃) 이하의 온도에서 박리하는 것이 보다 바람직하다. 이것에 의해 전사체에 형성된 패턴 형상을 정밀도 좋게 보지하고, 용이하게 이탈할 수 있다. 박리의 방법은, 몰드로부터 박리에 의해 박리해도, 또는, 몰드와 전사체를 예를 들어 물 등의 매체와 침지나 스프레이 등의 방법으로 접촉시킨 후에 표면 장력을 이용하여 박리할 수 있다. 또한, 전사체 배면에 수지재, 또는 유리 등의 무기재를 첩부하고 해당 기판을 지지체에서 박리해도 된다.
더욱이, 용융 성형법에 의해 요철 구조를 형성한 기재가 되는 필름을 제작하는 방법을 들 수 있다. 용융 성형법으로 필름 제조하는 방법으로서는, 상기에 예시한 불소 함유 환상 올레핀 폴리머를 용융 혼련기를 이용하여 T 다이를 거쳐 필름화하는 방법을 들 수 있다. T 다이에 의한 용융 압출 필름 제조에 있어서는, 예를 들어, 필요에 따라서 첨가제를 배합한 환상 올레핀 폴리머를 압출기에 투입하고, 유리전이온도보다도 바람직하게는 50℃∼200℃ 높은 온도, 보다 바람직하게는 80℃∼150℃ 높은 온도에서 용융 혼련하고, T 다이로부터 압출하고, 냉각 롤로 보내면서 폴리머의 유리전이온도 이상으로 가열한 표면에 미세한 패턴을 갖는 롤 형상의 몰드를 필름에 꽉 누름으로써 요철 구조를 형성한 필름으로 가공한다. 이 때의, 표면에 미세한 패턴을 갖는 롤의 가열 온도는, 전술한 필름과 몰드를 가열 압착하는 것에 의해 요철 구조를 형성할 때의 가열 온도와 동일한 범위에서 이용된다. 또한, 본 발명의 효과를 해치지 않는 범위에서, 자외선 흡수제, 산화 방지제, 난연제, 대전 방지제, 착색제 등의 첨가제를 첨가해도 된다.
본 발명에 있어서, 예를 들어, 불소 함유 환상 올레핀 폴리머 또는 불소 함유 환상 올레핀 폴리머 조성물을 이용하여 제작되는 필름 기재의 막 두께는, 1∼10000μm인 것이 바람직하고, 5∼5000μm인 것이 보다 바람직하고, 10∼2000μm인 것이 특히 바람직하다. 이들은, 예를 들어, 배양 백, 배양 플레이트, 배양 샬레 등의 세포 배양에 이용되는 의료 기구를 제작하는 관점에서 적합한 범위가 된다. 한편, 여기에서 말하는 기재의 막 두께는, 기재를 구성하는 필름의 막 두께이며, 이 막 두께는, 각 기구를 제작하는 프로세스나 기구의 용도에 맞추어 적절히 설정할 수 있다. 사출 성형 기재에 대해서는 특별히 제한은 없다.
본 발명의 불소 함유 환상 올레핀 폴리머 또는 불소 함유 환상 올레핀 폴리머 조성물을 이용한, 용액 캐스팅법, 가열 압착법 또는 용융 성형법으로 제조한 요철 구조를 형성한 필름이나 시트, 사출 성형물은, 히트 실링법이나, 접착제를 이용한 실링법, 용융 압출 또는 용융 성형 등에 의해, 예를 들어, 자루[袋], 튜브, 성형물 등의 형태의 의료 기구를 제조할 수 있다. 또한, 폴리스타이렌, 폴리에틸렌, 금속 등의 다른 재료로 제작된, 예를 들어 샬레, 멀티 웰 플레이트, 플라스크 등에, 본 방법으로 얻어진 필름, 시트, 또는 용융 성형물을 조합한 형태의 의료 기구를 제조할 수 있다.
본 발명의 불소 함유 환상 올레핀 폴리머 조성물은, 상기에 있어서 예시한 화학식(1)로 표시되는 구조 단위를 함유하는 불소 함유 환상 올레핀 폴리머와, 광경화성 화합물과, 광경화 개시제를 포함한다. 본 발명에 의하면, 이와 같은 불소 함유 환상 올레핀 폴리머 조성물을 이용하여, 의료 기구에 있어서의, 기재의 요철 구조를 갖는 일면을 형성할 수 있다.
이것에 의해, 몰드의 형상이나 사이즈를 정밀도 좋게 전사하면서, 각종 부재와의 강고한 밀착성을 발현하면서, 세포 배양 백, 또는 플레이트 등의 각종 배양 기구의 특성 등을 개질할 수 있어, 세포의 접착, 또는 부착을 억제하면서 증식시키는 것이 가능한 의료 기구를 제공할 수 있다.
더욱이, 본 발명에 있어서의 불소 함유 환상 올레핀 폴리머 조성물은, 예를 들어 불소 함유 환상 올레핀 폴리머를 임의의 농도로 광경화성 화합물과, 광경화 개시제와 혼합함으로써 얻어진다.
불소 함유 환상 올레핀 폴리머 조성물을 조제할 때에 이용하는 유기 용제는, 특별히 제한은 없지만, 예를 들어 메타자일렌 헥사플루오라이드, 벤조트라이플루오라이드, 플루오로벤젠, 다이플루오로벤젠, 헥사플루오로벤젠, 트라이플루오로메틸 벤젠, 비스(트라이플루오로메틸)벤젠 등의 불소 함유 방향족 탄화수소류; 퍼플루오로헥세인, 퍼플루오로옥테인 등의 불소 함유 지방족 탄화수소류; 퍼플루오로사이클로 데칼린 등의 불소 함유 지방족 환상 탄화수소류; 퍼플루오로-2-뷰틸테트라하이드로퓨란 등의 불소 함유 에터류, 클로로폼, 클로로벤젠, 트라이클로로벤젠 등의 할로젠화 탄화수소류; 테트라하이드로퓨란, 다이뷰틸 에터, 1,2-다이메톡시에테인, 다이옥세인, 프로필렌 글리콜 모노메틸 에터, 다이프로필렌 글리콜 모노메틸 에터, 프로필렌 글리콜 모노메틸 에터아세테이트 등의 에터류; 아세트산 에틸, 아세트산 프로필, 아세트산 뷰틸 등의 에스터류; 메틸 에틸 케톤, 메틸 아이소뷰틸 케톤, 사이클로헥산온 등의 케톤류; 메탄올, 에탄올, 아이소프로필알코올, 2-메톡시에탄올, 3-메톡시프로판올 등의 알코올류 등을 들 수 있다. 특히, 광경화성 화합물 그 자체를 조제 용제로서 이용할 수 있다.
이들 중에서, 특히, 제막성의 관점에서는, 대기압하에서 70℃ 이상의 비점을 갖는 용제가 바람직하다. 이것에 의해, 증발 속도가 지나치게 빨라지는 것을 확실히 억제할 수 있다. 이 때문에, 도포할 때에 부분적으로 용제가 마르기 시작해 버리는 등에 기인하여 막 두께 정밀도의 악화나 막 표면에 있어서의 얼룩이 생겨 버리는 것을, 확실히 억제할 수 있다.
한편, 불소 함유 환상 올레핀 폴리머 조성물에는, 필요에 따라서, 불소 함유 환상 올레핀 폴리머, 광경화성 화합물, 및 광경화 개시제 이외의 다른 공지의 성분을 첨가할 수도 있다. 이와 같은 성분으로서는, 예를 들어, 노화 방지제, 레벨링제, 젖음성 개량제, 계면활성제, 가소제 등의 개질제, 자외선 흡수제, 방부제, 항균제 등의 안정제, 광증감제, 실레인 커플링제 등을 들 수 있다.
본 발명의 불소 함유 환상 올레핀 폴리머 조성물에 있어서의 광경화성 화합물은, 불소 함유 환상 올레핀 폴리머와 광경화성 화합물의 질량비(불소 함유 환상 올레핀 폴리머/광경화성 화합물)는, 99.9/0.1∼50/50인 것이 바람직하고, 99.9/0.1∼55/45인 것이 보다 바람직하고, 99.9/0.1∼60/40인 것이 더 바람직하다. 광경화성 화합물로서는, 양이온 중합 가능한 개환 중합성 화합물, 반응성 이중 결합기를 갖는 화합물 등을 들 수 있다. 바람직하게는, 코팅하여 이용할 때의 경화 후의 체적 수축에 수반하는 기재의 변형의 억제나, 불소 함유 환상 올레핀 폴리머와의 상용성의 관점에서 양이온 중합 가능한 개환 중합성 화합물이 선택된다.
양이온 중합 가능한 개환 중합성 화합물 및 반응성 이중 결합기를 갖는 화합물은, 1분자 중에 반응성기를 1개 갖고 있어도 되고, 복수개 갖고 있어도 된다. 또한, 광경화성 화합물 중에는, 상이한 반응성기수의 화합물을 임의의 비율로 혼합하여 이용해도 된다. 더욱이, 광경화성 화합물로서 반응성 이중 결합기를 갖는 화합물과 양이온 중합 가능한 개환 중합성 화합물을 임의의 비율로 혼합한 것을 이용해도 된다. 이들에 의해, 본 발명의 불소 함유 환상 올레핀 폴리머 조성물로 몰드의 패턴을 치수 정밀도 좋게 전사하면서, 다른 재료로 이루어지는 부재와 치수 정밀도 좋게, 또한 강고하게 밀착시키는 것이 가능하게 된다. 또한, 본 발명의 효과를 발현 가능한 세포 배양, 또는 세포를 검사하기 위한 기재로서의 의료 기구를 적합하게 얻을 수 있다.
광경화성 화합물 중, 양이온 중합 가능한 개환 중합성 화합물로서는, 예를 들어, 사이클로헥센 에폭사이드, 다이사이클로펜타다이엔 옥사이드, 리모넨 다이옥사이드, 4-바이닐사이클로헥센 다이옥사이드, 3,4-에폭시사이클로헥실메틸-3',4'-에폭시사이클로헥세인 카복실레이트, 다이(3,4-에폭시사이클로헥실)아디페이트, (3,4-에폭시사이클로헥실)메틸알코올, (3,4-에폭시-6-메틸사이클로헥실)메틸-3,4-에폭시-6-메틸사이클로헥세인 카복실레이트, 에틸렌-1,2-다이(3,4-에폭시사이클로헥세인카복실산) 에스터, (3,4-에폭시사이클로헥실)에틸 트라이메톡시실레인, 페닐 글리시딜 에터, 다이사이클로헥실-3,3'-다이에폭사이드, 1,7-옥타다이엔 다이에폭사이드, 비스페놀 A형 에폭시 수지, 할로젠화 비스페놀 A형 에폭시 수지, 비스페놀 F형 에폭시 수지, o-, m-, p-크레졸 노볼락형 에폭시 수지, 페놀 노볼락형 에폭시 수지, 다가 알코올의 폴리글리시딜 에터, 3,4-에폭시사이클로헥센일메틸-3',4'-에폭시사이클로헥센 카복실레이트와 같은 지환식 에폭시 수지 또는 수첨 비스페놀 A의 글리시딜 에터 등의 에폭시 화합물 등의, 에폭시 화합물류를 들 수 있다.
더욱이, 3-메틸-3-(뷰톡시메틸)옥세테인, 3-메틸-3-(펜틸옥시메틸)옥세테인, 3-메틸-3-(헥실옥시메틸)옥세테인, 3-메틸-3-(2-에틸헥실옥시메틸)옥세테인, 3-메틸-3-(옥틸옥시메틸)옥세테인, 3-메틸-3-(데칸일옥시메틸)옥세테인, 3-메틸-3-(도데칸일옥시메틸)옥세테인, 3-메틸-3-(페녹시메틸)옥세테인, 3-에틸-3-(뷰톡시메틸)옥세테인, 3-에틸-3-(펜틸옥시메틸)옥세테인, 3-에틸-3-(헥실옥시메틸)옥세테인, 3-에틸-3-(2-에틸헥실옥시메틸)옥세테인, 3-에틸-3-(옥틸옥시메틸)옥세테인, 3-에틸-3-(데칸일옥시메틸)옥세테인, 3-에틸-3-(도데칸일옥시메틸)옥세테인, 3-(사이클로헥실옥시메틸)옥세테인, 3-메틸-3-(사이클로헥실옥시메틸)옥세테인, 3-에틸-3-(사이클로헥실옥시메틸)옥세테인, 3-에틸-3-(페녹시메틸)옥세테인, 3,3-다이메틸옥세테인, 3-하이드록시메틸옥세테인, 3-메틸-3-하이드록시메틸옥세테인, 3-에틸-3-하이드록시메틸옥세테인, 3-에틸-3-페노키시메틸옥세테인, 3-n-프로필-3-하이드록시메틸옥세테인, 3-아이소프로필-3-하이드록시메틸옥세테인, 3-n-뷰틸-3-하이드록시메틸옥세테인, 3-아이소뷰틸-3-하이드록시메틸옥세테인, 3-sec-뷰틸-3-하이드록시메틸옥세테인, 3-tert-뷰틸-3-하이드록시메틸옥세테인, 3-에틸-3-(2-에틸헥실)옥세테인 등,
그 외, 옥세탄일기를 2개 이상 갖는 화합물로서 비스(3-에틸-3-옥세탄일메틸)에터(3-에틸-3{[(3-에틸옥세탄-3-일)메톡시]메틸}옥세테인), 1,2-비스[(3-에틸-3-옥세탄일메톡시)]에테인, 1,3-비스[(3-에틸-3-옥세탄일메톡시)]프로페인, 1,3-비스[(3-에틸-3-옥세탄일메톡시)]-2,2-다이메틸-프로페인, 1,4-비스(3-에틸-3-옥세탄일메톡시)뷰테인, 1,6-비스(3-에틸-3-옥세탄일메톡시)헥세인, 1,4-비스[(3-메틸-3-옥세탄일)메톡시]벤젠, 1,3-비스[(3-메틸-3-옥세탄일)메톡시]벤젠, 1,4-비스{[(3-메틸-3-옥세탄일)메톡시]메틸}벤젠, 1,4-비스{[(3-메틸-3-옥세탄일)메톡시]메틸}사이클로헥세인, 4,4'-비스{[(3-메틸-3-옥세탄일)메톡시]메틸}바이페닐, 4,4'-비스{[(3-메틸-3-옥세탄일)메톡시]메틸}바이사이클로헥세인, 2,3-비스[(3-메틸-3-옥세탄일)메톡시]바이사이클로[2.2.1]헵테인, 2,5-비스[(3-메틸-3-옥세탄일)메톡시]바이사이클로[2.2.1]헵테인, 2,6-비스[(3-메틸-3-옥세탄일)메톡시]바이사이클로[2.2.1]헵테인, 1,4-비스[(3-에틸-3-옥세탄일)메톡시]벤젠, 1,3-비스[(3-에틸-3-옥세탄일)메톡시]벤젠, 1,4-비스{[(3-에틸-3-옥세탄일)메톡시]메틸}벤젠, 1,4-비스{[(3-에틸-3-옥세탄일)메톡시]메틸}사이클로헥세인, 4,4'-비스{[(3-에틸-3-옥세탄일)메톡시]메틸}바이페닐, 4,4'-비스{[(3-에틸-3-옥세탄일)메톡시]메틸}바이사이클로헥세인, 2,3-비스[(3-에틸-3-옥세탄일)메톡시]바이사이클로[2.2.1]헵테인, 2,5-비스[(3-에틸-3-옥세탄일)메톡시]바이사이클로[2.2.1]헵테인, 2,6-비스[(3-에틸-3-옥세탄일)메톡시]바이사이클로[2.2.1]헵테인 등의 옥세테인 화합물류를 들 수 있다. 이들은, 단독으로 이용해도, 2종 이상 조합으로 이용해도 된다.
또한, 광경화성 화합물 중, 반응성 이중 결합기를 갖는 화합물로서는, 예를 들어, 플루오로다이엔(CF2=CFOCF2CF2CF=CF2, CF2=CFOCF2CF(CF3)CF=CF2, CF2=CFCF2C(OH)(CF3)CH2CH=CH2, CF2=CFCF2C(OH)(CF3)CH=CH2, CF2=CFCF2C(CF3)(OCH2OCH3)CH2CH=CH2, CF2=CFCH2C(C(CF3)2OH)(CF3)CH2CH=CH2 등) 등의 올레핀류; 노보넨, 노보나다이엔 등의 환상 올레핀류; 사이클로헥실메틸 바이닐 에터, 아이소뷰틸 바이닐 에터, 사이클로헥실 바이닐 에터, 에틸 바이닐 에터 등의 알킬 바이닐 에터류; 아세트산 바이닐 등의 바이닐 에스터류; (메트)아크릴산, 페녹시에틸 아크릴레이트, 벤질 아크릴레이트, 스테아릴 아크릴레이트, 라우릴 아크릴레이트, 2-에틸헥실 아크릴레이트, 알릴 아크릴레이트, 1,3-뷰테인다이올 다이아크릴레이트, 1,4-뷰테인다이올 다이아크릴레이트, 1,6-헥세인다이올 다이아크릴레이트, 트라이메틸올프로페인 트라이아크릴레이트, 펜타에리트리톨 트라이아크릴레이트, 다이펜타에리트리톨 헥사아크릴레이트, 에톡시에틸 아크릴레이트, 메톡시에틸 아크릴레이트, 글리시딜 아크릴레이트, 테트라하이드로퍼퓨릴 아크릴레이트, 다이에틸렌 글리콜 다이아크릴레이트, 네오펜틸 글리콜 다이아크릴레이트, 폴리옥시에틸렌 글리콜 다이아크릴레이트, 트라이프로필렌 글리콜 다이아크릴레이트, 2-하이드록시에틸 아크릴레이트, 2-하이드록시프로필 아크릴레이트, 4-하이드록시뷰틸 바이닐 에터, N,N-다이에틸아미노에틸 아크릴레이트, N,N-다이메틸아미노에틸 아크릴레이트, N-바이닐피롤리돈, 다이메틸아미노에틸 메타크릴레이트 등의 (메트)아크릴산 및 그의 유도체 또는 그들의 불소 함유 아크릴레이트류 등을 들 수 있다. 이들은, 단독으로 이용해도, 2종 이상 조합으로 이용해도 된다.
본 발명의 상기 모노머를 경화시키기 위한 광경화 개시제로서는, 광의 조사에 의해 양이온을 생성하는 광양이온 개시제, 광의 조사에 의해 라디칼을 생성하는 광라디칼 개시제 등을 들 수 있다. 광경화 개시제의 사용량은, 광경화성 화합물 100질량부에 대해서 0.05질량부 이상인 것이 바람직하고, 0.1∼10질량부인 것이 보다 바람직하다.
광경화 개시제 중, 광의 조사에 의해 양이온을 생성하는 광양이온 개시제로서는, 광 조사에 의해, 상기 양이온 중합 가능한 개환 중합성 화합물류의 양이온 중합을 개시시키는 화합물이면 특별히 한정은 없지만, 예를 들어, 오늄 양이온과 짝을 이루는 음이온과의 오늄염과 같이 광반응하여 루이스산을 방출하는 화합물이 바람직하다.
오늄 양이온의 구체예로서는, 다이페닐아이오도늄, 4-메톡시다이페닐아이오도늄, 비스(4-메틸페닐)아이오도늄, 비스(4-tert-뷰틸페닐)아이오도늄, 비스(도데실페닐)아이오도늄, 트라이페닐설포늄, 다이페닐-4-싸이오페녹시페닐설포늄, 비스〔4-(다이페닐설포니오)-페닐〕설파이드, 비스〔4-(다이(4-(2-하이드록시에틸)페닐)설포니오)-페닐〕설파이드, η5-2,4-(사이클로펜타다이엔일)〔1,2,3,4,5,6-η-(메틸에틸)벤젠〕-철(1+) 등을 들 수 있다. 또한, 오늄 양이온 이외에, 과염소산 이온, 트라이플루오로메테인설폰산 이온, 톨루엔설폰산 이온, 트라이나이트로톨루엔설폰산 이온 등을 들 수 있다. 또한, 이들 광양이온 개시제는, 단독으로 이용해도, 2종 이상 조합하여 이용해도 된다.
한편, 음이온의 구체예로서는, 테트라플루오로보레이트, 헥사플루오로포스페이트, 헥사플루오로안티모네이트, 헥사플루오로아르세네이트, 헥사클로로안티모네이트, 테트라(플루오로페닐)보레이트, 테트라(다이플루오로페닐)보레이트, 테트라(트라이플루오로페닐)보레이트, 테트라(테트라플루오로페닐)보레이트, 테트라(펜타플루오로페닐)보레이트, 테트라(퍼플루오로페닐)보레이트, 테트라(트라이플루오로메틸페닐)보레이트, 테트라[다이(트라이플루오로메틸)페닐)]보레이트 등을 들 수 있다. 또한, 이들 광양이온 개시제는, 단독으로 이용해도, 2종 이상 조합하여 이용해도 된다.
더 바람직하게 이용되는 광양이온 개시제의 구체예로서는, 예를 들어, 이르가큐어 250(BASF사제), 이르가큐어 290(BASF사제), 이르가큐어 784(BASF사제), 에사큐어 1064(람베르티사제), WPI-124(와코준야쿠공업사제), CYRAURE UVI6990(유니온 카바이트 닛폰사제), CPI-100P(산아프로사제), PHOTOINITIATOR2074(솔베이재팬사제), 아데카옵토머 SP-172(ADEKA사제), 아데카옵토머 SP-170(ADEKA사제), 아데카옵토머 SP-152(ADEKA사제), 아데카옵토머 SP-150(ADEKA사제) 등을 들 수 있다. 또한, 이들 광양이온 개시제는, 단독으로 이용해도, 2종류 이상 조합하여 이용해도 된다.
또한, 광경화 개시제 중, 광의 조사에 의해 라디칼을 생성하는 광라디칼 개시제로서는, 예를 들어, 아세토페논, p-tert-뷰틸트라이클로로아세토페논, 클로로아세토페논, 2,2-다이에톡시아세토페논, 하이드록시아세토페논, 2,2-다이메톡시-2'-페닐아세토페논, 2-아미노아세토페논, 다이알킬아미노아세토페논 등의 아세토페논류; 벤조인, 벤조인 메틸 에터, 벤조인 에틸 에터, 벤조인 아이소프로필 에터, 벤조인 아이소뷰틸 에터, 1-하이드록시사이클로헥실 페닐 케톤, 2-하이드록시-2-메틸-1-페닐-2-메틸프로판-1-온, 1-(4-아이소프로필페닐)-2-하이드록시-2-메틸프로판-1-온 등의 벤조인류; 벤조페논, 벤조일벤조산, 벤조일벤조산 메틸, 메틸-o-벤조일벤조에이트, 4-페닐벤조페논, 하이드록시벤조페논, 하이드록시프로필벤조페논, 아크릴벤조페논, 4,4'-비스(다이메틸아미노)벤조페논 등의 벤조페논류; 싸이옥산톤, 2-클로로싸이옥산톤, 2-메틸싸이옥산톤, 다이에틸싸이옥산톤, 다이메틸싸이옥산톤 등의 싸이옥산톤류; 퍼플루오로(tert-뷰틸퍼옥사이드), 퍼플루오로벤조일퍼옥사이드 등의 불소계 퍼옥사이드류; 그 외, α-아실 옥심 에스터, 벤질-(o-에톡시카보닐)-α-모노옥심, 아실 포스핀 옥사이드, 글리옥시 에스터, 3-케토쿠마린, 2-에틸 안트라퀴논, 캠퍼 퀴논, 테트라메틸 티우람 설파이드, 아조비스아이소뷰티로나이트릴, 벤조일 퍼옥사이드, 다이알킬 퍼옥사이드, tert-뷰틸 퍼옥시피발레이트 등을 들 수 있다.
더 바람직하게 이용되는 광라디칼 개시제의 구체예로서는, 예를 들어, 이르가큐어 651(BASF사제), 이르가큐어 184(BASF사제), 다로큐어 1173(BASF사제), 벤조페논, 4-페닐벤조페논, 이르가큐어 500(BASF사제), 이르가큐어 2959(BASF사제), 이르가큐어 127(BASF사제), 이르가큐어 907(BASF사제), 이르가큐어 369(BASF사제), 이르가큐어 1300(BASF사제), 이르가큐어 819(BASF사제), 이르가큐어 1800(BASF사제), 다로큐어 TPO(BASF사제), 다로큐어 4265(BASF사제), 이르가큐어 OXE01(BASF사제), 이르가큐어 OXE02(BASF사제), 에사큐어 KT55(람베르티사제), 에사큐어 KIP150(람베르티사제), 에사큐어 KIP100F(람베르티사제), 에사큐어 KT37(람베르티사제), 에사큐어 KTO46(람베르티사제), 에사큐어 1001M(람베르티사제), 에사큐어 KIP/EM(람베르티사제), 에사큐어 DP250(람베르티사제), 에사큐어 KB1(람베르티사제), 2,4-다이에틸싸이옥산톤을 들 수 있다. 이들 중에서, 더 바람직하게 이용되는 광라디칼 중합 개시제로서는, 이르가큐어 184(BASF사제), 다로큐어 1173(BASF사제), 이르가큐어 500(BASF사제), 이르가큐어 819(BASF사제), 다로큐어 TPO(BASF사제), 에사큐어 KIP100F(람베르티사제), 에사큐어 KT37(람베르티사제) 및 에사큐어 KTO46(람베르티사제)을 들 수 있다. 또한, 이들 광라디칼 개시제는, 단독으로 이용해도, 2종 이상 조합하여 이용해도 된다.
더욱이, 필요에 따라서 제 3 성분으로서 다른 공지의 성분, 예를 들어, 노화 방지제, 레벨링제, 젖음성 개량제, 계면활성제, 가소제 등의 개질제, 자외선 흡수제, 방부제, 항균제 등의 안정제, 광증감제, 실레인 커플링제 등을 가해도 된다.
본 발명의 불소 함유 환상 올레핀 폴리머 조성물은 경화 후의 형태로, 광경화성 화합물이 3차원의 그물코 구조를 형성할 수 있어 표면 경도를 딱딱하게 개질할 수 있다. 이 때문에, 의료 기구 등에 실장한 경우의 흠집성을 개선할 수 있어, 세포 배양이나 세포의 검사를 위한 기재로서 이용할 때에, 편리성 좋게 사용할 수 있다.
본 발명의 광경화성 조성물은, 전술한 본 발명의 화학식(1)로 표시되는 불소 함유 환상 올레핀 폴리머 바니시와 마찬가지로 여과 정제할 수 있다.
다음에, 상기의 화학식(1)로 표시되는 구조 단위를 함유하는 불소 함유 환상 올레핀 폴리머와, 광경화성 화합물과, 광경화 개시제를 포함하는 광경화성 조성물로 이루어지는 바니시를 이용하여 기재의 요철 구조를 형성하는 방법은, 전술한 불소 함유 환상 올레핀 폴리머 바니시와 마찬가지의 도포 공정을 거친 후에, UV 조사 경화하는 것에 의해 몰드의 패턴을 전사하는 것에 의해 얻을 수 있다.
UV 조사 경화의 UV 조사 공정은, 멸균을 겸해도 되지만, 조사광으로서는, 광경화 개시제에 광을 조사하는 것에 의해 라디칼 반응 또는 이온 반응을 야기하는 에너지를 부여할 수 있으면 특별히 한정되는 것은 아니다. 이 광원으로서는, 파장 400nm 이하의 광선, 예를 들어, 저압 수은등, 중압 수은등, 고압 수은등, 초고압 수은등, 케미컬 램프, 블랙 라이트 램프, 마이크로웨이브 여기 수은등 및 메탈 할라이드 램프, i선, G선, KrF 엑시머 레이저광, ArF 엑시머 레이저광을 이용할 수 있다.
불소 함유 환상 올레핀 폴리머 조성물로 이루어지는 상기 필름에 대한 조사 강도는, 목적으로 하는 제품마다 제어되는 것이며 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 광경화 개시제의 활성화에 유효한 광파장 영역(광경화 개시제에 따라 상이하지만, 예를 들어 300∼420nm의 광이 이용된다)의 광조사 강도가 0.1∼100mW/cm2인 것이 바람직하다. 조사 강도를 0.1mW/cm2 이상으로 하는 것에 의해, 반응 시간이 지나치게 길어지는 것을 확실히 억제할 수 있다. 한편으로, 조사 강도를 100mW/cm2 이하로 하는 것에 의해, 램프로부터 복사되는 열 및 조성물의 중합 시의 발열에 기인하여 얻어지는 경화물의 응집력의 저하나 황변 또는 지지체의 열화가 생기는 것을, 보다 확실히 억제하는 것이 가능해진다.
이 광의 조사 시간은, 목적으로 하는 제품마다 제어되는 것이며 특별히 한정되는 것은 아니지만, 광파장 영역에서의 광조사 강도와 광조사 시간의 곱으로 표시되는 적산 광량을, 예를 들어 3∼1000mJ/cm2로 설정할 수 있다. 더욱 바람직하게는 5∼500mJ/cm2이며, 특히 바람직하게는 10∼300mJ/cm2이다. 적산 광량을 상기 하한치 이상으로 하는 것에 의해, 광중합 개시제로부터의 활성종의 발생을 충분한 것으로 하여, 얻어지는 경화물의 특성의 향상을 도모할 수 있다. 한편으로, 적산 광량을 상기 상한치 이하로 하는 것에 의해, 생산성 향상에 기여할 수 있다. 또한, 중합 반응을 촉진하기 위해서 가열을 병용하는 것도 경우에 따라서는 바람직하다. 또한, 광을 조사하여 경화성 수지를 경화시키는 경우의 온도는, 통상 0∼150℃가 바람직하고, 0∼60℃가 보다 바람직하다.
필름이나 시트상의 단층막으로 이루어지는 기재를 얻는 경우에는, 예를 들어 몰드로부터 필름을 박리시키는 것에 의해 기재를 제조할 수 있다. 지지체로부터의 필름의 박리는, 예를 들어, 필름의 단부에 시판의 테이프를 첩부하고, 이것에 응력을 가하여 박리하는 것에 의해 행해도 되고, 물이나 용제 등의 액체를 필름과 지지체의 접촉 계면에 접촉시켜 지지체 표면과 필름의 접촉면의 표면 장력의 차를 이용하여 필름을 박리하는 것에 의해 행해도 된다.
플라스틱이나 금속 등의 지지체 상에 요철 구조를 형성한 코팅막을 형성한 기재를 얻는 경우에는, 예를 들어 상기 공정 중 도포막의 건조 공정까지를 실시하여, 지지체 상에 불소 함유 환상 올레핀 폴리머 조성물을 코팅한다. 그 다음에, 몰드의 패턴면과 불소 함유 환상 올레핀 폴리머 조성물의 코팅면을 접촉시키고, 필요에 따라 압착하고, UV 조사, 박리하는 것에 의해 지지체 상에 본 발명의 불소 함유 환상 올레핀 폴리머 조성물로 이루어지는 요철 구조를 형성한 코팅막을 형성한 기재를 제조할 수 있다. 이 경우, 지지체는, 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET), 아크릴 수지 등의 유기 재료, 또는 유리, 실리콘, 알루미늄 등의 무기 재료로부터 선택되는 것이 특히 바람직하다.
몰드의 패턴면과 불소 함유 환상 올레핀 폴리머 조성물의 코팅면을 접촉시킬 때의 압력은, 0.01∼5MPa, 바람직하게는 0.05∼4MPa, 보다 바람직하게는 0.1∼3MPa의 범위로 이용되고, 압착하면서 UV 조사해도, 라미네이터 등의 압착 장치를 이용하여 압착한 후에 UV 조사해도 된다. 이것에 의해, 패턴의 형상, 사이즈에 의존하지 않고, 몰드의 패턴을 높은 정밀도로 전사한 기재를 제작할 수 있다.
본 발명에 있어서의 불소 함유 환상 올레핀 폴리머 조성물을 플라스틱 또는 금속으로 이루어지는 지지체에 제막하고, 가열하고, 필요에 따라 압착한 후에, 광을 조사하여 경화시켜 얻어지는 경화막 필름의 막 두께는, 특별히 제한은 없지만, 바람직하게는 1μm∼10000μm이고, 보다 바람직하게는 5μm∼5000μm이며, 더 바람직하게는 10μm∼2000μm이다. 이들 범위이면, 자립한 단층 필름이나, 지지체 상의 코팅막을 얻을 수 있다. 또한, 본 발명의 불소 함유 환상 올레핀 폴리머 조성물은, 광경화 시의 체적 수축이 작아, 정밀도 좋게 패턴을 전사하면서 기재의 변형을 확실히 억제할 수도 있다. 또한, 예를 들어, 배양 백, 배양 플레이트, 배양 샬레 등의 세포 배양에 이용되는 의료 기구를 제작하는 관점에서 적합한 범위가 된다. 더욱이, 필름의 막 두께는, 그들 기구를 제작하는 프로세스에 맞추어 적절히 설정할 수 있다.
본 발명의 불소 함유 환상 올레핀 폴리머, 또는 불소 함유 환상 올레핀 폴리머 조성물로부터 상기의 방법으로 제작한 요철 구조를 갖는 기재에 있어서, 몰드로부터 박리 후의 기재를 가열하여 용융 유동시킴으로써, 예를 들어, 볼록부의 정점으로부터 오목부 저면으로 향해 경사 구조를 가지는 형상으로 요철 구조를 변화시켜도 된다. 이것에 의해, 파종한 세포를 효과적으로 오목부 저면에 집합시킨 상태로 세포 배양할 수 있어, 배양 후의 형상으로서 세포로부터의 배양 세포가 균일한 두께인 세포 시트, 스페로이드 또는 콜로니 등의 성장 세포의 군체를 제작할 수 있다.
(세포 배양 방법)
본 발명에 있어서의 세포 배양 방법은, 본 발명에 있어서의 의료 기구를 구성하는 기재의 요철 구조를 형성한 일면에, 접촉 또는 보지시키도록 세포를 파종하는 공정과, 상기 세포를 배양하여 배양 세포를 얻는 공정과, 상기 일면 상에 인산 완충 생리 식염수 등의 완충액을 첨가하여, 상기 일면으로부터 상기 배양 세포를 부유시키는 공정을 구비한다. 이것에 의해, 배양 세포를 손상 없이 기재로부터 이탈시킬 수 있고, 또한 효율적인 증식으로 세포 배양할 수 있다.
본 발명에 있어서는, 세포 배양의 형태로서 의료 기구 내에 세포를 파종한 후, 정치한 상태로 부유 세포를 배양할 수 있다. 보다 구체적으로는, 본 발명의 세포 배양으로서는, 세포로서 군체를 형성시키면서 부유 증식시킬 수 있다.
이는, 기재의 세포를 접촉 또는 보지하는 일면이 본 발명에 있어서의 수접촉각이 70°이상의 소수인 표면 성상을 갖는 불소 함유 환상 올레핀 폴리머, 또는 불소 함유 환상 올레핀 폴리머 조성물에 의해 구성되어 있는 것에 의해 실현된다. 또한, 배양 환경을 일정하게 유지하기 위해서, 파종한 후에 태핑에 의해 기포를 빼도 되고, 세포의 형태나 증식성을 고려하여 진동을 주어 배양해도 되고, 배양액을 유동시키면서 배양해도 되고, 교반하면서 배양해도 되고, 특별히 제한은 없다. 이들 중에서, 세포의 특성, 장치의 형태, 생산성을 고려하여 적합하게 선택된다. 어느 형태여도, 본 발명에 있어서의 의료 기구로 세포를 배양하는 것에 의해, 세포를 배양 기구에 부착, 또는 밀착을 억제하면서, 세포 시트, 스페로이드, 콜로니 등의 군체를 형성시키면서 증식시킬 수 있다.
배양 방법은, 본 발명에 있어서의 기재를 각종 배양 방법에 따른 용기로 가공한 의료 기구를 이용하여 행해진다. 예를 들어, 정치 배양, 회전 배양, 마이크로캐리어 배양, 선회 배양, 스페로이드 배양, 겔내 배양, 삼차원 담체 배양, 가압 순환 배양 등의 방법으로 세포 배양을 실시할 수 있다. 이들 중, 세포의 특성, 배양 형태, 또는 생산성을 고려하여 적합하게 선택되고, 단독으로 이용해도 2종류 이상을 병용해도 된다.
이들 각종 배양 방법에 있어서의 온도는, 35∼40℃인 것이 바람직하고, 36∼38℃인 것이 보다 바람직하고, 36.5∼37.5℃인 것이 특히 바람직하다. 또한, 압력은, 0.02∼0.5MPa인 것이 바람직하고, 0.05∼0.3MPa인 것이 보다 바람직하고, 0.08∼0.2MPa인 것이 특히 바람직하다. 더욱이, 수소이온지수(pH)는, 8∼6인 것이 바람직하고, 7.5∼6.5인 것이 보다 바람직하다.
본 발명에 있어서의 의료 기구를 배양 기구로서 이용할 때의 멸균 방법으로서는, 예를 들어, 알코올 등에 침지하는 습식 멸균, 에틸렌 옥사이드에 의한 가스 멸균, 자외선 멸균, 방사선 멸균, 고온, 고압의 수증기에 의한 오토클레이브 멸균, 직접 증기에 접해서는 안 되는 것에 이용하는 건열 멸균, 열에 불안정한 성분을 포함하는 기재에 적절한 여과 멸균 등을 들 수 있다. 이들 중에서, 본 발명의 효과를 해치지 않는 범위에서 프로세스 적합성을 고려하여 적합하게 선택되고, 2종류 이상의 멸균 방법을 조합하여 이용해도 된다.
또한, 배양에 이용하는 배지의 종류로서는, 액상, 겔상, 고형(분말) 등의 형태에 상관없이, 세포의 특성, 배양 형태에 따라 선택할 수 있다. 이 예로서, 예를 들어, BME 배지, MEM 배지, DMEM 배지, 199 배지, RPMI 배지, 햄 F10 배지, 햄 F12 배지, MCDB104, 107, 131, 151, 170, 202 배지, RITC80-7 배지, MCDB153 배지 등을 들 수 있다. 이들은, 단독으로 이용해도, 2종류 이상을 혼합하여 이용해도 되고, 또한 인간, 개, 래트, 마우스, 새, 돼지, 소 등의 생물 유래의 혈청과 혼합하여 이용해도 된다.
또한, 세포 배양의 목적에 따라 본 발명의 효과를 해치지 않는 범위에서, 예를 들어, 라미닌-5, 라미닌-511, 라미닌-521 등의 콜라겐, 본 발명의 불소 함유 환상 올레핀 폴리머, 또는 불소 함유 환상 올레핀 폴리머 조성물 등을, 본 발명의 상기 기재의 내벽이나, 세포를 접촉 또는 보지하는 일면의 일부, 또는 전면에 도공하여 이용해도 된다. 이들은 단독, 또는 2종류 이상을 혼합하여 이용해도 된다. 또한, 본 발명에 있어서, 세포의 종류, 배양 세포의 응용에 따라, 세포의 배양액이나 완충액을 선택할 수 있고, 형광 색소나 세포의 고정화 시약도 자유롭게 선택하여 이용해도 된다.
더욱이, 배양, 또는 배양한 세포를 부유시켜 기재로부터 이탈시킬 때에 이용하는 인산 완충 생리 식염수 등의 완충액은, 세포가 증식하는 과정에 있어서, 계내의 수소이온지수(pH)를 변화시키지 않는 것이면 되고, 통상은, 예를 들어, 인산 완충 생리 식염수, 인산 완충액, 염산 완충액, 아세트산 완충액, 시트르산 완충액, 붕산 완충액, 타르타르산 완충액, 트리스 완충액, 트리스염산 완충액, 에틸렌다이아민 사아세트산 완충액, 트리스 EDTA 완충액, 트리스아세트산 EDTA 완충액, 트리스붕산 EDTA 완충액, 농축 SSC 완충액, 농축 SSPE 완충액, 시트르산 나트륨 완충액, 탄산 중탄산 완충액, 붕산 나트륨 완충액, 말레산 완충액, CABS 완충액, 피페리딘 완충액, 글리신 완충액, 말산 완충액, 폼산 완충액, 석신산 완충액, 아세트산 완충액, 프로피온산 완충액, 피페라진 완충액, 피리딘 완충액, 카코딜산 완충액, MES 완충액, 히스티딘 완충액, 에탄올아민 완충액, ADA 완충액, 탄산 완충액, ACES 완충액, PIPES 완충액, 이미다졸 완충액, 비스-트리스프로페인 완충액, BES 완충액, MOPS 완충액, HEPES 완충액, TES 완충액, MOPSO 완충액, MOBS 완충액, DIPSO 완충액, TAPSO 완충액, TEA 완충액, 피로인산 완충액, HEPPSO 완충액, POPSO 완충액, 트리신 완충액, 하이드라진 완충액, 글리실 글리신 완충액, EPPS 완충액, 바이신 완충액, HEPBS 완충액, TAPS 완충액, AMPD 완충액, TABS 완충액, AMPSO 완충액, 타우린 완충액, CHES 완충액, 글리신 완충액, 수산화암모늄 완충액, CAPSO 완충액, 메틸아민 완충액, CAPS 완충액 등을 단독 또는 트립신, 펩신, 레닛, 키모트립신, 엘라스타제, NADPH 데하이드로제나제, 또는 NADH 데하이드로제나제 등의 효소를 함유시켜 이용해도 되고, 바람직하게는, 인산 완충액, 인산 완충 생리 식염수, 염산 완충액, 아세트산 완충액, 시트르산 완충액, 붕산 완충액, 타르타르산 완충액, 트리스 완충액, 트리스염산 완충액, 에틸렌다이아민 사아세트산 완충액, 트리스 EDTA 완충액, 트리스아세트산 EDTA 완충액, 트리스붕산 EDTA 완충액, 농축 SSC 완충액, 농축 SSPE 완충액, 시트르산 나트륨 완충액, 탄산 중탄산 완충액, 붕산 나트륨 완충액, 말레산 완충액 등을 단독 또는 트립신, 펩신, 레닛, 키모트립신, 엘라스타제, NADPH 데하이드로제나제 또는 NADH 데하이드로제나제 등의 효소를 함유시켜 이용해도 된다.
더 바람직하게는, 인산 완충액, 인산 완충 생리 식염수, 트리스염산 완충액, 에틸렌다이아민 사아세트산 완충액, 트리스 EDTA 완충액, 트리스아세트산 EDTA 완충액, 트리스붕산 EDTA 완충액, 농축 SSC 완충액, 농축 SSPE 완충액, 시트르산 나트륨 완충액, 탄산 중탄산 완충액, 붕산 나트륨 완충액 등을 단독 또는 트립신, 펩신, 레닛, 키모트립신, 엘라스타제, NADPH 데하이드로제나제 또는 NADH 데하이드로제나제 등의 효소를 함유시켜 이용해도 된다.
본 발명의 의료 기구를 이용하여, 예를 들어 인간 세포를 포함하는 동물의 세포를 배양하고, 세포를 분리하여 채취하는 과정에 있어서, 예를 들어, 인산 완충 생리 식염수 등의 완충액을 첨가하면, 세포가 자연히 부유한 상태로 기재로부터 용이하게 이탈하는 방법을 발명했다.
본 발명에 의하면, 세포의 부유 이탈은, 예를 들어, 배양한 세포와 기재의 계면 상태를 관찰함으로써, 부유, 또는 접착의 현상을 이해할 수 있다. 통상의 스페로이드 배양에 이용되는 기재의 표면에서 보여지는 세포의 토대가 되는 미세한 요철 구조를 설치한 본 발명의 화학식(1)로 이루어지는 기재 상에서, 세포를 7일간 배양하고, 배양 세포와 기재의 계면을 주사형 전자현미경으로 관찰하면, 토대 형성에 필요한 충분히 작은 직경의 요철 구조를 설치한 기재 상에서 증식한 세포여도, 그 계면에 세포로부터 뻗은 발[anchor]은 관찰되지 않고, 또한, 본 배양 용기에서 배양한 세포에, 예를 들어, 인산 완충 생리 식염수와 같은 완충액을 첨가하면 세포는 부유하면서 기재로부터 이탈시킬 수 있다.
본 발명의 불소 함유 환상 올레핀 폴리머, 또는 불소 함유 환상 올레핀 폴리머 조성물로 이루어지는 의료 기구를 이용하여 세포 배양하는 것에 의해, 세포는 부유하여 세포 시트, 스페로이드, 콜로니 등의 군체를 형성하면서 효율적으로 증식하고, 증식한 성장 세포는 부유시켜 세포를 손상시키지 않고 기재로부터 이탈할 수 있다고 하는 우수한 세포 배양 방법을 실현할 수 있게 되었다.
실시예
이하, 실시예에 있어서 본 발명을 설명하지만, 본 발명은 이들 예에 의해 전혀 한정되는 것은 아니다. 한편, 실시예에 있어서의 폴리머 분석치 측정 방법, 기재(필름)의 제작 조건 및 분석 방법, 세포의 취급 방법, 배양 기구의 멸균 방법 및 배양 평가 방법은 이하에 기재된 바와 같다.
[중량 평균 분자량(Mw), 분자량 분포(Mw/Mn)]
하기의 조건하에서 겔 퍼미에이션 크로마토그래피(GPC)를 사용하여, 테트라하이드로퓨란(THF) 또는 트라이플루오로톨루엔(TFT)에 용해한 폴리머의 중량 평균 분자량(Mw) 및 수 평균 분자량(Mn)을, 폴리스타이렌 스탠다드에 의해 분자량을 교정하여 측정했다.
검출기: 닛폰분광사제 RI-2031 및 875-UV 또는 Viscotec사제 Model 270, 직렬 연결 컬럼: Shodex K-806M, 804, 803, 802.5, 컬럼 온도: 40℃, 유량: 1.0ml/분, 시료 농도: 3.0∼9.0mg/ml
[유리전이온도]
시마즈제작소사제 DSC-50을 이용하여 측정 시료를 질소 분위기하에서 10℃/분의 승온 속도로 가열하여 측정했다.
[수접촉각 측정]
교와계면과학사제 고체 표면 에너지 해석 장치 CA-XE형을 사용하여 JIS R3257(기판 유리 표면의 젖음성 시험 방법)에 준거하여, 2μl의 수적을 기재 표면에 적하하고, 정적법에 의해, 기재 표면에 수적이 접촉하고 나서 1분 이내에 접촉각을 측정했다.
[UV 경화]
도포막의 경화에는 광원으로서 SCIVAX사제 UV 임프린트 장치(X-100U)를 이용하여, 배양 필름과 몰드를 무압착 또는 압착한 상태로, 파장 365nm의 LED광을 조사하여 경화했다.
[배양 필름의 볼록볼록간의 폭(L1) 계측]
닛폰분광사제 주사형 전자현미경 JSM-6701F(이하, SEM으로도 표기한다.)를 사용하여, SEM의 사진으로부터 임의의 9점의 볼록볼록간의 폭을 계측하여 평균치에 의해 산출했다.
[세포종 및 배양액에 대해]
마우스 배섬유아세포(이하, BALB/3T3 세포라고 약칭한다)를 이용하여 10% 송아지 혈청(Calf Bovine Serum, CBS)과, 고(高)글루코스와, D-MEM 배지(L-글루타민, 페놀 레드, 피루브산 나트륨 함유)를 포함하는 용액(이하, BALB/3T3 세포액이라고 기재한다.) 중에서, 모든 계대 배양 및 세포 증식성 시험을 행했다. 또한, 인간 피부 섬유아세포(이하, Hs-68 세포라고 약칭한다)의 모든 계대 배양 및 세포 증식성 시험에 대해서도 마찬가지로 행했다.
[세포의 해동]
동결한 BALB/3T3 세포, 또는 Hs-68 세포의 세포 현탁액을 37℃ 워터 배쓰에 담가 해동하고, 해동한 세포 현탁액에 빙상 냉각한 10% 송아지 혈청 D-MEM 배지를 첨가하여 원심 분리했다. 원심 후, 상징액을 제거하고 세포괴를 태핑에 의해 푼 후, 37℃ 워터 배쓰로 보온한 10% 송아지 혈청 D-MEM 배지를 첨가했다. 혈구 계산반으로 세포수를 계수하고, 워터 배쓰로 보온한 10% 송아지 혈청 D-MEM 배지를 이용하여 세포 현탁액을 조제하여 배양 플라스크에 세포를 파종한 후, 가습 인큐베이터로 배양했다.
[세포의 계대]
가습 인큐베이터로부터 배양 플라스크를 꺼내고 배지를 아스피레이터로 제거하고, 37℃ 워터 배쓰 중에서 보온한 둘베코 PBS(-)를 가하고 상징을 아스피레이터로 제거했다. 재차, 마찬가지의 조작을 행한 후, 37℃ 워터 배쓰 중에서 보온한 0.025w/v% 트립신 EDTA 용액을 가하고 가습 인큐베이터 내에서 정치한 후, 10% 송아지 혈청 D-MEM 배지를 가하고 벗겨진 세포를 회수하여 원심관으로 옮기고 원심 분리하고 상징액을 제거하고, 태핑에 의해 세포괴를 푼 후, 10% 송아지 혈청 D-MEM 배지를 가했다. 혈구 계산반으로 세포수를 계수한 후, 10% 송아지 혈청 D-MEM 배지로 세포 현탁액을 조제하고, 배양 플라스크에 세포를 파종하고, 가습 인큐베이터로 배양했다.
[세포 배양 기구의 멸균 방법]
직경 15mm로 잘라낸 원형의 배양 필름을 TCPS 멀티 웰 플레이트(코닝사제) 구멍부에 놓고, 70% 에탄올 수용액을 가하여 40분∼1시간 침지한 후, 70% 에탄올 수용액을 제거하고 둘베코 PBS(-)에 15분∼40분간 침지했다. 다음에, PBS(-)를 제거하고, 배양 기구를 뒤집고, 마찬가지의 조작을 행하여, 배양 기구의 표리면을 멸균 처리했다. 멸균 처리 종료 후, 클린 벤치 내에서 하룻밤 건조시켰다.
[세포 현탁액의 조제와 세포 직경의 계측]
25cm2 배양 플라스크에서 약 60% 컨플루언트 상태가 된 BALB/3T3 세포를, 상기, 세포의 계대 조작과 마찬가지의 방법으로 0.025w/v% 트립신 EDTA로 처리하여 벗겼다. 혈구 계산반으로 세포수를 계수하고, 10% 송아지 혈청 D-MEM 배지로 7300∼7600cells/mL의 BALB/3T3 세포, 또는 Hs-68 세포의 세포 현탁액을 조제했다. 또한, 실시예 10에서는 Hs-68 세포를 1500cells/mL로 조정한 세포 현탁액을 사용했다.
현미경 관찰에 의한 1개당의 세포의 평균 계측으로부터, 세포의 최대 직경(L2)은 25μm였다. 또는, 마찬가지의 방법으로 조제한 Hs-68 세포의 현미경 관찰에 의한 1개당의 세포의 평균 계측으로부터, 세포의 최대 직경(L2)은 20μm였다.
[오목부 저면에 침강한 세포의 수의 확인]
BALB/3T3 세포, 또는 Hs-68 세포를 요철 구조의 세포를 배양하는 면에 파종 하고, 가습 인큐베이터에 넣은 직후부터 4시간 후의 샘플을 가습 인큐베이터로부터 꺼내고, 현미경 관찰하여, 기재 일면의 임의의 오목부 30개소에 침강하고 있는 세포의 수를 카운팅하여, 1개당의 오목부 저면에 침강한 세포의 수를 평균치(=세포수/30)로서 나타냈다.
[세포 증식성의 평가]
배양 개시 후 1, 3, 7, 및 14일 경과 후의 배양 용기를 가습 인큐베이터로부터 꺼내고 배지를 제거하고, 10% WST-8(Cell Counting Kit-8)/10% 송아지 혈청 D-MEM 배지의 혼합 용액을 첨가하고, 가습 인큐베이터에서 3시간 인큐베이팅했다. 그 후, 배지 200μl를 96웰 플레이트로 옮기고, 플레이트 리더(SPECTRA max PLUS384, Molecular Devices사제)로 파장 450nm의 흡광도를 측정했다. 각 배양 용기의 세포 증식성은, 흡광도의 경시 변화에 의해 확인했다.
[유의차 검정]
각종 배양 용기에 대해, 세포를 파종한 샘플을 9 검체 준비하여 배양하고, 흡광도의 측정 결과를 Prism 6 for Windows 6.01(엠디에프사제)에 의해 수치 해석하고, 결과의 평균치를 흡광도로서 산출하고, 표준 편차에 ±의 부호를 붙여 편차의 범위로 했다.
[형광 현미경 관찰]
소정 기간 세포를 배양한 용기로부터 배지를 제거하고, 4% 글루타르알데하이드/인산 완충액을 첨가하고 1시간 정치한 후, 4% 글루타르알데하이드/인산 완충액을 제거했다. 그 후, 멸균수로 세정하고, Image-iT Fixation/Permeabilization 키트(라이프사이언스제)를 사용하여 세포핵, 및 세포 골격 단백을 염색하여 형광 현미경 관찰에 이용하는 시료를 조제했다. 형광 현미경 관찰은, 올인원 형광 현미경 BZ-X700(키엔스제)을 사용했다.
[제조예 1] 폴리머 1
5,5,6-트라이플루오로-6-(트라이플루오로메틸)바이사이클로[2.2.1]헵트-2-엔(100g)과 1-헥센(0.268g)의 테트라하이드로퓨란 용액에, Mo(N-2,6-Pri 2C6H3)(CHCMe2Ph)(OBut)2(50mg)의 테트라하이드로퓨란 용액을 첨가하여, 70℃에서 개환 메타세시스 중합을 행했다. 얻어진 폴리머의 올레핀부를, 팔라듐 알루미나(5g) 존재하 160℃에서 수소 첨가 반응을 행하여, 폴리(1,1,2-트라이플루오로-2-트라이플루오로메틸-3,5-사이클로펜틸렌에틸렌)의 테트라하이드로퓨란 용액을 얻었다. 그 용액을 공경 5μm의 필터로 가압 여과하여 팔라듐 알루미나를 제거한 용액을 메탄올에 가하고, 백색의 폴리머를 여과분별, 건조하여 99g의 폴리머 1을 얻었다. 얻어진 폴리머 1은, 상기 화학식(1)에 의해 표시되는 구조 단위를 함유하고 있었다. 또한, 수소 첨가율은 100%, 중량 평균 분자량(Mw)은 83000, 분자량 분포(Mw/Mn)는 1.73, 유리전이온도는 109℃였다.
[제조예 2] 배양 필름 1
제조예 1에서 합성한 폴리머 1을 메틸 아이소뷰틸 케톤에 30질량% 농도로 용해하고, 그 용액을 공경 1μm의 필터로 가압 여과하고, 그 다음에 0.1μm의 필터로 여과하여 폴리머 1의 메틸 아이소뷰틸 케톤 용액을 조제했다. 그 다음에, 볼록부의 폭 100μm, 패턴 피치 130μm, 패턴 깊이 40μm의 격자 형상을 갖는 석영 몰드에 폴리머 1의 메틸 아이소뷰틸 케톤 용액을 도포하고, 어플리케이터를 이용하여 균일하게 코팅한 후, 140℃에서 60분 건조하고 박리함으로써, 두께 80μm의 격자 형상의 배양 필름 1을 제작했다.
배양 필름 1의 볼록볼록간의 폭(L1)은 100μm이며, BALB/3T3 세포의 최대 직경(L2=25μm)과의 비(L1/L2)는 4였다. 또한, 수접촉각(15초 경과 시)은 126.0°였다.
[제조예 3] 배양 필름 2
제조예 2에서 사용한 폴리머 1의 메틸 아이소뷰틸 케톤 용액을, 볼록부의 폭 500μm, 패턴 피치 570μm, 패턴 깊이 70μm의 격자 형상을 갖는 니켈 몰드에 도포하고, 어플리케이터를 이용하여 균일하게 코팅한 후, 140℃에서 60분 건조하고 박리함으로써, 두께 110μm의 격자 형상의 배양 필름 2를 제작했다.
배양 필름 2의 볼록볼록간의 폭(L1)은 500μm이며, BALB/3T3 세포의 최대 직경(L2=25μm)과의 비(L1/L2)는 20이었다. 또한, 수접촉각(15초 경과 시)은 134.1°였다.
[제조예 4] 배양 필름 3
제조예 1에서 합성한 불소 함유 환상 올레핀 폴리머 1(A)를 30질량% 농도로 용해한 메틸 아이소뷰틸 케톤 용액 100g에, 광경화성 화합물(B)로서 3-에틸-3{[(3-에틸옥세탄-3-일)메톡시]메틸}옥세테인과 1,7-옥타다이엔 다이에폭사이드의 질량비 9/1의 혼합물을 20g, 및 광경화 개시제로서 아데카옵토머 SP-172(ADEKA사제)를 0.8g 가한 용액을 조제하여, 공경 1μm의 필터로 가압 여과하고, 그 다음에 0.1μm의 필터로 여과하여 광경화성 조성물 1을 조제했다(성분(A)과 성분(B)의 비: [(A)/(B)=60/40]). 그 다음에, 볼록부의 폭 300μm, 패턴 피치 350μm, 패턴 깊이 50μm의 격자 형상을 갖는 석영 몰드에, 광경화성 조성물 1을 어플리케이터를 이용하여 균일하게 코팅한 후, 140℃에서 30분 건조하고, 코팅면의 배면으로부터 파장 365nm의 UV광을 200mJ/cm2의 적산 광량으로 조사하고, 그 후 몰드로부터 박리함으로써, 두께 90μm의 격자 형상의 배양 필름 3을 제작했다.
배양 필름 3의 볼록볼록간의 폭(L1)은 300μm이며, BALB/3T3 세포의 최대 직경(L2=25μm)과의 비(L1/L2)는 12였다. 또한, 수접촉각(15초 경과 시)은 128.1°였다.
[제조예 5] 배양 필름 4
제조예 1에서 합성한 불소 함유 환상 올레핀 폴리머 1(A)를 30질량% 농도로 용해한 사이클로헥산온 용액 100g에, 광경화성 화합물(B)로서 3-에틸-3{[(3-에틸옥세탄-3-일)메톡시]메틸}옥세테인과 1,7-옥타다이엔 다이에폭사이드의 질량비 9/1의 혼합물을 3g, 및 광경화 개시제로서 CPI-100P(산아프로사제)를 0.1g 가한 용액을 조제하여, 공경 1μm의 필터로 가압 여과하고, 그 다음에 0.1μm의 필터로 여과하여 광경화성 조성물 2를 조제했다(성분(A)와 성분(B)의 비: [(A)/(B)=90/10]). 그 다음에, 제조예 3에서 사용한 니켈 몰드에 광경화성 조성물 2를 어플리케이터를 이용하여 균일하게 코팅한 후, 140℃에서 50분 건조하고, 코팅면의 배면으로부터 파장 365nm의 UV광을 200mJ/cm2의 적산 광량으로 조사하고, 그 후 몰드로부터 박리함으로써, 두께 105μm의 격자 형상의 배양 필름 4를 제작했다.
배양 필름 4의 볼록볼록간의 폭(L1)은 500μm이며, BALB/3T3 세포의 최대 직경(L2=25μm)과의 비(L1/L2)는 20이었다. 또한, 수접촉각(15초 경과 시)은 129.4°였다.
[실시예 1]
제조예 2에서 제작한 배양 필름 1을 멸균하고, 패턴면을 상방으로 24구멍 TCPS 멀티 웰 플레이트의 구멍부 저면에 놓고, 멸균 그리스(도레이·다우코닝사제)로 SUS제 O-링(내경 11mm)과 밀착시켜 고정한 후, BALB/3T3 세포액(1mL)을 배양 필름 1의 패턴면에 파종했다. 동 조작을 9회 실시하여, 검체수로 9개의 샘플을 준비했다. 그 후, 뚜껑을 덮어 가습 인큐베이터로 이동하고, 고내 온도 37℃, 탄산 가스 농도 5%의 멸균 공기하에서 배양을 개시했다. 그 다음에, 4시간 경과 후의 샘플을 현미경 관찰하고 배양 필름 1의 요철 구조의 임의의 30개소의 오목부 저면에 침강한 BALB/3T3 세포의 수를 카운팅하여 평균을 산출했다. 그 결과, 1개당의 오목부 저면에 1.3개의 세포가 존재하는 것이 확인되었다.
WST-8법에 의한 세포 증식성의 평가에서는, 1일 경과 후의 흡광도가 0.31±0.02이며, 3일 경과 후에 0.95±0.05이며, 7일 경과 후에 2.37±0.08이었다. 경과일수에 대해서 흡광도는 직선적으로 증대하고 있고, 7일 경과해도 증식성에 변화는 보이지 않았다. 또한, 7일간 배양한 세포를 현미경 관찰하면, 세포는 두께 방향에 대해서 세포 시트의 군체를 형성한 상태로 증식하고 있고, 인산 완충 생리 식염수를 첨가하면 세포 시트의 군체 형성의 형태를 유지한 상태로 부유했다(도 1 참조).
[실시예 2]
제조예 3에서 제작한 배양 필름 2를 멸균하고, 실시예 1과 마찬가지의 방법으로 24구멍 TCPS 멀티 웰 플레이트에 고정하고, 해동 완료 BALB/3T3 세포액(1mL)을 배양 필름 2의 패턴면에 파종했다. 동 조작을 9회 반복하여, 검체수로 9개의 샘플을 준비했다. 그 후, 뚜껑을 덮고 인큐베이터로 이동하여 고내 온도 37℃, 탄산 가스 농도 5%의 멸균 공기하에서 배양을 개시했다. 그 다음에, 4시간 경과 후의 샘플을 현미경 관찰하여 배양 필름 2의 요철 구조의 임의의 30개소의 오목부 저면에 침강한 BALB/3T3 세포의 수를 카운팅하여 평균을 산출했다. 그 결과, 1개당의 오목부 저면에 26개의 세포가 존재하는 것이 확인되었다.
WST-8법에 의한 세포 증식성의 평가에서는, 1일 경과 후의 흡광도가 0.24±0.02이며, 3일 경과 후에 0.73±0.05이며, 7일 경과 후에 1.89±0.09였다. 경과일수에 대해서 흡광도는 직선적으로 증대하고 있고, 7일 경과해도 증식성에 변화는 보이지 않았다. 또한, 7일간 배양한 세포를 현미경 관찰하면, 세포는 두께 방향에 대해서 세포 시트의 군체를 형성한 상태로 증식하고 있고, 인산 완충 생리 식염수를 첨가하면 세포 시트의 군체 형성의 형태를 유지한 상태로 부유했다.
[실시예 3]
제조예 4에서 제작한 배양 필름 3을 멸균하고, 실시예 1과 마찬가지의 방법으로 24구멍 TCPS 멀티 웰 플레이트에 고정하고, 해동 완료 BALB/3T3 세포액(1mL)을 배양 필름 3의 패턴면에 파종했다. 동 조작을 9회 반복하여, 검체수로 9개의 샘플을 준비했다. 그 후, 뚜껑을 덮고 인큐베이터로 이동하여 고내 온도 37℃, 탄산 가스 농도 5%의 멸균 공기하에서 배양을 개시했다. 그 다음에, 4시간 경과 후의 샘플을 현미경 관찰하여 배양 필름 3의 요철 구조의 임의의 30개소의 오목부 저면에 침강한 BALB/3T3 세포의 수를 카운팅하여 평균치를 산출했다. 그 결과, 1개당의 오목부 저면에 9.7개의 세포가 존재하는 것이 확인되었다.
WST-8법에 의한 세포 증식성의 평가에서는, 1일 경과 후의 흡광도가 0.28±0.01이며, 3일 경과 후에 0.89±0.02이며, 7일 경과 후에 2.26±0.07이었다. 경과일수에 대해서 흡광도는 직선적으로 증대하고 있고, 7일 경과해도 증식성에 변화는 보이지 않았다. 또한, 7일간 배양한 세포를 현미경 관찰하면, 세포는 두께 방향에 대해서 세포 시트의 군체를 형성한 상태로 증식하고 있고, 인산 완충 생리 식염수를 첨가하면 세포 시트의 군체 형성의 형태를 유지한 상태로 부유했다.
[실시예 4]
제조예 5에서 제작한 배양 필름 4를 멸균하고, 실시예 1과 마찬가지의 방법으로 24구멍 TCPS 멀티 웰 플레이트에 고정하여, 해동 완료 BALB/3T3 세포액(1mL)을 배양 필름 4의 패턴면에 파종했다. 동 조작을 9회 반복하여, 검체수로 9개의 샘플을 준비했다. 그 후, 뚜껑을 덮고 인큐베이터로 이동하여 고내 온도 37℃, 탄산 가스 농도 5%의 멸균 공기하에서 배양을 개시했다. 그 다음에, 4시간 경과 후의 샘플을 현미경 관찰하여 배양 필름 4의 요철 구조의 임의의 30개소의 오목부 저면에 침강한 BALB/3T3 세포의 수를 카운팅하여 평균치를 산출했다. 그 결과, 1개당의 오목부 저면에 26개의 세포가 존재하는 것이 확인되었다.
WST-8법에 의한 세포 증식성의 평가에서는, 1일 경과 후의 흡광도가 0.24±0.03이며, 3일 경과 후에 0.70±0.04이며, 7일 경과 후에 1.75±0.06이었다. 경과일수에 대해서 흡광도는 직선적으로 증대하고 있고, 7일 경과해도 증식성에 변화는 보이지 않았다. 또한, 7일간 배양한 세포를 현미경 관찰하면, 세포는 두께 방향에 대해서 세포 시트의 군체를 형성한 상태로 증식하고 있고, 인산 완충 생리 식염수를 첨가하면 세포 시트의 군체 형성의 형태를 유지한 상태로 부유했다.
[실시예 5]
불소 함유 환상 올레핀 모노머의 종류를 5,6-다이플루오로-5-펜타플루오로에틸-6-트라이플루오로메틸바이사이클로[2.2.1]헵트-2-엔으로 변경한 것 이외에는, 제조예 1과 마찬가지의 방법에 의해 97g의 폴리머 2를 얻었다. 얻어진 폴리머 2는, 화학식(1)에 의해 표시되는 구조 단위를 함유하고 있었다. 또한, 수소 첨가율은 100%, 중량 평균 분자량(Mw)은 91000, 분자량 분포(Mw/Mn)는 1.93, 유리전이온도는 104℃였다.
다음에, 제조예 2와 마찬가지의 방법에 의해 두께 85μm의 격자 형상의 배양 필름 5를 제작했다. 배양 필름 5의 볼록볼록간의 폭(L1)은 100μm이며, BALB/3T3 세포의 최대 직경(L2=25μm)과의 비(L1/L2)는 4였다. 또한, 수접촉각(15초 경과 시)은 128.1°였다.
배양 필름 5에 의한 실시예 1과 마찬가지의 방법으로 실시한 BALB/3T3 세포의 배양에서는, 4시간 경과 후의 샘플을 현미경 관찰하여 배양 필름 5의 요철 구조의 임의의 30개소의 오목부 저면에 침강한 BALB/3T3 세포의 수를 카운팅하여 평균치를 산출하면, 1개당의 오목부 저면에 1.3개의 세포가 존재하는 것이 확인되었다.
WST-8법에 의한 세포 증식성의 평가에서는, 1일 경과 후의 흡광도가 0.30±0.03이며, 3일 경과 후에 0.99±0.03이며, 7일 경과 후에 2.28±0.11이었다. 경과일수에 대해서 흡광도는 직선적으로 증대하고 있고, 7일 경과해도 증식성에 변화는 보이지 않았다. 또한, 7일간 배양한 세포를 현미경 관찰하면, 세포는 두께 방향에 대해서 세포 시트의 군체를 형성한 상태로 증식하고 있고, 인산 완충 생리 식염수를 첨가하면 세포 시트의 군체 형성의 형태를 유지한 상태로 부유했다.
[실시예 6]
불소 함유 환상 올레핀 모노머의 종류를 5,6-다이플루오로-5-헵타플루오로-iso-프로필-6-트라이플루오로메틸바이사이클로[2.2.1]헵트-2-엔으로 변경한 것 이외에는, 제조예 1과 마찬가지의 방법에 의해 98g의 폴리머 3을 얻었다. 얻어진 폴리머 3은, 화학식(1)에 의해 표시되는 구조 단위를 함유하고 있었다. 또한, 수소 첨가율은 100%, 중량 평균 분자량(Mw)은 142000, 분자량 분포(Mw/Mn)는 1.40, 유리전이온도는 137℃였다.
다음에, 몰드를 제조예 3에서 사용한 격자 형상의 니켈 몰드로 변경한 것 이외에는, 제조예 2와 마찬가지의 방법에 의해 두께 103μm의 격자 형상의 배양 필름 6을 제작했다. 배양 필름 6의 볼록볼록간의 폭(L1)은 500μm이며, BALB/3T3 세포의 최대 직경(L2=25μm)과의 비(L1/L2)는 20이었다. 또한, 수접촉각(15초 경과 시)은 136.3°였다.
배양 필름 6에 의한 실시예 1과 마찬가지의 방법으로 실시한 BALB/3T3 세포의 배양에서는, 4시간 경과 후의 샘플을 현미경 관찰하여 배양 필름 6의 요철 구조의 임의의 30개소의 오목부 저면에 침강한 BALB/3T3 세포의 수를 카운팅하여 평균치를 산출하면, 1개당의 오목부 저면에 26개의 세포가 존재하는 것이 확인되었다.
WST-8법에 의한 세포 증식성의 평가에서는, 1일 경과 후의 흡광도가 0.21±0.03이며, 3일 경과 후에 0.68±0.03이며, 7일 경과 후에 1.56±0.15였다. 경과일수에 대해서 흡광도는 직선적으로 증대하고 있고, 7일 경과해도 증식성에 변화는 보이지 않았다. 또한, 7일간 배양한 세포를 현미경 관찰하면, 세포는 두께 방향에 대해서 세포 시트의 군체를 형성한 상태로 증식하고 있고, 인산 완충 생리 식염수를 첨가하면 세포 시트의 군체 형성의 형태를 유지한 상태로 부유했다.
[실시예 7]
제조예 4에서 조제한 광경화성 조성물 1[(A)/(B)=60/40]을 PET 필름에 스핀 코팅하고, 100℃에서 1분간 가열한 후에, 제조예 2에서 사용한 격자 형상의 석영 몰드의 패턴면과 광경화성 조성물 1의 코팅면이 접촉하도록 PET 필름을 씌워 0.3MPa의 압력으로 압착하면서 파장 365nm의 UV광을 200mJ/cm2의 적산 광량으로 조사했다. 그 다음에, 석영 몰드로부터 PET 필름을 박리하여, PET 필름의 표면에 격자 형상을 형성한 배양 필름 7을 제작했다. 배양 필름 7의 볼록볼록간의 폭(L1)은 100μm이며, BALB/3T3 세포의 최대 직경(L2=25μm)과의 비(L1/L2)는 4였다. 또한, 수접촉각(15초 경과 시)은 127.3°였다.
배양 필름 7에 의한 실시예 1과 마찬가지의 방법으로 실시한 BALB/3T3 세포의 배양에서는, 4시간 경과 후의 샘플을 현미경 관찰하여 배양 필름 7의 요철 구조의 임의의 30개소의 오목부 저면에 침강한 BALB/3T3 세포의 수를 카운팅하여 평균치를 산출하면, 1개당의 오목부 저면에 1.3개의 세포가 존재하는 것이 확인되었다.
WST-8법에 의한 세포 증식성의 평가로 1일 경과 후의 흡광도가 0.27±0.01이며, 3일 경과 후에 0.85±0.02이며, 7일 경과 후에 2.14±0.09였다. 경과일수에 대해서 흡광도는 직선적으로 증대하고 있고, 7일 경과해도 증식성에 변화는 보이지 않았다. 또한, 7일간 배양한 세포를 현미경 관찰하면, 세포는 두께 방향에 대해서 세포 시트의 군체를 형성한 상태로 증식하고 있고, 인산 완충 생리 식염수를 첨가하면 세포 시트의 군체 형성의 형태를 유지한 상태로 부유했다.
[실시예 8]
세포종을 Hs-68 세포로 변경한 것 이외에는, BALB/3T3 세포와 마찬가지의 방법에 의해 세포의 해동, 계대, 현탁액을 조제하여, 10% 송아지 혈청 D-MEM 배지로 7500cells/mL의 세포 현탁액을 조제했다.
배양 필름의 제작은, 몰드를 제조예 4에서 사용한 석영 몰드(볼록부의 폭 300μm, 패턴 피치 350μm, 패턴 깊이 50μm)로 변경한 것 이외에는, 제조예 2와 마찬가지의 방법으로 배양 필름 9를 제작했다. 배양 필름 9의 볼록볼록간의 폭(L1)은 300μm이며, Hs-68 세포의 최대 직경(L2=20μm)과의 비(L1/L2)는 15였다. 또한, 수접촉각(15초 경과 시)은 124.2°였다.
그 다음에, 멸균 완료 배양 필름 9를 이용하여 실시예 1과 마찬가지의 방법에 의해, 해동 완료 Hs-68 세포액(1mL)을 파종했다. 동 조작을 9회 반복하여, 검체수로 9개의 샘플을 준비했다. 그 후, 뚜껑을 덮고 인큐베이터로 이동하여 고내 온도 37℃, 탄산 가스 농도 5%의 멸균 공기하에서 배양을 개시했다. 4시간 경과 후의 샘플을 현미경 관찰하여 배양 필름 9의 요철 구조의 임의의 30개소의 오목부 저면에 침강한 Hs-68 세포의 수를 카운팅하여 평균치를 산출하면, 1개당의 오목부 저면에 9.7개의 세포가 존재하는 것을 확인했다.
WST-8법에 의한 세포 증식성의 평가에서는, 1일 경과 후의 흡광도가 0.27±0.05이며, 3일 경과 후에 0.82±0.09이며, 7일 경과 후에 1.69±0.11이며, 14일 경과 후에 3.21±0.13이었다. 경과일수에 대해서 흡광도는 직선적으로 증대하고 있고, 14일 경과해도 증식성에 변화는 보이지 않았다. 또한, 14일간 배양한 세포를 현미경 관찰하면, 세포는 스페로이드 또는 콜로니상으로 군체를 형성한 상태(도 2 참조)로 증식하고 있고, 트립신 함유 인산 완충 생리 식염수를 첨가하면 스페로이드 또는 콜로니상의 형태를 유지한 상태로 부유했다.
이 배양 세포의 NADPH 데하이드로제나제로 약물 대사계 효소 활성 평가를 행하면 거의 100%가, 생태계와 마찬가지의 약물 대사계 효소 활성이 있음을 알았다. 더욱이, 자가 형광을 관찰하면 마찬가지로 100%의 배양 세포가 생 세포임을 확인했다.
[실시예 9]
멸균 완료 배양 필름 1(L1/L2=5)을 이용하여 실시예 8과 마찬가지의 방법에 의해, 해동 완료 Hs-68 세포액(1mL)을 파종했다. 동 조작을 9회 반복하여, 검체수로 9개의 샘플을 준비했다. 그 후, 뚜껑을 덮고 인큐베이터로 이동하여 고내 온도 37℃, 탄산 가스 농도 5%의 멸균 공기하에서 배양을 개시했다. 4시간 경과 후의 샘플을 현미경 관찰하여 배양 필름 1의 요철 구조의 임의의 30개소의 오목부 저면에 침강한 Hs-68 세포의 수를 카운팅하여 평균치를 산출하면, 1개당의 오목부 저면에 1.3개의 세포가 존재하는 것을 확인했다.
WST-8법에 의한 세포 증식성의 평가에서는, 1일 경과 후의 흡광도가 0.28±0.04이며, 3일 경과 후에 1.83±0.05이며, 7일 경과 후에 1.79±0.10이었다. 경과일수에 대해서 흡광도는 직선적으로 증대하고 있고, 7일 경과해도 증식성에 변화는 보이지 않았다. 또한, 7일간 배양한 세포를 현미경 관찰하면, 세포는 시트상으로, 두께 방향에 대해서 세포 시트의 군체를 형성한 상태로 증식하고 있고, 트립신 함유 인산 완충 생리 식염수를 첨가하면 시트상의 형태를 유지한 상태로 부유했다.
이 배양 세포의 NADPH 데하이드로제나제로 약물 대사계 효소 활성 평가를 행하면 거의 100%가, 생태계와 마찬가지의 약물 대사계 효소 활성이 있음을 알았다. 더욱이, 자가 형광을 관찰하면 마찬가지로 99.8%의 배양 세포가 생 세포임을 확인했다.
[실시예 10]
멸균 완료 배양 필름 9(L1/L2=15)를 이용하고, 세포수를 1500cells/mL로 변경 한 것 이외에는 실시예 8과 마찬가지의 방법으로 조제한 해동 완료 Hs-68 세포액(1mL)을 파종했다. 동 조작을 9회 반복하여, 검체수로 9개의 샘플을 준비했다. 그 후, 뚜껑을 덮고 인큐베이터로 이동하여 고내 온도 37℃, 탄산 가스 농도 5%의 멸균 공기하에서 배양을 개시했다. 4시간 경과 후의 샘플을 현미경 관찰하여 배양 필름 9의 요철 구조의 임의의 30개소의 오목부 저면에 침강한 Hs-68 세포의 수를 카운팅하여 평균치를 산출하면, 1개당의 오목부 저면에 1.9개의 세포가 존재하는 것을 확인했다.
WST-8법에 의한 세포 증식성의 평가에서는, 1일 경과 후의 흡광도가 0.06±0.01이며, 3일 경과 후에 0.17±0.09이며, 7일 경과 후에 0.36±0.12였다. 경과일수에 대해서 흡광도는 직선적으로 증대하고 있고, 7일 경과해도 증식성에 변화는 보이지 않았다. 또한, 7일간 배양한 세포를 현미경 관찰하면, 세포는 스페로이드 또는 콜로니를 형성한 상태로 증식하고 있고, 트립신 함유 인산 완충 생리 식염수를 첨가하면 스페로이드 또는 콜로니상의 형태를 유지한 상태로 부유했다.
이 배양 세포의 NADPH 데하이드로제나제로 약물 대사계 효소 활성 평가를 행하면 거의 100%가, 생태계와 마찬가지의 약물 대사계 효소 활성이 있음을 알았다. 더욱이, 자가 형광을 관찰하면 마찬가지로 100%의 배양 세포가 생 세포임을 확인했다.
[실시예 11]
멸균 완료 배양 필름 3(L1/L2=15)을 이용하여 실시예 8과 마찬가지의 방법에 의해, 해동 완료 Hs-68 세포액(1mL)을 파종했다. 동 조작을 9회 반복하여, 검체수로 9개의 샘플을 준비했다. 그 후, 뚜껑을 덮고 인큐베이터로 이동하여 고내 온도 37℃, 탄산 가스 농도 5%의 멸균 공기하에서 배양을 개시했다. 4시간 경과 후의 샘플을 현미경 관찰하여 배양 필름 3의 요철 구조의 임의의 30개소의 오목부 저면에 침강한 Hs-68 세포의 수를 카운팅하여 평균치를 산출하면, 1개당의 오목부 저면에 9.6개의 세포가 존재하는 것을 확인했다.
WST-8법에 의한 세포 증식성의 평가에서는, 1일 경과 후의 흡광도가 0.21±0.04이며, 3일 경과 후에 0.74±0.09이며, 7일 경과 후에 1.60±0.11이었다. 경과일수에 대해서 흡광도는 직선적으로 증대하고 있고, 7일 경과해도 증식성에 변화는 보이지 않았다. 또한, 7일간 배양한 세포를 현미경 관찰하면, 세포는 시트상으로, 두께 방향에 대해서 세포 시트의 군체를 형성한 상태로 증식하고 있고, 트립신 함유 인산 완충 생리 식염수를 첨가하면 시트상의 형태를 유지한 상태로 부유했다.
이 배양 세포의 NADPH 데하이드로제나제로 약물 대사계 효소 활성 평가를 행하면 거의 100%가, 생태계와 마찬가지의 약물 대사계 효소 활성이 있음을 알았다. 더욱이, 자가 형광을 관찰하면 마찬가지로 99.9%의 배양 세포가 생 세포임을 확인했다.
[실시예 12]
실시예 6에서 제작한 멸균 완료 배양 필름 6(L1/L2=25)을 이용하여 실시예 8과 마찬가지의 방법에 의해, 해동 완료 Hs-68 세포액(1mL)을 파종했다. 동 조작을 9회 반복하여, 검체수로 9개의 샘플을 준비했다. 그 후, 뚜껑을 덮고 인큐베이터로 이동하여 고내 온도 37℃, 탄산 가스 농도 5%의 멸균 공기하에서 배양을 개시했다. 4시간 경과 후의 샘플을 현미경 관찰하여 배양 필름 6의 요철 구조의 임의의 30개소의 오목부 저면에 침강한 Hs-68 세포의 수를 카운팅하여 평균치를 산출하면, 1개당의 오목부 저면에 26개의 세포가 존재하는 것을 확인했다.
WST-8법에 의한 세포 증식성의 평가에서는, 1일 경과 후의 흡광도가 0.23±0.05이며, 3일 경과 후에 0.65±0.08이며, 7일 경과 후에 1.55±0.11이었다. 경과일수에 대해서 흡광도는 직선적으로 증대하고 있고, 7일 경과해도 증식성에 변화는 보이지 않았다. 또한, 7일간 배양한 세포를 현미경 관찰하면, 세포는 스페로이드를 형성한 상태로 증식하고 있고, 트립신 함유 인산 완충 생리 식염수를 첨가하면 스페로이드상의 형태를 유지한 상태로 부유했다.
이 배양 세포의 NADPH 데하이드로제나제로 약물 대사계 효소 활성 평가를 행하면 거의 100%가, 생태계와 마찬가지의 약물 대사계 효소 활성이 있음을 알았다. 더욱이, 자가 형광을 관찰하면 마찬가지로 100%의 배양 세포가 생 세포임을 확인했다.
[실시예 13]
제조예 2에서 사용한 폴리머 1의 메틸 아이소뷰틸 케톤 용액으로부터 용액 캐스팅법으로, 두께 120μm의 폴리머 1의 필름을 제작했다. 그 다음에, 가열판 상에서 폴리머 1의 필름과 제조예 4에서 사용한 석영 몰드(볼록부의 폭 300μm, 패턴 피치 350μm, 패턴 깊이 50μm)의 패턴면을 접촉시키고, 가열판에 놓고 150℃로 가열하고, 10MPa로 열압착하고 그대로 5초간 보지했다. 70℃로 냉각 후, 몰드를 이탈하여 배양 필름 10을 제작했다. 배양 필름 10의 볼록볼록간의 폭(L1)은 300μm이며, Hs-68 세포의 최대 직경(L2=20μm)과의 비(L1/L2)는 15였다. 또한, 수접촉각(15초 경과 시)은 124.9°였다.
그 다음에, 멸균 완료 배양 필름 10을 이용하여 실시예 1과 마찬가지의 방법에 의해, 해동 완료 Hs-68 세포액(1mL)을 파종했다. 동 조작을 9회 반복하여, 검체수로 9개의 샘플을 준비했다. 그 후, 뚜껑을 덮고 인큐베이터로 이동하여 고내 온도 37℃, 탄산 가스 농도 5%의 멸균 공기하에서 배양을 개시했다. 4시간 경과 후의 샘플을 현미경 관찰하여 배양 필름 10의 요철 구조의 임의의 30개소의 오목부 저면에 침강한 Hs-68 세포의 수를 카운팅하여 평균치를 산출하면, 1개당의 오목부 저면에 9.8개의 세포가 존재하는 것을 확인했다.
WST-8법에 의한 세포 증식성의 평가에서는, 1일 경과 후의 흡광도가 0.26±0.04이며, 3일 경과 후에 0.87±0.03이며, 7일 경과 후에 1.70±0.10이었다. 경과일수에 대해서 흡광도는 직선적으로 증대하고 있고, 7일 경과해도 증식성에 변화는 보이지 않았다. 또한, 7일간 배양한 세포를 현미경 관찰하면, 세포는 스페로이드 또는 콜로니를 형성한 상태로 증식하고 있고, 트립신 함유 인산 완충 생리 식염수를 첨가하면 스페로이드 또는 콜로니상의 형태를 유지한 상태로 부유했다.
이 배양 세포의 NADPH 데하이드로제나제로 약물 대사계 효소 활성 평가를 행하면 거의 100%가, 생태계와 마찬가지의 약물 대사계 효소 활성이 있음을 알았다. 더욱이, 자가 형광을 관찰하면 마찬가지로 100%의 배양 세포가 생 세포임을 확인했다.
[실시예 14]
6구멍 TCPS 멀티 웰 플레이트(코닝제)의 오목부 저면을 잘라내고, 제조예 2에서 제작한 볼록볼록간의 폭(L1)이 100μm이며 인간 배섬유아세포의 최대 직경(L2=20μm)과의 비(L1/L2)가 5인 필름 1을 6구멍 전부의 오목부 저면에 용기의 이면으로부터 첩부하여 세포 배양 용기를 제작하고, 에탄올에 의해 멸균 처리했다.
그 다음에, 세포액의 양을 10mL로 변경한 것 이외에는, 실시예 8과 마찬가지의 방법에 의해, 해동 완료 Hs-68 세포액을 파종했다. 동 조작을 9회 반복하여, 검체수로 9개의 샘플을 준비했다. 그 후, 뚜껑을 덮고 인큐베이터로 이동하여 고내 온도 37℃, 탄산 가스 농도 5%의 멸균 공기하에서 배양을 개시했다. 4시간 경과 후의 샘플을 현미경 관찰하여 배양 필름 1의 요철 구조의 임의의 30개소의 오목부 저면에 침강한 Hs-68 세포의 수를 카운팅하여 평균치를 산출하면, 1개당의 오목부 저면에 1.3개의 세포가 존재하는 것을 확인했다.
WST-8법에 의한 세포 증식성의 평가에서는, 1일 경과 후의 흡광도가 0.29±0.01이며, 3일 경과 후에 0.83±0.01이며, 7일 경과 후에 1.79±0.05였다. 경과일수에 대해서 흡광도는 직선적으로 증대하고 있고, 7일 경과해도 증식성에 변화는 보이지 않았다. 또한, 7일간 배양한 세포를 현미경 관찰하면, 세포는 시트상으로, 두께 방향에 대해서 군체를 형성한 상태로 증식하고 있고, 트립신 함유 인산 완충 생리 식염수를 첨가하면 시트상의 형태를 유지한 상태로 부유했다.
이 배양 세포의 NADPH 데하이드로제나제로 약물 대사계 효소 활성 평가를 행하면 거의 100%가, 생태계와 마찬가지의 약물 대사계 효소 활성이 있음을 알았다. 더욱이, 자가 형광을 관찰해도, 거의 형광이 관찰되지 않으므로, 마찬가지로 100%의 배양 세포가 생 세포임을 확인했다.
[참고예 1]
제조예 2에서 사용한 폴리머 1의 메틸 아이소뷰틸 케톤 용액을, 직경 150nm, 피치 250nm의 필러 형상을 갖는 니켈 몰드에 도포하고, 어플리케이터를 이용하여 균일하게 코팅한 후, 140℃에서 60분 건조하고 박리함으로써, 두께 50μm의 홀 형상의 배양 필름 11을 제작했다. 배양 필름 11의 수접촉각(15초 경과 시)은 124.3°였다.
그 다음에, 멸균 완료 배양 필름 11을 이용하여, 실시예 1과 마찬가지의 방법으로 24구멍 TCPS 멀티 웰 플레이트에 고정하고, 해동 완료 BALB/3T3 세포액(1mL)을 배양 필름 11의 패턴면에 파종했다. 동 조작을 9회 반복하여, 검체수로 9개의 샘플을 준비했다. 그 후, 뚜껑을 덮고 인큐베이터로 이동하여 고내 온도 37℃, 탄산 가스 농도 5%의 멸균 공기하에서 배양을 개시했다.
WST-8법에 의한 세포 증식성의 평가에서는, 1일 경과 후의 흡광도가 0.10±0.02이며, 3일 경과 후에 0.34±0.03이며, 7일 경과 후에 0.70±0.09였다. 경과일수에 대해서 흡광도는 직선적으로 증대하고 있고, 7일 경과해도 증식성에 변화는 보이지 않았다. 또한, 7일간 배양한 세포를 현미경 관찰하면, 세포는 두께 방향에 대해서 세포 시트의 군체를 형성한 상태로 증식하고 있고, 인산 완충 생리 식염수를 첨가하면 세포 시트의 군체 형성의 형태를 유지한 상태로 부유했다.
더욱이, 7일간 배양한 BALB/3T3 세포의 배양액을 제거하고, 탈수 처리, 건조하여 SEM 관찰용의 시료를 조제하고, 세포와 배양 필름 11의 계면 상태를 관찰하면, 배양 필름 11의 패턴면의 최대 직경 150nm의 홀(오목부)에 휘감기도록 세포로부터 뻗은 실모양의 토대 형성은 보이지 않았다.
[비교예 1]
γ선 멸균 완료 24구멍 TCPS 멀티 웰 플레이트(코닝제, 수접촉각은 15초 후에 46.1°)의 구멍부 저면에 해동 완료 BALB/3T3 세포액(1mL)을 파종했다. 동 조작을 9회 반복하여, 검체수 9개의 샘플을 준비했다. 그 후, 뚜껑을 덮고 인큐베이터로 이동하여 고내 온도 37℃, 탄산 가스 농도 5%의 멸균 공기하에서 배양을 개시했다. 4시간 경과 후의 샘플을 현미경 관찰하여 멀티 웰 플레이트의 저부를 관찰하면, 드문드문하게 점재한 BALB/3T3 세포가 관찰되고, 그 중에는 응집괴 상태로 침강한 것도 있어 전체적으로 배양면에 대해서 불균일한 상태로 침강하고 있었다.
WST-8법에 의한 세포 증식성의 평가에서는, 1일 경과 후의 흡광도가 0.27±0.03이며, 3일 경과 후에 1.08±0.11이며, 7일 경과 후에 1.51±0.23이었다. 경과일수에 대해서 흡광도의 증가 비율은 서서히 감쇠하는 경향을 나타내고, 경과일수에 따라 세포 증식의 정도는 작아졌다. 또한, 7일간 배양한 세포를 현미경 관찰하면, 세포는 시트상으로, 두께 방향에 대해서 두께 불균일이 있는 평면 상태로 증식하고 있고, 인산 완충 생리 식염수를 첨가해도 형태에 변함 없고 부유하지 않았다.
[비교예 2]
에탄올 멸균 완료 아펠TM 필름(미쓰이화학사제)을 사용하여, 실시예 1과 마찬가지의 방법으로 BALB/3T3 세포의 배양을 개시했다. 4시간 경과 후의 샘플을 현미경 관찰하면, 드문드문하게 점재한 BALB/3T3 세포가 관찰되고, 그 중에는 응집괴 상태로 침강한 것도 있어 전체적으로 배양면에 대해서 불균일한 상태로 침강하고 있었다.
WST-8법에 의한 세포 증식성의 평가에서는, 1일 경과 후의 흡광도가 0.11±0.01이며, 3일 경과 후에 1.22±0.10이며, 7일 경과 후에 1.71±0.19였다. 경과일수에 대해서 흡광도의 증가 비율은 서서히 감쇠하는 경향을 나타내고, 경과일수에 따라 세포 증식의 정도는 작아졌다. 또한, 7일간 배양한 세포를 현미경 관찰하면, 세포는 시트상으로, 두께 방향에 대해서 두께 불균일이 있는 평면 상태로 증식하고 있고, 인산 완충 생리 식염수를 첨가해도 형태에 변함 없고 부유하지 않았다.
[비교예 3]
제조예 1에 기재된 모노머를 5-메틸-바이사이클로[2.2.1]헵트-2-엔으로, 용제를 사이클로헥세인으로 변경한 것 이외에는 제조예 1과 마찬가지의 방법에 의해 49g의 폴리머 4를 얻었다. 또한, 수소 첨가율은 100%, 중량 평균 분자량(Mw)은 129000, 분자량 분포(Mw/Mn)는 2.26, 유리전이온도는 67℃였다.
다음에, 폴리머 4를 30질량%로 용해한 사이클로헥산온 용액을 유리 기판에 도공하고, 150℃에서 3시간 건조하여 두께 75μm의 필름을 제작했다. 그 후, 제조예 2에서 사용한 격자 형상의 석영 몰드를 이용하여 가열 용융 압착 나노임프린트법에 의해, 두께 73μm의 격자 형상의 배양 필름 8을 제작했다. 배양 필름 8의 볼록볼록간의 폭(L1)은 100μm이며, BALB/3T3 세포의 최대 직경(L2=25μm)과의 비(L1/L2)는 4였다. 또한, 수접촉각(15초 경과 시)은 101.2°였다.
배양 필름 8에 의한 실시예 1과 마찬가지의 방법으로 실시한 BALB/3T3 세포의 배양에서는, 4시간 경과 후의 샘플을 현미경 관찰하여 배양 필름 4의 요철 구조의 임의의 30개소의 오목부 저면에 침강한 BALB/3T3 세포의 수를 카운팅하여 평균치를 산출하면, 1개당의 오목부 저면에 1.4개의 세포가 존재하는 것이 확인되었다.
WST-8법에 의한 세포 증식성의 평가로 1일 경과 후의 흡광도가 0.07±0.01이며, 3일 경과 후에 0.15±0.02이며, 7일 경과 후에 0.18±0.11이었다. 경과일수에 따라 세포 증식의 정도는 작아졌다. 또한, 7일간 배양한 세포를 현미경 관찰하면, 세포는 시트상으로, 두께 방향에 대해서 두께 불균일이 있는 평면 상태로 증식하고 있고, 인산 완충 생리 식염수를 첨가해도 형태에 변함 없고 부유하지 않았다.
[비교예 4]
세포 현탁액을 Hs-68 세포액(10mL)으로 변경한 것 이외에는, 비교예 1과 마찬가지로 인큐베이터의 고내 온도 37℃, 탄산 가스 농도 5%의 멸균 공기하에서 배양을 개시했다.
WST-8법에 의한 세포 증식성의 평가에서는, 1일 경과 후의 흡광도가 0.33±0.06이며, 3일 경과 후에 1.49±0.11이며, 7일 경과 후에 3.10±0.13이었다. 경과일수에 대해서 흡광도는 서서히 감쇠하는 경향을 나타내고, 경과일수에 따라 세포 증식의 정도는 작아졌다. 또한, 7일간 배양한 세포를 현미경 관찰하면, 시트상으로 세포는 증식하고 있고, 트립신 함유 인산 완충 생리 식염수를 첨가해도 형태에 변함 없고 부유하지 않았다(도 3 참조).
더욱이, 7일간 배양한 세포를 형광 발광 시약으로 염색하여 세포핵, 및 세포 골격 단백의 형태를 형광 현미경 관찰하면, 청색 형광 발광한 세포핵, 및 녹색 형광 발광한 세포 골격 단백은, 이차원적으로 퍼진 시트 형상의 형광 발광 분포로 관찰되고 세포가 두께 방향으로 겹쳐진 세포 시트의 군체 형성은 확인할 수 없었다.
이 배양 세포의 NADPH 데하이드로제나제로 약물 대사계 효소 활성 평가를 행하면 거의 0%가, 생태계와 마찬가지의 약물 대사계 효소 활성이 있음을 알았다. 더욱이, 자가 형광 관찰은, γ선 멸균 완료 24구멍 TCPS 멀티 웰 플레이트의 형광 흡수로 측정할 수 없었다.
[비교예 5]
패턴 피치 4μm의 육방최밀충전 배열을 부형한 멸균 완료 24구멍 나노컬처 플레이트(SCIVAX사제, 수접촉각(15초 경과 시)은 125°, L1/L2=0.16)의 구멍부 저면의 패턴면에 해동 완료 BALB/3T3 세포액(1mL)을 파종했다. 동 조작을 9회 반복하여, 검체수 9개의 샘플을 준비했다. 그 후, 뚜껑을 덮고 인큐베이터로 이동하여 고내 온도 37℃, 탄산 가스 농도 5%의 멸균 공기하에서 배양을 개시했다.
4시간 경과 후의 샘플을 현미경 관찰하여 요철 구조의 임의의 30개소의 오목부 저면을 관찰하면 1개의 오목부에도 침강한 BALB/3T3 세포는 들어가 있지 않았다.
WST-8법에 의한 세포 증식성의 평가에서는, 1일 경과 후의 흡광도가 0.07±0.03이며, 3일 경과 후에 0.09±0.02이며, 7일 경과 후에 0.10±0.09였다. 경과일수에 대해서 흡광도의 증가 비율은 서서히 감쇠하는 경향을 나타내고, 경과일수에 따라 세포 증식의 정도는 작아졌다. 또한, 7일간 배양한 세포를 현미경 관찰하면, 세포는 두께 방향에 대해서 스페로이드의 군체를 형성하여 증식하며 사이즈, 형상은 고르지 않고, 인산 완충 생리 식염수를 첨가해도 형태에 변함 없고 부유하지 않았다.
더욱이, 7일간 배양한 BALB/3T3 세포의 배양액을 제거하고, 탈수 처리, 건조하여 SEM 관찰용의 시료를 조제하고, 세포와 나노컬처 플레이트 계면 상태를 관찰하면, 나노컬처 플레이트의 패턴면의 오목부에 휘감기도록 세포의 토대가 형성되고 있는 모습이 관찰되었다.
[비교예 6]
구경 500μm의 홀 형상을 부형한 멸균 완료 6구멍 스페로이드 형성 배양용 용기(IWAKI사제, L1/L2=25)의 구멍부 저면의 패턴면에 실시예 8과 마찬가지로 Hs-68 세포의 세포 현탁액을 파종했다. 동 조작을 9회 반복하여, 검체수 9개의 샘플을 준비했다. 그 후, 뚜껑을 덮고 인큐베이터로 이동하여 고내 온도 37℃, 탄산 가스 농도 5%의 멸균 공기하에서 배양을 개시했다.
4시간 경과 후의 샘플을 현미경 관찰하여, 요철 구조의 임의의 30개소의 오목부 저면에 침강한 Hs-68 세포의 수를 카운팅하여 평균치를 산출하면, 1개당의 오목부 저면에 25개의 세포가 존재하는 것을 확인했다.
WST-8법에 의한 세포 증식성의 평가에서는, 1일 경과 후의 흡광도가 0.08±0.01이며, 3일 경과 후에 0.11±0.04이며, 7일 경과 후에 0.15±0.06이었다. 또한, 7일간 배양한 세포를 현미경 관찰하면, 세포는 두께 방향에 대해서 스페로이드의 군체를 형성하여 증식했지만 사이즈, 형상은 고르지 않고, 인산 완충 생리 식염수를 첨가해도 형태에 변함 없고 부유하지 않았다.
이 출원은, 2015년 3월 31일에 출원된 일본 출원특원 2015-070868호를 기초로 하는 우선권을 주장하고, 그 개시의 전부를 여기에 원용한다.
본 발명은, 이하의 태양을 포함한다.
＜1＞
기재를 구비하는 의료 기구로서,
상기 기재는 세포를 접촉시키는 일면을 갖는 것이고,
상기 기재의 상기 세포와 접촉하는 상기 일면이, 하기 화학식(1)로 표시되는 구조 단위를 함유하는 불소 함유 환상 올레핀 폴리머에 의해 구성된 요철 구조를 구비하고,
당해 요철 구조로 구성되는 볼록볼록간의 폭(L1)과 1개당의 상기 세포의 직경(L2)의 비(L1/L2)가 1∼100이며, 상기 세포가 요철 구조를 구비한 상기 일면에 접착하지 않는 것을 특징으로 하는 의료 기구.
Figure pct00007
(식(1) 중, R1∼R4 중 적어도 하나는, 불소, 불소를 함유하는 탄소수 1∼10의 알킬기, 불소를 함유하는 탄소수 1∼10의 알콕시기, 또는 불소를 함유하는 탄소수 2∼10의 알콕시알킬기이다. R1∼R4가 불소를 함유하지 않는 기인 경우, R1∼R4는, 수소, 탄소수 1∼10의 알킬기, 탄소수 1∼10의 알콕시기, 또는 탄소수 2∼10의 알콕시알킬기로부터 선택된다. R1∼R4는 서로 동일해도 상이해도 된다. 또한, R1∼R4는 서로 결합하여 환 구조를 형성하고 있어도 된다.)
＜2＞
상기 세포를 접촉시키는 상기 일면이 구비하는 요철 구조의 볼록볼록간의 폭이 10μm∼1000μm인 ＜1＞에 기재된 의료 기구.
＜3＞
상기 세포를 접촉시키는 상기 일면의 수접촉각이 70°∼160°인 ＜1＞ 또는 ＜2＞에 기재된 의료 기구.
＜4＞
상기 기재가 구비하는 상기 일면은, 상기 불소 함유 환상 올레핀 폴리머와, 광경화성 화합물과, 광경화 개시제를 포함하는 불소 함유 환상 올레핀 폴리머 조성물에 의해 구성되는 ＜1＞ 내지 ＜3＞ 중 어느 하나에 기재된 의료 기구.
＜5＞
상기 불소 함유 환상 올레핀 폴리머 조성물 중에 있어서의 상기 불소 함유 환상 올레핀 폴리머와 상기 광경화성 화합물의 질량비(불소 함유 환상 올레핀 폴리머/광경화성 화합물)가, 99.9/0.1∼50/50인 ＜4＞에 기재된 의료 기구.
＜6＞
상기 일면에 접촉시킨 상기 세포를 배양하기 위해서 이용되는 ＜1＞ 내지 ＜5＞ 중 어느 하나에 기재된 의료 기구.
＜7＞
세포 배양에 있어서, 상기 세포가 군체를 형성하면서 부유 증식하는 ＜6＞에 기재된 의료 기구.
＜8＞
배양한 상기 세포를 인산 완충 생리 식염수에 의해 부유하여 상기 일면으로부터 이탈시키는 ＜6＞ 또는 ＜7＞에 기재된 의료 기구.
＜9＞
기재의 요철 구조를 갖는 일면에 세포를 접촉시키는 의료 기구의, 상기 일면을 형성하기 위해서 이용되는 불소 함유 환상 올레핀 폴리머로서, 하기 화학식(1)로 표시되는 구조 단위를 함유하는 불소 함유 환상 올레핀 폴리머.
Figure pct00008
(식(1) 중, R1∼R4 중 적어도 하나는, 불소, 불소를 함유하는 탄소수 1∼10의 알킬기, 불소를 함유하는 탄소수 1∼10의 알콕시기, 또는 불소를 함유하는 탄소수 2∼10의 알콕시알킬기이다. R1∼R4가 불소를 함유하지 않는 기인 경우, R1∼R4는, 수소, 탄소수 1∼10의 알킬기, 탄소수 1∼10의 알콕시기, 또는 탄소수 2∼10의 알콕시알킬기로부터 선택된다. R1∼R4는 서로 동일해도 상이해도 된다. 또한, R1∼R4는 서로 결합하여 환 구조를 형성하고 있어도 된다.)
＜10＞
기재의 요철 구조를 갖는 일면에 세포를 접촉시키는 의료 기구의, 상기 일면을 형성하기 위해서 이용되는 불소 함유 환상 올레핀 폴리머 조성물로서,
하기 화학식(1)로 표시되는 구조 단위를 함유하는 불소 함유 환상 올레핀 폴리머와,
광경화성 화합물과,
광경화 개시제
를 포함하는 불소 함유 환상 올레핀 폴리머 조성물.
Figure pct00009
(식(1) 중, R1∼R4 중 적어도 하나는, 불소, 불소를 함유하는 탄소수 1∼10의 알킬기, 불소를 함유하는 탄소수 1∼10의 알콕시기, 또는 불소를 함유하는 탄소수 2∼10의 알콕시알킬기이다. R1∼R4가 불소를 함유하지 않는 기인 경우, R1∼R4는, 수소, 탄소수 1∼10의 알킬기, 탄소수 1∼10의 알콕시기, 또는 탄소수 2∼10의 알콕시알킬기로부터 선택된다. R1∼R4는 서로 동일해도 상이해도 된다. 또한, R1∼R4는 서로 결합하여 환 구조를 형성하고 있어도 된다.)
＜11＞
＜1＞ 내지 ＜8＞ 중 어느 하나에 기재된 의료 기구의 상기 일면 상에, 상기 일면에 접촉시키도록 상기 세포를 파종하는 공정과,
상기 세포를 배양하여 배양 세포를 얻는 공정과,
상기 일면 상에 인산 완충 생리 식염수를 첨가하여, 상기 일면으로부터 상기 배양 세포를 부유시키는 공정
을 구비하는 세포 배양 방법.

Claims (12)

  1. 화학식(1)로 표시되는 구조 단위를 함유하는 불소 함유 환상 올레핀 폴리머를 사용한 기재를 구비하는 의료 기구로서,
    상기 기재는, 해당 기재와 세포를 접촉시키는 일면을 갖는 것이고, 또한, 해당 기재는, 상기 일면에 요철 구조를 구비하고,
    상기 요철 구조로 구성되는 볼록볼록간의 폭(L1)과, 상기 세포 중의 1개당의 파종 세포의 최대 직경(L2)의 비(L1/L2)가 1∼300이며, 상기 세포가 상기 요철 구조를 구비한 상기 일면에 접착 또는 부착하지 않고, 세포 증식을 촉진하는 것을 특징으로 하는 의료 기구.
    Figure pct00010

    (식(1) 중, R1∼R4 중 적어도 하나는, 불소, 불소를 함유하는 탄소수 1∼10의 알킬기, 불소를 함유하는 탄소수 1∼10의 알콕시기, 또는 불소를 함유하는 탄소수 2∼10의 알콕시알킬기이다. R1∼R4가 불소를 함유하지 않는 기인 경우, R1∼R4는, 수소, 탄소수 1∼10의 알킬기, 탄소수 1∼10의 알콕시기, 또는 탄소수 2∼10의 알콕시알킬기로부터 선택된다. R1∼R4는 서로 동일해도 상이해도 된다. 또한, R1∼R4는 서로 결합하여 환 구조를 형성하고 있어도 된다.)
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 L1/L2가 1∼100인 의료 기구.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 요철 구조의 볼록볼록간의 폭이 10μm∼1000μm인 의료 기구.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 일면의 수접촉각이 70°∼160°인 의료 기구.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 일면은, 상기 불소 함유 환상 올레핀 폴리머와, 광경화성 화합물과, 광경화 개시제를 포함하는 불소 함유 환상 올레핀 폴리머 조성물에 의해 구성되는 의료 기구.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 불소 함유 환상 올레핀 폴리머 조성물 중에 있어서의 상기 불소 함유 환상 올레핀 폴리머와 상기 광경화성 화합물의 질량비(불소 함유 환상 올레핀 폴리머/광경화성 화합물)가, 99.9/0.1∼50/50인 의료 기구.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 일면에 접촉시켜 세포를 배양하기 위해서 이용되는 의료 기구.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 세포로부터의 배양 세포가 세포 시트, 스페로이드 또는 콜로니로부터 선택되는 성장 세포의 군체를 형성하면서 부유 증식하는 의료 기구.
  9. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서,
    성장 세포의 군체를 완충액에 의해 유리하여 상기 일면으로부터 이탈시키는 의료 기구.
  10. 기재의 요철 구조를 갖는 일면에 세포를 접촉시키는 의료 기구의 상기 일면을 형성하기 위해서 이용되는 불소 함유 환상 올레핀 폴리머로서, 하기 화학식(1)로 표시되는 구조 단위를 함유하는 불소 함유 환상 올레핀 폴리머.
    Figure pct00011

    (식(1) 중, R1∼R4 중 적어도 하나는, 불소, 불소를 함유하는 탄소수 1∼10의 알킬기, 불소를 함유하는 탄소수 1∼10의 알콕시기, 또는 불소를 함유하는 탄소수 2∼10의 알콕시알킬기이다. R1∼R4가 불소를 함유하지 않는 기인 경우, R1∼R4는, 수소, 탄소수 1∼10의 알킬기, 탄소수 1∼10의 알콕시기, 또는 탄소수 2∼10의 알콕시알킬기로부터 선택된다. R1∼R4는 서로 동일해도 상이해도 된다. 또한, R1∼R4는 서로 결합하여 환 구조를 형성하고 있어도 된다.)
  11. 기재의 요철 구조를 갖는 일면에 세포를 접촉시키는 의료 기구의 상기 일면을 형성하기 위해서 이용되는 불소 함유 환상 올레핀 폴리머 조성물로서,
    하기 화학식(1)로 표시되는 구조 단위를 함유하는 불소 함유 환상 올레핀 폴리머와,
    광경화성 화합물과,
    광경화 개시제
    를 포함하는 불소 함유 환상 올레핀 폴리머 조성물.
    Figure pct00012

    (식(1) 중, R1∼R4 중 적어도 하나는, 불소, 불소를 함유하는 탄소수 1∼10의 알킬기, 불소를 함유하는 탄소수 1∼10의 알콕시기, 또는 불소를 함유하는 탄소수 2∼10의 알콕시알킬기이다. R1∼R4가 불소를 함유하지 않는 기인 경우, R1∼R4는, 수소, 탄소수 1∼10의 알킬기, 탄소수 1∼10의 알콕시기, 또는 탄소수 2∼10의 알콕시알킬기로부터 선택된다. R1∼R4는 서로 동일해도 상이해도 된다. 또한, R1∼R4는 서로 결합하여 환 구조를 형성하고 있어도 된다.)
  12. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 기재된 의료 기구의 일면 상에 접촉시키도록 세포를 파종하는 공정과,
    상기 세포를 배양하여 배양 세포를 얻는 공정과,
    해당 일면 상에 완충액을 첨가하여, 해당 일면으로부터 배양 세포를 부유시키는 공정
    을 구비하는 세포 배양 방법.
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