KR100761922B1 - 분말형 지지체를 이용한 세포 배양에 있어 세포 사이의 신호 조절에 의한 세포 배양방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 세포의 개체수를 늘리기 위한 배양 방법에서 증식 효율에 가장 큰 변수가 되는 세포 사이의 증식 및 억제 신호의 적절한 조절을 통하여 세포 증식 효율을 향상하고자 하는 3차원 증식배양(three dimensional proliferation culture)하는 방법을 제시할 목적을 갖는다. 이를 위해 본 발명은 세포 배양과정에서 a) 적절한 세포 간격(지지체에 비한 상대적 농도)을 유지하기 위해 초기에는 적은 양의 지지체를 사용하다가 증식 속도에 맞추어 서서히 지지체를 증량시키는 지지체의 단계적 첨가 과정과, b) 일정시간 이상 정체시킨 후 붙어 있는 세포들의 사이를 물리적 힘으로 분리하기 위해 흔들어 주는 주기적 동요 과정을 동시에 수행하여 세포 사이의 증식 및 억제 신호를 조절하고, 이를 반복수행하여 세포를 증식 배양하는 것을 특징으로 하는 분말형 지지체를 이용한 세포 배양에 있어 세포 사이의 신호 조절에 의한 세포 배양방법을 제시한다.

세포배양, 3차원 증식 배양, 주기적 동요, 지지체의 단계적 첨가

Description

분말형 지지체를 이용한 세포 배양에 있어 세포 사이의 신호 조절에 의한 세포 배양방법{Proliferation culture methods using micro-scaffolds for regulations of cell-to-cell signals}

본 발명은 세포의 개체수를 늘리기 위한 배양 방법에서 증식 효율에 가장 큰 변수가 되는 세포 사이의 증식 및 억제 신호의 적절한 조절을 통하여 지방조직(fat tissues)에서 성체 줄기세포(stromal stem cell)를 분리하고 이를 목적에 맞는 세포로 증식(proliferation) 하고 필요에 따라 이를 분화(differentiation)하는 등의 세포 증식 효율을 향상하고자 하는 3차원 증식배양(three dimensional proliferation culture)하는 방법에 관한 것이다.

최근 급격히 진보된 줄기세포 연구의 결과로서 지방조직(fat tissues)에서 성체 줄기세포(stromal stem cell)를 분리하고 이를 목적에 맞는 세포로 증식(proliferation), 분화(differentiation) 시킬 수 있는 단계에 이르렀다. 그러나 실제 세포의 배양에는 수많은 고가의 장비와 시설, 연구 인력, 고가의 소모품 등이 필수적이어서 현실적인 어려움이 많다.

특히, 철저한 준비 없는 배양시에는 공기 중의 세균이 오염(contamination)되어 과정 전체가 실패에 이르는 경우도 있고 연구인력의 실수로 인한 실패 등 여러 가지 실패 요인이 있어 연구의 성과를 위해서는 막대한 시설 투자와 연구인력 양성이 필요한 상황이다.

예로서 공기중의 세균오염을 감소시키기 위해 공기의 흐름을 위에서 아래로 형성한 클린룸(clean room) 또는 클린벤치(clean bench)와 같은 시설이 필요하며 다양한 용기들을 소독하기 위한 소독장비, 공기 정화기, 흡인기 등등 부수적 시설이 필요하다. 또한 연구인력이 이러한 시설들을 제대로 사용하며 복잡한 과정 중에 오염되지 않도록 하기 위해서는 장기간의 실습을 통한 숙달이 필수적이다.

한편, 세포가 증식이 유발되기 위한 조건에는 화학적 환경(chemical environment)이 무수히 많이 존재하나 아직 정확히 밝혀지지 않는 것들도 있다. 증식억제 역시 그 환경의 영향을 크게 받는 것은 마찬가지이며 이 역시 아직 밝혀지지 않은 원리가 많다고 보고 있다. 예를 들면 병원균 역시 1㎤의 인체 조직에서 10⁶개 이상이 있을 때 인체 내에서 증식이 가속화되어 감염증을 일으킨다는 실험적 보고가 존재하나 그 정확한 기전은 파악되지 않고 있다. 일반 세포 배양 역시 일정 숫자 이상의 세포가 어느 정도 밀집되어 있을 때 세포 간의 증식 신호를 유발하여 기하급수적 증식이 유도된다고 보고되어 있으나 수용성 물질, 또는 전도성 물질에서 가능하다는 것 외에는 정확한 물질과 원리는 밝혀지지 않고 있다.

증식 억제 역시 여러 가지 환경이 보고되어 있으며 이중 확실한 것은 같은 세포가 옆에 붙어있을 때 존재할 때 그쪽으로는 더 이상 증식하지 않는다는 접촉억제 현상(contact inhibition)은 거의 명확히 밝혀진 사실이다.

이와 같은 관점에서 볼 때 증식을 위한 기존의 배양법은 구체적으로 다음과 같은 장단점이 있다.

[평면배양]

기존의 세포 배양법으로서 전통적인 방법은 평면위에서 세포 분열을 유도하는 평면배양법이다. 특정 세포들을 배양액 내에서 평면 위에 뿌려 바닥 즉 평면에 부착시킨 후 자신의 주변으로 증식하여 자라도록 한 후 포화상태가 되면 세포가 부착하는 구조물을 트립신과 같은 효소로 제거하여 분리한다. 이때의 세포 부유액(suspension)을 원심분리하여 원심분리 용기 바닥에 적층된 세포들을 얻은 후 효소를 씻어내기 위해 충분한 양의 중화액(buffer, PBS)에 부유시켜 다시 원심분리를 하여 세포들을 원심분리 용기의 바닥 쪽에 적층시킨다. 이 과정을 여러 번 반복 한 후 이 세포들을 배양액에 부유시켜 새로운 배양 평면에 분산 접종(seeding, loading))한다. 이들이 자라 다시 포화 상태가 되면 같은 과정을 반복함으로써 기하 급수적인 세포 수의 증가를 얻을 수 있다.

이 방법에서의 제한 점은 세포군락(cell colony)의 주변부에서만 증식이 일어나고 세포로 둘러싸인 세포는 증식을 하지 않으므로 실질적으로는 군락의 외곽선에 국한하여 증식이 일어난다는 증식속도 제한 요인이 있다. 따라서 평면 증식배양의 원리는 가능한 한 여러 군락을 형성하여 증식하는 세포의 수를 최대화 하는데 있다.

이 때의 부착면은 용기의 바닥이나 벽이 되며 세포의 적층은 일어나지 않고 한 개의 층만을 형성하여 단일층 배양(mono-layer culture)이라고도 한다.

[지지체를 사용하지 않는 3차원 배양]

세포를 액체 또는 겔(gel)상에 부유시킨 상태에서 증식 조건을 형성함으로써 평면 배양의 제한을 해결하고자 하는 배양법으로서 적절한 조건을 위해 액체의 흐름을 제어하기도 한다. 이는 개념상에서 3차원 배양으로서 상호 접촉 억제 현상이 없고 세포의 증식 방향성에서 평면 배양보다 월등히 많은 기회를 갖지만 세포간 증식 신호의 인지 및 각 세포 단위서의 분열 속도가 저하되어 실질적인 속도 증가 효과를 내기 위해서는 세포의 종류와 조건에서 제한을 갖는다.

[분말형이 아닌 지지체를 이용한 3차원 배양]

지지체는 세포들이 부착하여 자랄 수 있는 구조물로서 세포가 자랄 공간을 확보해주기 위한 것과 동시에 지지체의 모양에 따라 세포의 군락이 형성되므로 세포 군락의 형태를 조절하는 목적의 물질이다. 지지체를 이용한 배양은 평면 배양에 비해 월등히 많은 세포 부착면을 갖는다는 점과 세포의 성장 방향이 같은 평면이 아닌 상 하로의 성장도 가능하여 적층 구조도 이룰 수 있다는 의미에서 3차원 배양이라고 한다.

3차원 배양에 사용되는 지지체는 대부분 고체이지만 젤라틴과 같은 액체와 고체 중간 성질의 물질을 이용하기도 한다.

지지체의 형태는 대부분 배양액의 이동이 가능하고 세포 부착면이 최대화 된 다공성 구조로서 스폰지 형태의 디스크나 블록 형태 또는 구형의 형태를 가진다.

이들 지지체는 실질적으로는 복잡한 형상으로 통해 부착 평면의 적층 또는 굴곡으로 부착면적의 최대화를 이룬 구조이나 세포들이 이 지지체를 관통하여 자랄 수 없으므로 내부에서는 거의 자랄 수 없는 구조이고 그 표면은 결국 포화상태에 이르게 된다. 따라서 포화 상태 이후에는 세포들을 지지체로부터 분리하여 다시 새로운 지지체에 분산 접종하는 과정을 통해서만이 증식을 더욱 확대 할 수 있으므로 평면배양에서와 같이 세포 분리 및 세척의 과정을 거칠 수 밖에 없다.

[분말 형태 즉 미립자형 지지체를 이용한 3차원 배양]

고체 분말을 이용하긴 하나 입자들이 포화되면서 세포에 의해 서로 뭉치는 것으로 간주되고 세포 단위로 생각하여 일반적으로는 종전과 같이 증식량을 늘리기 위한 분산접종을 위해서는 트립신등을 이용한 세포 분리 과정을 거치므로 기존의 다른 배양법에 비해 증식 속도와 효율이 증가하지만 여전히 세포 분리 및 분산접종 단계에서는 일정양의 노력과 시간을 필요로 하고 화학적 분리시 세포의 생존도 저하라는 문제를 지닌다.

[지지체부유배양]

일정량의 지지체와 함께 세포를 지속적으로 부유시켜 세포의 부착을 유도하는데 세포가 붙어입자가 포화상태가 되면 더 이상 증식이 일어나지 않으므로 시간이 갈수록 증식이 일어나는 입자의 수도 늘어나지만 포화된 입자의 비율도 같이 상승하므로 증식억제의 총량도 증가한다. 이는 배양액만의 조절로 일정한 밀도 유지가 용이하나 항시 동적이어서 상호 세포간 증식 유발 신호 교환과 정적인 표면에 부착된 상태에서의 장점이 없어 불리한 면이 있다.

[지지체 정지 배양]

의도한 충분한 양의 지지체에 세포를 분산 접종하고 배양액에 와류를 형성하여 미 부착 세포들의 꾸준한 이동으로 부착 기회를 늘리는 방법이 있으나 이는 세포가 증식하고 있는 곳에서는 실질적으로 부분적인 포화상태가 되어 같은 세포로 둘러싸인 세포들의 비율이 높아 상호 접촉 억제량이 증가하고 초기에 너무 낮은 세포 밀도로 상호 증식 신호양이 적다.

[지지체 초기 동요 및 정지 배양]

의도한 충분한 양의 지지체에 세포를 분산 접종하고 초기에만 적절한 시기에 동요시킴으로써 상호 접촉 억제량을 최소화할 수 있으나 역시 초기에 너무 낮은 세포 밀도로 상호 증식 유발 신호 양이 적다. 또한 각 세포의 분리를 화학적으로 시행하고 기하급수적 지지체 추가방식을 활용하지 않으므로 세포가 없는 새로운 지지체에 분산 접종하기 위해 화학적 세포 분리 과정을 거치게 된다. 또한 지지체의 기하급수적 추가가 아니면 미리 다량의 지지체를 사용하므로 배양액의 침투가 초기부터 힘들어져 배양 초기단계의 효율에 저하를 가져오므로 줄기세포의 유지에 어려움이 있을 수 있다.

본 발명은 세포 배양에 있어 세포가 자랄 수 있는 환경 중 세포 간 신호(cell-to-cell signal or interaction)에 의해 증식이 가속화되는 환경을 적절히 이용하고 동시에 분열되어 증식한 세포가 서로 붙어있게 되면 증식억제 신호가 크게 발생하여 증식 가능 면적의 상대적 비율이 줄어드는 현상을 최소화시키며 동시에 이를 위한 세포 간의 분리는 적절한 시간에 유전자 변이(mutation)를 일으킬 가능성이 있다고 알려진 화학적 방법이 아닌 물리적 힘에 의한 세포 간의 분리를 이용하여 세포 증식효율을 높임으로써 기존 배양법이 갖는 제 문제를 해소할 목적으로 안출된 것이다.

또한 본 발명은 배양에서의 복잡한 과정과 다양한 장비 및 도구들을 단순화하여 실험에 소요되는 경제적 부담을 줄이고 소규모의 시설에서도 이러한 진보된 연구를 구현 가능하게 하며 연구의 성과를 확실하게 얻을 수 있는 세포배양방법을 제시하기 위한 것이다.

이를 위하여 본 발명은 배양액 속에서 분말형 지지체(micro-scaffold, micro-beads)를 이용한 3차원 세포 배양에서 정체 상태(static status)와 분말형 지지체들의 동요 상태(moving status;shaking, rolling, stirring, whirling, rocking, mixing,blending, rotation 등등.)를 주기적으로 반복하는 세포 배양 방법 또는 분말형 지지체를 서서히 증량시키는 세포 배양방법을 동시 또는 개별적으로 수행함으로써 세포 배양에 있어 세포가 자랄 수 있는 환경 중 세포 간 신호(cell-to-cell signal or interaction)에 의해 증식이 가속화되는 환경을 적절히 이용하고 동시에 분열되어 증식한 세포가 서로 붙어있게 되면 증식억제 신호가 크게 발생하여 증식 가능 면적의 상대적 비율이 줄어드는 현상을 최소화시키며 동시에 이를 위한 세포 간의 분리는 적절한 시간에 유전자 변이(mutation)를 일으킬 가능성이 있다고 알려진 화학적 방법이 아닌 물리적 힘에 의한 세포 간의 분리를 이용하여 세포 증식효율을 높이는 방법을 제시한다.

상기한 세포배양방법은 피스톤 개폐가 가능한 주사기를 구비하여 세포를 채취한 후 증식에 적합한 상태로 원심분리 및 세척과정을 거치는 사전처리단계와; 상기 주사기의 피스톤을 열고 배양액과 분말형 지지체를 넣어 배양액 내에서 부유상태로 분말형지지체(micronized scaffold)와 세포(stem cells)를 부착시켜 이를 적층 침전시키는 분말형지지체부착단계와; 피스턴이 열린 상태에서 세포를 배양하는 세포배양단계와; 배양이 진행된 상태에서 피스턴 개폐구를 통하여 배양액 및 분말형 지지체를 추가한 후 동요((moving status;shaking, rolling, stirring, whirling, rocking, mixing,blending, rotation 등등.) 시키는 증식단계와; 상기 증식단계를 주기적으로 반복하는 증식반복단계; 로 이루어지는 주사기를 이용한 밀폐식 세포 배양 방법이 적용될 수 있다.

이와 같은 본 발명은 줄기 세포(stem cells)의 3차원 증식배양(three dimensional proliferation culture) 방법으로써 종래의 제 세포배양방법에 비해 세포수의 고도 증가와 빠른 배양속도 및 안전성을 갖는 특징이 있다.

상기에서 사전처리단계는 세포를 채취하고, 이를 콜라겐용해제(collagenage) 처리하여 세포를 분리시킨 후 원심분리과정과, 부산물제거과정과, 세척액(PBS)등을 사용한 세척과정을 거쳐 배양 전 단계로 처리하는 단계이다.

분말형지지체부착단계는 세포가 부착하여 자랄 수 있는 고체 분말형 지지체를 세포들과 혼합하여 배양액 내에 적층, 침전시켜 각 입자들의 표면이 모두 배양면으로서 표면적의 합산이 평면배양에서의 배양면적에 상응하는 효과를 내도록 한 단계이다.

상기 단계에서 배양액 내에서 각 세포들은 부유하며, 분말형지지체 또한 부유하여 세포와 부착이 이루어지고, 세포부착 후 배양액보다 증량이 무거워진 분말형 지지체는 침전하여 주사기 바닥에서 단계적으로 적층된다.

분말형 지지체는 키토산분말, 동종진피조직 가루, 다공성 폴리에틸린(Poyethylene) 가루, PTFE(polytetrafluoroethyelene) 가루, PLGA입자(poly lactic-co-glycolic acid) 분말, PGA(Poly glycolic acid) 분말, PLA(lactic-co-glycolic acid) 분말 , PLLA(poly L-lactic acid), PCL(poly e-carprolactone) 이용될 수 있다.

증식단계는 주기적인 동요(shaking, stirring, blending)를 통해 포화된 입자들을 분리하고 포화된 입자가 새로운 입자에 접할 가능성을 높이고 새로운 입자에 세포가 자라 들어가도록 하며 새로운 입자들이 포화될 시점에 다시 지지체를 추가하면서 동요를 시켜 세포 증식의 기회를 일정한 수준으로 유지하는 단계이다.

이러한 과정은 기존에 연접한 세포들을 각각 분리하여 고정된 지지체에 분산 접종하는 과정을 대치함으로써 화학물질(예: trypsin)을 이용한 세포 분리 과정을 없애 세포의 생존률(viability) 감소 현상과 유실을 최소화한다.

또한 포화된 입자의 비율을 조절함으로써 세포의 밀도가 급격히 높아져 야기되는 접촉 억제(contact inhibition) 상태의 기회를 최소화 하여 접촉 억제 총량을 최소화하고 세포 증식에 가장 적절한 세포간 상호 신호(cell to cell signal)를 유지할 수 있는 밀도를 유지하여 상호 증식 신호의 총량을 최대화 한다.

정적(static)인 침전 상태는 입자들의 상대적 위치 변화가 없으므로 세포의 이동에 안정적인 증식 환경이므로 일정 시간 이상 유지 되어야 하며 동요의 시기에는 일부의 세포가 각기 떨어졌다가 새로운 입자에 재 부착되게 된다.

세포가 부착된 입자는 빠른 시간 안에 포화되게 되어 더 이상 자랄 수 없으나 연결된 입자가 있는 경우 세포는 접촉 억제가 없는 쪽인 연결된 입자의 표면으로 이주하며 증식하는데 그 입자마저도 표면이 세포로 싸이게 되면 완전한 접촉억제 상태가 되어 더 이상 증식할 수 없다. 이때 새로운 빈 입자가 접촉하게 되면 다시 증식, 이주(migration)하게 된다.

따라서 주기적으로 흔들어서 새로운 빈 입자와의 접촉을 유발하고 단계적으로 증량하는 지지체의 추가를 통해 빈 입자의 밀도를 유지하여 세포 증식의 기회를 극대화 한다. 이 과정에서 초기에는 소량의 지지체를 추가하며 이후 기하급수적으로 증량하여 추가하게 되는데 초기 소량 추가의 의미는 포화된 입자가 상대적으로 다른 포화된 입자와 너무 멀리 떨어져 있으면 세포 상호간의 신호가 어려워 증식유도가 약해지므로 적절한 밀도 유지가 중요하며 입자의 크기와 형태 또한 적절하게 유지되어야 한다.

이러한 개념은 기존에 세포 밀도 조절을 위해 각 세포단위의 개념으로 세포들을 분리하여 분산시키는 과정을 대신하여 지지체입자들의 단위에서 이들이 움직이는 물리적 힘으로 이주 된 세포로 연결이된 인접한 입자간의 연결을 분리하고 지지체입자 단위의 개념으로 분산시켜 입자의 밀도를 조절함으로써 세포 밀도 유지 측면에서 세포단위의 밀도 조절과 비슷한 효과를 얻도록 한다. 따라서 너무 크지 않은 (20- 100um )의 분말형 입자를 사용하는 것이 적절하다.

이는 여러 개의 세포로 포화된 각 입자들을 최소단위로 간주하므로 모든 과정은 세포가 입자에 부착된 상태로 진행되며 특별한 화학물질 없이는 분리되지 않는 세포간의 연결에 비해 입자들의 분리는 보다 쉽게 이루어진다는 측면을 이용한 개념이다. 보다 원리적인 측면에서 보면 몇 개의 세포가 붙어있는 입자들이 액체의 움직임에 따라 움직이려는 관성 즉, 입자의 무게에 따른 관성과 배양액 등 액체의 저항이 입자간을 연결하는 세포의 분리에 충분한 물리적 힘이 될 수 있다는 새로운 사실을 적용시킨 것이다.

따라서 각 입자의 크기는 일정 수준이상이 되어야 하고 동요의 주기는 입자간에 과다한 세포의 연결이 발생하지 않는 수준으로 이루어져야 한다. 이러한 적정 값들은 지지체의 소재에 따라 다르고 세포에 따라 약간 다르지만 간단한 실험을 통해 적정 범위를 얻을 수 있다.

예를 들면, 분말형 지지체는 20 ~ 250 ㎛ 크기가 사용되고, 동요주기는 4 ~ 8시간 마다 0.5 ~ 2 분간 시행하며, 분말형 지지체는 추가는 16 ~ 48 시간마다 직전 투입량의 1.5 ~ 4배 투입하는 방법으로 실시될 수 있다. 배양 후 지지체와 함께 체내 이식을 목적으로 할 경우 주사바늘에 의해 체내주입이 가능한 크기인 20 ~ 100 ㎛ 분말형 지지체의 사용이 바람직하며, 기타 지지체에 대한 동요주기와 시간, 분말형 지지체의 단계적 추가량은 지지체와 세포의 특성에 맞게 선행 시험을 통하여 간단하게 얻을 수 있다.

본 발명에 의한 배양 방법은 기 제시한 바 있은 밀폐형 지방채취 및 배양용 주사기에 의해 지방의 채취, 사전처리 및 배양의 전 과정이 주사기 안에서 이루어지도록 구성할 수 있다.

상기 주사기는 몸체 즉 실린더의 외형은 일반 의료용 주사기와 같으나 통상적으로 바늘이 부착되는 선단부가 중앙에 위치하며 고무마개를 끼워 밀봉할 수 있도록 외경에 나사를 형성하였다. 피스톤은 원심분리기에 장착 가능하도록 플런져(plunger)를 분리할 수 있으며 피스톤을 중심으로 전후방 공간이 통하도록 통로가 형성되어 이를 개폐할 수 있도록 함으로써 이를 통해 세포 분리액, 세척액, 배양액, 지지체 부유액 등과 같은 액체, 산소 이산화탄소와 같은 특정 기체 등의 주입과 제거 가능하도록 한다.

피스톤의 통로의 내경에는 나사가 형성되어 플런져, 연결관, 마개 중 하나를 장착할 수 있도록 한다. 이 피스톤은 배양 전 과정에서 용기를 밀폐해주므로 배양액의 이동이나 세척 등의 과정에서 외부 공기와의 접촉 기회를 최소화하며 이를 시 행하는 인력의 실수로 인한 오염의 가능성도 최소화한다. 또한 위가 열려있는 용기와 달리 동요를 위해 별도의 동요저(stirrer)와 동력 없이 단지 주사기를 흔들거나 뒤집어 주는 행동만으로도 충분한 동요가 가능하므로 조작이 간편해진다.

선단의 고무마개는 수시로 있을 수 있는 샘플링을 주사바늘로 가능하도록 하여 최소의 조작, 최소의 노출로 샘플링 중의 오염가능성을 최소화 한다.

경제적 측면에서는 쉽게 구할 수 있고 가격이 싼 주사기를 이용하는 것으로써 수술실에서의 채취 단계부터 배양장소까지 이동이 수월하여 별도의 비용이 들지 않고 복잡한 과정과 다양한 도구나 고가의 배양장비가 필요 없어 줄기세포의 연구와 같이 동시에 여러 가지의 배양이 필요한 경우에는 특히 비용의 절감효과가 매우 큰 장점을 갖는다.

상기한 주사기를 이용하는 배양법은 상기 주사기를 구비하여 세포를 채취한 후 증식에 적합한 상태로 원심분리 및 세척과정을 거치는 사전처리단계와; 상기 주사기의 피스톤을 열고 배양액과 분말형 지지체를 넣어 배양액 내에서 부유상태로 분말형지지체(micronized scaffold)와 세포(stem cells)를 부착시켜 이를 적층 침전시키는 분말형지지체부착단계와; 피스턴이 열린 상태에서 세포를 배양하는 세포배양단계와; 배양이 진행된 상태에서 피스턴 개폐구를 통하여 배양액 및 분말형 지지체를 추가한 후 동요((moving status;shaking, rolling, stirring, whirling, rocking, mixing,blending, rotation 등등.) 시키는 증식단계와; 상기 증식단계를 주기적으로 반복하는 증식반복단계; 로 이루어진다.

세포의 채취는 주사기 선단의 고무마개를 열고 여기에 지방채취를 위한 주사 바늘을 결합하고, 주사기의 내부 피스턴통로를 막고, 주사기의 플런지에 셕션케이블을 부착하여 흡입 부위에 바늘을 꽂고 피스턴 배면에 음압을 가하여 주사기 용기 내부로 지방을 흡입 채취하는 방법으로 진행된다.

원심분리 및 세척은 주사기의 바늘을 제거하고 선단 고무마개를 막고, 피스톤의 통로를 통하여 콜라겐(collagenage)을 투입한 후 피스턴 통로를 막아 주사기 내부 공간을 밀폐하는 단계와, 상기 주사기 용기를 원심분리기에 넣고 원심분리하는 단계와, 이후 피스턴의 통로를 통하여 부산물을 제거하는 단계와, 피스턴의 통로를 통하여 세척액을 주입하여 수십 회 흔들어 준 후 세척액을 제거하는 단계로 이루어진다.

분말형지지체부착은 배양액과 분말형지지체를 피스턴 통로를 통하여 주입하여 3~4회 흔들어줌으로써 혼합하는 단계와, 분말형지지체 및 지방세포가 배양액에서 부유하는 상태에서 안정된 상태를 유지함으로써 지방세포가 분말형지지체에 부착되면서 침전하는 단계로 이루어진다.

배양은 피스턴을 연 상태에서 Shaker를 사용하여 주기적으로 동요하고, 1차세포의 배양이 완료되면 배양액과 분말형지지체를 추가로 투입한 후 최초 흔들어주기와 이후 주기적 동요를 반복하는 과정에 의해 배양 증식을 진행한다.

상기한 주사기를 이용한 배양 방법은 기존 배양법과 구분되는 다음과 같은 장점을 갖는다.

1) 지방 조직을 채취한 주사기에서 다른 용기로의 이동 없이 분리, 세척 원심분리를 시행할 수 있다.

2) 지지체와 세포가 침전된 정적인 상태에서도 상층인 배양액의 교환이 쉽게 이루어진다.

3) 특정 기체가 채워진 인큐베이터에서 피스톤을 통해 접촉하거나 특정 기체를 피스톤을 통해 주입하고 밀폐함으로써 의도한 기체와의 접촉(aeration)을 쉽게 유지할 수 있다.

4) 배양액 교환시 지지체를 동요시키지 않고 쉽게 가능하다.

5) 지지체의 추가, 배양액, 기체의 교환 등의 과정이 수월하다.

6) 원심분리가 수월하다.

7) 용기를 뒤집을 수 있으므로 동요(stirring)가 쉽다.

8) 하나의 용기를 이용함에 있어 유실이 최소화된다.

9) 밀폐과정을 통해 감염이 최소화된다.

1 0)분말형 지지체를 사용함에 따른 장점으로서 세포 분리과정을 생략할 수 있다.

11) 희석, 분산접종,등의 과정에서 지지체를 제어하는 것으로 동시에 세포의 밀도를 원하는 수준으로 제어할 수 있다.

12) 지지체와 함께 저장된 냉동 샘플로부터 바로 증식에 사용되어질 수 있어 분리과정 없이 진행되어 세포의 생존도를 극대화하며 비용과 시간을 절약한다.

이하 구체적인 세포 배양 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한 다.

상기한 실시 예는 분말형 지지체(micro-scaffolds, micro-beads)를 이용한 3차원 세포 증식 배양에서 동일한 양의 세포와 동일한 양의 지지체를 이용하여 동일한 시간 배양하였을 때 간헐적 흔들기( shaking, moving status, rolling, stirring, whirling, rocking, mixing, rotation 등등.)과 분말형 지지체(micro-scaffolds, micro-beads)의 단계적 추가 방식이 세포 배양 효율에 미치는 영향을 조사하기 위해 실시된 것이며, 다음의 가설이 성립됨을 확인하기 위한 것이다.

가설 1

세포 증식에 필요한 두 가지 조건 즉, 1) 세포 상호 간의 증식 유발 신호 2) 세포 상호 간의 증식 억제 신호를 모두 적절한 상태로 유지하고자 하는 시도가 세포 증식량을 늘릴 수 있는 방법으로 작용할 것이다.

가설 1-1

간헐적 흔들기(intermittent shaking)는 1)"정체 상태로 흔들지 않는 것"에 비해 세포 간의 일정 간격을 일정 시간 유지하여 증식 유발 신호를 최대한 활용하고 접촉억제가 강해지기 시작할 때 다시 세포들을 분리하여 접촉억제가 작아지는 상황으로 전환함으로써 2) "계속 흔드는 것(continuous shaking, stirring, rolling, rocking, whirling, 등)" 에 비해서는 정체상태가 존재하므로 부분적 밀도 상승에 의한 증식 유발 효과를 보다 증가시키고 접촉억제를 최소화함으로써, 1), 2) 에 비해 세포 증식량을 증가시킬 것이다.

가설 1-2

단계적 지지체추가는 같은 양의 세포로 증식하고자 할 때 세포 수가 늘어남에 따라 증가하게 되는 세포의 상대적 농도 증가 즉, 접촉 억제를 최소화하기 위한 것으로서 처음에는 소량의 지지체에 세포를 seeding 하여 서서히 지지체의 양을 늘려가는 개념으로, 처음부터 많은 양의 지지체에 seeding 하여 세포의 상대적 농도가 낮아 증식 유발 신호가 약한 단계를 피하기 위해 처음에는 세포의 상대적 농도를 높게 유지하다가 세포가 증식하여 상대적 농도가 높아짐에 증가하게 될 증식 억제 신호를 최소화하기 위해 상대적 농도를 일정하게 유지하려는 시도이다. 이는 최종적으로 세포의 증식량을 늘리는 데 기여할 것이다.

가설 2

Micro-scaffold를 이용한 3차원 세포 증식에서는 단순한 shaking or stirring 만으로도 입자 간 연결된 세포를 분할할 것이다. 따라서 세포의 재 seeding을 위한 세포 분할을 위해 trypsin 등의 변종유발 가능물질을 사용할 필요가 없을 것이다.

가설 3

가설 1, 2에 의해 가설 1-1, 1-2를 복합하였을 경우( 실험군 2) 이러한 가설들을 적용치 않은 배양법 즉, "정체 상태( 대조군 1; 1-1-2)", " 계속 흔드는 것 ( 대조군 2; 1-1-2)" 또는 가설 1-1 만을 적용한 군( 실험군 1; 간헐적으로 흔들어 주는 것) 에 비해 가설 2의 상승효과에 의해 세포 증식량이 실험군 1 에 비해 증가할 것이다.

이와 같은 가설의 확인하기 위하여 다음과 같은 방법으로 시험하였다.

[사용재료 및 방법( Material and Method) ]

. 분말형 지지체(Micro-scaffold): PLLA (직경 10㎛-100㎛, 구형, nonporous )

. 세포(Cell): 지방조직으로부터 추출한 계대배양을 거치지 않은(P0) stromal cell

. Media: DMEM(구성; 4.00mM L-Glutamine, 4500mg/L Glucose, with sodium pyruvate, DW - 0.2 ㎛ sterile filtered ) + 10% FBS + 1%PS

. 세척액: PBS(구성; KCl: 200.00 mg/L, KH₂PO₄ : 200.00 mg/L, NaCl: 8000.00 mg/L, Na₂HPO₄H₂O : 2160.00 mg/L)

. 배양 용기: 50cc 밀폐형 지방채취 및 배양용 주사기(메디칸 (주)) (직립상태로 위치 → cell과 micro-scaffold 침전 유도)

. Shaker: 기종; Vortex Genie-2(Scientific industries, Co)-60rpm

. 배양 온도 및 환경: 37℃, 5% CO2-incubator

. 총 배양기간: 7일

[ 배양 방법 ]

1) (밀폐형 지방채취 및 배양용 주사기에 바늘을 끼워 지방조직으로부터 지방을 채취한다.

2) 이후 주사기의 바늘을 제거하고 선단 고무마개를 막고, 피스톤의 통로를 통하여 콜라겐(collagenage)을 투입하여 피스턴 통로를 막아 주사기 내부 공간을 밀폐한다.

3) 다음으로 상기 주사기 용기를 의료용 원심분리기에 넣고 원심분리하였다. 이후 상부의 부산물과 하부의 지방세포로 분리하고, 이후 상부의 부산물을 피스턴통로를 통하여 외부로 배출하여 지방세포를 얻는다.

다음으로 세척액(PBS)을 피스턴 통로를 통하여 투입하고, 용기 전체를 고루 흔들어 지방세포를 세척하며, 이후 피스턴 통로를 통하여 세척액을 흡입 제거한다. 이와 같은 과정을 통하여 사전처리된 세포(stromal cell)를 얻는다.

4) 이후 상기 사전 처리된 세포를 배양액과 분말형 지지체에 넣어 배양액 내에서 부유상태로 분말형지지체(micronized scaffold)와 세포(stromal cells)를 부착시키고, 이를 각각의 조건에 맞게 배양한다.

대조군 및 실험군을 포함한 모든 군에서 7일까지 배양 후 1분 shaking 후 샘플 중앙부에서 25㎕ sampling 하였다.

a) 대조군 1

static culture에서 micro-scaffold 8ml, media 40cc에 scaffold가 한 시간 이상 침전 후 cell 1 x 10⁶ cell/ml를 위에서 pipet으로 seeding 하였다.

b) 대조군 2

continuous shaking culture 에서 대조군 1과 동일한 과정 후 continuous shaking 하였다.

c) 실험군 1

intermittent shaking culture에서 대조군 1과 동일한 과정 후 6시간 마다 1분 shaking 하였다.

d) 실험군 2

intermittent shaking + gradual micro-scaffold adding culture에서 micro-scaffold 500 ㎕, media 40cc 에 넣고 shaking 후 6시간 마다 1분 shaking 하였다.

다음으로 24시간(1일) 후 micro-scaffold 500 ㎕ 넣고 shaking 후 6시간 마다 1분 shaking 하였다.

다음으로 36시간(2일) 후 micro-scaffold 1ml 넣고 shaking 후 6시간 마다 1분 shaking 하였다.

다음으로 72시간 후(3일) micro-scaffold 2ml shaking 후 6시간 마다 1분 shaking 하였다.

다음으로 5일째 시작할 때 micro-scaffold 4ml 첨가 shaking 후 6시간 마다 1분 shaking 하였다.

[측정방법]

1) Sample 채취

동일 조건(shaking 후 즉시) 샘플의 중앙부에서 25 ㎕ 채취하고 여기서 10 ㎕ 를 cell counting을 위해 다시 채취한다.

다음에 Static and Shaking culture에서 1일, 2일, 3일, 4일, 7일

micro-scaffold 25㎕를 sampling하여 trypsin-EDTA로 incubator(37℃, 5%CO2)에서 10분간 incubation 시킨 후 sampling한 micro-scaffold를 꺼낸 후 trypsin-EDTA를 inactivation 시키기 위해 DMEM media(10% FBS+1% PS) 넣고, 1분 shaking 한 후 trypan blue를 이용하여 염색하여 Haemocytomer 로 세포수를 측정한다.

대조군 1은 마지막 sampling에서만 적용하고 haemocytomer를 이용하여 세포 수를 측정하며 남은 샘플은 염색에 사용한다.

b) Microscopic examination and Staining method에 의한 Cell counting

haemocytomer 를 이용하여 세포 현미경 하 육안으로 세포 개체 수를 측정한다.

c) H&E staining

Haematoxylin & Eosin 염색하여 micro-scaffold 붙어있는 세포를 확인한다.

d) DAPI staining

DAPI solution으로 micro-scaffold 염색하여 fluorescent microscopy를 이용하여 붙어있는 세포를 확인한다.

대조군 1을 제외한 다른 모든 군 에서는 1, 2, 3, 5, 7일째 모두 1분 shaking 후 sampling 하여 측정하였으나 본 보고에서는 제외하였다.

[ 실험결과 ]

1) 대조군 1 ( static culture)

Cell total number : 220개 계산 : 220 x 10⁴ x 4 x 1/4 = 2.2 x 10⁶

2) 대조군 2 ( Continuous shaking culture)

Cell total number : 260개 계산 : 260 x 10⁴ x 4 x 1/4 = 2.6 x 10⁶

3) 실험군 1 (Intermittent shaking culture)

Cell total number : 340개 계산 : 340 x 10⁴ x 4 x 1/4 = 3.4 x 10⁶

4) 실험군 2 (Intermittent shaking + gradual micro-scaffold adding culture)

Cell total number : 680개 계산 : 680 x 10⁴ x 4 x 1/4 = 6.8 x 10⁶

[ Doubling time 구하기 ]

세포가 2배로 증식되는 시간(doubling time)을 구하기 위해서 sampling을 6시간 마다 25㎕ 채취하여 그 중 10㎕를 따서 세포 개수를 측정하였으며, 표 1은 그 결과를 나타낸 것이다.

표 1

구하는 공식 : ln(Nf/Ni)/ln2

(Nf : 시간당 채취한 세포개수 Ni : 최초 세포개수

1) 대조군 1 ( static culture)

doubling time 약 40시간(죽은 세포 포함)

2) 대조군 2 ( continuous shaking culture)

doubling time 약 40 시간

3) 실험군 1 ( intermittent shaking culture)

doubling time 약 28 시간

4) 실험군 2 (intermittent shaking + gradual micro-scaffold adding culture )

doubling time 약 20 시간

다음은 상기한 각 시험 군에 대한 측정 실물 사진을 표시한 것이다.

1) 대조군 1 ( static culture, 2.2 x 10⁶ )

a. haemocytomer 결과

b. H&E x20 결과

c. H&E x40 결과

d . DAPI staining x20 결과

e. DAPI staining x10

2) 대조군 ( Continuous shaking culture :2.6 x 10⁶ )

a. haemocytomer

b. H&E x40_1

c. H&E x40_2

d. DAPI staining x20_1

e. DAPI staining x20_2

3) 실험군 1 (Intermittent shaking culture,3.4 x 10⁶ )

a. haemocytomer

b. H&E x40-1

c. H&E x40-2

d. DAPI staining x10

e. DAPI staining x20

4) 실험군 2( Intermittent shaking + gradual micro-scaffold adding culture , 6.8 x 10⁶ )

a.haemocytomer

b. H&E x40-1

c. H&E x40-2

d. DAPI staining x10

e. DAPI staining x20

실험을 통하여 얻어진 결과에 의하면, 가설 1(세포 증식에 필요한 두 가지 조건 즉, 1) 세포 상호 간의 증식 유발 신호 2) 세포 상호 간의 증식 억제 신호를 모두 적절한 상태로 유지하고자 하는 시도가 세포 증식량을 늘릴 수 있는 방법으로 작용할 것이다.)이 성립됨을 알 수 있다.

또한, 가설 1-1(간헐적 흔들기(intermittent shaking)는 1)" 정체 상태로 흔들지 않는 것"에 비해 세포 간의 일정 간격을 일정 시간 유지하여 증식 유발 신호를 최대화하면서도 접촉억제가 강해지기 시작할 때 다시 세포들을 분리하여 접촉 억제가 작아지는 상황으로 전환함으로써 2) "계속 흔드는 것(continuous shaking, stirring, rolling, rocking, whirling, 등)" 에 비해서는 정체 상태가 존재함으로써 증식유발 신호를 이용하면서도 접촉억제는 최소화함으로써, 1),2) 에 비해 세포 증식량을 증가시킬 것이다.) 또한 성립된다.

또한, 상기 시험 결과는 가설 1-2 (단계적 지지체추가는 같은 양의 세포로 증식하고자 할 때 세포 수가 늘어남에 따라 증가하게 되는 세포의 상대적 농도 증가 즉, 접촉 억제를 최소화하기 위한 것으로서 처음에는 소량의 지지체에 세포를 seeding 하여 서서히 지지체의 양을 늘려가는 개념으로, 처음부터 많은 양의 지지체에 seeding 하여 세포의 상대적 농도가 낮아 증식 유발 신호가 약한 단계를 피하기 위해 처음에는 세포의 상대적 농도를 높게 유지하다가 세포가 증식하여 상대적 농도가 높아짐에 증가하게 될 증식 억제 신호를 최소화하기 위해 상대적 농도를 일정하게 유지하려는 시도이다. 이는 최종적으로 세포의 증식량을 늘리는 데 기여할 것이다)가 성립되고, 가설 2 (Micro-scaffold를 이용한 3차원 세포 증식에서는 단순한 shaking or stirring 만으로도 입자 간 연결된 세포를 분할할 것이다. 따라서 세포의 재 seeding을 위한 세포 분할을 위해 trypsin 등의 변종유발 가능물질을 사용할 필요가 없을 것이다) 또한 성립한다.

또한, 간헐적으로 흔들어주고 동시에 단계적으로 지지체를 추가하는 방법이 단지 간헐적으로 흔들어주거나 단지 단계적으로 지지체를 추가하는 방법에 비해 세포 증식 효과가 상승하는 결과를 제공한다.

기존의 세포 증식 배양법들 중 지지체를 이용한 3차원 배양시 세포가 증식하여 더 이상 증식할 수 있는 공간이 부족해지면 상호 억제 효과에 의해 증식률이 감소하므로 세포들을 새로운 공간에 분산시켜 주는 과정을 통해 계속 증식률을 유지하고 계속 증식할 수 있도록 함으로써 세포의 수를 크게 늘릴 수 있는데 이러한 세포의 분산을 위해서는 연접한 세포들을 서로 분리하고 지지체로부터 분리하여야 하는데 이때 트립신과 같은 화학 물질 또는 효소를 이용하여 세포가 지지체에 붙거나 세포간에 연결되는 결합부를 분리하게 된다.

이 과정은 세포의 일부를 녹이는 과정으로서 세포에게 충격을 주게 되고 세포가 이 충격으로부터 회복되는 과정이 반복되면 유전자 변이 가능성이 높아진다고 간주되어 일정횟수 이상 불가능하다. 본 발명은 이러한 세포 분리 과정을 생략할 수 있게 해 줌으로써 세포 분열의 횟수 제한이 없는 이론적으로는 무한 대에 가까운 배수의 증식이 가능해진다. 또한 기존 방법들에서의 분리 분산 접종의 과정 중 필수적인 효소작용시간 및 원심 분리, 적절한 분할에 의한 재접종, 세포의 충격으로부터의 회복 등에 소모되는 시간과 노력이 상당하여 증식률에 미치는 영향이 큰데 본 발명은 이러한 시간과 노력을 아끼게 되어 기존보다 월등한 증식률을 얻을 수 있다.

세포배양에 사용되는 설비는 기본적으로 공기 중의 세균과 접촉 기회를 최소화하기 위한 장비들이 필수적이고 적정 양의 소재를 사용하기 위한 정량도구와 용기들이 필요하며 수시로 행해지는 원심분리에 사용할 용기들과 이동 수단을 구비해야 한다. 그러나 이러한 장비들에도 이를 수행하는 연구원의 손이나 글러브, 제대로 소독되지 않은 용기, 정화되지 않은 공기의 유입 등으로 세균에 오염되는 경우가 많아 철저한 점검 시스템과 반복학습을 통한 오염 가능성의 최소화는 어느 연구소에서나 필수적인 사안이다. 그러나 본 발명은 일반 실험용 원추형 튜브(Falcon tube(B-D Co.) 가 아닌 상기한 실험도구(지방추출용 주사기로서 앞이 막히지 않고 고무 또는 밸브가 부착된 주입구를 갖는 채취용 및 배양용 주사기)로 사용한 시린지를 배양용기로 활용함으로써 방법적으로 최대한 밀폐된 공간에서 배양과정이 이루어 있어 질 수 있어 오염기회를 줄여주므로 상대적으로 설비와 연구인력의 훈련에 대한 투자가 감소 될 수 있다.

Claims (3)

1. 세포의 부착과 증식을 수용할 수 있는 표면적을 가진 분말형 지지체를 이용한 3차원 배양에서,

   a) 적절한 세포 간격(지지체에 비한 상대적 농도)을 유지하기 위해 초기에는 적은 양의 지지체를 사용하다가 증식 속도에 맞추어 서서히 지지체를 증량시키는 지지체의 단계적 첨가 과정과,

   b) 일정시간 이상 정체시킨 후 붙어 있는 세포들의 사이를 분리하기 위해 흔들어주는 주기적 동요 과정 중 어느 한 과정의 수행에 의해 세포 사이의 증식 및 억제 신호를 조절하고, 이를 반복수행하여 세포를 증식 배양하는 것을 특징으로 하는 분말형 지지체를 이용한 세포 배양에 있어 세포 사이의 신호 조절에 의한 세포 배양방법.
2. 제 1항에 있어서, a) 적절한 세포 간격(지지체에 비한 상대적 농도)을 유지하기 위해 초기에는 적은 양의 지지체를 사용하다가 증식 속도에 맞추어 서서히 지지체를 증량시키는 지지체의 단계적 첨가 과정과,

   b) 일정시간 이상 정체시킨 후 붙어 있는 세포들의 사이를 분리하기 위해 흔들어주는 주기적 동요 과정을 동시에 수행하여 세포 사이의 증식 및 억제 신호를 조절하고, 이를 반복수행하여 세포를 증식 배양하는 것을 특징으로 하는 분말형 지지체를 이용한 세포 배양에 있어 세포 사이의 신호 조절에 의한 세포 배양방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 세포의 배양은 증식에 적합한 상태로 원심분리 및 세척과정을 거치는 사전처리단계와; 배양용기에 배양액과 분말형 지지체를 넣어 배양액 내에서 부유상태로 분말형지지체(micronized scaffold)와 세포(stem cells)를 부착시켜 이를 적층 침전시키는 분말형지지체부착단계와; 배양실에서 세포를 배양하는 세포배양단계와; 배양이 진행된 상태에서 지지체의 단계적 첨가 또는 주기적 동요 과정의 어느 하나를 반복하거나 단계적 첨가 및 주기적 동요 과정의 반복을 동시에 수행하는 방법으로 이루어지고, 상기한 세포 배양은 선단과 주입구를 막을 수 있고 피스턴에는 개폐가능한 통로가 구비된 구조의 지방 채취 및 배양용 주사기에 의해 이루어지도록 구성함으로써 상기한 사전처리단계와, 분말형지지체부착단계와, 세포배양단계와, 지지체의 단계적 첨가 및 주기적 동요 전 과정이 상기한 주사기 내에서 이루어지도록 구성되는 것을 특징으로 하는 분말형 지지체를 이용한 세포 배양에 있어 세포 사이의 신호 조절에 의한 세포 배양방법.