JP2020174560A - 培養方法、培養容器、ガス封入チャンバおよび無菌アイソレータ - Google Patents

Abstract

【課題】空気と異なる培養用ガスの雰囲気下で細胞培養を行う場合に、該培養用ガスの使用量を低減することのできる、培養方法、培養容器および無菌アイソレータを提供すること。【解決手段】開閉可能な密閉型の培養容器内に細胞および培地を収容し、前記培養容器内において空気と異なる培養用ガスの雰囲気下で細胞を培養する、培養方法。【選択図】図１

Description

本発明は、培養方法、培養容器、ガス封入チャンバおよび無菌アイソレータに関する。

細胞の培養方法として、例えば、図６に示されるような本体１１と通気フィルタ１３ａを有する蓋１３とを備える培養容器を、温度と湿度が一定に保たれたインキュベータ（恒温恒湿槽）の中に静置して、容器内に収容された培地中で細胞を培養する方法が知られている。この場合、細胞はインキュベータ内の気体と同じ気体雰囲気下で培養される。

細胞は、空気とは異なる気体の雰囲気下で培養することが望ましい場合がある。例えば、生体内の細胞などは、生体内と同様の空気よりも酸素濃度の低い気体（低酸素ガス）の雰囲気下で培養することが望ましい。例えば、特許文献１（特許第３５４９９４９号公報）には、低酸素雰囲気下で細胞を培養するための培養器が開示されている。

特許第３５４９９４９号公報

上記のように、低酸素ガスなどの空気と異なる培養用ガスの雰囲気下で細胞培養を行う場合、通気フィルタを有する半開放型の培養容器を用いると、培養容器内を培養用ガスで充満させるためにインキュベータ内を培養用ガスで充満させる必要がある。

また、細胞培養では、通常、定期的に培養容器をインキュベータ内から取り出して、無菌アイソレータ（以下、単に「アイソレータ」という場合がある）などの中で培養容器内の細胞や培地に対して培養に必要な操作を行い、再度インキュベータ内に培養容器を戻すといった作業が必要である。このため、そのような培養に必要な操作を行う度に、培養容器をインキュベータに戻した後、インキュベータ内にインキュベータの内容積分の培養用ガスを再び充填する必要がある。

したがって、空気と異なる培養用ガスの雰囲気下で細胞培養を行う場合、多くの培養用ガスが必要となるが、培養用ガスの供給にはコストを要するため、培養用ガスの使用量を低減することが望まれる。

本発明は、上記の課題に鑑みてなされたものであり、空気と異なる培養用ガスの雰囲気下で細胞培養を行う場合に、該培養用ガスの使用量を低減することのできる、培養方法、培養容器および無菌アイソレータを提供することを目的とする。

（１） 開閉可能な密閉型の培養容器内に細胞および培地を収容し、前記培養容器内において空気と異なる培養用ガスの雰囲気下で細胞を培養する、培養方法。
（２） 無菌アイソレータ内で前記培養容器内に前記培養用ガスを充填する、（１）に記載の培養方法。
（３） 前記無菌アイソレータ内に設けられたガス封入チャンバ内に開放された前記培養容器を収容し、前記ガス封入チャンバ内で前記培養容器を密閉することで、前記培養容器内に前記培養用ガスを充填する、（２）に記載の培養方法。
（４） 前記無菌アイソレータ内で開放された前記培養容器に対して、細胞の培養に必要な操作を実施する、（２）または（３）に記載の培養方法。
（５） 前記培養容器は、開閉可能な蓋を有する、（１）〜（４）のいずれかに記載の培養方法。
（６） 前記蓋は回転操作により開閉することができる、（５）に記載の培養方法。
（７） 前記細胞は、間葉系幹細胞である、（１）〜（６）のいずれかに記載の培養方法。
（８） 前記培養用ガスは、空気よりも酸素濃度が低い低酸素ガスである、（１）〜（７）のいずれかに記載の培養方法。
（９） 前記低酸素ガスは、空気よりも二酸化炭素濃度が高い、（８）に記載の培養方法。
（１０） （１）〜（９）のいずれかに記載の培養方法に用いられる培養容器。
（１１） （１０）に記載の培養容器内に前記培養用ガスを封入するために用いられるガス封入チャンバ。
（１２） （１１）に記載のガス封入チャンバを備える、無菌アイソレータ。

本発明によれば、空気と異なる培養用ガスの雰囲気下で細胞培養を行う場合に、該培養用ガスの使用量を低減することのできる、培養方法、培養容器および無菌アイソレータを提供することができる。

無菌アイソレータ内で培養容器内に培養用ガスを充填する操作の一例を説明するための模式図である。 実施形態の培養方法および無菌アイソレータを説明するための模式図である。 実施形態で用いられるガス封入チャンバを説明するための模式図である。 実施形態の培養方法および無菌アイソレータ等を説明するための概略斜視図である。 実施形態で用いられる培養容器の一例を示す概略斜視図である。 従来の培養容器の一例を示す概略斜視図である。 実施例２の播種から４日後の観察写真である。（ａ）は試験Ａ（５％Ｏ_２分圧下培養）、（ｂ）は試験Ｂ（２０％Ｏ_２分圧下培養）についての観察写真である。 実施例２の播種から８日後の観察写真である。（ａ）は試験Ａ、（ｂ）は試験Ｂについての観察写真である。 実施例２の播種から１１日後の観察写真である。（ａ）は試験Ａ、（ｂ）は試験Ｂについての観察写真である。 実施例２の播種から１５日後の試験Ａについての観察写真である。

以下、本発明の一実施形態について具体的に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

本実施形態の培養方法では、開閉可能な密閉型の培養容器内に細胞および培地を収容し、培養容器内において空気と異なる培養用ガスの雰囲気下で細胞を培養する。

（培養容器）
培養容器は、内部を気密に閉塞された空間とすることが可能な密閉型の容器である。また、培養容器は、開閉可能である。培養容器は、例えば、開閉可能な蓋を有することにより、開閉可能となる。

蓋は、開閉可能であれば特に限定されないが、例えば、回転操作により開閉することができる（すなわち、蓋は培養容器本体に螺合可能である）。この場合、図１に示されるような開閉装置（蓋回転装置）３によって、ガス封入チャンバ２が密閉された状態で、培養容器１の蓋１２をガス封入チャンバ２の外部から開閉することが可能である。

培養容器は、円または多角形を底面とする直角柱形状を有することが好ましい。多角形は、少なくとも１組の対向する平行な２つの辺を有することが好ましい。このような多角形としては、例えば、正偶数角形が挙げられる。この場合、培養中に培養容器内の細胞の状態を確認することが容易である。

なお、培養容器の材質としては、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタラートなどが挙げられる。

（細胞）
細胞は、特に限定されないが、多細胞生物を構成する細胞などの空気と異なる雰囲気下で培養することが望ましい細胞であることが好ましい。多細胞生物を構成する細胞は、好ましくは間葉系幹細胞である。なお、間葉系幹細胞は、例えば、骨髄、歯髄、脂肪組織、胎盤組織、臍帯組織などから取得可能である。

（培地）
培地は、細胞を培養可能なものであれば特に限定されず、細胞腫や培養条件に応じて、種々公知の細胞培養用の培地を用いることができる。培地は、液体であってもよく、固体、ゾル、ゲル等であってもよい。

（培養用ガス）
本実施形態において、培養用ガスは、空気と異なる気体である。すなわち、培養用ガスは、特に限定されないが、通常、用意するためにコストを要するガスである。培養用ガスとしては、例えば、空気よりも酸素濃度が低い（低酸素ガス）が挙げられる。培養用ガス中の酸素濃度は、好ましくは２０体積％未満であり、より好ましくは１５体積％以下であり、さらに好ましくは１０体積％以下である。

低酸素ガスとしては、例えば、空気よりも酸素濃度が低く、かつ、空気よりも二酸化炭素濃度が高いガスが挙げられる。このようなガスは、例えば、空気と二酸化炭素との混合気体である。かかる混合気体において、混合気体の全量に対する二酸化炭素の比率は、例えば、１〜２０体積％であり、好ましくは３〜７体積％である。

（培養方法）
以下、本実施形態の培養方法の具体的な操作の一例について説明する。

図４は、本実施形態の培養方法および無菌アイソレータ等を説明するための概略斜視図である。図４を参照して、無菌アイソレータ４は、ガス封入チャンバ２を備える。アイソレータ４は、インキュベータ５およびパスボックス６と連結されている。

なお、無菌アイソレータとは、一般に（無菌）アイソレータと呼ばれる装置に限定されず、その内部で無菌的に培養容器に対する種々の培養操作を実施することのできる装置であればよく、培養用の局部クリーンボックス、バイオセイフティ対応のキャビネットなどもアイソレータに包含される。

例えば、まず、パスボックス６の扉６ａを開いて、外部から培養容器１、培地、細胞などの培養に必要な材料をパスボックス６内に収納する。扉６ａを閉じた後に、パスボックス６内が除染される。除染方法としては、特に限定されず種々公知の方法を用いることができるが、例えば、過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）を用いる除染方法が挙げられる。なお、培養容器等は過酸化水素に耐性がないため、このような過酸化水素に耐性のない材料は、予め滅菌された状態で過酸化水素に耐性のあるケース内に収納された状態でパスボックス６内に収納され除染される。

パスボックス６の除染後に、扉６ｂを開閉して、培養容器１などの細胞培養に必要な材料（予め滅菌された状態で過酸化水素に耐性のあるケース内に収納された状態）をパスボックス６からアイソレータ４へ無菌的に移動させる。アイソレータ内を過酸化水素で除染した後、上記ケースを開放し、細胞培養に必要な材料を取り出す。

次に、アイソレータ４内で、培地および細胞などの必要な材料を培養容器１内に収納し、培養容器１内の空気を培養用ガス（低酸素ガス等）で置換し、培養容器１を密閉する。このように、無菌アイソレータ４内で開放された培養容器１に対して、細胞の培養に必要な操作を実施することが好ましい。

次に、扉５ａを開閉して、密閉された培養容器１をアイソレータ４からインキュベータ５へ無菌的に移動させる。培養容器１は、インキュベータ５内において、例えば、直角柱形状の母線方向が水平方向となるように設置される。そして、インキュベータ５内が所定の温度に維持される。これにより、細胞の培養が開始される。なお、培地交換や培養途中で必要な操作を行う場合も上記と同様の手順を繰り返せばよい。

なお、従来のように通気フィルタを有する半開放型の培養容器を用いる場合、インキュベータ内を低酸素ガスで充満させることで、通気フィルタを介して培養容器内を低酸素ガス雰囲気とする。このため、インキュベータの容積分以上の培養用ガスが操作回数分必要であった。

これに対して、本実施形態のように密封型の培養容器を用いる場合、培養容器１内を培養用ガスで満たせばよく、そのために必要な比較的小型のガス封入チャンバ内を培養用ガスで充填すればよい。このため、培養用ガスの使用量を低減し、培養のコストを削減することができる。

また、従来の半開放型の培養容器を用いる場合、例えば、一の容器に収納された細胞と別の容器に収納された由来の異なる細胞とを同じインキュベータ内に収容すると、クロスコンタミネーションが起こる可能性があるため、それらの容器は別々のインキュベータ内で保管されていた。このため、ある一人に由来する細胞をインキュベータ５に収納した後、インキュベータ５を一旦アイソレータ４から切り離し、別のインキュベータ５をアイソレータ４に接続してから、別の人に由来する細胞をその別のインキュベータに収納する作業が必要であった。このように由来の異なる細胞を培養する場合等において、インキュベータ５とアイソレータ４の連結と分離（切り離し）を繰り返す必要があり、作業に多くの時間（例えば、５時間）を要していた。

これに対して、本実施形態の密封型の培養容器を用いる場合、インキュベータ５をアイソレータ４から切り離さず、由来の異なる細胞を別々に収容した複数の培養容器を同一のインキュベータ５内に収納しても、クロスコンタミネーションが起こり難い。このため、インキュベータ５とアイソレータ４は接続したままでよい。したがって、由来の異なる細胞を培養する場合等においても、インキュベータ５とアイソレータ４の連結と分離を繰り返す必要がなく、作業時間が大幅に短縮されるという利点がある。

また、従来の通気フィルタを有する半開放型の培養容器を用いる培養方法では、培養容器１内の湿度を所定範囲に維持するために、インキュベータ５による湿度調整が必要であった。しかし、本実施形態のように密封型の培養容器１を用いる場合、培養容器１内の湿度は基本的に維持されるため、インキュベータ５による湿度調整が必要ないという利点も期待される。

また、従来のように、通気フィルタ１３ａを有する培養容器（図６参照）を用いる場合に、例えば、培地（培養液）が通気フィルタ１３ａを介してこぼれないように、培養容器の設置状態における通気フィルタ１３ａの位置、通気フィルタ１３ａの大きさ等に応じて、培養容器内に収容できる培地（培養液）の量には制限があった。これに対して、本実施形態のように密閉型の培養容器を用いる場合は、そのような理由で培養液の量が制限されることがないという利点がある。

上記のように、培養容器１内を無菌状態に保つ（コンタミネーションを防止する）ために、培養容器１内に培養用ガスを充填する操作は、無菌的に行われることが好ましい。具体的には、例えば、培養容器内に培養用ガスを充填する操作は、無菌アイソレータ内で実施されることが好ましい。

図１は、無菌アイソレータ内で培養容器内に培養用ガスを充填する操作の一例を説明するための模式図である。図１を参照して、まず、無菌アイソレータ４内に設けられたガス封入チャンバ２内に開放された培養容器１を収容する。なお、培養容器１を密閉した状態でガス封入チャンバ２内に収容した後に、例えば開閉装置３によりガス封入チャンバ２の外部から培養容器１を開放してもよい。

次に、バルブ２２ａを開放することにより、ボンベ２１に収容された培養用ガスを、流路２２を介してガス封入チャンバ２内に充填する。なお、培養用ガスを充填する前のガス封入チャンバ２内の気体は、バルブ２３ａを開放することにより、流路２３を介して排出される。圧力計２４および酸素計２５によってガス封入チャンバ２内が培養用ガスで満たされたことを確認した後、バルブ２２ａおよびバルブ２３ａを閉じて、ガス封入チャンバ２を密閉状態にする。この状態で、ガス封入チャンバ２内で培養容器１を密閉することで、培養容器１内に培養用ガスを充填させることができる。

（ガス封入チャンバ）
ガス封入チャンバ２は、培養容器１内に培養用ガスを効率的に封入するために用いられる（図１〜図３）。ガス封入チャンバ２は、アイソレータ４内で使用可能であることが好ましい。

ガス封入チャンバ２は、少なくともインキュベータ５よりも内容積が小さいことが好ましく、また、培養容器１を内部に収容可能な範囲で小型であることが好ましい。これにより、培養用ガスの使用量の削減効果が高められる。ガス封入チャンバ２の内容積は、例えば、培養容器１の外容積の２〜１００倍程度であり、好ましくは５〜２５倍程度である。

ガス封入チャンバ２は、例えば、図２（ａ）に示されるように、互いに脱着可能なケース２ａおよびカバー２ｂから開閉可能に構成され得る。なお、図２（ｂ）に示されるように、ケース２ａとカバー２ｂが蝶番状に接合されていることにより、ガス封入チャンバ２が開閉可能に構成されていてもよい。

さらに図２を参照して、例えば、ケース２ａにはポート２ｃが設けられており、ポート２ｃを介して、培養用ガスを充填することができる。ガス封入チャンバ２内のガスを排出するための別のポートを有していてもよい。また、ガス封入チャンバ２内の圧力計、酸素計などは、例えば、ポート２ｃを介して外部と接続され得る。

また、ケース２ａは蓋を開閉するための開閉装置３を有しており、密閉されたガス封入チャンバ２内に設置された培養容器１を密閉することができる。開閉装置３は、例えば、図１に示されるように、回転軸と蓋１２を把持する把持部とを備えており、回転軸を駆動装置で回動させることにより、培養容器１の蓋１２を開閉することが可能である。開閉装置３は、自動で、培養容器１（蓋１２）を開閉できることが好ましい。

なお、図３（ａ）を参照して、回転軸（プランジャー）３ｂなどの開閉装置３の部材がガス封入チャンバ２の壁を貫通する部分は、例えばＯ−リング３ｂ等によって、ガス封入チャンバ２の気密性を保つように構成されている。また、図３（ｂ）を参照して、開閉装置３がシール部材３１によって気密に覆われていることで、ガス封入チャンバ２の気密性を保つように構成されていてもよい。なお、図３（ｂ）の場合、電源供給などのケーブル３２は、シール部材の機密性を保った状態で、シール部材３１内の開閉装置３の駆動装置等に接続される。

以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

［実施例１］
本実施例では、歯髄細胞を本発明の培養方法によって培養する。

まず、アイソレータ内でイヌ（ビーグル犬）の歯を輸送ケースから取り出し、歯を分割して歯髄組織を取り出す。歯髄組織を細切後、酵素（コラーゲナーゼ）により３７℃で３０分間の処理を行う。処理後の歯髄細胞を１０％の血清を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）とともに培養容器内に収容する。

培養容器としては、図５に示されるような正八角柱状の本体１１（８角培養容器）を有する培養容器１を用いる。この培養容器１は、密閉可能であり、蓋１２によって開閉可能である。なお、首部１１ａには外周ねじ山（図示せず）が設けられ、蓋１２には内周ねじ溝（図示せず）が設けられており、開閉装置３によって、蓋１２を本体１１の首部１１ａにねじ込むことで、培養容器１を密閉することができる。

次に、培地および細胞が収容された培養容器内を、培養用ガスで充満させる。ガス封入チャンバ２内および培養容器内への培養用ガスによる充填は、上記実施形態で図１および図２を用いて説明した方法により実施する。培養用ガスとしては、低酸素ガス（９０体積％のＮ_２と５体積％のＯ_２と５体積％のＣＯ_２との混合気体）を用いる。なお、ガス封入チャンバ２の内容積は、培養容器１の外容積の１５倍程度である。

また、培養開始時の細胞数は、０．１×１０^４〜１．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬが適当であり、より最適には０．５×１０^４〜０．２×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬである。培地中の初期ｐＨ調整はＨＥＰＥＳバッファーを用いて行う。ｐＨは、７．５〜９．５が適当であり、最適には７．５〜８．５であり、より最適には７．９程度である。培養中の培地温度は３７℃である。

細胞および培地が収容された培養容器を、インキュベータ内に移動し、３７℃に維持されたインキュベータ内で５〜１２日間培養する（初代培養）。

次に、コロニー形成ができたことを確認し、酵素（トリプシン）を用いた処理を行う。処理後の歯髄細胞を培地とともに再度、培養容器内に収容し、２〜５日間静置培養する(二次培養)。この操作を再度行い、２〜７日間回転培養を行う(三次培養)。

三次培養液を取り出して、培養液中の細胞数が１．０×１０^６ｃｅｌｌｓ以上であることを確認する。この培養細胞に対して、通常のディッシュ（シャーレ）での培養と比較して、ｍＲＮＡ発現量、増殖能、遊走能、免疫原性などを評価する。また、イヌの歯の抜髄後根管内に移植して歯髄再生能、血管新生能、神経突起伸長促進作用などを検討する。

ｍＲＮＡ発現量は、リアルタイムＰＣＲを用いて評価する。まず、４代目の培養細胞からＴｒｉｚｏｌ ｋｉｔで抽出したＴｏｔａｌ ＲＮＡを用いて、１本鎖ＤＮＡを生成する。その１本鎖ＤＮＡと、幹細胞マーカー（ＣＸＣＲ４，Ｓｏｘ２，ＯＣＴ３/４，Ｓｔａｔ３，Ｔｅｒｔ）、血管新生・神経栄養因子（ＮＧＦ，ＢＤＮＦ，ＶＥＧＦ，ＧＤＮＦ，ＭＭＰ３）、抗炎症・免疫調整因子（ＴＧＦ−β，ＩＬ−８，ＩＤＯ，ＰＴＧＥ，ＩＬ−６）などのプライマーと、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉとを用いて、リアルタイムＰＣＲを行い、発現量を評価する。

増殖能の評価では、まず、４代目培養細胞を９６ｗｅｌｌ（２００μＬの培地）に２５００ｃｅｌｌｓ/ｗｅｌｌにて播種する。播種から２４時間、４８時間および７２時間後のそれぞれにおいて、培地を交換し、ＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ ｒｅａｇｅｎｔｓを添加して２時間後に上清の蛍光色素濃度を測定することにより、増殖能を評価する。

１．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬまで増殖した４代目培養細胞に対して、蛍光標識されているか蛍光標識可能な幹細胞マーカー抗体（ＣＤ２９，ＣＤ４４，ＣＤ１０５，ＣＤ１６６，ＣＸＣＲ４，Ｇ−ＣＳＦＲ）および血管内皮細胞マーカー（ＣＤ３１）を結合する。標識細胞の陽性率をフローサイトメーターで測定することにより、幹細胞性を評価する。

遊走能の評価では、まず、２４ｗｅｌｌプレートに、１００ｎｇ／ｍＬのＧ−ＣＳＦ、６００μＬの培地、および１．０×１０^５個の細胞を添加し、これを３７℃、５体積％ＣＯ_２環境下のインキュベータで４８時間保管する。保管後、ホルムアルデヒドで固定処理を行い、最後にギムザ染色を行い、遊走細胞を光学顕微鏡で計数する事で評価する。

アルカリフォスファターゼ活性は、細胞を７０−８０％コンフルエントまで増殖させた後、細胞を剥離して２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液（ｐＨ８．５）に懸濁し、超音波で細胞を破砕して、遠心上清のアルカリフォスファターゼ活性をＬａｂＡｓｓａｙ^ＴＭ ＡＬＰ ｋｉｔを用いて測定することにより、遊走能を評価する。

抗炎症因子および免疫調整因子（ＩＤＯ，ＩＬ−８，ＩＬ−１α，ＩＬ−６，ＰＧＥ２）の発現は、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔにより評価する。まず、４代目培養細胞に対して、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＩＧＥＰＡＬＣＡ−６３０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、および、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌから成るＲＩＰＡバッファーを用いて、全細胞溶解液を調製する。全細胞溶解液中の細胞を超音波破砕した後、遠心上清を回収し、ビシンコニン酸法によりタンパク質量を定量する。

定量されたタンパク質を９５℃で変性させた後、１２質量％ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動により分離し、２０〜２５μｇの分離されたタンパク質をＰＶＤＦ膜へ転写する。転写されたタンパク質に対して、ＩＤＯ、ＩＬ−８、ＩＬ−１α、ＩＬ−６およびＰＧＥ２の各々に対応する一次抗体を４℃で一晩反応させる。その後、さらに、それぞれの一次抗体に対する二次抗体および化学発光基質を反応させ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｍａｇｅｒ ６８０を用いて化学発光を検出する。検出された化学発光の強度は、β―アクチンで標準化を行い、ＩｍａｇｅＪ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖｅｒｓｉｏｎ １．４８）にて定量解析を行う。

Ｔｒｏｐｈｉｃ効果の確認は、遊走促進能、抗アポトーシス、血管新生促進、神経突起伸長促進および免疫調整能（ＭＬＲ assay）をそれぞれ評価することにより行う。まず、６０％コンフルエントまで増殖させた４代目培養細胞を、血清を含まないＤＭＥＭ培地に移し、２４時間後の培養上清を回収して、約４０倍に濃縮する。さらに、終濃度５μｇ/ｍＬに調節した培養上清について、タンパク質濃度をＣｏｏｍａｓｓｉｅ (Ｂｒａｄｆｏｒｄ) Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ （Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）で定量する。

遊走促進能の評価では、まず、１００μＬの培地が収容されたＣｏｒｎｉｎｇ ｔｒａｎｓｗｅｌｌ ｉｎｓｅｒｔ（２４ｗｅｌｌ（Ｌｏｗｅｒ Ｃｈａｍｂｅｒ）に設置）に１×１０^５個の細胞を播種し、各々の培地に細胞由来の培養上清（終濃度５μｇ/ｍＬに調製）を６００μＬ添加する。４８時間後にｉｎｓｅｒｔ下面に遊走した細胞数を測定することで、遊走促進能を評価する。

培養上清の抗アポトーシス効果は、Ｃａｓｐａｓｅ３活性測定により評価する。まず、５μｇ／ｍＬの培養上清と５００ｎＭのスタウロスポリンとを含むＤＭＥＭ内に細胞を２時間保持し、細胞回収後の懸濁液について、ＡＰＯＰＣＹＴＯＴＭ Ｃａｓｐａｓｅ−３ Ｃａｓｐａｓｅ−３ Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを用いてＣａｓｐａｓｅ３活性を測定する。

血管新生促進能は、９６ｗｅｌｌプレート内に、２％ＦＢＳ含、ヘパリン含、アスコルビン酸含、ヒドロコルチゾン含有ＥＢＭ２に細胞由来の培養上清を５μｇ／ｍＬ添加し、マトリゲル上へ１．０×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌでＨＵＶＥＣ細胞を播種し、培養４時間後の索状、管様構造の血管全長を倒立顕微鏡にて計測することで評価する。

神経突起伸長促進の評価では、ヒト神経芽細胞の細胞株であるＴＧＷ細胞に対して、培養上清５μｇ／ｍＬを用いて、血清不含の状態で刺激を与え、４８時間後の１サンプルあたり１００細胞の神経突起長の計測を、倒立顕微鏡にてｎ＝３で行う。

培養上清による増殖促進能の評価では、まず、５μｇ／ｍＬの培養上清を含み、血清を含まないＤＭＥＭが収容された９６ｗｅｌｌプレートに、２．５×１０^３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度で細胞を播種する。その２４、４８および７２時間後のそれぞれにおいて、培地を１０μＬのＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ ｒｅａｇｅｎｔｓを含有する新鮮培地１００μＬに交換し、２時間後の細胞数を、蛍光分光光度計を用いて５３５−６１５ｎｍの蛍光強度を測定することにより計測し、計測された細胞数に基づいて神経突起伸長促進を評価する。

歯髄再生能、血管新生能、および神経再生能は、下記の方法で評価する。まず、１３か月齢のイヌに全身麻酔を施した後、上下顎前歯部に抜髄処置を行い、根尖部まで＃５０〜５５（Ｎｏ．５０〜５５）の大きさに根管内を拡大後、根管内を５w/v％次亜塩素酸ナトリウム溶液と３w/v％過酸化水素水とで交互に洗浄し、さらに生理食塩水で洗浄する。次に、ペーパーポイントで根管内を完全に乾燥して止血し、その後、セメントとレジンにて完全に仮封する。

抜髄処置７日後に、仮封をはずし、再度根管内を交互洗浄し、生理食塩水で洗浄した後、スメアクリーンを２分反応させ、さらに生理食塩水で洗浄し、乾燥させる。自家の培養細胞５×１０^５個を２０μＬのｓｃａｆｆｏｌｄ（コーケンアテロコラーゲンインプラント、株式会社高研）にサスペンドし、さらにＧ−ＣＳＦ（ノイトロジン、中外製薬）１００μｇ／ｍＬを１．５μＬサスペンドして根管充填材を作成する。この根管充填材を根管内に気泡を入れないよう注意しながら注入する。なお細胞は、上述した方法で培養した歯髄幹細胞である。

その後、その上に止血用ゼラチンスポンジ（スポンジェル）を置き、セメントおよびレジンにて窩洞を完全に封鎖する。移植後１４日目に抜歯し、通法に従って縦断面の５μｍパラフィン切片を作製し、Ｈ−Ｅ染色後形態観察を行う。血管新生はＢＳ−１ ｌｅｃｔｉｎにて、神経新生はＰＧＰ９．５にて免疫染色し比較する。それぞれの標本の歯髄再生量は１サンプルにつき、４枚の切片を測定し、４サンプルの平均で評価する。

なお、インキュベータの容量（内容積）は４９Ｌである。このため、従来の方法で、最初にインキュベータに培養容器を収納した後に培養容器の出し入れを５回行った場合、２９４Ｌ以上の培養用ガスが必要になる。これに対して、培養容器の容量は２７０ｍＬであり、ガス封入チャンバの容量は４Ｌであり、ガス封入チャンバのパージに必要な培養用ガスの量は２４Ｌ程度である。このように培養用ガスの使用量を半分程度に低減することができる。なお、ガス封入チャンバの容量をさらに小さくすれば、培養用ガスの使用量をさらに低減することが可能である。

［実施例２］
本実施例では、ヒトの歯髄細胞を本発明の培養方法によって培養した。なお、異なる酸素分圧を有する２種の培養用ガスを用いた試験Ａおよび試験Ｂを実施した。

１４歳のヒトの永久歯（左下顎８番）を、２０μｇ／ｍＬゲンタマイシン（ゲンタロール(登録商標)、株式会社日本点眼薬研究所）および０．２５μｇ／ｍＬアンホテリシンＢ（ファンギゾン（登録商標）、ブリストル・マイヤーズ株式会社）を含有するHanks'液を輸送液として、特殊な運搬容器を用いて、温度管理下で輸送した。

抜歯より１８時間後、クリーンベンチ内で歯髄組織を摘出および細切し、０．０４ｍｇ／ｍＬリベラーゼ溶液（Roche Liberase MTF C/T(2：3）GMP grade）を５ｍＬ加え、振盪恒温槽にて２０分間振盪した。その後、２０００ｒｐｍで５分間の遠心分離を行い、遠心分離後の上清を吸引した。上清が除去された沈殿物に１０％ウシ胎児血清ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培養液を加えた。なお、この培養液は、ＤＭＥＭ溶液であるGibco high glucose 4.5に、１０体積％のウシ胎児血清ＦＢＳ、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、並びに、１×となるよう調整した「GlutaMax（商標） I １００×」および「Antibiotic-Antimycoic １００×」を添加してなる液である。ウシ胎児血清ＦＢＳとしては、Gibco、Lot．1966175を使用した。

上記沈殿物に上記培養液を添加してなる液を懸濁した後、その液の一部を取り出し、等量のトリパンブルー（0.4質量％，SIGMA）と混合し、生細胞数のセルカウントを実施した。

残りの懸濁液を２つの培養容器へ均一に播種を行った。培養容器としては、０．６体積％Ｏ_２含有Ｈｅガスによるプラズマ処理およびγ線滅菌が施された実施例１と同様の８角培養容器を用いた。播種濃度は、５ｍＬの上記培養液中に細胞数２．５×１０^５個である。一方の培養容器中には、実施例１と同様の低酸素ガス（培養用ガス）を充満させた（試験Ａ）。もう一方の培養容器中には、低酸素ガス（培養用ガス）の充填は行わず、空気（Ｏ_２分圧：約２０％）を用いて試験を行った（試験Ｂ）。なお、試験Ａでは、培養容器中への低酸素ガス（培養用ガス）の充填は、実施例１と同様にして実施された。試験Ｂでは、低酸素ガス（培養用ガス）の充填は行わず、培養容器内は空気で満たされている状態とした。その後、３７℃に維持された恒温槽内で、培養の経過観察を実施した。

試験ＡおよびＢの経過観察では、播種から４日経過後において、試験ＡおよびＢのどちらにおいても細胞の接着が確認された（図７（ａ）、（ｂ））。播種から８日後、試験Ａの細胞は分散して増殖していることが確認された（図８（ａ））。一方、試験Ｂではコロニーの形成が見受けられるものの、細胞の形態が細長く、増殖よりも細胞径が大きくなっていた（図８（ｂ））。

試験Ａでは、播種から９日後に継代操作を実施した。そのときの細胞数は１．７×１０^５個であった。継代後は細胞増殖が著しく、播種から１１日後には再度継代を実施した（図９（ａ））。そのときの細胞数は７．０×１０^５個であった。この３代目細胞は、回転培養により上記培養容器の全内側面にて培養された。播種から１５日後（図１０）に細胞数３．６１×１０^６個となった。凍結操作を実施して、この細胞を−８０℃下にて保管した。

一方、試験Ｂでは、播種から８日後以降も細胞の増殖が見受けられなかったが、播種から１１日後に継代を行い、経過観察を継続した（図９（ｂ））。この継代時の細胞数は１．１×１０^４個であり、適切な接着と増殖が繰り返されず、アポトーシスが生じていた。それ以降も経過観察を継続したが、細胞の増殖は見受けられなかった。

試験Ａおよび試験Ｂにおける培養日数（播種からの経過日数）と総細胞数との関係を表１に示す。

今回開示された実施の形態および実施例はすべての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上記した説明ではなくて特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。

１ 培養容器、１１ 本体、１１ａ 首部、１２，１３ 蓋、１３ａ 通気フィルタ、２ ガス封入チャンバ、２ａ ケース、２ｂ カバー、２ｃ ポート、２１ ボンベ、２２，２３ 流路、２２ａ，２３ａ バルブ、２４ 圧力計、２５ 酸素計、３ 開閉装置、３ａ 回転軸、３ｂ Ｏ−リング、３１ シール部材、３２ ケーブル、４ （無菌）アイソレータ、５ インキュベータ、５ａ 扉、６ パスボックス、６ａ，６ｂ 扉。

Claims (12)

1. 開閉可能な密閉型の培養容器内に細胞および培地を収容し、前記培養容器内において空気と異なる培養用ガスの雰囲気下で細胞を培養する、培養方法。
2. 無菌アイソレータ内で前記培養容器内に前記培養用ガスを充填する、請求項１に記載の培養方法。
3. 前記無菌アイソレータ内に設けられたガス封入チャンバ内に開放された前記培養容器を収容し、前記ガス封入チャンバ内で前記培養容器を密閉することで、前記培養容器内に前記培養用ガスを充填する、請求項２に記載の培養方法。
4. 前記無菌アイソレータ内で開放された前記培養容器に対して、細胞の培養に必要な操作を実施する、請求項２または３に記載の培養方法。
5. 前記培養容器は、開閉可能な蓋を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の培養方法。
6. 前記蓋は回転操作により開閉することができる、請求項５に記載の培養方法。
7. 前記細胞は、間葉系幹細胞である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の培養方法。
8. 前記培養用ガスは、空気よりも酸素濃度が低い低酸素ガスである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の培養方法。
9. 前記低酸素ガスは、空気よりも二酸化炭素濃度が高い、請求項８に記載の培養方法。
10. 請求項１〜９のいずれか１項に記載の培養方法に用いられる培養容器。
11. 請求項１０に記載の培養容器内に前記培養用ガスを封入するために用いられるガス封入チャンバ。
12. 請求項１１に記載のガス封入チャンバを備える、無菌アイソレータ。