JP2004129558A - 細胞培養用容器、スクレーパーおよび細胞培養方法 - Google Patents

Abstract

【課題】足場依存性動物細胞の継代培養操作を閉鎖系で行うことができるようにする。
【解決手段】開口部を有し内部が中空であり、上記中空の内部に面積が順次大きくなる複数の培養面を形成した本体部と、上記本体部の開口部を覆う蓋と、上記本体部の内部に配置されるとともに、所定形状に形成されかつ磁力を帯び、上記本体部の内部に位置した状態で、他の磁性体によって上記本体部の外部からの操作で移動自在なスクレーパーとを有する。さらに、上記本体部の内部に位置し、上記本体部の内部に注入される培養対象の細胞を含まない培養液を、上記培養対象の細胞を含む培養液と混合せずに隔離する仕切り部材とを有する。
【選択図】　　　　図１

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞培養用容器、スクレーパーおよび細胞培養方法に関し、さらに詳細には、足場依存性動物細胞の培養に用いて好適な細胞培養用容器、スクレーパーおよび細胞培養方法に関する。
【０００２】
なお、本明細書において「足場依存性動物細胞」とは、動物由来の細胞であって、固体の表面に付着し伸展状態とならなければ増殖し難い細胞であり、「足場依存性動物細胞」としては、例えば、ヒトの通常２倍体線維芽細胞などが知られている。
【０００３】
また、本明細書においては、「足場依存性動物細胞が付着し伸展状態となって増殖可能な固体の表面」を、適宜に「培養面」と称することとする。
【０００４】
【従来の技術】
近年、足場依存性動物細胞を培養して増殖させる技術は、バイオテクノロジーの領域において広く普及しており、インターフェロンやエリスロポエチンなどのバイオ医薬品の生産などからも明らかなように、その工業的な意義の大きい技術である。
【０００５】
このため、様々の細胞培養技術が開発されているが、その基本的な細胞培養技術としては、古くから知られている細胞培養技術がそのまま継承されているものである。
【０００６】
例えば、細胞培養技術が発達した１９６０年代から、所謂、細胞密度効果が知られており、培養動物細胞は一般的に、細胞と細胞の間隙が少ない密度で培養した方が増殖しやすいという性質を有している。つまり、培養動物細胞は、互いの細胞間隙が広く空いていると増殖しにくくなり、栄養補給や酸素供給が十分な状態であっても死滅することがある。
【０００７】
また、増殖培養の対象である細胞を、別の異なる細胞を含む生物学的活性化法により刺激して増殖を容易にする場合においても、細胞密度効果により、両者の細胞それぞれの細胞密度が高い方が、相手方の細胞への刺激効果が高くなり、容易に増殖させることができる。
【０００８】
そして、上記した細胞密度効果の影響が大きい細胞が多い足場依存性動物細胞を大量に培養する場合には、まず、細胞数の少ない培養初期には、小さな培養面を有する小さな培養用容器で細胞密度を下げないようにして初期培養を行う。
【０００９】
その後、小さな培養用容器の小さな培養面における増殖限界点に細胞が到達する頃に、従前の小さな培養面に比べて大きな培養面を有する培養用容器に細胞を植え継ぐ継代培養操作を行い、細胞の増殖性を維持するようになされている。
【００１０】
こうした従来の足場依存性動物細胞の培養に用いられる培養用容器としては、培養用ディッシュの他に、例えば、各種サイズの培養用フラスコが知られている（例えば、特許文献１参照）。
【００１１】
【特許文献１】
特開平６−２３３６７１号公報（図１（ａ）（ｂ））
この培養容器である培養用フラスコにおいては、内部に足場依存性動物細胞と培養液とを注入した本体部にキャップをして密封し、本体部の略矩形形状の培養面に足場依存性動物細胞が付着し伸展状態となって培養が行われる。
【００１２】
そして、培養面における増殖限界点に足場依存性動物細胞が到達する頃には、培養用フラスコの外部空間を無菌的に維持するクリーンベンチやクリーンルームを用い、培養用フラスコのキャップを外して、本体部の内部にトリプシン液などを注入する。これにより、培養用フラスコの培養面に付着している足場依存性動物細胞を、付着し足場となっている培養面から剥して培養液中に浮遊させ、従前の培養面より大きな培養面を有するより大きなサイズの培養用フラスコに移して継代培養の操作が行われる。
【００１３】
こうした従来の足場依存性動物細胞の継代培養の操作は、開放系の継代培養操作であって、継代培養の操作中は、通常の外部空間に漂う雑菌による汚染を避けるために、培養用容器外において無菌操作を行わなければならないという問題点があった。
【００１４】
また、従来の足場依存性動物細胞の継代培養操作に際しては、無菌操作が欠かせないため、培養用容器である培養用フラスコの外部空間を無菌的に維持するのに、無菌空間を確保する大型のクリーンベンチやクリーンルームの設備を整えなければならないという問題点があった。
【００１５】
そして、こうしたクリーンベンチやクリーンルームなどの無菌空間において、継代培養を無菌操作によって行うには、操作に使用する全ての器具類を無菌的に維持した状態で、無菌操作に習熟した作業者が継代培養を行わなければならず、継代培養操作が非常に煩雑であるという問題点があった。
【００１６】
なお、足場依存性動物細胞とは異なる足場非依存性の浮遊性細胞の場合には、閉鎖系のまま継代培養操作が可能な方法が提案されている。
【００１７】
具体的には、内部が無菌的な２本のプラスチック製チューブを、無菌的な状態のまま切断、再接合できるチューブコネクターを用いる。このチューブとチューブコネクターとによって連結された２つのプラスチックバッグのうちの一方のプラスチックバッグの内部に、培養液に懸濁培養が可能な足場非依存性の浮遊性細胞を収容するとともに、他方のプラスチックバッグには培養液のみを収容する。そして、チューブを介して、足場非依存性の浮遊性細胞を収容したプラスチックバッグの内部に培養液を無菌的に注入することにより、容易に培養液量を拡大できる。
【００１８】
つまり、足場非依存性の浮遊性細胞を収容したプラスチックバッグを開封することなく、プラスチックバッグの外部からの操作のみの閉鎖系で、足場非依存性の浮遊性細胞は継代培養操作を行うことが可能となっていた。
【００１９】
しかしながら、足場依存性動物細胞の場合には、付着している足場依存性動物細胞を培養面から剥すためのトリプシン液などを、培養用容器を開封して注入する必要があるので、上記したような足場非依存性の浮遊性細胞では可能な閉鎖系の継代培養操作の手法を使用することができなかった。
【００２０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記したような従来の技術の有する種々の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、足場依存性動物細胞の継代培養操作を閉鎖系で行うことができるようにした細胞培養用容器、スクレーパーおよび細胞培養方法を提供しようとするものである。
【００２１】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、本発明のうち請求項１に記載の発明は、開口部を有し内部が中空であり、上記中空の内部に面積が順次大きくなる複数の培養面を形成した本体部と、上記本体部の開口部を覆う蓋とを有するようにしたものである。
【００２２】
また、本発明のうち請求項２に記載の発明は、所定形状に形成されかつ磁力を帯び、細胞培養用容器の内部に位置した状態で、他の磁性体によって上記細胞培養用容器の外部からの操作で移動自在であるようにしたものである。
【００２３】
また、本発明のうち請求項３に記載の発明は、開口部を有し内部が中空であり、上記中空の内部に面積が順次大きくなる複数の培養面を形成した本体部と、上記本体部の開口部を覆う蓋と、上記本体部の内部に配置されるとともに、所定形状に形成されかつ磁力を帯び、上記本体部の内部に位置した状態で、他の磁性体によって上記本体部の外部からの操作で移動自在なスクレーパーとを有するようにしたものである。
【００２４】
また、本発明のうち請求項４に記載の発明は、請求項１または請求項３のいずれか１項に記載の発明において、さらに、上記本体部の内部に位置し、上記本体部の内部に注入される培養対象の細胞を含まない培養液を、上記培養対象の細胞を含む培養液と混合せずに隔離する仕切り部材とを有するようにしたものである。
【００２５】
また、本発明のうち請求項５に記載の発明は、請求項４に記載の発明において、上記仕切り部材は、上記複数の培養面のうち最小の面積を有する微小な培養面を形成するものである。
【００２６】
また、本発明のうち請求項６に記載の発明は、請求項４または請求項５のいずれか１項に記載の発明において、上記仕切り部材は、上記本体部の内部に位置するトレイにより形成されたものである。
【００２７】
また、本発明のうち請求項７に記載の発明は、開口部を有し内部が中空であり、上記中空の内部に面積が順次大きくなる複数の培養面を形成した細胞培養用容器の本体部の上記開口部に蓋を締めた密栓状態において、上記複数の培養面のうちの最小の面積の培養面から順次に大きな面積の培養面を使用して、足場依存性動物細胞の継代培養を行うようにしたものである。
【００２８】
また、本発明のうち請求項８に記載の発明は、開口部を有し内部が中空であり、上記中空の内部に面積が順次大きくなる複数の培養面を形成した細胞培養用容器の本体部の上記開口部に蓋を締めた密栓状態において、仕切り部材の一方の側に形成された上記複数の培養面のうち最小の面積を有する微小な培養面に、培養液と足場依存性動物細胞とを注入し、上記仕切り部材の他方の側には培養液を注入して、上記最小の面積を有する微小な培養面を使用して初期培養を行い、上記仕切り部材の他方の側の培養液の一部を、上記仕切り部材の一方の側に追加して培地交換を行い、上記培地交換の後に行う継代培養操作後は、上記仕切り部材の他方の側の培養液の残余分を追加して、上記最小の面積を有する微小な培養面に比べて大きな面積の培養面を使用して足場依存性動物細胞を培養し、上記複数の培養面のうちの上記最小の面積の培養面から順次に大きな面積の培養面を使用して、足場依存性動物細胞の継代培養を行うようにしたものである。
【００２９】
また、本発明のうち請求項９に記載の発明は、開口部を有し内部が中空であり、上記中空の内部に面積が順次大きくなる複数の培養面を形成した細胞培養用容器の本体部の上記開口部に蓋を締めた密栓状態において、仕切り部材の一方の側に形成された上記複数の培養面のうち最小の面積を有する微小な培養面に、培養液と足場依存性動物細胞とを注入し、上記仕切り部材の他方の側には培養液を注入して、上記最小の面積を有する微小な培養面を使用して初期培養を行い、上記仕切り部材の他方の側の培養液の一部を、上記仕切り部材の一方の側に追加して培地交換を行い、上記培地交換の後に行う継代培養操作のときには、上記本体部の内部に配置されるとともに所定形状に形成されかつ磁力を帯びたスクレーパーを上記本体部の内部に位置させた状態で、他の磁性体によって上記本体部の外部からの操作で移動させて、上記スクレーパーにより上記最小の面積を有する微小な培養面に付着した足場依存性動物細胞を、上記最小の面積を有する微小な培養面から剥がし、上記継代培養操作後は、上記仕切り部材の他方の側の培養液の残余分を追加して、上記最小の面積を有する微小な培養面に比べて大きな面積の培養面を使用して足場依存性動物細胞を培養し、上記複数の培養面のうちの上記最小の面積の培養面から順次に大きな面積の培養面を使用して、足場依存性動物細胞の継代培養を行うようにしたものである。
【００３０】
【発明の実施の形態】
以下、添付の図面を参照しながら、本発明による細胞培養用容器および細胞培養方法の実施の形態の一例について詳細に説明するものとする。
【００３１】
図１には本発明による細胞培養用容器の実施の形態の一例を示す正面図（図３のＢ矢視図）が示されており、図２には図１に示す細胞培養用容器の上面図（図３のＡ矢視図）が示されており、図３には図１に示す細胞培養用容器の概略構成斜視説明図が示されている。
【００３２】
この細胞培養用容器１０は、単一の開口部１２ｂを有し、内部１２ａが中空の多面体である本体部１２と、本体部１２の開口部１２ｂを覆う蓋１４とを有して構成されている。
【００３３】
本体部１２ならびに蓋１４は、例えば、プラスチックにより形成されており、本体部１２は透明である。
【００３４】
そして、本体部１２は、略矩形形状の底面部１２ｃと、底面部１２ｃの外縁辺から立設されたいずれも略矩形形状の３つの側面部、即ち、第１の側面部１２ｄ、第２の側面部１２ｅならびに第３の側面部１２ｆと、第１の側面部１２ｄ、第２の側面部１２ｅならびに第３の側面部１２ｆの端部に位置し底面１２ｃと対向する略多角形形状の上面部１２ｇと、底面部１２ｃの第２の側面部１２ｅが形成された外縁辺と対向する外縁辺から延設された略多角形形状の斜面部１２ｈと、上面部１２ｇ、斜面部１２ｈ、第１の側面部１２ｄならびに第２の側面部１２ｅを連結し、開口部１２ｂが先端に位置する突部１２ｉが突設形成された先端部１２ｊとを有して構成されている。
【００３５】
これら底面部１２ｃ、第１の側面部１２ｄ、第２の側面部１２ｅ、第３の側面部１２ｆ、上面部１２ｇ、斜面部１２ｈならびに先端部１２ｊの外面は、それぞれ所定の平坦度が維持された平面により構成されている。
【００３６】
このため、本体部１２の底面部１２ｃ、第１の側面部１２ｄ、第２の側面部１２ｅあるいは第３の側面部１２ｆのいずれかが、ＸＹＺ直交座標系におけるＸＹ平面に位置するようにして、細胞培養用容器１０を静置することができる。
【００３７】
より詳細には、細胞培養用容器１０を静置した際に、本体部１２の底面部１２ｃの延長方向がＸＹ平面に一致する場合には、第１の側面部１２ｄ、第２の側面部１２ｅならびに第３の側面部１２ｆの延長方向はＺ軸方向に一致するようになり、また、本体部１２の第１の側面部１２ｄの延長方向がＸＹ平面に一致する場合には、底面部１２ｃならびに第２の側面部１２ｅの延長方向はＺ軸方向に一致し、第３の側面部１２ｆの延長方向はＸＹ平面に一致するようになり、また、本体部１２の第２の側面部１２ｅの延長方向がＸＹ平面に一致する場合には、底面部１２ｃ、第１の側面部１２ｄならびに第３の側面部１２ｆの延長方向はＺ軸方向に一致するようになり、また、本体部１２の第３の側面部１２ｆの延長方向がＸＹ平面に一致する場合には、底面部１２ｃならびに第２の側面部１２ｅの延長方向はＺ軸方向に一致し、第１の側面部１２ｄの延長方向はＸＹ平面に一致するようになる。
【００３８】
なお、図３に示す状態は、第１の側面部１２ｄがＸＹＺ直交座標系におけるＸＹ平面に位置するようにして、細胞培養用容器１０が静置され、底面部１２ｃならびに第２の側面部１２ｅの延長方向はＺ軸方向に一致し、第３の側面部１２ｆの延長方向はＸＹ平面に一致している状態を示すものである。
【００３９】
また、本体部１２の内部１２ａ側に位置する底面部１２ｃの略長方形形状の内面１２ｃｃ、第１の側面部１２ｄの略長方形形状の内面１２ｄｄ、第２の側面部１２ｅの略長方形形状の内面１２ｅｅ、第３の側面部１２ｆの略長方形形状の内面１２ｆｆ、上面部１２ｇの略六角形形状の内面１２ｇｇ、斜面部１２ｈの略四角形形状の内面１２ｈｈならびに先端部１２ｊの内面１２ｊｊはいずれも、所定の平坦度が維持された平面であり、表面が平滑に形成されている。
【００４０】
そして、第１の側面１２ｄの内面１２ｄｄの第２の側面１２ｅの近傍には、略板状体の仕切り部材１６が配設されている。この仕切り部材１６は、第１の側面１２ｄの内面１２ｄｄから立設される基部１６ａと、基部１６ａから延設された傾斜部１６ｂとを有して構成されている。
【００４１】
より詳細には、仕切り部材１６の基部１６ａは、第１の側面１２ｄの内面１２ｄｄの幅Ｗ１（図３参照）に略一致する長さで延長されており、基部１６ａの面１６ｃが第２の側面１２ｅの内面１２ｅｅと対向し、面１６ｃの背面側の面１６ｄが開口部１２ｂに対向している。そして、傾斜部１６ｂは第２の側面１２ｅに向かって傾斜している。
【００４２】
なお、仕切り部材１６と第２の側面１２ｅとの間隔、即ち、第１の側面１２ｄの内面１２ｄｄの延長方向に沿った仕切り部材１６の基部１６ａの面１６ｃと第２の側面１２ｅの内面１２ｅｅとの間隔Ｗ２（図２参照）は、仕切り部材１６の基部１６ａの面１６ｄから第１の側面１２ｄの内面１２ｄｄの延長方向に沿った端部までの長さＬ（図２参照）に比べて短くなるようにして寸法設定されている。
【００４３】
また、本体部１２の先端部１２ｊに突設形成された突部１２ｉは、略円筒状体であって、先端に略円形形状の開口部１２ｂが位置し、外周側にはねじ山１２ｋが形成されている。
【００４４】
そして、蓋１４の内周側１４ａには、本体部１２の突部１２ｉのねじ山１２ｋとねじ結合可能なねじ溝１４ｂが形成されている。また、略円形形状の先端面１４ｃには、ガス交換用のフィルター１４ｄが配設されている。このフィルター１４ｄは、外気とのガス交換は可能であるが雑菌は通さないようして形成されている。
【００４５】
従って、蓋１４によって本体部１２の開口部１２ｂを覆い、蓋１４を締めることにより密栓した際には、蓋１４のフィルター１４ｄによって本体部１２の内部１２ａと細胞培養用容器１０の外部との通気が確保されてガス交換が可能であるが、その一方、細胞培養用容器１０の外部から本体部１２の内部１２ａへの雑菌などの流入は防止される。
【００４６】
ここで、図４（ａ）には、スクレーパーを示す概略構成斜視図が示されている。このスクレーパー２０は、略三角柱状体であり、例えば、プラスチックにより形成されている。スクレーパー２０は、軸線方向に沿って凹面状に湾曲した３つの側面２０ａ，２０ｂ，２０ｃと、内部に配設され軸線方向に沿って延長された磁性体２２とを有している。こうしたスクレーパー２０には、鋭利な直線状の３つの角部２０ｄが形成されることになる。
【００４７】
なお、スクレーパー２０は、本体部１２の開口部１２ｂから入れて本体部１２の内部１２ａに配置することができ、後述する微小な培養面１０ａに位置することができる大きさに寸法設定されている。
【００４８】
そして、スクレーパー２０は、磁性体２２と磁力により互いに引き合う磁性体３２を有する作業用部材３０（図７参照）を用いることにより、作業用部材３０が移動する方向に従って移動自在となされているものである。
【００４９】
以上の構成において、上記した細胞培養用容器１０を用いて、足場依存性動物細胞を培養する際の操作について、（Ｉ）初期培養、（ＩＩ）培地交換、（ＩＩＩ）継代培養の順に説明することとする。
【００５０】
（Ｉ）初期培養
まず、足場依存性動物細胞の培養を開始する際には、培養に使用するピペットなどの各種器具と同様に、細胞培養用容器１０、即ち、本体部１２ならびに蓋１４とスクレーパー２０とを滅菌する。
【００５１】
そして、足場依存性動物細胞１００の培養を開始するときは、後述する培地交換操作や継代培養操作のときとは異なり、クリーンベンチやクリーンルームなどを用いた無菌空間において開放系で作業を行う。つまり、使用する各種器具と培養用容器自体と培養用容器の外部空間とのいずれも、無菌的に維持した状態で作業を行う。
【００５２】
こうしたクリーンベンチやクリーンルームなどを用いた無菌空間において、滅菌された細胞培養用容器１０の本体部１２の内部１２ａに、培養対象の細胞である足場依存性動物細胞１００と、足場依存性動物細胞１００の種類に応じた所定の培養液２００とを注入する。さらに、細胞培養用容器１０の本体部１２の内部１２ａにスクレーパー２０を配置する。
【００５３】
それから、蓋１４によって本体部１２の開口部１２ｂを覆い、蓋１４を締めて密栓する。こうして足場依存性動物細胞１００の培養の開始に際して、蓋１４を締めた細胞培養用容器１０の内部、即ち、本体部１２の内部１２ａの無菌性を保持する。そして、ＣＯ_２インキュベーターなどを用いて所定の条件で培養を行うことになる。
【００５４】
より詳細には、足場依存性動物細胞１００の培養を開始する際には、図５（ａ）に示すように、細胞培養用容器１０は、第１の側面部１２ｄがＸＹＺ直交座標系におけるＸＹ平面に位置するようにして静置する。この際、細胞培養用容器１０の本体部１２の底面部１２ｃ、第２の側面部１２ｅならびに仕切り部材１６の基部１６ａの延長方向はＺ軸方向に一致し、第１の側面部１２ｄならびに第３の側面部１２ｆの延長方向はＸＹ平面に一致している。
【００５５】
次に、第１の側面部１２ｄがＸＹ平面に位置するようにして静置された細胞培養用容器１０において、仕切り部材１６の基部１６ａの面１６ｃと本体部１２の第２の側面部１２ｅの内面１２ｅｅとの間に、足場依存性動物細胞１００と培養液２００を注入し、さらに、スクレーパー２０を配置する（図５（ａ）参照）。一方、仕切り部材１６の基部１６ａの面１６ｄ側には、培養液２００のみを注入する。
【００５６】
なお、以下の説明においては「足場依存性動物細胞１００を含む培養液２００」を、適宜に「細胞含有の培養液２００ａ」と称し、「足場依存性動物細胞１００を含まない培養液２００」を、適宜に「新鮮な培養液２００ｂ」と称することとする。
【００５７】
つまり、上記した初期培養のときに、仕切り部材１６の基部１６ａの面１６ｃと本体部１２の第２の側面部１２ｅの内面１２ｅｅとの間に注入された培養液２００は、細胞含有の培養液２００ａ（図５（ａ）においてグレーで示した培養液参照）であり、仕切り部材１６の基部１６ａの面１６ｄ側に注入された培養液は、新鮮な培養液２００ｂ（図５（ａ）において白抜きで示した培養液参照）である。このように、仕切り部材１６は、本体部１２の内部１２ａに注入される新鮮な培養液２００ｂを、細胞含有の培養液２００ａと混合せずに隔離するものである。
【００５８】
また、上記したようにして足場依存性動物細胞１００の培養を開始する際の細胞含有の培養液２００ａの総量は、培養液２００ａ中の足場依存性動物細胞１００の総数に応じて、初期培養が高密度下に行われ細胞密度効果により増殖効率を高く維持できるようにして予め設定されている。一方、新鮮な培養液２００ｂの総量は、後述する培地交換操作のときの使用量と継代培養操作のときの使用量との総和になるようにして予め設定されている。
【００５９】
こうした初期培養の際には、仕切り部材１６の基部１６ａの面１６ｃ側と面１６ｄ側のいずれにも培養液２００が注入されているが、仕切り部材１６の基部１６ａの面１６ｃ側にのみ足場依存性動物細胞１００が注入されているので、足場依存性動物細胞１００が付着し伸展状態となって増殖可能な固体の表面たる培養面は、図５（ａ）ならびに図６（ａ）に示す培養面１０ａである。
【００６０】
この培養面１０ａは、仕切り部材１６によって基部１６ａの面１６ｃ側に形成された微小な培養面である。より詳細には、培養面１０ａは、本体部１２の第１の側面１２ｄの内面１２ｄｄの一部の略矩形形状の領域（第１の側面１２ｄの内面１２ｄｄの幅Ｗ１と、仕切り部材１６の基部１６ａの面１６ｃと第２の側面１２ｅの内面１２ｅｅとの間隔Ｗ２との積に略一致する面積を有する領域である。）と、細胞含有の培養液２００ａ中に位置する底面部１２ｃの内面１２ｃｃの一部、第２の側面部１２ｅの内面１２ｅｅの一部、上面部１２ｇの内面１２ｇｇの一部ならびに仕切り部材１６の基部１６ａの面１６ｃの一部により構成されている。
【００６１】
（ＩＩ）培地交換
上記した（Ｉ）初期培養において説明したように、細胞培養用容器１０の培養面１０ａを使用して初期培養を所定の時間継続した後には、培地交換の操作を行う。
【００６２】
この培地交換の操作の際には、培地交換の操作を行う作業者が、蓋１４が締められて密栓され静置されている細胞培養用容器１０を把持して、所定の方向に静かに傾けることにより、新鮮な培養液２００ｂを細胞含有の培養液２００ａに追加する。この際、細胞含有の培養液２００ａが、追加される新鮮な培養液２００ｂと１：１の割合で混ざるようにして、所定量の新鮮な培養液２００ｂを細胞含有の培養液２００ａに追加することにより、通常の培養法でいうところの半交換が行われる。
【００６３】
その後、細胞培養用容器１０を、初期培養の際と同様に、第１の側面部１２ｄがＸＹＺ直交座標系におけるＸＹ平面に位置するようにして静置する（図５（ｂ）参照）。そして、ＣＯ_２インキュベーターなどを用いて所定の条件で培養を行う。
【００６４】
ここで、上記した半交換での培地交換によって、仕切り部材１６の基部１６ａの面１６ｃと本体部１２の第２の側面部１２ｅの内面１２ｅｅとの間の培養液２００、即ち、細胞含有の培養液２００ａの総量は、培地交換の前の細胞含有の培養液２００ａの総量のおよそ２倍になっている。つまり、細胞含有の培養液２００ａの液面の第１の側面１２ｄの内面１２ｄｄからの高さＨ２（図６（ｂ）参照）は、足場依存性動物細胞１００の培養を開始したときの細胞含有の培養液２００ａの液面の高さＨ１（図６（ａ）参照）のおよそ２倍となる。
【００６５】
なお、上記した培地交換の操作の際には、仕切り部材１６の基部１６ａの面１６ｄ側の新鮮な培養液２００ｂの一部のみを、仕切り部材１６の基部１６ａの面１６ｃ側に移動させる。このため、培地交換操作により、仕切り部材１６の基部１６ａの面１６ｃ側に位置する細胞含有の培養液２００ａや足場依存性動物細胞１００ならびにスクレーパー２０が、仕切り部材１６の基部１６ａの面１６ｄ側などに移動することはない。また、仕切り部材１６の基部１６ａの面１６ｄ側には、培地交換の前に比べて細胞含有の培養液２００ａに追加した量だけ減少した新鮮な培養液２００ｂが残っている（図６（ｂ）参照）。
【００６６】
（ＩＩＩ）継代培養
上記した（Ｉ）初期培養ならびに（ＩＩ）培地交換に続いて、足場依存性動物細胞１００の初期培養の培養面１０ａにおける増殖限界点に足場依存性動物細胞１００が到達する頃に、細胞を植え継ぐ継代培養の操作を行う。
【００６７】
この継代培養操作の際には、仕切り部材１６の基部１６ａの面１６ｃと本体部１２の第２の側面部１２ｅの内面１２ｅｅとの間に注入された細胞含有の培養液２００ａ中の足場依存性動物細胞１００は、培養面１０ａに付着し伸展状態となっている（図７に示す足場依存性動物細胞１００ａ参照）。
【００６８】
このため、継代培養操作の際には、まず、仕切り部材１６の基部１６ａの面１６ｃと本体部１２の第２の側面部１２ｅの内面１２ｅｅとの間に入れておいたスクレーパー２０によって、培養面１０ａに付着している足場依存性動物細胞１００ａを、付着し足場となっている培養面１０ａから剥して、細胞含有の培養液２００ａ中に浮遊させる（図７に示す足場依存性動物細胞１００ｂ参照）。
【００６９】
より詳細には、継代培養の操作を行う作業者が、作業用部材３０を細胞培養用容器１０の本体部１２の第１の側面部１２ｄの外面からスクレーパー２０と対向するように位置させて、所定の方向、例えば、第１の側面１２ｄの内面１２ｄｄの延長方向に沿って往復する方向（図７に示す矢印Ｄ方向）に移動する。そうすると、この作業用部材３０の磁性体３２とスクレーパー２０の磁性体２２とが磁力により互いに引き合い、作業用部材３０が移動する方向に従って、細胞培養用容器１０の本体部１２の内部１２ａにおいてスクレーパー２０が移動する（図７に示す矢印Ｅ参照）。
【００７０】
こうして細胞培養用容器１０の蓋１４を開けることなく、蓋１４を締めて密栓した状態において、細胞培養用容器１０の外部からの操作のみで移動するスクレーパー２０の角部２０ｄによって、培養面１０ａに付着している足場依存性動物細胞１００ａが剥がすことができ、浮遊する足場依存性動物細胞１００ｂとすることができる。
【００７１】
次に、継代培養の操作を行う作業者が、蓋１４の締まった状態の細胞培養用容器１０を把持して傾けて、初期培養（図５（ａ）参照）や培地交換操作後の培養（図５（ｂ）参照）とは異なり、底面部１２ｃがＸＹＺ直交座標系におけるＸＹ平面に位置するようにして細胞培養用容器１０を静置する（図５（ｃ）参照）。この際、細胞培養用容器１０の本体部１２の第１の側面部１２ｄ、第２の側面部１２ｅならびに第３の側面部１２ｆの延長方向はＺ軸方向に一致し、本体部１２の底面部１２ｃならびに上面部１２ｇの延長方向はＸＹ平面に一致している。
【００７２】
その結果、仕切り部材１６の基部１６ａの面１６ｃ側に位置する足場依存性動物細胞１００ｂが浮遊する細胞含有の培養液２００ａと、仕切り部材１６の基部１６ａの面１６ｄ側に位置する新鮮な培養液２００ｂとは共に、本体１２の底面部１２ｃの内面１２ｃｃ上に移動する（図５（ｃ）参照）。この際、細胞含有の培養液２００ａ中に浮遊している培養面１０ａにおいて増殖限界点に到達した足場依存性動物細胞１００も、細胞含有の培養液２００ａと共に本体１２の底面部１２ｃの内面１２ｃｃ上に移動する。
【００７３】
従って、使用する培養面を培養面１０ａから足場依存性動物細胞１００を剥がして植え継ぐ継代培養操作のときには、培地交換操作の後に仕切り部材１６の基部１６ａの面１６ｄ側に残っていた新鮮な培養液２００ｂ（図５（ｂ）参照）を追加して、培養液量を拡大できる。そして、本体１２の底面部１２ｃの内面１２ｃｃ上に位置する足場依存性動物細胞１００を含む細胞含有の培養液２００ａ（図５（ｃ）参照）の総量は、足場依存性動物細胞１００の培養を開始する際（図５（ａ）参照）の細胞含有の培養液２００ａと新鮮な培養液２００ｂとの総和に略一致する。
【００７４】
なお、仕切り部材１６の基部１６ａの面１６ｃ側に位置していたスクレーパー２０も、本体１２の底面部１２ｃの内面１２ｃｃ上に位置するようになる。
【００７５】
そして、足場依存性動物細胞１００、培養液２００ならびにスクレーパー２０が、細胞培養用容器１０の本体１２の底面部１２ｃの内面１２ｃｃ上に位置する状態で、ＣＯ_２インキュベーターなどを用いて所定の条件で培養を行う。
【００７６】
この継代培養操作後の培養の際には、本体１２の底面部１２ｃの内面１２ｃｃ上にのみ培養液２００と足場依存性動物細胞１００とが位置しているので、足場依存性動物細胞１００が付着し伸展状態となって増殖可能な固体の表面たる培養面は、図５（ｃ）に示す培養面１０ｂである。
【００７７】
この培養面１０ｂは、仕切り部材１６の基部１６ａの面１６ｃ側に形成された微小な培養面１０ａに比べて大きな面積の培養面である。より詳細には、培養面１０ｂは、本体部１２の底面部１２ｃの内面１２ｃｃの全領域と、培養液２００ａ中に位置する第１の側面１２ｄの内面１２ｄｄの一部と、第２の側面部１２ｅの内面１２ｅｅの一部と、第３の側面部１２ｆの内面１２ｆｆの一部と、斜面部１２ｈの内面１２ｈｈの一部により構成されている。
【００７８】
そして、足場依存性動物細胞１００の継代培養操作後の培養面１０ｂにおける増殖限界点に足場依存性動物細胞１００が到達する頃には、細胞を植え継ぐ２回目の継代培養の操作を行うか、あるいは、培養されて増殖した足場依存性動物細胞１００の回収を行う。
【００７９】
なお、この２回目の継代培養操作、あるいは、増殖した細胞の回収操作は、上記した足場依存性動物細胞１００の培養を開始するときと同様に、クリーンベンチやクリーンルームなどを用いた無菌空間において開放系で作業を行う。つまり、上記した１回目の継代培養操作のときとは異なり、使用する各種器具と培養用容器自体と培養用容器の外部空間とをいずれも、無菌的に維持した状態で作業を行う。
【００８０】
具体的には、まず、作業者が、細胞培養用容器１０の蓋１４を締めて密栓した状態において、作業用部材３０を細胞培養用容器１０の本体部１２の底面部１２ｃの外面からスクレーパー２０と対向するように位置させて所定の方向に移動させ、細胞培養用容器１０の外部からの操作のみでスクレーパー２０を移動させて、培養面１０ｃに付着している足場依存性動物細胞１００ａが剥がして、浮遊する足場依存性動物細胞１００ｂとする。
【００８１】
それから、クリーンベンチやクリーンルームなどを用いた無菌空間において、作業者により細胞培養用容器１０の蓋１４を開けて、ピペットなどにより、足場依存性動物細胞１００ｂが浮遊する細胞含有の培養液２００ａを回収して、細胞培養用容器１０の外部に取り出す。
【００８２】
上記したようにして、本発明による細胞培養用容器１０によれば、本体部１２の内部１２ａに面積が順次大きくなる複数の培養面たる培養面１０ａならびに培養面１０ｂが存在するので、培養面１０ａならびに培養面１０ｂのうち仕切り部材１６によって形成された最小の面積を有する微小な培養面１０ａの次は培養面１０ｂという順序で使用する培養面を変えることにより、足場依存性動物細胞１００の継代培養操作を細胞培養用容器１０の蓋１４を締めた密栓状態で外気に直接開放せずに閉鎖系で行うことができる。
【００８３】
つまり、本発明による細胞培養用容器１０によれば、予め無菌性を保持している密閉容器内（即ち、本体部１２の内部１２ａ）で、継代培養操作を行うことができるので、継代培養操作を雑菌が漂う通常の空間で行うことが可能となり、雑菌による汚染を避けるために培養用容器外において無菌操作を行う必要がなくなる。
【００８４】
換言すれば、本発明による細胞培養用容器１０における継代培養操作においては、雑菌が漂う通常の空間で作業者は操作することができ、しかも、作業者はスクレーパー２０を用いたり、蓋１４の締まった状態の細胞培養用容器１０を把持して傾けるという単純な操作をするだけでよく、無菌空間を確保する大型のクリーンベンチやクリーンルームの設備は必要なくなる。
【００８５】
このように、本発明による細胞培養用容器１０によれば、継代培養操作を簡単に行うことができ、従来の継代培養操作の大幅な簡便化が実現されるので、無菌操作に習熟した作業者でなくとも継代培養操作を行うことができるようになる。さらに、本発明による細胞培養用容器１０によれば、継代培養操作のみならず培地交換の操作も、細胞培養用容器１０の蓋１４を締めた密栓状態で外気に直接開放せずに閉鎖系で行うことができるので、全体として細胞培養工程が単純にして、培養の自動化を図ることも可能となる。
【００８６】
そして、本発明による細胞培養用容器１０によれば、本体部１２の内部１２ａに仕切り部材１６を配設するようにしたため、複数の培養面のうち最小の面積を有する微小な培養面１０ａが形成される。そして、この小さな培養面１０ａを初期培養の際に培養面として用いることにより、まだ培養初期で細胞数の少ないに足場依存性動物細胞１００の細胞密度を下げず初期培養を行うことができ、初期培養が高密度下に行われるため細胞密度効果で増殖効率を高くできる。
【００８７】
また、本発明による細胞培養用容器１０によれば、良好な初期培養に続いて培地交換を行い、そして、使用する培養面を培養面１０ａから培養面１０ｂに変えて次第に培養面の面積を大きくすることもできるので、一層良好な培養結果を得ることができる。
【００８８】
そして、本発明による細胞培養用容器１０においては、スクレーパー２０を用いて、付着している足場依存性動物細胞１００ａを剥がして浮遊させるようにしたので（図７参照）、本体部１２の内面に沿って移動するスクレーパー２０の鋭利な直線状の角部２０ｄと凹面状に湾曲した３つの側面２０ａ，２０ｂ，２０ｃとによって、付着している足場依存性動物細胞１００ａをすりつぶすことなく、細胞に与える物理的障害を最小に培養面から剥離でき、一層良好な培養結果を得ることができる。
【００８９】
また、スクレーパー２０を用いた場合には、細胞培養用容器１０の外部からの操作のみで、付着している足場依存性動物細胞１００ａを剥がして浮遊させることができるので、従来のスクレーパーのように、小さな本体部１２の開口部１２ｂから内部１２ａにスクレーパーを差し込んで細胞を掻きとる必要がなく、非常に簡単な操作ですみ、異物が混入する恐れもない。
【００９０】
なお、本発明による細胞培養用容器１０を構成するのに、例えば、従来より市販されている各種サイズの培養用フラスコを用いることも可能なので、細胞培養用容器１０を安価に製造することができる。
【００９１】
ここで、本発明による細胞培養用容器１０を用いて細胞の培養を行った実験結果を説明する。
【００９２】
具体的には、ヒトのウィルムス腫瘍細胞を刺激物質（即ち、細胞増殖を促進する物質）として用いることにより、ヒト末梢血単核球からナチュラルキラー細胞を誘導する。
【００９３】
まず、ヒトウィルムス腫瘍細胞株ＨＦＷＴ（理化学研究所の細胞開発銀行に細胞番号ＲＣＢ０６６５として保存されている。）に、予め５０グレイ（Ｇｙ）のＸ線を照射しておく。
【００９４】
そして、本発明による細胞培養用容器１０を第１の側面部１２ｄがＸＹ平面に位置するようにして静置させ（図５（ａ）に示す状態参照）、仕切り部材１６の基部１６ａの面１６ｃと本体部１２の第２の側面部１２ｅの内面１２ｅｅとの間に、
ヒト末梢血単核球１×１０^６個（ヒトナチュラルキラー細胞前駆細胞を含んでいる。）と、
Ｘ線照射済みＨＦＷＴ細胞２×１０^５個と、
インターロイキン−２（５００／ｍｌで全部で１０００ＩＵ）と、
１０％血清を含むリンパ球細胞培養用培地２ｍｌと
を注入する。一方、細胞培養用容器１０の仕切り部材１６の基部１６ａの面１６ｄ側には、
インターロイキン−２（５００／ｍｌで全部で９０００ＩＵ）と、
１０％血清を含む細胞培養用培地１８ｍｌと
を注入する。つまり、仕切り部材１６の基部１６ａの面１６ｃ側の１０％血清を含むリンパ球細胞培養用培地２ｍｌが、細胞含有の培養液２００ａであり、細胞培養用容器１０の仕切り部材１６の基部１６ａの面１６ｄ側の１０％血清を含む細胞培養用培地１８ｍｌが新鮮な培養液２００ｂであり、本発明による細胞培養用容器１０の初期培養の培養面は培養面１０ａである。なお、スクレーパー２０は用いていない。
【００９５】
ここで、この培養に用いた細胞培養用容器１０は、本体１２の底面部１２ｃの内面１２ｃｃの面積がおよそ７５ｃｍ^２で、第１の側面１２ｄの内面１２ｄｄの幅Ｗ１（図３参照）をおよそ３ｃｍとし、仕切り部材１６の基部１６ａの面１６ｃと第２の側面１２ｅの内面１２ｅｅとの間隔Ｗ２（図２参照）をおよそ１ｃｍとした。従って、細胞培養用容器１０の培養面１０ａの面積はおよそ３ｃｍ^２であり、培養面１０ｂの面積はおよそ７２ｃｍ^２である。
【００９６】
また、本発明による細胞培養用容器１０の他に、従来より市販されている培養面積７５ｃｍ^２の培養用フラスコ（ファルコン製）を用いた培養も行う。この際、従来の培養用フラスコも本発明による細胞培養用容器１０と同様に、側面がＸＹ平面に位置するようにして静置させる（図５（ａ）に示す状態参照）。そして、この従来の培養用フラスコには、
ヒト末梢血単核球１×１０^６個（ヒトナチュラルキラー細胞前駆細胞を含んでいる。）と、
Ｘ線照射済みＨＦＷＴ細胞２×１０^５個と、
インターロイキン−２（５００／ｍｌで全部で１００００ＩＵ）と、
１０％血清を含むリンパ球細胞培養用培地２ｍｌと、
１０％血清を含む細胞培養用培地１８ｍｌと
を注入する。つまり、この従来の培養用フラスコの内容物は、上記した本発明による細胞培養用容器１０の仕切り部材１６の基部１６ａの面１６ｃ側に注入されたものと、仕切り部材１６の基部１６ａの面１６ｄ側に注入されたものとが混じり合った物に対応する。
【００９７】
こうした従来の培養用フラスコの初期培養の培養面は、本発明による細胞培養用容器１０の本体部１２の第１の側面１２ｄの内面１２ｄｄ全面に対応する大きさを有し、本発明による細胞培養用容器１０の初期培養の培養面（即ち、培養面１０ａのみ）に比べて広くなる。その結果、従来の培養用フラスコの初期培養の際には、本発明による細胞培養用容器１０の初期培養に比べて、培養の対象細胞であるヒト末梢血単核球の細胞密度は低下する。
【００９８】
上記したような本発明による細胞培養用容器１０と従来の培養用フラスコとのそれぞれを用いて初期培養を開始し、４８時間が経過した後、本発明による細胞培養用容器１０については、作業者が蓋１４が締められて密栓され静置されている細胞培養用容器１０を把持して、所定の方向に静かに傾けることにより、新鮮な培養液２００ｂを細胞含有の培養液２００ａに追加して、半交換での培地交換を行った（図５（ｂ）ならびに図６（ｂ）に示す状態参照）。一方、従来の培養用フラスコについては培地交換操作ならびに継代培養操作は行わずに培養を継続した。
【００９９】
さらに、初期培養の開始から９６時間が経過した後、本発明による細胞培養用容器１０については、継代培養操作を行って培養面を培養面１０ａから培養面１０ｂに変更した（図５（ｃ）に示す状態参照）。一方、従来の培養用フラスコについても、本発明による細胞培養用容器１０と同様に、７２ｃｍ^２の培養面がＸＹ平面に位置するようにして静置させる。
【０１００】
そして、本発明による細胞培養用容器１０と従来の培養用フラスコとのいずれも、初期培養の開始から７日間培養した。
【０１０１】
ここで、ヒト活性化ナチュラルキラー細胞は、従来の常識では浮遊性細胞とされてきたものである。しかし、上記したようにしてヒト末梢血単核球からナチュラルキラー細胞を誘導するときに、殺傷標的となる刺激用細胞（即ち、ヒトのウィルムス腫瘍細胞）を用いて活性化すると、実際には、ヒト活性化ナチュラルキラー細胞は付着性細胞に変化し、足場依存性に増殖することが確認された。
【０１０２】
即ち、ヒト活性化ナチュラルキラー細胞を従来のように、浮遊状態で増殖させようとすると、細胞同士が相互に付着して塊を形成しつつ増殖するが、その増殖が遅いのに対して、上記したようにして培養面に付着しているリンパ球細胞の方は格段に早く増殖し、しかも細胞密度効果が強く現れる結果となった。
【０１０３】
なお、付着性細胞に変化して足場依存性に増殖するヒト活性化ナチュラルキラー細胞は付着性が弱いので、こうしたヒト活性化ナチュラルキラー細胞を継代培養操作の際に培養面から剥がすには、スクレーパー２０を用いずに、蓋１４の締まった状態の細胞培養用容器１０と従来の培養用フラスコとをそれぞれ作業者が把持して容器全体を揺り動かすだけでよい。
【０１０４】
図８には、本発明による細胞培養用容器１０ならびに従来の培養用フラスコそれぞれを用いて、初期培養の開始から７日間培養した後に計測されたナチュラルキラー細胞の総数を示す表が示されている。
【０１０５】
なお、ナチュラルキラー細胞数を確認するために、市販されている抗ＣＤ５６−モノクローナル抗体と抗ＣＤ１６−モノクローナル抗体とを用いて、定法により、７日間培養した細胞全体を免疫染色した。これにより、ナチュラルキラー細胞（ＣＤ５６陽性かつＣＤ１６陽性の細胞）の割合を、フローサイトメトリー法を用いて調べることができ、ナチュラルキラー細胞の割合に、容器内全体の細胞数を積算して、ナチュラルキラー細胞数を算出した。
【０１０６】
図８から明かなように、本発明による細胞培養用容器１０を使用した場合には、従来の培養用フラスコを使用した場合に比べて、平均７倍のナチュラルキラー細胞を誘導することができた。
【０１０７】
なお、上記した実施の形態は、以下の（１）乃至（８）に説明するように変形することができる。
【０１０８】
（１）上記した実施の形態においては、ヒトのウィルムス腫瘍細胞を刺激物質として用いることにより、ヒト末梢血単核球からナチュラルキラー細胞を誘導すのに細胞培養用容器１０を用いるようにしたが、これに限られるものではないことは勿論であり、本発明による細胞培養用容器１０を各種の足場依存性動物細胞、例えば、ヒト線維芽細胞ＷＩ−３８やサル腎臓細胞Ｖｅｒｏなどの培養に用いてもよい。
【０１０９】
あるいは、本発明による細胞培養用容器１０を、閉鎖系での継代培養操作が可能な培養用容器として、足場非依存性の浮遊性細胞（例えば、ヒト白血病細胞Ｋ５６２）の培養に用いてもよい。
【０１１０】
こうした各種細胞の培養に細胞培養用容器１０を用いる場合には、培養対象である細胞の種類に応じて培養液や刺激物質を選択して使用すればよい。
【０１１１】
（２）上記した実施の形態においては、細胞培養用容器１０の本体部１２ならびに蓋１４をプラスチックにより形成するようにしたが、これに限られるものではないことは勿論であり、培養対象である足場依存性動物細胞が付着可能な培養面を備えるようにして、各種材料により細胞培養用容器１０を構成するようにすればよい。
【０１１２】
また、細胞培養用容器１０の各種寸法を任意に設定してよく、培養面１０ａならびに培養面１０ｂなどの培養面の大きさも任意に変更可能なものである。所定の足場依存性動物細胞の増殖を促進するのに、細胞培養用容器１０の本体部１２の内部１２ａに所定の処理やコーティングを施すようにしてもよい。
【０１１３】
また、本発明による細胞培養用容器１０の本体部１２は透明なので、内部で培養している足場依存性動物細胞の顕微鏡観察などが容易であるが、培養対象である足場依存性動物細胞の種類などに応じて、細胞培養用容器１０の本体部１２を透明にしなくてもよい。
【０１１４】
そして、本発明による細胞培養用容器１０の形状は、図１乃至図３に示すようにしたが、これに限られるものではないことは勿論であり、培養対象である足場依存性動物細胞を容器外に回収する際に回収し易いようにしたり、複数の細胞培養用容器１０を積み重ねることができるようにしたり、顕微鏡観察し易くするなど適宜変更するようにしてもよい。また、培養面１０ａ，１０ｂなどの培養面の形状も矩形形状には限定されず、円形形状や台形形状となるように構成してもよいし、培養面は平滑な表面には限定されず凹凸や起伏があってもよい。
【０１１５】
（３）上記した実施の形態においては、細胞培養用容器１０の内部に配設された仕切り部材１６によって、仕切り部材１６の基部１６ａの面１６ｃ側と面１６ｄ側とは遮断されるようにしたが、これに限られるものではないことは勿論であり、仕切り部材１６の全部あるいは一部を、ガスや液体は透過可能であって細胞は透過できない膜によって形成するようにしてもよい。こうすると、細胞培養用容器１０を傾けることなしに、こうした膜によって形成された仕切り部材を介して培地交換をすることができる。
【０１１６】
また、図９（ａ）（ｂ）に示すように、仕切り部材１６を本体部１２と一体的に成形するようにしてもよい。
【０１１７】
また、培養対象である足場依存性動物細胞の種類や継代培養操作の回数などに応じて、仕切り部材１６を配設しないようにしてもよい。
【０１１８】
（４）上記した実施の形態においては、蓋１４は、細胞培養用容器１０の単一の開口部１２ｂを覆うようにしたが、これに限られるものではないことは勿論であり、本体部１２に複数の開口部が形成された場合には、各開口部に蓋をするようにすればよい。また、複数の蓋を用いる場合には、それぞれ異なる色彩の蓋を用いるようにすると、作業ミスを軽減することができる。また、蓋１４はねじ溝１４ｂによってねじ結合するようにしたが、その他形状により開口部を覆うようにしてもよい。
【０１１９】
さらに、蓋１４にはガス交換用のフィルター１４ｄが配設されるようにしたが、培養対象である足場依存性動物細胞の種類や培養条件などに応じては、フィルター１４ｄを配設せずに、蓋を締めた状態において、本体部１２の内部１２ａと細胞培養用容器１０の外部との通気がなくガス交換できないようにしてもよい。
【０１２０】
（５）上記した実施の形態においては、スクレーパー２０は磁性体２２を有し、磁力によって細胞培養用容器１０の外部からの操作のみで移動可能となされていたが、これに限られるものではないことは勿論であり、磁力以外の動力でスクレーパー２０が移動可能なように構成してもよい。
【０１２１】
また、スクレーパー２０は略三角柱状体としたが、培養面に付着している足場依存性動物細胞にショックを与えることなく浮遊する足場依存性動物細胞とすることができる範囲内で形状を変更したり、あるいは、プラスチック以外の材料で形成するようにしてもよい。また、スクレーパー２０全体を磁性体によって形成するようにしてもよい。また、スクレーパーの形状は、細胞培養用容器１０の培養面の表面形状に応じて設計すると、付着している足場依存性動物細胞を効率よく剥離することができる。
【０１２２】
また、培養対象である足場依存性動物細胞の種類に応じては、スクレーパー２０を用いなくてもよい。
【０１２３】
具体的には、温度操作することによって培養面に付着している足場依存性動物細胞の付着能力を低減化できる場合には、スクレーパー２０によって掻き出すことなしに温度操作するだけでよい。また、上記した付着性細胞に変化して足場依存性に増殖するヒト活性化ナチュラルキラー細胞のように、付着性の弱い足場依存性動物細胞の場合には、スクレーパー２０を用いずに容器全体を揺り動かすだけでよい。勿論、ヒトの通常２倍体線維芽細胞のように付着性の強い足場依存性動物細胞の場合には、温度操作や揺り動かすだけでは培養面から容易に剥離することができないので、スクレーパー２０を用いるのが有効である。
【０１２４】
（６）上記した実施の形態においては、培養面１０ａの次は培養面１０ｂという順序で使用する培養面を変えることにより、１回だけ継代培養操作を行うようになされていたが、これに限られるものではないことは勿論であり、培養対象である細胞の種類に応じては、図１０（ａ）（ｂ）（ｃ）に示すようにして継代培養操作を２回行うようにしてもよい。
【０１２５】
より詳細には、上記した（Ｉ）初期培養に続いて、足場依存性動物細胞１００の初期培養の培養面１０ａにおける増殖限界点に足場依存性動物細胞１００が到達する頃に、１回目の継代培養の操作を行う。
【０１２６】
まず、この１回目の継代培養の操作の際には、初期培養によって培養面１０ａに付着している足場依存性動物細胞１００ａを、スクレーパー２０によって付着し足場となっている培養面１０ａから剥して、細胞含有の培養液２００ａ中に浮遊させる（図１０（ａ）参照）。
【０１２７】
そして、継代培養の操作を行う作業者が、蓋１４の締まった状態の細胞培養用容器１０を把持して傾けて、仕切り部材１６の基部１６ａの面１６ｃ側の足場依存性動物細胞１００ｂが浮遊する細胞含有の培養液２００ａを、仕切り部材１６の基部１６ａの面１６ｄ側に移動させて、新鮮な培養液２００ｂと混ぜる。この際、仕切り部材１６の基部１６ａの面１６ｃ側には、培養液２００を残留させる必要はない。また、仕切り部材１６の基部１６ａの面１６ｃ側に位置していたスクレーパー２０も、仕切り部材１６の基部１６ａの面１６ｄ側に移動させる（図１０（ｂ）参照）。
【０１２８】
こうして、培養面１０ａにおいて増殖限界点に到達した足場依存性動物細胞１００を、細胞含有の培養液２００ａと共に仕切り部材１６の基部１６ａの面１６ｄ側に移動させて、培養する培養液２００の総量と培養面の面積とを増加させる。
【０１２９】
つまり、上記した１回目の継代培養操作後の培養面は、図１０（ｂ）に示す培養面１０ｃとなる。この培養面１０ｃは、仕切り部材１６の基部１６ａの面１６ｄ側に形成され、培養面１０ａに比べて大きな面積の培養面である。より詳細には、培養面１０ｃは、本体部１２の第１の側面１２ｄの内面１２ｄｄの一部の略矩形形状の領域（第１の側面１２ｄの内面１２ｄｄの幅Ｗ１（図３参照）と、仕切り部材１６の基部１６ａの面１６ｄから第１の側面１２ｄの内面１２ｄｄの延長方向に沿った端部までの長さＬ（図２参照）との積に略一致する面積を有する領域である。）と、細胞含有の培養液２００ａ中に位置する底面部１２ｃの内面１２ｃｃの一部、斜面部１２ｈの内面１２ｈｈの一部、上面部１２ｇの内面１２ｇｇの一部ならびに仕切り部材１６の基部１６ａの面１６ｄの一部により構成されている。
【０１３０】
次に、足場依存性動物細胞１００の１回目の継代培養操作後の培養面１０ｃにおける増殖限界点に足場依存性動物細胞１００が到達する頃に、細胞を植え継ぐ２回目の継代培養の操作を行う。
【０１３１】
この２回目の継代培養操作の際には、仕切り部材１６の基部１６ａの面１６ｄ側に位置する足場依存性動物細胞１００は、培養面１０ｃに付着し伸展状態となっているので、スクレーパー２０によって、付着し足場となっている培養面１０ｃから剥して細胞含有の培養液２００ａ中に浮遊させる。そして、細胞培養用容器１０を、蓋１４の締まった状態の細胞培養用容器１０を把持して傾けて、底面部１２ｃがＸＹＺ直交座標系におけるＸＹ平面に位置するようにして静置させる（図１０（ｃ）参照）。
【０１３２】
これにより、使用する培養面を、仕切り部材１６の基部１６ａの面１６ｄ側に形成された培養面１０ｃに比べて大きな面積の培養面である培養面１０ｂに変更する。このようにして、培養面１０ａ、培養面１０ｃ、培養面１０ｂの順で、順次大きくなる複数の培養面それぞれを使用するようにしてもよい。
【０１３３】
また、培養面１０ａの次には、培養面１０ａと培養面１０ｃとを培養面として使用し、その後、培養面１０ｂを使用するようにしてもよい。
【０１３４】
（７）上記した実施の形態においては、継代培養の操作のときに、仕切り部材１６の基部１６ａの面１６ｄ側の新鮮な培養液２００ｂ（図５（ｂ）参照）が追加されるようになされていたが、これに限られるものではないことは勿論であり、培養対象である細胞の種類や培地の種類や培養条件などに応じては、継代培養操作のときに新鮮な培養液が追加されないようにしてもよい。また、閉鎖系を維持した状態であれば、継代培養操作のときに、本発明による細胞培養用容器内へ新たに新鮮な培養液を注入するように構成してもよい。
【０１３５】
例えば、図１１乃至図１４には、本発明による細胞培養用容器１０の他の実施の形態である細胞培養用容器４０，５０，６０，７０が示されている。
【０１３６】
より詳細には、図１１に示す細胞培養用容器４０は、上記した細胞培養用容器１０の３つの側面部（即ち、第１の側面部１２ｄ、第２の側面部１２ｅならびに第３の側面部１２ｆ）に代わって５つの側面部を有するようにし、斜面部１２ｈを大きくするとともに底面部１２ｃを小さくして、仕切り部材１６の大きさと配設位置とを変更したものである。
【０１３７】
この細胞培養用容器４０によれば、仕切り部材１６によって、培養対象の細胞を含まない培養液が、培養対象の細胞を含む培養液と混合せずに隔離されているので、この培養細胞を含まない培養液を、継代培養操作のときに培養対象の細胞を含む培養液に追加しながら、面積が順次大きくなる培養面４０ａ（図１１（ａ）参照）、培養面４０ｂ（図１１（ｂ）参照）、培養面４０ｃ（図１１（ｃ）参照）、培養面４０ｄ（図１１（ｄ）参照）を、最小の面積を有する培養面４０ａから順次使用して、３回の継代培養操作を行うことができる。
【０１３８】
こうした細胞培養容器４０によれば、細胞継代可能な回数を増やすことができる。また、細胞培養容器４０は、静置されている状態で、現在何回目の継代培養操作が行われたのかが明らかなので、作業ミスを低減し効率よく作業することができる。なお、細胞培養容器４０を収容して静置するために収容ラックを用いてもよい。
【０１３９】
また、細胞培養用容器４０のように３つ以上の培養面が形成されている場合には、培養面が順次大きくなるようにして使用する培養面を変えればよいので、培養面４０ａの次に培養面４０ｄを使用してもよいことは勿論である。
【０１４０】
また、図１２に示す細胞培養用容器５０は、上記した細胞培養用容器１０の斜面部１２ｈをなくして底面部１２ｃを拡大し、本体部の内部に仕切り部材１６に代わって、互いに異なる大きさの２つのトレイを底面部１２ｃに積層するようにして配設したものである。
【０１４１】
この細胞培養用容器５０においては、小さなトレイによって形成される最小の面積を有する培養面５０ａを使用する初期培養のときに、大きなトレイと本体部の底面部とに培養対象の細胞を含まない培養液を注入しておく（図１２（ａ−１）（ａ−２）参照）。
【０１４２】
そして、初期培養の後に、小さなトレイ内の培養液を大きなトレイ内の培養対象の細胞を含まない培養液に混ぜて１回目の継代培養操作を行い、使用する培養面を培養面５０ａから大きなトレイによって形成される培養面５０ｂに拡大する（図１２（ｂ−１）（ｂ−２）参照）。その後、大きなトレイ内の培養液を底面部の培養対象の細胞を含まない培養液に混ぜて２回目の継代培養操作を行い、使用する培養面を培養面５０ｂから底面部によって形成される培養面５０ｃに拡大する（図１２（ｃ−１）（ｃ−２）参照）。
【０１４３】
また、図１３に示す細胞培養用容器６０は、図１１に示す細胞培養用容器４０の仕切り部材がないものである。この細胞培養用容器６０においては、継代培養操作のときに新鮮な培養液を追加せずに、面積が順次大きくなる培養面６０ａ（図１３（ａ）参照）、培養面６０ｂ（図１３（ｂ）参照）、培養面６０ｃ（図１３（ｃ）参照）、培養面６０ｄ（図１３（ｄ）参照）、培養面６０ｅ（図１３（ｅ）参照）を、最小の面積を有する培養面６０ａから順次使用して、４回の継代培養操作を行うことができる。
【０１４４】
また、図１４に示す細胞培養用容器７０は、図１２に示す細胞培養用容器５０に比べてトレイが１つ多く配設されたものである。この細胞培養用容器７０においては、継代培養操作のときに新鮮な培養液を追加せずに、面積が順次大きくなる培養面７０ａ（図１４（ａ−１）（ａ−２）参照）、培養面７０ｂ（図１４（ｂ−１）（ｂ−２）参照）、培養面７０ｃ（図１４（ｃ−１）（ｃ−２）参照）、培養面７０ｄ（図１４（ｄ−１）（ｄ−２）参照）を、最小の面積を有する培養面７０ａから順次使用して、３回の継代培養操作を行うことができる。
【０１４５】
つまり、細胞培養用容器６０（図１３参照）ならびに細胞培養用容器７０（図１４参照）の場合には、培養対象の細胞を含まない培養液が、培養対象の細胞を含む培養液と混合せずに隔離されることがないので、初期培養とその後の複数の継代培養操作後とでは、培養液の総量は一定のまま変化せず、培養面の面積だけが順次大きくなる。
【０１４６】
（８）上記した実施の形態ならびに上記（１）乃至（７）に示す変形例は、適宜に組み合わせるようにしてもよい。
【０１４７】
【発明の効果】
本発明は、以上説明したように構成されているので、足場依存性動物細胞の継代培養操作を閉鎖系で行うことができるという優れた効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明による細胞培養用容器の実施の形態の一例を示す正面図（図３のＢ矢視図）である。
【図２】図１に示す細胞培養用容器の上面図（図３のＡ矢視図）である。
【図３】図１に示す細胞培養用容器の概略構成斜視説明図である。
【図４】（ａ）は、スクレーパーを示す概略構成斜視図が示されており、（ｂ）は、（ａ）のＣ−Ｃ線断面図である。
【図５】（ａ）は、初期培養のときの本発明による細胞培養用容器を示す概略構成斜視説明図であり、（ｂ）は、培地交換操作後の本発明による細胞培養用容器を示す概略構成斜視説明図であり、（ｃ）は、継代培養操作後の本発明による細胞培養用容器を示す概略構成斜視説明図である。
【図６】（ａ）は、初期培養のときの本発明による細胞培養用容器の要部を示す概略構成斜視説明図であり、（ｂ）は、培地交換操作後の本発明による細胞培養用容器の要部を示す概略構成斜視説明図である。
【図７】継代培養操作を示す概念説明図である。
【図８】本発明による細胞培養用容器ならびに従来の培養用フラスコそれぞれを用いて、初期培養の開始から７日間培養した後に計測されたナチュラルキラー細胞の総数を示す表である。
【図９】本発明による細胞培養用容器の実施の形態の他の例を示す概略構成斜視説明図であり、（ａ）は、初期培養のときの細胞培養用容器を示す概略構成斜視説明図であり、（ｂ）は、継代培養操作後の細胞培養用容器を示す概略構成斜視説明図である。
【図１０】本発明による細胞培養用容器の実施の形態の他の例を示す概略構成斜視説明図であり、（ａ）は、初期培養のときの細胞培養用容器を示す概略構成斜視説明図であり、（ｂ）は、１回目の継代培養操作後の細胞培養用容器を示す概略構成斜視説明図であり、（ｃ）は、２回目の継代培養操作後の細胞培養用容器を示す概略構成斜視説明図である。
【図１１】本発明による細胞培養用容器の実施の形態の他の例を示す概略構成斜視説明図であり、（ａ）は、初期培養のときの細胞培養用容器を示す概略構成斜視説明図であり、（ｂ）は、１回目の継代培養操作後の細胞培養用容器を示す概略構成斜視説明図であり、（ｃ）は、２回目の継代培養操作後の細胞培養用容器を示す概略構成斜視説明図であり、（ｄ）は、３回目の継代培養操作後の細胞培養用容器を示す概略構成斜視説明図である。
【図１２】本発明による細胞培養用容器の実施の形態の他の例を示す概略構成斜視説明図であり、（ａ−１）は、初期培養のときの細胞培養用容器の正面図であり、（ａ−２）は、初期培養のときの細胞培養用容器の上面図であり、（ｂ−１）は、１回目の継代培養操作後の細胞培養用容器の正面図であり、（ｂ−２）は、１回目の継代培養操作後の細胞培養用容器の上面図であり、（ｃ−１）は、２回目の継代培養操作後の細胞培養用容器の正面図であり、（ｃ−２）は、２回目の継代培養操作後の細胞培養用容器の上面図である。
【図１３】本発明による細胞培養用容器の実施の形態の他の例を示す概略構成斜視説明図であり、（ａ）は、初期培養のときの細胞培養用容器を示す概略構成斜視説明図であり、（ｂ）は、１回目の継代培養操作後の細胞培養用容器を示す概略構成斜視説明図であり、（ｃ）は、２回目の継代培養操作後の細胞培養用容器を示す概略構成斜視説明図であり、（ｄ）は、３回目の継代培養操作後の細胞培養用容器を示す概略構成斜視説明図であり、（ｅ）は、４回目の継代培養操作後の細胞培養用容器を示す概略構成斜視説明図である。
【図１４】本発明による細胞培養用容器の実施の形態の他の例を示す概略構成斜視説明図であり、（ａ−１）は、初期培養のときの細胞培養用容器の正面図であり、（ａ−２）は、初期培養のときの細胞培養用容器の上面図であり、（ｂ−１）は、１回目の継代培養操作後の細胞培養用容器の正面図であり、（ｂ−２）は、１回目の継代培養操作後の細胞培養用容器の上面図であり、（ｃ−１）は、２回目の継代培養操作後の細胞培養用容器の正面図であり、（ｃ−２）は、２回目の継代培養操作後の細胞培養用容器の上面図であり、（ｄ−１）は、３回目の継代培養操作後の細胞培養用容器の正面図であり、（ｄ−２）は、３回目の継代培養操作後の細胞培養用容器の上面図である。
【符号の説明】
１０，４０，５０，６０，７０　　　細胞培養用容器
１０ａ，１０ｂ，１０ｃ　　培養面
１２　　　本体部
１２ａ　　内部
１２ｂ　　開口部
１２ｃ　　底面部
１２ｄ　　第１の側面部
１２ｅ　　第２の側面部
１２ｆ　　第３の側面部
１２ｇ　　上面部
１２ｈ　　斜面部
１２ｉ　　突部
１２ｊ　　先端部
１２ｋ　　ねじ山
１２ｃｃ，１２ｄｄ，１２ｅｅ，１２ｆｆ，１２ｇｇ，１２ｈｈ，１２ｊｊ内面
１４　　　蓋
１４ａ　　内周側
１４ｂ　　ねじ溝
１４ｃ　　先端面
１４ｄ　　フィルター
１６　　　仕切り部材
１６ａ　　基部
１６ｂ　　傾斜部
１６ｃ，１６ｄ　　面
２０　　　スクレーパー
２０ａ，２０ｂ，２０ｃ　　側面
２０ｄ　　角部
２２　　　磁性体
３０　　　作業用部材
３２　　　磁性体
１００　　　足場依存性動物細胞
１００ａ　　付着している足場依存性動物細胞
１００ｂ　　浮遊している足場依存性動物細胞
２００　　　培養液
２００ａ　　細胞含有の培養液
２００ｂ　　新鮮な培養液

Claims (9)

1. 開口部を有し内部が中空であり、前記中空の内部に面積が順次大きくなる複数の培養面を形成した本体部と、
   前記本体部の開口部を覆う蓋と
   を有する細胞培養用容器。
2. 所定形状に形成されかつ磁力を帯び、細胞培養用容器の内部に位置した状態で、他の磁性体によって前記細胞培養用容器の外部からの操作で移動自在である
   スクレーパー。
3. 開口部を有し内部が中空であり、前記中空の内部に面積が順次大きくなる複数の培養面を形成した本体部と、
   前記本体部の開口部を覆う蓋と、
   前記本体部の内部に配置されるとともに、所定形状に形成されかつ磁力を帯び、前記本体部の内部に位置した状態で、他の磁性体によって前記本体部の外部からの操作で移動自在なスクレーパーと
   を有する細胞培養用容器。
4. 請求項１または請求項３のいずれか１項に記載の細胞培養用容器において、さらに、
   前記本体部の内部に位置し、前記本体部の内部に注入される培養対象の細胞を含まない培養液を、前記培養対象の細胞を含む培養液と混合せずに隔離する仕切り部材と
   を有する細胞培養用容器。
5. 請求項４に記載の細胞培養用容器において、
   前記仕切り部材は、前記複数の培養面のうち最小の面積を有する微小な培養面を形成する
   ものである細胞培養用容器。
6. 請求項４または請求項５のいずれか１項に記載の細胞培養用容器において、
   前記仕切り部材は、前記本体部の内部に位置するトレイにより形成された
   ものである細胞培養用容器。
7. 開口部を有し内部が中空であり、前記中空の内部に面積が順次大きくなる複数の培養面を形成した細胞培養用容器の本体部の前記開口部に蓋を締めた密栓状態において、前記複数の培養面のうちの最小の面積の培養面から順次に大きな面積の培養面を使用して、足場依存性動物細胞の継代培養を行う
   細胞培養方法。
8. 開口部を有し内部が中空であり、前記中空の内部に面積が順次大きくなる複数の培養面を形成した細胞培養用容器の本体部の前記開口部に蓋を締めた密栓状態において、仕切り部材の一方の側に形成された前記複数の培養面のうち最小の面積を有する微小な培養面に、培養液と足場依存性動物細胞とを注入し、前記仕切り部材の他方の側には培養液を注入して、前記最小の面積を有する微小な培養面を使用して初期培養を行い、
   前記仕切り部材の他方の側の培養液の一部を、前記仕切り部材の一方の側に追加して培地交換を行い、
   前記培地交換の後に行う継代培養操作後は、前記仕切り部材の他方の側の培養液の残余分を追加して、前記最小の面積を有する微小な培養面に比べて大きな面積の培養面を使用して足場依存性動物細胞を培養し、
   前記複数の培養面のうちの前記最小の面積の培養面から順次に大きな面積の培養面を使用して、足場依存性動物細胞の継代培養を行う
   細胞培養方法。
9. 開口部を有し内部が中空であり、前記中空の内部に面積が順次大きくなる複数の培養面を形成した細胞培養用容器の本体部の前記開口部に蓋を締めた密栓状態において、仕切り部材の一方の側に形成された前記複数の培養面のうち最小の面積を有する微小な培養面に、培養液と足場依存性動物細胞とを注入し、前記仕切り部材の他方の側には培養液を注入して、前記最小の面積を有する微小な培養面を使用して初期培養を行い、
   前記仕切り部材の他方の側の培養液の一部を、前記仕切り部材の一方の側に追加して培地交換を行い、
   前記培地交換の後に行う継代培養操作のときには、前記本体部の内部に配置されるとともに所定形状に形成されかつ磁力を帯びたスクレーパーを前記本体部の内部に位置させた状態で、他の磁性体によって前記本体部の外部からの操作で移動させて、前記スクレーパーにより前記最小の面積を有する微小な培養面に付着した足場依存性動物細胞を、前記最小の面積を有する微小な培養面から剥がし、
   前記継代培養操作後は、前記仕切り部材の他方の側の培養液の残余分を追加して、前記最小の面積を有する微小な培養面に比べて大きな面積の培養面を使用して足場依存性動物細胞を培養し、
   前記複数の培養面のうちの前記最小の面積の培養面から順次に大きな面積の培養面を使用して、足場依存性動物細胞の継代培養を行う
   細胞培養方法。

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