CN116376820A - 一种牙髓间充质干细胞、培养方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种牙髓间充质干细胞、培养方法及应用，全过程全面质量监控，从牙齿采集前的筛选开始直至细胞制备成成品中间品及终产品的质量全部受控；使用无血清培养基和药品级抗生素，避免动物源蛋白及劣质抗生素可能引起的疾病或过敏风险；规模化培养，保证细胞均一性和有效性；温和型重组酶消化，保持细胞的活性及干细胞的干性，避免引入异源蛋白；干细胞表面标志检测的阳性指标表达率95%以上，阴性指标2%以下；细胞培养过程中，使用的无血清培养基、温和消化酶和细胞冻存保护液为GMP级，所用抗生素为药品级，所用耗材均满足无菌无热源标准，且生产商通过ISO13485质量管理体系认证。
Description
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，尤其是涉及一种牙髓间充质干细胞、培养方法及应用。
背景技术
传统的间充质干细胞提取及培养方法使用胰酶和含有血清的培养基，一方面造成成纤维细胞的污染，影响细胞生长，加速细胞角质化；另一方面由于血清和成分不明的蛋白的存在，对细胞生物学、毒理学、病理学等基础研究形成干扰。同时采用猪来源的胰酶消化液和添加血清的培养基构建的培养体系所培养的间充质干细胞进行体内移植，可以使受者体内产生抗牛蛋白抗体引起免疫反应，从而导致患者尤其在重复输注干细胞治疗后治疗失效等不安全因素，因使用了动物源成分的试剂，需要增加更多的检测工作，同时也增加了成本支出。
发明内容
本发明第一个目的在于，构建一种增殖能力强、适合于临床应用/无异源成分/无血清成分牙髓间充质干细胞培养方法。
为此，本发明的上述目的通过如下技术方案实现：
一种牙髓间充质干细胞培养方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
S1、牙齿筛选与保存：筛选、采集健康志愿者乳牙/恒牙，使用生理盐水清洗、碘伏消毒，置于牙齿保存液中4℃冷藏，并于24小时内进行分离处理；
S2、牙髓分离：将牙齿转移至培养皿中，PBS清洗，剪断牙冠，使用牙齿探针取出牙髓组织，使用PBS清洗牙髓组织，洗净后放入50ml离心管中，加入适量PBS，用剪刀剪碎至1～4mm3的小块；
S3、牙髓间充质干细胞原代培养：
将剪碎的牙髓组织400～600g离心10min，去上清；
加入2～3ml组织消化液，37℃，摇床消化30～60min；
消化后的组织加入等体积无血清完全培养基中止消化，300～500g，离心10min，去上清；
使用2～3ml无血清完全培养基重悬后接种于T25培养瓶中，置于37℃、5％CO2的饱和湿度环境中培养；
第5天首次换液，以后每3天换液一次，至14天左右；细胞融合度达80％左右时，进行传代培养
S4、传代培养：
传代时，用消化传代酶消化传代，使用无血清完全培养基中止消化；传代细胞接种密度约为4000～6000个/cm2；3天后，细胞密度达80％以上，再次传代；传至第2/5代，细胞数约为2～3×109个；
收集并冷冻保存。
在采用上述技术方案的同时，本发明还可以采用或者组合采用如下技术方案：
作为本发明的一种优选技术方案：步骤S1中，所述牙齿保存液为无血清基础培养基a-MEM，且含有临床级抗生素。
作为本发明的一种优选技术方案：步骤S1中，筛选的项目包括：携带病毒、家族遗传史，所述病毒包括：乙肝、丙肝、梅毒、艾滋、EB。
作为本发明的一种优选技术方案：步骤S3中，所述组织消化液为：2～3mg/ml的胶原酶I、2～4mg/ml的分散酶。
作为本发明的一种优选技术方案：步骤S3、S4中，所述无血清完全培养基为间充质干细胞培养基。
作为本发明的一种优选技术方案：所述无血清完全培养基由无血清基础培养基a-MEM、血清替代物以及谷氨酰胺组成；
所述血清替代物的质量体积比为：5％；所述谷氨酰胺的浓度为0.02mmol/ml。
作为本发明的一种优选技术方案：步骤S4中，所述消化传代酶为TrypLETMExpress。
作为本发明的一种优选技术方案：步骤S4中，冷冻保存所用细胞冷冻保护液为CELLBANKER无血清冷冻保护液。
本发明第二个目的在于，提供前文所述的牙髓间充质干细胞培养方法所培养的牙髓间充质干细胞。
本发明还有一个目的在于，提供前文所述的牙髓间充质干细胞培养方法所培养的P5代细胞在临床上的应用，取冷冻P5代细胞，复苏后用生理盐水选涤两遍，统计细胞数和细胞活率，根据计数结果按临床需要将细胞和复方电解质/生理盐水溶液混匀待用；并留样进行内毒素和无菌检测。
无菌检测包括用血培养仪进行细菌和真菌检测；内毒素检测包括用凝胶法进行内毒素检测。
本发明提供一种牙髓间充质干细胞、培养方法及应用，与现有技术相比，具有如下有益效果：
(1)、全过程全面质量监控，从牙齿采集前的筛选开始直至细胞制备成成品中间品及终产品的质量全部受控；
(2)、使用无血清培养基和药品级抗生素，避免动物源蛋白及劣质抗生素可能引起的疾病或过敏风险；
(3)、规模化培养，保证细胞均一性和有效性；
(4)、温和型重组酶消化，保持细胞的活性及干细胞的干性，避免引入异源蛋白；
(5)、干细胞表面标志检测的阳性指标表达率95％以上，阴性指标2％以下；
(6)、细胞培养过程中，使用的无血清培养基、温和消化酶和细胞冻存保护液为GMP级，所用抗生素为药品级，所用耗材均满足无菌无热源标准，且生产商通过ISO13485质量管理体系认证。
附图说明
图1为P5代细胞生长形态图，其中：(a)为实施例，(b)为对比实施例。
图2为实施例的P5代细胞的流式图。
图3为实施例的P5代细胞的三系分化图，其中：(a)为成骨；(b)为成软骨；(c)为成脂。
图4为实施例的P5代细胞的克隆形成能力照片。
图5为对比实施例的P5代细胞的流式图。
图6为对比实施例的P5代细胞的三系分化图，其中：(a)为成骨；(b)为成软骨；(c)为成脂。
图7为对比实施例的P5代细胞的克隆形成能力照片。
具体实施方式
参照附图和具体实施例对本发明作进一步详细地描述。
实施例
原代培养
D0：
采集后的牙齿样本需在24小时以内进行牙髓干细胞的分离制备。
用眼科镊从采集杯内取出牙齿样本置于50ml离心管内，用含50μg/ml硫酸庆大霉素的PBS溶液冲洗5遍。
在生物安全柜内，剪断牙冠，用牙探针和眼科镊分离取出牙髓组织，将取出的牙髓置于装有2mlα-MEM培养基(含50μg/ml硫酸庆大霉素)的6孔培养板中，浸泡5min。
用巴氏吸管弃去浸泡液，加入2ml含50μg/ml庆大霉素的α-MEM培养基漂洗5次。
用无菌手术剪将牙髓组织剪成约1mm3的碎块。
向已剪碎的牙髓组织中加入已经预热的2ml胶原酶(3mg/ml)与分散酶(4mg/ml)混合液，重悬后将牙髓组织转移至15ml离心管内，置于37℃恒温摇床内100rpm振荡消化牙髓组织60min，每隔10min手动摇匀10次。
加入两倍体积α-MEM培养基(含50μg/ml庆大霉素)以终止消化，吹打5～7次以充分混匀，形成单细胞悬液。
600g，离心5min，弃上清，沉淀用一定体积AMMS无血清完全培养基重悬，600g，5min再次离心洗涤一次。
弃去离心后上清液，加入5ml AMMS无血清完全培养基混匀后接种于T25细胞培养瓶中，记为P0代，Day0天。
将T25细胞培养瓶放入37℃、5％CO2的饱和湿度二氧化碳培养箱内培养。
D5：第一次换液
在生物安全柜内轻轻晃动培养瓶内培养液，吸弃全部培养液，加入相应新鲜AMMS无血清完全培养基(T25培养瓶加入5ml，T75培养瓶加入15ml，T175培养瓶加入30ml)。
将细胞培养瓶放入37℃、5％CO2的饱和湿度二氧化碳培养箱内培养。
D8：第二次换液
在生物安全柜内轻轻晃动培养瓶内培养液，吸弃全部培养液，加入相应新鲜AMMS无血清完全培养基(T25培养瓶加入5ml，T75培养瓶加入15ml，T175培养瓶加入30ml)。
将细胞培养瓶放入37℃、5％CO2的饱和湿度二氧化碳培养箱内培养。
D11：第三次换液
在生物安全柜内轻轻晃动培养瓶内培养液，吸弃全部培养液，加入相应新鲜AMMS无血清完全培养基(T25培养瓶加入5ml，T75培养瓶加入15ml，T175培养瓶加入30ml)。
将细胞培养瓶放入37℃、5％CO2的饱和湿度二氧化碳培养箱内培养。
D14：传代培养
传代判断标准：倒置显微镜下观察培养瓶内局部细胞融合度大于80％时即可传代。
洗涤：收集细胞培养上清液做无菌检查，用一定体积PBS溶液洗涤培养瓶两次。
消化：弃去洗涤液后加入相应体积TrypLE Express重组酶(T25培养瓶1ml，T75培养瓶3ml，T175培养瓶5ml)，轻轻晃动混匀使酶能够与细胞充分接触，将细胞培养瓶置于37℃二氧化碳培养箱中静止消化2min～3min，倒置显微镜下观察如80％以上细胞变圆，轻轻用手拍打培养瓶侧面大部分细胞脱落至培养瓶底部即可终止消化。
终止消化：用2倍体积的α-MEM培养基终止消化，再用一定体积PBS溶液洗涤培养瓶，收集细胞悬液至15ml或50ml离心管内。
离心：细胞悬液以500g，离心6min，离心完毕后，弃去上清液，用适量AMMS无血清完全培养基重悬细胞沉淀。
细胞计数：取20μl混匀的细胞悬液在EP管内与20μl 0.4％台盼蓝染液混合均匀，吸取10μl细胞悬液加至细胞计数板，Countess自动细胞计数仪计数，记录细胞密度与活率，计算细胞数量。
接种培养：细胞按照5×103cells/cm2至6×103cells/cm2的密度接种培养，根据细胞计数结果计算所需培养瓶规格及数量。将细胞放入37℃、5％CO2的饱和湿度二氧化碳培养箱内培养，记为P1代。
换液：在生物安全柜内轻轻晃动培养瓶内培养液，吸弃一半体积培养液，加入相同体积的新鲜无血清完全培养后将细胞培养瓶放入37℃、5％CO2的饱和湿度二氧化碳培养箱内培养。
重复上述步骤，传至P2/P5代，在收集P2/P5代细胞的同时，做如下检测项目：
1)、取1×106细胞进行细胞表面抗原分析：流式细胞术；
2)、取1×106细胞进行分化能力检测：体外诱导分化试验；
3)、取5×103细胞做克隆形成能力检测：CFU-F；
4)、取1.5×105细胞做分泌因子检测：ELISA法。
表1.流式检测结果
表2.细胞分泌因子检测
对比实施例
D0：
采集后的牙齿样本需在24小时以内进行牙髓干细胞的分离制备。
用眼科镊从采集杯内取出牙齿样本置于50ml离心管内，用含50μg/ml硫酸庆大霉素的PBS溶液冲洗5遍。
在生物安全柜内，剪断牙冠，用牙探针和眼科镊分离取出牙髓组织，将取出的牙髓置于装有2mlα-MEM培养基(含50μg/ml硫酸庆大霉素)的6孔培养板中，浸泡5min。
用巴氏吸管弃去浸泡液，加入2ml含50μg/ml庆大霉素的α-MEM培养基漂洗5次。
用无菌手术剪将牙髓组织剪成约1mm3的碎块。
向已剪碎的牙髓组织中加入已经预热的2ml胶原酶(3mg/ml)与分散酶(4mg/ml)混合液，重悬后将牙髓组织转移至15ml离心管内，置于37℃恒温摇床内100rpm振荡消化牙髓组织60min，每隔10min手动摇匀10次。
加入两倍体积α-MEM培养基(含50μg/ml庆大霉素)以终止消化，吹打5～7次以充分混匀，形成单细胞悬液。
600g，离心5min，弃上清，沉淀用一定体积a-MEM培养基重悬，600g，5min再次离心洗涤一次。
弃去离心后上清液，加入5mlα-MEM+15％FBS完全培养基混匀后接种于T25细胞培养瓶中，记为P0代，Day0天。
将T25细胞培养瓶放入37℃、5％CO2的饱和湿度二氧化碳培养箱内培养。
D5：第一次换液
在生物安全柜内轻轻晃动培养瓶内培养液，吸弃全部培养液，加入相应新鲜α-MEM+15％FBS完全培养基(T25培养瓶加入5ml，T75培养瓶加入15ml，T175培养瓶加入30ml)。
将细胞培养瓶放入37℃、5％CO2的饱和湿度二氧化碳培养箱内培养。
D8：第二次换液
在生物安全柜内轻轻晃动培养瓶内培养液，吸弃全部培养液，加入相应新鲜α-MEM+15％FBS完全培养基(T25培养瓶加入5ml，T75培养瓶加入15ml，T175培养瓶加入30ml)。
将细胞培养瓶放入37℃、5％CO2的饱和湿度二氧化碳培养箱内培养。
D11：第三次换液
在生物安全柜内轻轻晃动培养瓶内培养液，吸弃全部培养液，加入相应新鲜α-MEM+15％FBS完全培养基(T25培养瓶加入5ml，T75培养瓶加入15ml，T175培养瓶加入30ml)。
将细胞培养瓶放入37℃、5％CO2的饱和湿度二氧化碳培养箱内培养。
D14：传代培养
传代判断标准：倒置显微镜下观察培养瓶内局部细胞融合度大于80％时即可传代。
洗涤：收集细胞培养上清液做无菌检查，用一定体积PBS溶液洗涤培养瓶两次。
消化：弃去洗涤液后加入相应体积TrypLE Express重组酶(T25培养瓶加入5ml，T75培养瓶加入15ml，T175培养瓶加入30ml)，轻轻晃动混匀使酶能够与细胞充分接触，将细胞培养瓶置于37℃二氧化碳培养箱中静止消化2min～3min，倒置显微镜下观察如80％以上细胞变圆，轻轻用手拍打培养瓶侧面大部分细胞脱落至培养瓶底部即可终止消化。
终止消化：用2倍体积的α-MEM培养基终止消化，再用一定体积PBS溶液洗涤培养瓶，收集细胞悬液至15ml或50ml离心管内。
离心：细胞悬液以500g，离心6min，离心完毕后，弃去上清液，用适量α-MEM+15％FBS完全培养基重悬细胞沉淀。
细胞计数：取20μl混匀的细胞悬液在EP管内与20μl 0.4％台盼蓝染液混合均匀，吸取10μl细胞悬液加至细胞计数板，Countess自动细胞计数仪计数，记录细胞密度与活率，计算细胞数量。
接种培养：细胞按照5×103cells/cm2至6×103cells/cm2的密度接种培养，根据细胞计数结果计算所需培养瓶规格及数量。将细胞放入37℃、5％CO2的饱和湿度二氧化碳培养箱内培养，记为P1代。
换液：在生物安全柜内轻轻晃动培养瓶内培养液，吸弃一半体积培养液，加入相同体积的新鲜α-MEM+15％FBS完全培养基后将细胞培养瓶放入37℃、5％CO2的饱和湿度二氧化碳培养箱内培养。
重复上述步骤，传至P5代，在收集细胞的同时，做如下检测项目：
1)取1×106细胞进行细胞表面抗原分析：流式细胞术；
2)取1×106细胞进行分化能力检测：体外诱导分化试验；
3)取5×103细胞做克隆形成能力检测：CFU-F；
4)取1.5×105细胞做分泌因子检测：ELISA法。
表3.流式检测结果
表4.细胞分泌因子检测
结果讨论分析：
流式检测：AMMS无血清培养体系和血清培养体系并无明显差异，表明牙髓间充质干细胞纯度符合相关标准。
诱导：人牙髓间充质干细胞在AMMS无血清培养体系和血清培养体系中均具有分化为骨、脂肪和软骨的能力，从染色结果来看，AMMS无血清培养的人牙髓间充质干细胞在体外形成脂肪的能力更强。
克隆形成能力：虽然AMMS无血清培养体系与血清培养体系在克隆形成率统计中并无明显差异，但从形态学上看，AMMS培养的hDPSC单个克隆所含细胞数量更多，单个克隆的扩散面积更大。
分泌因子检测：两种培养体系下，人牙髓间充质干细胞均具有分泌IL-6、IL-10和PEG2的能力，其中免疫调节因子PGE2在血清培养体系中表达较高。PGE2作为一种促炎因子，几乎在所有细胞中都有表达，在PGE合成酶的催化下，PGE2大量产生并发挥促炎作用；当MSC大量表达PGE2时，可通过诱导DC上共刺激分子的表达增强T细胞的活化，从而产生TGFβ1，进而影响机体免疫系统。由此可见，血清中含有的动物蛋白或其他成分可能促进hDPSC促炎因子的分泌，这可能是临床上使用hDPSC进行细胞治疗的一个隐患。
综上所述，在AMMS无血清培养体系中，牙髓间充质干细胞仍保持间充质干细胞的相应表型特征；具有成骨、成脂、成软骨的分化能力；相对于血清培养体系，由于因子分泌能力的差异，AMMS无血清培养体系在临床应用中可能更加安全。
上述具体实施方式用来解释说明本发明，仅为本发明的优选实施例，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明做出的任何修改、等同替换、改进等，都落入本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种牙髓间充质干细胞培养方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
S1、牙齿筛选与保存：筛选、采集健康志愿者乳牙/恒牙，使用生理盐水清洗、碘伏消毒，置于牙齿保存液中4℃冷藏，并于24小时内进行分离处理；
S2、牙髓分离：将牙齿转移至培养皿中，PBS清洗，剪断牙冠，使用牙齿探针取出牙髓组织，使用PBS清洗牙髓组织，洗净后放入50ml离心管中，加入适量PBS，用剪刀剪碎至1～4mm3的小块；
S3、牙髓间充质干细胞原代培养：
将剪碎的牙髓组织400～600g离心10min，去上清；
加入2～3ml组织消化液，37℃，摇床消化30～60min；
消化后的组织加入等体积无血清完全培养基中止消化，300～500g，离心10min，去上清；
使用2～3ml无血清完全培养基重悬后接种于T25培养瓶中，置于37℃、5％CO2的饱和湿度环境中培养；
第5天首次换液，以后每3天换液一次，至14天左右；细胞融合度达80％左右时，进行传代培养
S4、传代培养：
传代时，用消化传代酶消化传代，使用无血清完全培养基中止消化；传代细胞接种密度约为4000～6000个/cm2；3天后，细胞密度达80％以上，再次传代；传至第2/5代，细胞数约为2～3×109个；
收集并冷冻保存。
2.根据权利要求1所述的牙髓间充质干细胞培养方法，其特征在于：步骤S1中，所述牙齿保存液为无血清基础培养基a-MEM，且含有临床级抗生素。
3.根据权利要求1所述的牙髓间充质干细胞培养方法，其特征在于：步骤S1中，筛选的项目包括：携带病毒、家族遗传史，所述病毒包括：乙肝、丙肝、梅毒、艾滋、EB。
4.根据权利要求1所述的牙髓间充质干细胞培养方法，其特征在于：步骤S3中，所述组织消化液为：2～3mg/ml的胶原酶I、2～4mg/ml的分散酶。
5.根据权利要求1所述的牙髓间充质干细胞培养方法，其特征在于：步骤S3、S4中，所述无血清完全培养基为间充质干细胞培养基。
6.根据权利要求5所述的牙髓间充质干细胞培养方法，其特征在于：所述无血清完全培养基由无血清基础培养基a-MEM、血清替代物以及谷氨酰胺组成；
所述血清替代物的质量体积比为：5％；所述谷氨酰胺的浓度为0.02mmol/ml。
7.根据权利要求1所述的牙髓间充质干细胞培养方法，其特征在于：步骤S4中，所述消化传代酶为TrypLETMExpress。
8.根据权利要求1所述的牙髓间充质干细胞培养方法，其特征在于：步骤S4中，冷冻保存所用细胞冷冻保护液为CELLBANKER无血清冷冻保护液。
9.根据权利要求1所述的牙髓间充质干细胞培养方法所培养的牙髓间充质干细胞。
10.根据权利要求1所述的牙髓间充质干细胞培养方法所培养的P5代细胞在临床上的应用。
Priority Applications (1)
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| CN202310398730.0A CN116376820A (zh) | 2023-04-14 | 2023-04-14 | 一种牙髓间充质干细胞、培养方法及应用 |
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Publications (1)
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