KR20160125997A

KR20160125997A - 스페로이드 제작용 디바이스, 스페로이드의 회수 방법 및 제조 방법

Info

Publication number: KR20160125997A
Application number: KR1020167025237A
Authority: KR
Inventors: 쇼이치로 스미
Original assignee: 주식회사 쿠라레; 고쿠리츠 다이가쿠 호진 교토 다이가쿠
Priority date: 2014-02-25
Filing date: 2015-02-25
Publication date: 2016-11-01
Also published as: JP6534380B2; AU2015221599B2; CN106029862A; US10683477B2; MX2016011006A; AU2015221599A1; SG11201606992PA; SG10202003061SA; WO2015129263A1; EP3112449A4; CA2939884A1; CN113046237A; EP3112449A1; US11208625B2; JPWO2015129263A1; US20170015966A1; US20200255782A1

Abstract

본 발명은 간이한 수법으로, 균일한 스페로이드를, 대량으로 제작하는 스페로이드 제작용 디바이스를 제공한다. 본 발명의 스페로이드 제작용 디바이스 (1) 는, 제 1 표면 (11), 제 2 표면 (12) 및 복수의 벽면 (13) 을 적어도 구비한다. 제 2 표면 (12) 은, 제 1 표면 (11) 에 대향하는 면이다. 각 벽면 (13) 은, 제 1 표면과 제 2 표면을 관통하는 복수의 구멍을 형성한다. 이에 더하여, 제 1 표면 (11) 의 개구부의 내접원의 상당 직경이 제 2 표면 (12) 의 개구부의 내접원의 상당 직경보다 크다.

Description

스페로이드 제작용 디바이스, 스페로이드의 회수 방법 및 제조 방법{DEVICE FOR FABRICATING SPHEROID, AND SPHEROID RECOVERY METHOD AND MANUFACTURING METHOD}

본 발명은 균일한 크기의 스페로이드를 대량 또한 고밀도로 배양하는 데에 적합한 디바이스 및 그것을 사용하는 방법에 관한 것이다.

삼차원 배양법은 이차원 배양 방법보다 보다 정확하게 생체 조직의 기능을 모방할 수 있는 것이 비특허문헌 1 에 나타나 있다. 또한, 다능성 간세포나 iPS 세포를 효율적으로 분화시키는 방법 중 하나로서도 삼차원 배양법이 유용하다는 것이 비특허문헌 1 에 나타나 있다. 이와 같은 기술을 사용하여, 삼차원 배양한 인공 조직을 체내로 되돌려 없어진 기능을 재건·보완하는 시도가 이루어지고 있다. 또 손상된 조직 수복을 살리는 재생 의료에 응용하는 시도가 이루어지고 있다. 또 의약품의 독성이나 검사에 이용하는 시도가 이루어지고 있다. 특히, 재생 의료 및 그 연구를 위해서는, 크기나 형태가 균질한 세포 덩어리를 대량으로 제작할 필요가 있다. 이에 더하여 현행의 방법보다 간편하고 저비용의 방법이 필요하다.

[크기나 형태가 균일한 세포 덩어리를 제작하는 것의 의의]

간세포의 경우에는 생체 내의 기능을 in vitro 로 재현할 수 없다고 한 문제가 있다. 이 문제의 일례는, 간세포를 이차원 배양한 경우에는 간세포가 본래 갖고 있는 약물 대사 기능이 저하되는 경우가 있다. 이 문제를 해결하는 수단으로서, 비특허문헌 2 에 거론되고 있는 세포 덩어리를 형성시키는 방법이 있다. 이 방법으로 제작한 세포 덩어리는 이차원 배양한 세포와 비교하여 현격히 기능이 향상되는 것이 나타나 있다.

in vitro 로 배성 간세포나 유도성 다능성 간세포를 목적 세포로 분화시키는 경우에 대하여, 배양체, embryoid body 로 불리는 세포 덩어리를 형성하거나 하여 발생 분화의 프로그램이 기동하여 목적 세포로 분화시킬 수 있다. 비특허문헌 3 에는, 세포 덩어리의 크기에 의해 분화의 방향성이 변화하는 것이 보고되어 있다.

[크기나 형태가 균일한 세포 덩어리를 대량으로 제작하는 기술에 대해]

비특허문헌 4 에는, 행잉드롭법으로 불리는 액적 중에서 배양하는 방법이 개시되어 있다. 또 바닥이 U 자 또는 V 자의 저접착 플레이트가 개시되어 있다. 또한, 바이오리엑터를 사용한 대량 배양법이 개시되어 있다. 행잉드롭법이나 U 자 플레이트는, 균질한 크기나 형태의 세포 덩어리를 제작하는 데에 적합하다. 한편, 이들을 사용해도 1 웰에 1 개의 세포 덩어리밖에 제작할 수 없기 때문에 대량 배양에 적합하지 않았다. 행잉드롭법은 널리 연구에 응용되고 있지만, 수백, 수천 개 이상의 오더의 세포 덩어리를 한 번에 제작하는 대량 배양에는 적합하지 않다.

또한, 비특허문헌 4 에는 저접착 용기를 사용하는 방법이 나타나 있다. 또 롤러 보틀을 사용하는 방법도 개발되어 있다. 또한 겔이나 비드에 고정화하여 현탁 배양하는 방법도 개발되어 있다. 이들 방법은 고밀도로 수천 개의 세포 덩어리를 제작할 수 있지만, 제작된 세포 덩어리가 불균질해진다는 문제가 있다. 저회전의 롤러 보틀로서 비교적 균질한 세포 덩어리를 대량으로 제작할 수 있는 것이 개발되어 있다. 그러나, 어느 방법도 조작이 복잡하고 대대적인 장치가 필요하다. 또한 롤러 보틀 등의 회전수를 엄밀하게 컨트롤해도, 근접하는 임의의 세포 및 세포 덩어리가 용액 내에서 불규칙하게 회합하여 새로운 세포 덩어리를 형성하는 경우도 있다. 이 때문에 균일한 크기의 세포 덩어리를 얻는 것은 곤란하다.

예를 들어, 특허문헌 1 에는, 세포 덩어리의 집단을, 대량으로 또한 간편하게 생산하는 방법의 일례를 개시하고 있다. 이러한 집단에서는 세포 덩어리의 크기나 형태 등의 형태와, 세포외의 성질이 균일해져 있다. 특허문헌 1 에 개시된 방법에서는, 적어도 하측의 일단이 개구되어 있는 공동부를 갖는 구조체의 공동부 내에, 세포를 포함하는 배양액을 주입한다. 이 때, 상기 배양액의 일부를 상기 개구단보다 하측으로 돌출시킨다. 이 방법에서는 상기 배양액의 상기 돌출 부분에서 세포를 배양한다. 이 방법에서는, 상방의 일단이 폐쇄되어 있는 경우에 배양액의 공동부 내로 주입하는 것에 문제가 있다. 또 배양액의 돌출 부분의 형성의 공정이 번잡하다는 문제가 있다. 또 이러한 공정에 있어서는 주입량의 정확 (精確) 한 조정을 필요로 한다는 문제가 있다. 또, 이러한 방법은 양단이 개구되어 있는 경우에는 배양액의 주입 (흡인) 은 효율적으로 실시할 수 있는 방법이지만 다른 문제를 갖고 있다. 다른 문제란, 주입된 배양액 상태를 유지하기 위해서 상단을 폐쇄하거나, 혹은 흡인압을 유지하는 기구가 별도로 필요하다는 것이다. 또한, 이 양식에서는 세포의 대사에 관여할 수 있는 배양액의 양이 공동부의 용적으로 규정되기 때문에 새로운 제한이 생기고 있다. 새로운 제한 중 하나는 사용하는 세포의 대사 활성에 따라 세포 농도나 배양 기간이 제한되는 것이다. 이러한 새로운 제한에 의해, 제조 가능한 세포 덩어리의 크기나 세포의 종류도 제한을 받는다. 또, 특허문헌 2 에는, 특허문헌 1 에 비해 배양액의 주입이 용이한 현탁 플레이트가 개시되어 있다. 특허문헌 2 에서는, 배양액이 제 1 표면으로부터 제 2 표면에 연통하는 구조가 개시되어 있다. 그러나, 특허문헌 2 의 양식에서는 제조하는 세포 덩어리의 수에 비례하여 주입 조작의 횟수가 증가한다. 이 때문에, 또한 공정의 번잡함의 문제는 면할 수 없다.

일본 특허공보 제5074382호 국제 공개 제2010/031194호

Kenneth M. Yamada, 외 저, "Modeling Tissue Morphogenesis and Cancer in 3D", Cell 130, 2007년 9월 24일, pp. 601-610 Erik Eschbach, 외 저, "Microstructured Scaffolds for Liver Tissue Cultures of High Cell Density : Morphological and Biochemical Characterization of Tissue Aggregates", Journal of Cellular Biochemistry 95, 2005년, pp. 243-255 CL Bauwens, 외 저, "Control of Human Embryonic Stem Cell Colony and Aggregate Size Heterogeneity Influences Differentiation Trajectories", Stem Cells 26, 2008년, pp. 2300-2310 Sasitorn Rungarunlert, 외 저, "Embryoid body formation from embryonic and induced pluripotent stem cells: Benefits of bioreactors", World Journal of Stem Cells 1 (1), 2009년 12월 31일, pp. 11-21

상기 서술한 바와 같이, 종래의 행잉드롭법용 용기를 사용한 배양 방법 및 로터리 보틀을 사용한 배양 방법에는 일장일단이 있다. 이 때문에 형태나 크기가 균질한 세포 덩어리를 대량으로 제작하는 것은 곤란하였다. 또, 이러한 세포 덩어리를 수백, 수천 개 오더로 간편하고 또한 대량으로 제작하는 것은 특히 곤란하였다.

본 발명은 이와 같은 과제를 감안하여 발명된 것이다.

발명자들은, 세포를 배양하는 디바이스와 배지 사이에서 발생하는 물리 현상을 검토하였다. 그 결과, 간이한 수법으로 스페로이드를 제작하는 디바이스를 실현시켰다.

본 발명에 관련된 스페로이드 제작용 디바이스의 일 양태는, 제 1 표면, 제 2 표면 및 복수의 벽면을 적어도 구비한다. 제 2 표면은, 제 1 표면의 이면이 되는 면이다. 각 벽면은, 제 1 표면과 제 2 표면 사이를 관통하는 복수의 구멍을 형성한다. 이에 더하여, 제 1 표면의 개구부의 내접원의 상당 직경이 제 2 표면의 개구부의 내접원의 상당 직경보다 크다. 본 양태에 의하면, 스페로이드를 간이하게 또한 대량으로 제작하는 데에 적합한 디바이스를 제공할 수 있다. 이러한 디바이스는 상측에 배치되는 제 1 표면으로부터 배지를 주입하고, 하측이 되는 제 2 표면으로부터 제작한 스페로이드를 회수하는 것을 가능하게 한다. 그 때문에, 세포의 파종 공정 및 세포의 배양 공정의 조작이 용이해진다. 따라서, 이들 작업에 필요로 하는 시간을 삭감할 수 있다. 이에 더하여, 스페로이드 제작용 디바이스에, 제 2 표면으로부터 제 1 표면을 향하여 커지는 구멍을 형성하는 것에는 이하의 장점이 있다. 먼저 제 1 표면으로부터 제 2 표면을 향하여 배양액이 침입하기 쉽다. 또 빠져 들어간 세포의 밀도가 제 2 표면 근방에서 보다 높아지므로 스페로이드 형성이 조장된다. 이에 더하여, 디바이스 자체의 제조가 용이해진다.

스페로이드 제작용 디바이스의 일 양태에 있어서, 각 구멍에 의해 형성되는 개구부의 내접원의 상당 직경이 상기 제 2 표면의 개구부의 내접원의 상당 직경의 길이 이상인 것이 바람직하다. 제 2 표면의 개구부의 내접원의 상당 직경이 200 마이크로미터 내지 1 센티미터의 범위인 것이 바람직하다. 각 벽면의 적어도 일부분은, 상기 제 2 표면에 대해 1 도 보다 크고, 90 도 보다 작은 각도의 경사를 갖는 것이 바람직하다. 소수성의 재료를 사용하는 경우에는, 디바이스의 재질과 배지의 접촉각을 고려하여, 제 2 표면의 개구부의 외접원의 상당 반경 (상당 직경의 절반의 길이) 을 결정하는 것이 바람직하다. 친수성의 재료를 사용하는 경우에는, 디바이스의 재질과 배지의 접촉각을 고려하여, 제 2 표면의 개구부의 내접원의 상당 반경을 결정하는 것이 바람직하다.

또, 상기 서술한 스페로이드 제작용 디바이스를 사용하여 제작한 스페로이드를 회수하는 방법의 일 양태는, 스페로이드 제작용 디바이스의 상기 제 2 표면을 물, 배지 및 완충액 중 하나에서 선택되는 용액과 접촉시켜 스페로이드를 회수하는 방법이다. 혹은, 제 1 표면으로부터 압력을 가함으로써 스페로이드를 제 2 표면의 개구부로부터 회수하는 방법이다. 이들 어느 것의 회수 방법에 의하면, 스페로이드를 또한 손상시키지 않고 용이하게 회수할 수 있다.

또한, 상기 서술한 스페로이드 제작용 디바이스를 사용하는 스페로이드의 제조 방법의 일 양태는, 각 구멍에 세포를 포함하는 배지를 제 1 표면으로부터 주입하고, 각 구멍에서 액적을 형성시키고, 액적의 부분에서 세포를 배양하여, 스페로이드를 제작하는 방법이다. 이러한 방법으로 제작한 스페로이드를 회수하기 위해서, 상기 서술한 회수 방법을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 일 실시형태에 의하면, 균일한 스페로이드를 간이한 수법으로 대량으로 제작하는 데에 적합한 스페로이드 제작용 디바이스, 그리고 스페로이드 회수 방법 및 스페로이드 제조 방법으로서, 균일한 스페로이드를 대량으로 제작하는 데에 적합한 간이한 방법을 제공할 수 있다.

도 1 은 일 실시형태에 관련된 스페로이드 제작용 디바이스의 일례를 나타내는 도면이다.
도 2 는 도 1 에 나타내는 스페로이드 제작용 디바이스의 II-II 선을 따른 단면도이다.
도 3 은 스페로이드 제작용 디바이스의 상세를 설명하는 도면이다.
도 4 는 일 실시형태의 스페로이드 제작용 디바이스를 사용하는 세포 배양 용기의 일례를 나타내는 도면이다.
도 5 는 액적에 가해지는 힘을 설명하는 도면이다.
도 6 은 벽면의 재질과 배지의 접촉각을 설명하는 도면이다.
도 7 은 각도 θ₀ 을 설명하는 도면이다.
도 8 은 액면과 수압의 관계를 설명하는 도면이다.
도 9 는 도 8 보다 수압이 큰 경우의 액면과 수압의 관계를 설명하는 도면이다.
도 10 은 도 8 및 도 9 보다 수압이 큰 경우의 액면과 수압의 관계를 설명하는 도면이다.
도 11 은 액면과 수압이 균형을 이룰 때의 제 2 표면의 개구부에서의 표면 장력을 설명하는 도면이다.
도 12 는 기체와 수압이 균형을 이룰 때의 제 2 표면의 개구부에서의 표면 장력을 설명하는 도면이다.
도 13 은 스페로이드를 제작하는 공정을 설명하는 도면이다.
도 14 는 스페로이드를 제작하는 공정 외의 일례를 설명하는 도면이다.
도 15 는 스페로이드를 회수하는 수법 (배지의 이용) 을 설명하는 도면이다.
도 16 은 스페로이드를 회수하는 다른 수법 (가압) 을 설명하는 도면이다.
도 17 은 스페로이드 제작용 디바이스의 단면의 형상예를 나타내는 도면이다.
도 18 은 스페로이드 제작용 디바이스의 단면의 다른 형상예를 나타내는 도면이다.
도 19 는 스페로이드 제작용 디바이스의 단면의 다른 형상예를 나타내는 도면이다.
도 20 은 스페로이드 제작용 디바이스의 단면의 다른 형상예를 나타내는 도면이다.
도 21 은 스페로이드 제작용 디바이스의 단면의 다른 형상예를 나타내는 도면이다.
도 22 는 스페로이드 제작용 디바이스의 단면의 다른 형상예를 나타내는 도면이다.
도 23 은 스페로이드 제작용 디바이스의 개구부의 형상예를 나타내는 도면이다.
도 24 는 스페로이드 제작용 디바이스의 개구부 외의 형상예를 나타내는 도면이다.
도 25 는 스페로이드 제작용 디바이스의 개구부 외의 형상예를 나타내는 도면이다.
도 26 은 스페로이드 제작용 디바이스의 개구부 외의 형상예를 나타내는 도면이다.
도 27 은 실시예에서 사용하는 스페로이드 제작용 디바이스의 형상을 설명하는 도면이다.
도 28 은 도 27 의 XXVIII-XXVIII 선을 따른 단면도이다.
도 29 는 실시예에서 사용하는 세포 배양 용기의 구성을 설명하는 도면이다.
도 30 은 도 29 의 XXX-XXX 선을 따른 단면도이다.
도 31 은 실시예 1 의 스페로이드 회수 전의 배양면의 사진이다.
도 32 는 도 31 을 확대한 사진이다.
도 33 은 실시예 1 및 비교예 1 에 대하여, 회수 후의 스페로이드의 현미경 사진이다.
도 34 는 실시예 1 에 대하여, 스페로이드 회수 후의 디바이스 표면의 사진이다.
도 35 는 비교예 1 의 스페로이드의 사진이다.
도 36 은 실시예 1 및 비교예 1 의 입경 직경 분포를 나타내는 그래프이다.
도 37 은 실시예 1 의 세포수를 변경한 경우의 입경 직경 분포를 나타내는 그래프이다.

이하, 실시형태에 대하여, 도면을 참조하면서 설명한다. 설명의 명확화를 위하여, 이하의 기재 및 도면은, 적절히 생략 및 간략화가 이루어져 있다. 각 도면에 있어서 동일한 구성 또는 기능을 갖는 구성 요소 및 상당 부분에는, 동일한 부호를 붙이고, 그 설명은 생략한다.

실시형태 1

도 1 에 일 실시형태에 관련된 스페로이드 제작용 디바이스의 일례를 나타낸다. 또, 도 2 에 도 1 에 나타내는 스페로이드 제작용 디바이스의 II-II 선을 따른 단면도를 나타낸다. 스페로이드 제작용 디바이스 (1) 는, 액적 형상으로 형성한 배지 중에서 세포를 배양함으로써, 세포를 응집시켜 얻어지는 스페로이드를 제작하는 디바이스이다. 스페로이드는 세포가 다수 응집하여 삼차원이 된 것이다.

스페로이드 제작용 디바이스 (1) 는, 제 1 표면 (11), 제 2 표면 (12) 및 벽면 (13) 을 적어도 구비한다. 도 1 은, 스페로이드 제작용 디바이스 (1) 를 제 1 표면 (11) 측에서 본 도면을 나타내고 있다.

제 1 표면 (11) 은, 스페로이드 제작용 디바이스 (1) 의 상면이고, 세포를 배양할 때에 배지 등을 주입하는 상측의 면이 된다.

제 2 표면 (12) 은, 제 1 표면 (11) 과 대향하는 면이다. 제 2 표면 (12) 은, 스페로이드 제작용 디바이스 (1) 의 바닥 (바닥면) 을 형성하고, 상면 (제 1 표면 (11)) 에 대한 이면이 된다.

벽면 (13) 은, 제 1 표면 (11) 과 제 2 표면 (12) 을 관통하는 구멍 (관통공) 을 형성한다. 또, 벽면 (13) 은, 제 1 표면 (11) 과 제 2 표면 (12) 에 개구부를 형성함과 함께, 제 1 표면 (11) 과 제 2 표면 (12) 을 연통시키는 기능을 한다.

이에 더하여, 일 실시형태의 스페로이드 제작용 디바이스 (1) 에 있어서, 벽면 (13) 에 의해 형성되는 구멍은, 제 1 표면 (11) 에 가까운 쪽에 형성되는 개구부에 비하여, 제 2 표면 (12) 에 가까운 쪽에 형성되는 개구부가 작아지도록 설계된다. 개구부의 크기는, 상당 직경을 사용하여 비교한다.

「상당 직경」은 내접원의 상당 직경과 외접원의 상당 직경의 총칭으로서 사용한다. 「외접원의 상당 직경」은, 개구부에 외접하는 원의 직경이며, 제 2 표면 (12) 과 평행한 평면상에 그린 외접원의 직경으로서 사용한다. 예를 들어, 제 1 표면 (11) 과 제 2 표면 (12) 사이에 형성되는 구멍의 개구부의 상당 직경은, 제 2 표면 (12) 과 평행한 평면상에 외접원을 그렸을 때의 직경을 사용한다. 「내접원의 상당 직경」은 개구부에 내접하는 원의 직경이며, 제 2 표면 (12) 과 평행한 평면상에 그린 내접원의 직경을 말한다. 예를 들어 제 1 표면 (11) 과 제 2 표면 (12) 사이에 형성되는 구멍의 개구부의 상당 직경은, 제 2 표면 (12) 과 평행한 평면상에 내접원을 그렸을 때의 직경을 사용한다. 도면 중, 부호 「D」로 나타내는 길이는, 외접원의 상당 직경 Dout 또는 내접원의 상당 직경 Din 중 어느 것이고, Dout 과 Din 을 엄밀하게 구별하지 않고 나타낸다.

개구부의 크기의 상세에 대해서는 이하에 도 3 을 참조하여 설명한다.

여기서, 도 1, 2 에 더하여 도 3 을 참조하여, 스페로이드 제작용 디바이스 (1) 의 구성을 보다 상세하게 설명한다. 도 3 은, 스페로이드 제작용 디바이스의 상세를 설명하는 도면이다. 도 3 에서는, 도 2 에 나타내는 단면의 도면을 사용하여 나타내는데, 설명을 용이하게 하기 위해 단면을 나타내는 사선을 생략한다.

스페로이드 제작용 디바이스 (1) 는, 각도 θi, 제 2 표면 (12) 의 개구부의 외접원의 상당 직경 Dout 또는 제 2 표면 (12) 의 개구부의 내접원의 직경 Din, 디바이스에 사용하는 재질 및 세포 배양에 사용하는 배지 (8) 를 적어도 고려하여 설계된다. 이에 더하여, 두께 (T), 상면의 폭 (W) 등을 고려하는 것이 바람직하다.

각도 θi 는, 벽면 (13) 의 사면이, 제 2 표면 (12) 에 대해 이루는 각도이다. 벽면 (13) 에서는, 사면의 적어도 일부분이 제 2 표면 (12) 에 대해 각도 θi 를 가지면 된다. 한편으로 구멍을 형성하는 벽면 (13) 전체가 균일한 각도 θi 의 사면이 아니어도 된다. 각도 θi 는, 1 도보다 크고 90 도보다 작은 것이 바람직하고, 30 도 내지 80 도의 범위가 보다 바람직하다. 이것은, 구멍에 배지 (8) 가 들어가기 쉽게 하기 위해서이다. 혹은, 파종된 세포 전체가 벽면 (13) 에 머물지 않고 액적 하부까지 자중으로 침강하도록 하기 위해서이다. 이로써, 효율적으로 세포를 배양할 수 있다.

두께 (T) 는, 제 1 표면 (11) 으로부터 제 2 표면 (12) 까지의 스페로이드 제작용 디바이스 (1) 의 두께이다. 두께 (T) 는, 배지 (8) 의 무게에 견딜 수 있는 두께이면 된다.

제 2 표면 (12) 의 개구부의 외접원의 상당 직경 Dout 은, 제 2 표면 (12) 에 형성된 개구부에 외접하는 외접원의 직경이다.

제 2 표면 (12) 의 개구부의 내접원의 상당 직경 Din 은, 제 2 표면 (12) 에 형성된 개구부에 내접하는 원의 직경이다. 또, 외접원의 상당 반경 Rout 은, 외접원의 상당 직경 Dout 의 절반의 길이이다. 내접원의 상당 반경 Rin 은, 내접원의 상당 직경 Din 의 절반의 길이이다.

일 실시형태에서는, 제 1 표면 (11) 의 개구부의 내접원의 상당 직경이 제 2 표면 (12) 의 개구부의 내접원의 상당 직경 Din 보다 커지도록 설계된다.

이에 더하여, 제 2 표면 (12) 의 개구부의 내접원의 상당 직경 Din 은, 원하는 스페로이드 크기의 1 배 내지 10 배의 상당 직경 (예를 들어, 200 ㎛ ∼ 1 ㎝) 인 것이 바람직하다. 추가로 이에 더하여, 단위 면적당의 구멍의 수가 많을수록, 작은 면적에서 많은 세포 덩어리를 제작할 수 있는 점에서, 원하는 세포 덩어리의 직경의 1 배 ∼ 2 배로 하는 것이 보다 바람직하다.

상면의 폭 (W) 은, 하나의 구멍을 형성하는 벽면 (13) 과 인접하는 다른 구멍을 형성하는 벽면 (13) 사이의 폭이다. 또 상면의 폭 (W) 은, 제 2 표면 (12) 에 대하여, 각도 θi 를 이루는 벽면 (13) 이 종료되는 위치의 폭이다. 바꾸어 말하면, 인접하는 구멍을 형성하는 2 개의 벽면 (13) 은 제 2 표면 (12) 으로부터 제 1 표면 (11) 을 향하는 사면을 갖는 바, 상면의 폭 (W) 은 이러한 사면이 각도 θi 를 갖는 것을 가능하게 하는 단부의 폭이라고도 말할 수 있다.

도 3 은, 배지 (8) 의 높이 (깊이) 가 높이 (깊이) (H) 가 될 때까지, 제 1 표면 (11) 으로부터 (제 1 표면 (11) 의 개구부로부터), 구멍과 스페로이드 제작용 디바이스 (1) 상부의 공간에 배지 (8) 를 주입한 상태를 모식적으로 나타낸다. 도 4 에 나타내는 바와 같이, 이러한 공간은 웰 용기 (91) 내의 공간에 상당한다. 도 3 에 나타내는 스페로이드 제작용 디바이스 (1) 의 구성예에서는, 제 2 표면 (12) 의 개구부로부터 배지 (8) 가 돌출되도록 배지 (8) 가 주입된다. 제 2 표면 (12) 으로부터 돌출된 부분은 액적 (81) 이다. 바꾸어 말하면, 액적 (81) 이 형성되도록, 배지 (8) 를 스페로이드 제작용 디바이스 (1) 에 주입한다. 액적 (81) 은, 세포를 배양하여, 스페로이드를 형성할 때에, 삼차원의 세포 배양기로서 작용한다. 여기서, 액적 (81) 의 하측 방향의 액면은, 소정의 곡률 반경을 갖는 곡면으로 형성되어 있다. 액적을 둘러싸고 있는 공기 및 액체의 압력차 ΔP(P - Pair) 는 영-라플라스의 관계식, ΔP = Hρ = γ_L(1/r1 ＋ 1/r2) 로 나타낸다. 여기서 γ_L 은 액체의 표면 장력 [g/㎝], r1, r2 는 직교하는 곡률 반경이다. 액적 (81) 의 표면을 구면으로 상정한 경우에는 r1 = r2 가 된다. 이러한 곡면은 아래로 볼록해지므로, 액적 (81) 이 형성된다.

도 3 의 변형예로서, 제 1 표면 (11) 으로부터 (제 1 표면 (11) 의 개구부로부터) 배지 (8) 를 주입할 때에, 배지 (8) 의 높이 (깊이) (H) 가 상기 서술한 높이 (깊이) 보다 낮아지도록 주입을 조정할 수 있다. 이 경우, 도 3 에 나타내는 스페로이드 제작용 디바이스 (1) 의 구성예에 있어서, 제 2 표면 (12) 의 개구부로부터 제 1 표면 (11) 의 개구부를 연결하고 있는 사면 (벽면 (13)) 의 도중에 배지 (8) 가 머물도록, 배지 (8) 를 주입한다. 후술하는 도 14 에, 사면의 도중에 배지 (8) 를 머무르게 하여 세포를 배양하고 있는 상태를 모식적으로 나타내고 있다.

디바이스에 사용하는 재료의 재질, 세포 배양에 사용하는 배지의 성질, 상당 직경 등의, 스페로이드 제작용 디바이스의 설계에 관한 상세 사항에 대해서는, 도면을 참조하여 후술한다.

또한, 도 3 에 있어서, 엄밀하게는 벽면 (13) 을, 제 2 표면 (12) 에 대해 각도 θi 를 유지하는 면을 말한다. 또 제 1 표면 (11) 과 벽면 (13) 사이의 사면을 상면이라고 하는 경우도 있다. 혹은, 제 1 표면 (11) 을 넓게 파악하여, 제 1 표면 (11) 이, 제 2 표면 (12) 과 평행이 되지 않는 면 (상면) 도 포함하도록 나타내는 경우도 있다. 이들 본 발명의 일 양태에 관련된 본질이 아닌 경우에는 이들을 엄밀하게 구별하지 않는다.

도 4 에, 일 실시형태의 스페로이드 제작용 디바이스를 사용하는 세포 배양 용기의 일례를 나타낸다. 세포 배양 용기 (9) 는 세포 배양 용기의 기본 구조의 일례이다. 세포 배양 용기 (9) 에서는, 스페로이드 제작용 디바이스 (1) 가 웰 용기 (91) 에 장착된다. 또한, 웰 용기 (91) 의 외측에 샬레 (92) 가 배치된다.

스페로이드 제작용 디바이스 (1) 와 웰 용기 (91) 는, 동일한 재질이어도 되고, 상이한 재질이어도 된다. 웰 용기 (91) 는, 배지 (8) 를 넣는 공간을 제공하는 것이기 때문에, 세포에 대해 독성이 없으면 어떠한 재질이어도 된다. 한편, 샬레 (92) 는, 스페로이드 제작용 디바이스 (1) 의 제 2 표면 (12) 이나 액적 (81) 에 접촉하지 않는 형상이면 된다.

스페로이드 제작용 디바이스 (1) 가 장착되는 용기는 도 4 에 나타내는 구성물에 한정되는 경우는 없다. 세포를 스페로이드 제작용 디바이스 (1) 에서 배양할 때에는, 멀티 웰 플레이트나 샬레 등에 스페로이드 제작용 디바이스 (1) 를 장착하여 사용해도 된다. 스페로이드 제작용 디바이스 (1) 는, 제 2 표면 (12) (바닥면) 이나 액적 (81) 이 멀티 웰 플레이트나 샬레와 접촉하지 않으면 어떠한 방법으로 사용해도 된다.

이하에, 스페로이드 제작용 디바이스의 설계의 상세한 것에 대하여 설명한다. 스페로이드 제작용 디바이스 (1) 의 재질 및 표면과, 제 2 표면 (12) 의 개구부의 내접원의 상당 직경 Din 또는 외접원의 상당 직경 Dout 의 설계에 있어서는, 이하의 물리 현상을 고려하여 설계를 실시하는 것이 바람직하다. 특히, 벽면 (13) 의 재질과 배지 (8) 의 접촉각 θc 를 고려하는 것이 바람직하다. 그 이유는, 스페로이드 제작용 디바이스 (1) 의 접촉각 θc 가, 디바이스에 사용하는 재료의 재질, 배지의 성질 등에 의해 영향을 받기 때문이다. 이후의 설명에서는, 먼저, 접촉각 θc 에 관계하는 물리 현상에 따른 스페로이드 제작용 디바이스 (1) 의 설계에 대해 검토한다. 그 후, 다른 요소에 대해 설명한다.

도 6 에 벽면 (13) 에 나타나는 재료의 재질과 배지 (8) 의 접촉각 θc 를 설명하는 모식도를 나타낸다. 접촉각 θc 는 고체에 대한 액체의 접촉각이다. 접촉각 θc 는 이러한 고체 및 액체의 성질로부터 정해진다. γ_S 는 고체의 표면 장력 [g/㎝], γ_SL 은 고액 표면 장력 [g/㎝], γ_L 은 액체의 표면 장력 [g/㎝] 이다.

접촉각 θc 는, 고체와 액체의 성질로부터 정해진다. 구체적으로는, 스페로이드 제작용 디바이스 (1) 에 사용하는 재료 재질 (벽면 (13) 에 나타나는 재료의 재질) 과 배지 (8) 의 성질에 의해 정해지게 된다.

＜접촉각 θc 의 검토＞

(1) 접촉각 θc 가 -1 ＜ cosθc ≤ 0 의 범위에 포함되는 경우

이 경우, 액적의 크기는 접촉각에 영향을 받는 경우가 없다. 각도 θ₀ = 90 도가 허용 범위가 된다.

접촉각 θc 가 -1 ＜ cosθc ≤ 0 의 범위에 포함되는 경우에는, 일반적으로는 스페로이드 제작용 디바이스 (1) 가 소수성의 재질이라고 말할 수 있다. 이 때의 제 2 표면 (12) 의 개구부의 내접원의 직경 Din 은 제 1 표면 (11) 의 개구부의 내접원의 직경보다 작다. 이에 더하여, 외접원의 상당 직경 Dout 의 크기가 중요해진다.

도 5 에 액적 (81) 에 가해지는 힘을 설명하는 도면을 나타낸다. 도 5 에서는 액적 (81) 의 형상이 반구인 것을 전제로 한다. 제 2 표면은 수평으로 놓여져 있는 것으로 한다. 또, 액적 (81) 은, 실제로는 배지 (8) 와의 경계가 없는 연속하는 액체이다. 여기서는 설명을 용이하게 하기 위해, 도 5 에서는 액적 (81) 으로 정의하여 설명하는 범위를 배지 (8) 와는 상이한 사선을 사용하여 나타낸다.

액적 (81) 에 가해지는 힘으로, 중력과 병행하여 작용하고 있는 힘으로서, F0 내지 F2 가 존재한다.

F0 는, 액적 (81) 에 가해지는 중력의 힘이며, 이하의 식에 의해 산출한다.

F0 = 체적 × 비중

= V·α

F1 은, 액적 (81) 이 액 (배지 (8)) 으로부터 받는 수압에서 유래하는 힘으로, 이하의 식에 의해 산출한다.

F1 = 수압 × 면적 = pS

대기압의 경우에는

F1 = 액 상면으로부터 액적까지의 깊이 × 액체의 밀도 × 면적

= HρS

F2 는, 액면의 변 가장자리에서 발생하는 액체의 표면 장력에서 유래하는 힘으로, 이하의 식에 의해 산출한다.

F2 = 외주 × 액체 표면 장력 × 각도

= Lγ_Lsinθ₀

액체의 표면 장력 γ_L 은, Wilhelmy 법 등 여러 가지 방법으로 측정할 수 있다. 또는 판매원으로부터 정보를 입수하는 것이 가능하다. 또한, 접촉각 θc 는 사용하는 액체 (배지나 완충액) 와 재료를, 액적법이나 기액법에 의해 측정할 수 있다.

도 8 의 경우, 수면이 벽면에서 멈추기 위한 조건에는 γ_SL 도 관여한다. 한편, 도 9 와 같은 경우에 액적이 유지되기 위한 조건에는 γ_SL 은 관여하지 않는다. 이 때 γ_SL 은 제 2 표면의 방향으로 상정된다.

상기 각 식에 있어서, 체적 V 는 액적 (81) 의 체적 [㎤], 비중 α 는 배지 (8) 의 비중, 높이 H 는 배지 (8) 의 상면으로부터 액적 (81) 의 하단까지의 깊이 [㎝] 와 동등한 높이, 밀도 ρ 는 배지 (8) 의 밀도 [g/㎝] 이다.

면적 S 는 액적 (81) 이 발생하는 위치 (구멍 중에서 액적이 형성되는 위치) 의 개구부의 면적의 크기이다. 여기서는, 면적 S 는 제 2 표면 (12) 과 접하는 경계의 면적 [㎠] 이며, 제 2 표면 (12) 의 개구부의 면적과 동일하다.

수압 p 는 제 2 표면 (12) 의 개구부에서의 수압 [g/㎠] 이다. 외주의 길이 L 은 액적이 제 2 표면 (12) 과 접하는 경계의 길이 [㎝] 이다. L 은 제 2 표면의 개구부의 주위의 길이와 일치한다. 고액 표면 장력 (γ_SL) 은, 벽면 (13) 과 배지 (8) 의 표면 장력 (계면 장력) [g/㎝] 이다. 각도 θ₀ 은, 액적 (81) 의 표면이 수평면 혹은 수평하게 둔 제 2 표면 (12) 이 이루는 각도이다. 도 5 에서 액적 (81) 을 반구로 한 경우에는 각도 θ₀ = sin90°= 1 이 된다. 각도 θ₀ 은 액적 (81) 이 접하고 있는 변 가장자리부에 있어서의 접면과 수평면이 이루는 각이다. 혹은 각도 θ₀ 은 그 접면과 수평으로 둔 제 2 표면 (12) 이 이루는 각이다. 도 7 에 각도 θ₀ 을 설명하는 도면을 나타낸다.

그리고, 이하의 식 1 의 관계가 성립될 때에 액적 (81) 이 스페로이드 제작용 디바이스 (1) 에 유지된다.

F0 ＋ F1 ＜ F2 … 식 1

또한, 도 8 에 나타내는 바와 같이 액적이 벽면 (13) 에 머무는 경우, 상기 서술한 계산 식에 의해, F2 는 이하의 식으로 나타낼 수 있다.

F2 = Lγ_SLsinθ_i ＋ Lγ_Lsinθ₀

(θi 는 벽면의 경사각이다)

따라서 식 1 (F0 ＋ F1 ＜ F2) 은 다음과 같이 식 2 로 나타낼 수 있다.

Vα ＋ pS ＜ Lγ_SLsinθ_i ＋ Lγ_Lsinθ₀… 식 2

또, 도 9 에 나타내는 바와 같이 액적이 제 2 표면 (12) 과 연속하는 경우, F2 는 이하의 식으로 나타낼 수 있다.

F2 = Lγ_Lsinθ₀

따라서 식 1 (F0 ＋ F1 ＜ F2) 은 다음과 같이 식 3 으로 나타낼 수 있다.

Vα ＋ pS ＜ Lγ_Lsinθ₀… 식 2-2

여기서, 어떤 접촉각 θc 를 갖는 소재를 사용하여, 배지 (8) 를 높이 (H) 까지 넣는 것으로 한다. 액적 (81) 이 잘록해지기 시작할 때는 예를 들어, 제 2 표면 (12) 으로부터 외측으로 돌출되기 시작한다. 이 때 F0 ＋ F1 = F2 가 된다. 이 때의 각도 θ₀ 은 90 도 (sin90 = 1) 가 된다.

액적 (81) 의 체적을 V, 제 2 표면 (12) 의 개구부의 외접원의 상당 반경을 Rout, 비중을 α 로 하면, 이하의 식으로 같이 나타낼 수 있다.

F0 = ((4/3)πRout³ ÷ 2) × α = (2/3)πR³·α

단, 액적 (81) 이 반구라고 하고, 체적 V 를 [(구의 체적) ÷ 2] 로 한다.

또한, 개구부의 면적 S 및 외주의 길이 L 를 상당 반경 R 로 나타내면, 이하와 같이 나타낼 수 있다.

S = πRout², L = 2πRout

식 3 으로부터

(2/3)πRout³·α ＋ pπRout²

= 2πRoutLγ_Lsin90

단, sin90 = 1.

따라서,

(2/3)αRout² ＋ pRout = 2γ_L … 식 3

즉, 식 3 의 외접원의 상당 반경 Rout 이 제 2 표면 (12) 의 개구부의 최대 상당 반경인 것이 바람직하다. 또 제 2 표면 (12) 의 개구부의 직경은 2Rout 이하로 설정하는 것이 바람직하다. 세포 덩어리가 중력으로부터 받는 힘 (Fc) 도 고려하여 설계하는 것이 보다 바람직하다.

상기 서술한 바와 같이, 접촉각 θc 가 -1 ＜ cosθc ＜ 0 (접촉각 90°이상, θ₀ 은 θc 를 초과할 수 없다) 의 범위에 포함되는 경우에는, 제 2 표면 (12) 의 개구부의 외접원의 상당 직경 Dout 을, 식 3 으로 산출한 외접원의 상당 반경의 2 배 이하로 하는 것이 바람직하다. 이러한 양태에 의해 스페로이드 제작용 디바이스 (1) 에 액적을 유지할 수 있다.

(2) 접촉각 θc 가 0 ＜ cosθc ＜ 1 의 범위인 경우

접촉각 θc 가 0 ＜ cosθc ＜ 1 의 범위인 경우에는, 일반적으로는 스페로이드 제작용 디바이스 (1) 가 친수성의 재질이라고 말할 수 있다. 이와 같은 재료를 사용하는 경우의 제 2 표면의 개구부 (12) 의 크기의 설계시에는, 내접원의 상당 직경을 사용한다.

도 8 내지 9 를 사용하여 액면과 수압의 관계를 설명한다. 도 8 의 수압 p1 을 기준으로 하면, 도 9 는 도 8 보다 수압 p2 가 큰 경우 (p1 ＜ p2) 를 나타낸다. 도 10 은, 도 8 및 도 9 보다 수압이 큰 경우 (p1 ＜ p2 ＜ p3) 를 나타낸다. 도 8 은, 수압 p1 의 크기와 액면이 균형을 이루고 있어, 액체는 낙하하지 않고 정지하는 상태를 나타낸다. 도 9 는, 수압 p2 가 수압 p1 보다 크기 때문에, 액면이 보다 제 2 표면 (12) 에 가깝게 되어 있는 상태를 나타낸다. 도 9 에서는 수압 p2 의 크기와 액면 사이에서 밸런스가 성립하고 있다. 도 5 에 나타내는 높이 (H) 를 높게 하면 할수록 (배지 (8) 의 양을 많게 하면 할수록) 수압이 커진다. 그 결과, θ₀ 이 접촉각 θc 를 초과한 시점에서 도 10 에 나타내는 바와 같이 액체와 디바이스 및 공기가 접하는 삼중선이 이동한다. 따라서 액면이 제 2 표면 (12) 의 개구부로부터 돌아 들어와, 제 2 표면 (12) 상에 부착된다. 도 10 과 같은 상태가 되면, 스페로이드 제작용 디바이스 (1) 의 상부로부터 액체가 지속적으로 공급된다. 이 결과, 액적이 증대되어 적하하고, 각 구멍에 1 개의 액적을 안정적으로 유지하는 것이 곤란해진다. 즉, 도 8 또는 도 9 로 나타내는 상태에 있는 것이 바람직하다.

그래서, 이하와 같은 조건이 되도록 스페로이드 제작용 디바이스 (1) 를 설계하는 것이 바람직하다. 도 12 는, 액면과 수압이 균형을 이룰 때의 제 2 표면 (12) 의 개구부에서의 표면 장력을 설명하는 도면이다. 도 11 은, 도 9 의 상태가 되도록 조정한 경우를 나타낸다.

도 10 의 상태가 되지 않을 때의 조건은, 고체의 표면 장력 (γ_S) 이 고액 계면 장력 (γ_SL) 과 액면의 표면 장력 (γ_Lcosθ₀) 의 합을 초과하지 않을 때가 된다. 즉,

γ_S ≤ γ_SL ＋ γ_Lcosθ₀ … 식 5

이것을 Young 의 식 (γ_S = γ_SL ＋ γ_Lcosθ_c) 과 비교하면, θ₀ ≤ θ_c 일 때, 액적은 안정적으로 유지된다.

도 6 에 벽면 (13) 의 재질과 배지 (8) 의 접촉각 θc 를 설명하는 모식도를 나타낸다. 접촉각 θc 는 고체에 대한 액체의 접촉각이고, 고체·액체의 성질로 정해진다. γ_S 는 고체의 표면 장력 [g/㎝], γ_SL 은 고액 표면 장력 [g/㎝], γ_L 은 액체의 표면 장력 [g/㎝] 이다.

접촉각 θc 는, 고체와 액체의 성질로 정해지고, 구체적으로는, 스페로이드 제작용 디바이스 (1) 의 재질 (제 2 표면 (12) 이나 벽면 (13) 의 재질) 과 배지 (8) 의 성질로 정해지게 된다.

고체의 표면 장력 (γ_SL) 은, 예를 들어, 인터넷상의 정보 (http://www.surface-tension.de/solid-surface-energy.htm 등), 혹은 구입원 등에서 얻어지는 정보로서 입수하는 것이 바람직하다. 혹은, Zisman 법을 사용하여 산출해도 된다. 액체의 표면 장력 (γ_L) 은, Wilhelmy 법 등 여러 가지 방법으로 측정할 수 있다. 또는 판매원으로부터 정보를 입수하는 것이 가능하다. 또한, 접촉각 θc 는 사용하는 액체 (배지나 완충액) 와 재료를, 액적법이나 기액법에 의해 측정할 수 있다. 따라서, γ_SL 에 대해서는, γ_L 과 γ_S 의 값을 사용하여, γ_SL = γ_Lcosθc - γ_S 의 식에 대입하여 도출할 수 있다.

따라서 식 5 는

γ_S ≤ γ_Lcosθc - γ_S ＋ γ_Lcosθc

γ_Lcosθc - γ_S ≥ 0 … 식 6

또한 도 12 에 나타내는 바와 같이, 액적 (81) 의 하측 방향의 액면은, 영-라플라스의 식에 따라 액적을 둘러싸고 있는 공기와 액체의 압력차 ΔP(P - Pair) 는

ΔP = p = γL(1/r1 ＋ 1/r2) … 식 7

단 대기압의 경우에는

ΔP = Hρ = γL(1/r1 ＋ 1/r2) … 식 7-2

의 관계식으로 나타내고, 곡면을 형성하여 아래로 볼록해져, 액적을 형성한다. 여기서 γ_L 은 액체의 표면 장력 [g/㎝], r1 [㎝], r2 [㎝] 는 표면의 1 점에서 직교하는 곡률 반경이다.

액적 (81) 의 표면을 구면으로 상정한 경우에는 r1 = r2 가 된다. 따라서

p = γL × (2/r) … 식 8

대기압의 경우에는

Hρ = γL × (2/r) … 식 8-2

또, 상기 서술한 바와 같이, 제 2 표면 (12) 에 액적이 돌아 들어가기 시작한 순간에 액적을 유지하는 것이 곤란해진다. 이것을 근거로 하여, 접촉각 θc 가 0 ＜ cosθc ＜ 1 의 범위에 있어서, θ₀ = θ_c가 된 상태에서의 모든 조건과 제 2 표면 (12) 의 개구부의 내접원의 상당 직경 Din 의 관계를, 도 12 를 참조하여 고찰한다.

대기압하에 대하여, 배지가 ρ, γL 이고, γ_S 의 값의 재료를 사용하여 높이 (H)[㎝] 까지 배지를 넣는 경우에 대하여,

식 6 으로부터 cosθc ＞ γ_S/γ_L 을 만족시키는 재질을 선택한다.

곡률 반경으로부터 상정되는 원의 중심으로부터 아래로 수직인 보조선을 그으면,

Din = 2r·sinθ₀

여기서, 식 8-2 로부터, r = 2HργL 이기 때문에,

Din = 4·γL·sinθ₀/Hρ … 식 9

여기에, 액적이 제 2 표면 (12) 으로 돌아 들어가기 시작하는 한계, 즉 θ₀ = θ_c 를 대입하면, 액적을 유지할 수 있는 내접원의 최대 직경 Din (max) 은,

Din (max) = 4·γL·sinθ_c/Hρ … 식 9-2

가 된다.

즉, 이 값보다 작은 내접원의 직경이 되도록 설계하는 것이 바람직하다.

이와 같은 조건으로 설계할 때에, 접촉각 θc 에 관계없이 (바꾸어 말하면 디바이스의 재료가 소수성인지 친수성인지에 관계없이), 배지 중의 단백질의 재질로의 흡착을 고려하는 것이 바람직하다. 이 때문에, 제 2 표면 (12) 의 개구부의 크기는, 도출된 상당 반경 R 의 최대치의 20 - 80 ％ 의 값으로 하는 것이 바람직하다. 또한, 배지 (8) 의 높이 (H) 에서 유래하는 수압이, 도출된 최대의 수압 p 의 50 - 80 ％ 의 범위가 되도록 배지 (8) 의 높이 (H) 를 조절하여, 배지량을 조정하는 것이 보다 바람직하다.

상기 서술한 바와 같이, 접촉각 θc 에 따라 내접원의 상당 직경 Din 또는 외접원의 상당 직경 Dout 을 설계함으로써, 액적이 적절히 형성되는 스페로이드 제작용 디바이스 (1) 를 제작하는 것이 가능해진다. 바꾸어 말하면, 스페로이드 제작용 디바이스 (1) 에 사용하는 재질과, 세포 배양에 사용하는 배지 (8) 의 성질에 따른 스페로이드 제작용 디바이스 (1) 를 설계·제작하는 것이 가능해진다. 이로써, 스페로이드 제작용 디바이스 (1) 에 의해 세포 배양에 적합한 액적이 형성되므로, 스페로이드 제작용 디바이스 (1) 를 사용하여 스페로이드를 효율적으로, 대량으로 제작하는 것을 기대할 수 있다. 이에 더하여, 스페로이드 제작용 디바이스 (1) 를 사용하여 적절한 액적을 형성시킴으로써, 균일한 스페로이드를 제작하는 것을 기대할 수 있다.

또한, 상기 (1) 내지 (3) 에서는, 접촉각 θc 의 값이 취하는 범위에 따라, 스페로이드 제작용 디바이스 (1) 를 설계할 때에 사용하는 계산식을 제시하였다. 이것은, 스페로이드 제작용 디바이스 (1) 의 재질, 또는 배지 (8) 의 성질에 따라, 복수의 설계 수법을 시험하는 것이 바람직하기 때문이다. 또, 이것은, 적절히 바람직한 계산식을 사용하여 스페로이드 제작용 디바이스 (1) 를 설계, 제조하기 위해서이다.

＜상면의 폭＞

공간과 공간을 구분하는 벽의 상면의 폭 (W) 은 5 ㎜ 이하가 바람직하다. 또 상면 (제 1 표면 (11) 및 그 근방) 에 세포가 체류 또는 정치 (靜置) 하지 않도록 하기 위해서 2 ㎜ 이하가 보다 바람직하다. 상면의 폭 (W) 과 아울러, 상면의 형상 (제 1 표면 (11) 으로부터 상면의 폭까지의 상부의 형상) 에 대해서도 고려하는 것이 바람직하다. 이것에 대해서는, 도 17 내지 22 를 참조하여 후술한다.

＜스페로이드 제작용 디바이스의 재질＞

스페로이드 제작용 디바이스 (1) 는, 아크릴계 수지, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 스티렌계 수지, 아크릴·스티렌계 공중합 수지, 폴리카보네이트계 수지, 폴리에스테르계 수지, 폴리비닐알코올계 수지, 에틸렌·비닐알코올계 공중합 수지, 열가소성 엘라스토머 염화비닐계 수지, 실리콘 수지 및 실리콘 수지 중 하나, 또는 이들 조합으로 이루어지는 수지 성형품인 것이 바람직하다. 이것은, 염가로, 또한 대량으로 디바이스를 제조하기 위해서는, 성형 가공이 가능한 수지를 사용하기 때문이다.

또, 스페로이드 제작용 디바이스 (1) 가 상기 서술한 수지 성형품인 경우에, 적어도 벽면 (13) 에, 플라스마 처리, 코로나 방전, UV 오존 처리 중 하나, 또는 이들 조합으로 이루어지는 표면 개질 처리 방법에 의해 관능기를 형성시키는 것이 바람직하다. 스페로이드 제작용 디바이스 (1) 전체에 관능기를 형성시켜도 된다. 이것은, 소수성이 지나치게 높은 경우나 개구부가 작은 경우에는 친수성을 부여함으로써, 개구부로의 배지의 유입을 순조롭게 실시할 수 있기 때문이다.

또한, 스페로이드 제작용 디바이스 (1) 가 상기 서술한 수지 성형품인 경우에, 적어도 벽면 (13) 에, 무기물, 금속, 합성 폴리머, 다이머, 트리머, 테트라머, 생체 유래 폴리머 중 하나, 또는 이들 조합으로 이루어지는 물질이 피복되어 있는 것이 바람직하다. 또 스페로이드 제작용 디바이스 (1) 전체에 이들 물질을 피복해도 된다. 이것은, 상기와 동일한 이유에 의한다. 이에 더하여, 표면을 상기 서술한 재료로 코트함으로써, 보다 소수성의 표면을 제조하는 것은 매우 유효하다. 이것은 동일한 상당 직경의 구멍을 갖는 디바이스라도, 표면 장력이 작은 배지를 사용하는 경우에는, 표면이 소수성인 것이 표면이 친수성인 것보다 유효해지기 때문이다.

또, 스페로이드 제작용 디바이스 (1) 가, 금속, 유리 등의 무기물 중 하나, 또는 이들 조합으로 이루어지는 성형품인 것이 바람직하다. 스페로이드 제작용 디바이스 (1) 가 상기 서술한 성형품인 경우에, 적어도 벽면 (13) 에, 플라스마 처리, 코로나 방전, UV 오존 처리 중 하나, 또는 이들 조합으로 이루어지는 표면 개질 처리 방법에 의해 표면을 개질하는 것이 바람직하다. 스페로이드 제작용 디바이스 (1) 전체의 표면을 개질해도 된다. 이것은 상기와 동일한 이유에 의한다. 이에 더하여, 표면을 상기 서술한 재료로 코트함으로써, 보다 소수성의 표면을 제조하는 것은 매우 유효하다. 이것은 동일한 상당 직경의 구멍을 갖는 디바이스라도, 표면 장력이 작은 배지를 사용하는 경우에는, 표면이 소수성인 것이 표면이 친수성인 것보다 유효해지기 때문이다.

혹은, 스페로이드 제작용 디바이스 (1) 가 상기 서술한 성형품인 경우에, 적어도 벽면 (13) 에, 무기물, 금속, 폴리머, 다이머, 트리머, 테트라머 중 하나, 또는 이들 조합으로 이루어지는 물질이 피복되어 있는 것이 바람직하다. 스페로이드 제작용 디바이스 (1) 전체에, 이들 물질이 피복되어 있어도 된다. 이것은, 상기와 동일한 이유에 의한다. 이에 더하여, 표면을 상기 서술한 재료로 코트함으로써, 보다 소수성의 표면을 제조하는 것은 매우 유효하다. 이것은 동일한 상당 직경의 구멍을 갖는 디바이스라도, 표면 장력이 작은 배지를 사용하는 경우에는, 표면이 소수성인 것이 표면이 친수성인 것보다 유효해지기 때문이다.

추가로 이에 더하여, 상기 서술한 가공에 더하여, 적어도 벽면 (13) 의 표면, 혹은 스페로이드 제작용 디바이스 (1) 전체에, 나노미터 오더의 미세 구조를 갖는 것이 바람직하다. 미세 구조는, 예를 들어 표면을 요철로 가공한 구조이다. 재료 표면의 성질은 디바이스의 재료에 의해 기정되는 것이 아니라, 재료 표면의 성질에 의해 기정된다. 이 때문에, 동일한 재료라도 표면의 친소수성을 후 처리에 의해 컨트롤할 수 있기 때문에, 어떤 재료를 디바이스의 재료로서 사용해도 된다.

＜스페로이드의 회수 방법＞

상기 서술한 스페로이드 제작용 디바이스 (1) 를 사용하여 스페로이드를 제작하는 방법의 개략 및 제작한 스페로이드의 회수 방법에 대해 설명한다.

도 13 에, 도 4 에 나타내는 세포 배양 용기 (9) 를 사용하여 스페로이드를 제작하는 공정을 설명하는 도면을 나타낸다. 스페로이드 제작용 디바이스 (1) 의 각 구멍에, 세포를 포함하는 배지 (8) 를, 제 1 표면 (11) 측으로부터 각 구멍에 주입한다. 상기 서술한 바와 같이 적절히 스페로이드 제작용 디바이스 (1) 를 설계함으로써, 배지 (8) 가 스페로이드 제작용 디바이스 (1) 의 바닥 (제 2 표면의 개구부) 으로부터 돌출되므로, 배지의 액적을 형성할 수 있다. 배지 (8) 에 포함되는 세포는, 액적 부분에서 응집하여 스페로이드 (7) 를 형성한다. 세포 배양 중에는, 예를 들어, 배지 (8) 의 상청을 취출하고, 새로운 배지를 보충하여 배지 (8) 를 교환한다.

도 14 에 도 4 에 나타내는 세포 배양 용기 (9) 를 사용하여 스페로이드를 제작하는 공정 외의 일례를 설명하는 도면을 나타냈다. 도 14 는, 액적이 제 2 표면 (12) 의 개구부에 도달하지 않고 도중에 정지하고 있는 상태를 나타내는 도면이다. 상기 서술한 바와 같이 적절히 설계된 스페로이드 제작용 디바이스 (1) 에, 설계시의 높이 (H) 보다 낮은 높이까지 배지를 첨가한 경우에는 이와 같은 현상이 일어난다. 이와 같은 경우라도, 배지 (8) 에 포함되는 세포는, 액적 부분에서, 응집되어 스페로이드 (7) 를 형성한다. 세포 배양 중에는, 예를 들어, 배지 (8) 의 상청을 취출하고, 새로운 배지를 보충하여 배지 (8) 를 교환할 수 있다. 스페로이드를 회수할 때에는, 배지를 제 1 표면 (11) 측으로부터 첨가하여 H 를 크게 하거나, 또는 제 1 표면측의 압력을 높게 함으로써, 예를 들어, 이하에 나타낸 도 14 와 같은 상태로 함으로써, 도 15 또는 도 16 의 수법으로 회수 가능해진다.

제작한 스페로이드 (7) 는, 예를 들어, 도 15, 16 에 나타내는 수법으로 회수한다. 이하에 서술하는 방법에 의하면, 스페로이드 (7) 를 손상시키지 않고 회수하는 것이 가능해진다.

도 15 는, 샬레 (92) 에 회수용 용액을 넣고, 제 2 표면과 접촉시켜 스페로이드 (7) 를 회수하는 수법을 나타낸다. 회수용 용액은, 예를 들어, 배지 (8), 물, 또는 완충액 중 어느 것에서 선택할 수 있다. 스페로이드 제작용 디바이스 (1) 를 사용하여 세포를 배양함으로써 제작한 스페로이드 (7) 는, 이러한 수법에 의해 취출한다. 이러한 수법의 바람직한 양태는, 액적을 회수용 용액측으로 이동시킴으로써 스페로이드를 회수하는 것이다. 액적을 이동시킬 때에는, 제 2 표면 (12) 측에 형성되어 있는 액적을 회수용 용액과 접촉시키는 것이 특히 바람직하다.

도 16 은, 세포 배양 용기 (9) 를 뚜껑 (93) 으로 닫은 다음 제 1 표면 (11) 측으로부터 압력을 가하여 스페로이드 (7) 를 회수하는 수법을 나타낸다. 제 1 표면 (11) 측으로부터 압력을 가하면, 액적이 파괴된다. 그 결과, 배지 (8) 가 샬레 (92) 로 유출됨으로써, 스페로이드 (7) 를 회수할 수 있다. 스페로이드 제작용 디바이스 (1) 를 사용하여 배양한 스페로이드를 취출할 때에는, 이와 같이 액적을 파괴하는 것이 바람직하다. 액적을 파괴할 때에는 어떠한 방법으로 제 1 표면 (11) 측으로부터 압력을 가해도 된다. 예를 들어 배지 (8) 를 액적이 파단될 때까지 첨가하는 방법이어도 된다. 또 제 1 표면 (11) 측을 밀폐하고 기체를 흘려 넣어 가압하는 방법 등이어도 된다.

이상 설명한 바와 같이, 본 실시형태의 스페로이드 제작용 디바이스 (1) 에 의하면, 복수의 구멍에 액적을 발생시켜, 스페로이드를 제작할 수 있기 때문에, 스페로이드를 효율적으로 대량으로 제작할 수 있다. 그 때, 복수의 구멍의 크기를 동일하게 함으로써, 균일한 스페로이드를 제작할 수 있다. 이에 더하여, 스페로이드 제작용 디바이스 (1) 에는, 배지를 제 1 표면 (11) (상측) 으로부터 주입하는 것이 가능하다. 또한, 배지를 제 1 표면 (11) 측으로부터 교환하는 것이 가능하다. 이 때문에 스페로이드 제작용 디바이스 (1) 의 조작은 용이하다. 이에 더하여, 스페로이드 제작용 디바이스 (1) 를 물리 현상에 기초하여 설계함으로써, 그 구조를 간이한 것으로 할 수 있다. 이로써, 예를 들어, 특허문헌 2 에 기재된 현탁 플레이트에 비하여, 스페로이드 제작용 디바이스 (1) 자체를 용이하게 제조할 수 있다. 그 결과, 스페로이드를 제작하는 비용, 작업 시간을 대폭 삭감할 수 있다.

실시형태 2

실시형태 1 에서는, 도 1, 2 에 나타내는 바와 같은 구멍의 형상을 갖는 스페로이드 제작용 디바이스 (1) 를 설명했지만, 구멍의 형상은 이것에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 도 2 에 나타내는 단면이 아니라, 도 17 내지 22 에 나타내는 형상의 단면을 갖는 스페로이드 제작용 디바이스 (1a ∼ 1f) 여도 된다. 스페로이드 제작용 디바이스 (1a ∼ 1c) 는, 도 2 와 마찬가지로, 벽면 (13) 이, 제 2 표면 (12) 과의 경계로부터, 각도 θi 를 갖는 사면으로 구성되어 있는 예이다. 한편, 도 20 에 나타내는 스페로이드 제작용 디바이스 (1d) 는, 각도를 갖는 사면이 벽면 (13) 의 도중부터 형성되어 있는 예이다.

또, 상면의 형상은, 도 2, 도 17 내지 22 에 일례로서 나타내는 바와 같이, 구의 일부의 형상 (도 2, 20 내지 22) 이나 평탄 (도 19) 해도 된다. 혹은 상면의 형상은, 원뿔 또는 다각뿔의 정점과 같은 형상 (도 17, 18) 이어도 된다. 스페로이드 제작용 디바이스의 일 양태에 있어서, 세포가 상면에 체류 또는 정치하는 것을 방지하기 위해서, 상면의 형상은 구형, 원뿔 또는 다각뿔의 정점의 형상인 것이 보다 바람직하다. 이에 더하여, 도시하지 않지만, 제 1 표면 (11) 의 개구부로부터 구멍으로의 입구는 수직이고 제 2 방면 (12) 의 개구부 주변만 기울어져 있는 형상이어도 된다.

여기서, 도 20 ∼ 도 22 에 나타내는 스페로이드 제작용 디바이스 (1d) 에 대해 설명한다. 상당 직경 D 및 각도 θi 는 디바이스의 제 2 표면 (12) 의 개구부에 있어서 배지와 접하는 위치에 있어서의 상당 직경 및 각도이다. 여기서 디바이스의 형상은 도 20, 도 21 또는 도 22 와 같은 디바이스의 형상이어도 된다. 도 20 은, 레벨 2 에서 레벨 3 까지의 벽면 (13) 이 각도를 갖고 있는 경우를 나타내는 도면이다. 도면 중에서는 레벨 3 의 개구부의 내접원의 상당 직경이 레벨 4 의 내접원의 상당 직경과 동일하다. 이 경우에는 레벨 4 의 위치가 내접원의 상당 직경 Din 및 각도 θi 의 기준이 된다. 도 21 은, 레벨 3 에서 레벨 4 까지의 벽면 (13) 이 각도를 갖는 경우의 일례를 나타내는 도면이다. 도면 중에서는 레벨 3 의 개구부의 내접원의 상당 직경이 레벨 4 의 내접원의 상당 직경 D 보다 크다. 이 경우에는 레벨 4 의 위치가 내접원의 상당 직경 Din 및 각도 θi 의 기준이 된다. 이 때, 레벨 3 에서 레벨 4 까지의 벽면 (13) 의 경사도, 즉 각도 θi 는, 레벨 2 에서 레벨 3 까지의 벽면 (13) 의 경사도보다 작은 것이 바람직하다.

또한, 도 22 에 나타내는 바와 같이 레벨 2 에서 레벨 3 까지의 벽면 (13) 이 각도를 갖고 있어도 된다. 이러한 경우, 레벨 3 의 개구부의 내접원의 상당 직경보다 레벨 4 의 개구부의 내접원의 상당 직경이 크다. 이 때, 벽면 (13) 중에서 배지가 접하는 가장 아래의 레벨은 레벨 3 이다. 따라서 레벨 2 에서 레벨 3 의 경사도가 각도 θi 가 되고, 레벨 3 의 위치가 내접원의 상당 직경 Din 이 된다. 도 20 내지 22 에 있어서, 각도 θi 는, 제 2 표면 (하면) 또는 제 2 표면측의 개구부로서, 액면이 접하는 위치의 각도가 된다.

실시형태 1 에서는, 도 1, 2 에 나타내는 바와 같은 제 1 표면 (11) 및 제 2 표면 (12) 에 형성되는 개구부가 원형인 경우를 설명하였다. 그러나, 개구부의 형상은 이것에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 개구부가, 도 23 내지 26 에 나타내는 바와 같은 형상을 갖는 스페로이드 제작용 디바이스 (1g ∼ 1j) 여도 된다. 도 1, 2 에서 설명한 바와 같이, 스페로이드 제작용 디바이스 (1) 는, 배지와 접촉하는 부분으로서, 제 1 표면 (11) (상면) 과 제 1 표면 (11) 의 개구부와 제 2 표면 (12) (하면) 의 개구부를 구비하는 것이 바람직하다. 또한, 제 1 표면 (11) 의 개구부의 내접원의 상당 직경이 제 2 표면 (12) 의 개구부의 내접원의 상당 직경 Din 보다 큰 것이 바람직하다. 그 때문에, 구멍의 형상은 스페로이드 제작용 디바이스 (1g ∼ 1j) 에 나타내는 바와 같이, 원이어도 되고, 사각, 팔각형과 같은 다각형이어도 된다. 또한, 제 1 표면 (11) 의 개구부의 형상과 제 2 표면 (12) 의 개구부의 형태는 상이해도 된다. 도 23 내지 26 의 각 도면에서는, 제 1 표면 (11) 의 개구부 (또는, 상면의 폭 (W) 의 위치의 개구부의 형상) 를 실선으로 나타내고 있다. 또, 제 2 표면의 개구부를 점선으로 나타내고 있다. 이들 개구부는, 스페로이드 제작용 디바이스 (1g ∼ 1j) 를 제 1 표면 (11) 측에서 보았을 때의 4 개의 구멍으로서 나타내고 있다.

이에 더하여, 스페로이드 제작용 디바이스의 일 양태에서는, 예를 들어, 얇은 시트상의 필름에 펀치로 구멍을 뚫어도 되고, 금형을 제조하고 수지를 흘려 넣어 성형해도 된다. 이 때, 상면의 개구부의 내접원의 상당 직경이 하면의 개구부의 내접원의 상당 직경 Din 보다 큰 공간이 되도록 한다. 또한, 배지의 중량을 지지하기 위해서, 필름이나 수지를 보강하기 위한 버팀목을 형성해도 된다. 필름이나 수지를 두껍게 하는 경우, 경량화를 도모하기 위해 내부를 공동으로 해도 된다.

실시예

스페로이드를 제작하는 시험을 실시하였다. 먼저 도 27, 28 에 나타내는 형상의 스페로이드 제작용 디바이스 (1x) 를 설계·제조하였다. 다음으로 스페로이드 제작용 디바이스 (1x) 를 도 29, 30 에 나타내는 웰 용기 (91x) 에 장착하였다. 스페로이드 제작용 디바이스 (1x) 를 구비한, 도 29, 30 에 나타내는 웰 용기 (91x) 를 6 웰 플레이트 (도시 생략) 에 장착하였다. 이 때, 액적 (81) 및 제 2 표면 (12) 이 웰 플레이트의 바닥에 접촉하지 않는 것을 확인하였다.

도 27 에 제 1 표면에서 본 도면을 나타낸다. 또 도 28 에, 도 27 의 XXVIII-XXVIII 선을 따른 단면도를 나타낸다. 또, 도 29 에 제 1 표면에서 본 도면을 나타낸다. 또 도 30 에, 도 29 의 XXX-XXX 선을 따른 단면도를 나타낸다.

스페로이드 제작용 디바이스 (1x) 는, 1 피치 (PI) 를 1.00 ㎜ 로 하고, 이하의 크기로 제작하였다.

제 2 표면 (12x) 의 상당 직경 D：0.25 ㎜

각도 θi ：67.5 도

두께 T ：0.74 ㎜

상면의 폭 W ：0.184 ㎜

웰 용기 (91x) 에 대해서는, 이하의 크기로 하였다.

웰 용기의 내주의 직경 L1：31 ㎜

웰 용기의 높이 L3：1.5 ㎝

1. 배양 용기

[실시예 1]

접촉각 θc 가 -1 ＜ cosθc ＜ 0 의 범위에 있는 재료를 사용하였다. 스페로이드 제작용 디바이스의 재질로서 실리콘 (메이커：KCC, 그레이드：SL7260) 을 사용하였다. 배지로서 10 ％ FBS 첨가 DMEM/F12 를 사용하였다. 이후에서는, 배지 A 라고 기재한다.

＜스페로이드 제작용 디바이스의 설계＞

상기 서술한 식 3 (이하에 재게) 을 사용한다.

(2/3)αR² ＋ pR = 2γ_L … 식 3

본 실시예에서는, 순수의 조건으로 설계를 실시하였다.

·순수의 밀도 및 비중：1.00 (문헌치)

·액체의 표면 장력 γ_L：7 × 10^-2 [g/㎝]

배지 A 의 액체의 표면 장력 γ_L 은, Wilhelmy 법 등 여러 가지 방법으로 측정할 수 있다. 또는 판매원으로부터 정보를 입수하는 것이 가능하다. 순수의 디바이스의 재질에 대한 접촉각 θc 를 액적법에 의해 측정한 결과, 91 도 (cos91 도 = -0.017) 였다. 또한, 본 실시예에서 사용한 배지와 순수는, 이 접촉각 θc 에 대하여, 근방의 값을 나타내는 것이다.

·배지의 높이 (H) 는, 1 ㎝ 이내가 되도록 설계한다.

배지 A 를 사용할 때, 식 3 에 상기 서술한 값을 대입하고 외접원의 상당 반경 Rout 을 구한다.

(2/3) × 1.00 × R² ＋ 1 × 1.00 × R = 2 × 7 × 10^-2

R = 0.123, -1.629

여기서, 외접원의 상당 반경 Rout 은 정의 값이기 때문에, 이하의 값이 정해진다.

R = 0.123 ㎝ = 1230 ㎛

외접원의 상당 직경 Dout 을 산출치의 23 ％ 의 285 ㎛ 로 하였다. 이 때, 단백질의 흡착에 의한 소수성의 저하나 스페로이드의 중력으로부터 받는 힘과, 배지 교환이나 운반시의 진동에 의해 액적을 유지할 수 없게 될 가능성을 고려하였다. 각도 θi 는 67.5 도로 하였다. 또 개구부가 1 ㎜ 가 되도록 하였다. 도 14 에 나타내는 바와 같이, 액적이 디바이스의 측면의 도중에 멈춤으로써, 디바이스가 확실하게 액적을 유지할 수 있도록 설계하였다. 도 30 의 91x 의 직경이 31 ㎜ 가 되도록 하였다.

[비교예 1]

저접착성 용기는 직경 5 ㎝ 의 유리 샬레의 바닥에, 신에츠 화학사 제조의 실리콘 수지 (KE-1603 (A/B)) 을 첩부 (貼付) 한 것을 사용하였다.

2. 배양 방법

(1) 배지 10 ㎖ 중에 마우스 ES 세포를 250 만개 포함하도록 조정한 세포 현탁액을 도 30 에 나타내는 웰에 첨가하였다. 이러한 세포를 2 일간 배양하였다. 이 세포 현탁액은 실시예 및 비교예의 양방에서 사용하였다. 또한, 이 세포 현탁액을 사용함으로써, 1 개의 개구부에 넣을 수 있는 세포수는 1250개/개구부이다. 또 다른 실시예에서는, 1 개의 개구부당 들어가는 세포수의 양을 1500, 1000, 500 개가 되도록 조정한 세포 현탁액을 조정하였다. 이들의 실시예에서도 동일하게 2 일간 배양을 실시하였다.

(2) 실시예에서는 제 2 표면 (12) 을 배지에 접촉시키고, 스페로이드를 회수한 것을 관찰하였다. 비교예는 세포 현탁액을 다른 용기로 옮기지 않고, 배양하고 있는 용기를 사용하여 스페로이드를 관찰하였다.

(3) 도립 현미경으로 관찰하고, 얻어진 화상을 사용하여 직경을 계측하였다.

3. 결과

도 31, 32 에 실시예 1 에 대하여, 스페로이드 회수 전의 디바이스와 세포의 현미경 사진을 나타낸다. 도 32 는, 도 31 의 확대도이다. 실시예 1 에서는, 각 개구부 내에 스페로이드가 형성되어 있었다.

도 33 에, 실시예 1 및 비교예 1 에 대하여, 회수 후의 스페로이드의 현미경 사진을 나타냈다.

도 34 에, 실시예 1 에 대하여, 스페로이드 회수 후의 디바이스 표면의 사진을 나타냈다. 도 31 에서 보여진 스페로이드가 거의 전체 수가 회수되어 있었다. 단, 끝에 대해서는 잔존하고 있는 것도 보여졌다. 회수율은 95 ％ 이상이었다. 회수율은, 식 (세포가 잔존하고 있지 않은 개구부의 수/개구부의 총 수) × 100) 에 의해 구하였다.

도 35 에 비교예 1 의 스페로이드의 사진을 나타낸다.

또, 도 36 에 실시예 1 및 비교예 1 의 입경 직경 분포를 나타내는 그래프를 나타낸다. 도 36 의 그래프 제조에 있어서는, 도 33 (좌측의 실시예 1 의 사진, 우측의 비교예 1 의 사진) 의 ×75 의 렌즈로 촬영하고, 스페로이드의 화상을 취입하였다. 취입한 화상을 임의로 하기 표 1 의 데이터수만큼 선택하고, 각각의 스페로이드의 직경을 계측하였다.

이 때의 세포 덩어리의 직경의 평균치 (㎛) 와 표본 표준 편차 (SD) 와 편차 (SD 를 직경의 평균치로 나눈 것으로 정의된다) 를 표 1 에 나타냈다. SD/평균 직경의 값으로부터 알 수 있는 바와 같이, 실시예 1 의 편차는 비교예 1 의 편차의 1/3 이하였다.

도 37 에 실시예 1 의 세포수를 변경한 경우의 입자 직경 분포를 나타낸다.

또한, 세포수를 변경한 경우라도, 균일한 직경의 세포 덩어리를 형성시킬 수 있는지를 검토하였다. 표 2 에 검토 결과를 나타낸다. 이번에 설계한 상당 직경 D 에서는 1500, 1000 세포/개구부일 때에 비교예와 비교하여 10 ％ 정도 낮은 편차가 되었다. 500 세포/개구부의 경우에는, 비교예와 동등한 편차가 되었다.

또한, 본 발명은 상기 실시형태에 한정된 것은 아니고, 취지를 일탈하지 않는 범위에서 적절히 변경하는 것이 가능하다.

이 출원은, 2014년 2월 25일에 출원된 일본 특허출원 2014-034577호를 기초로 하는 우선권을 주장하고, 그 개시의 전부를 여기에 취입한다.

1, 1a ∼ 1h, 1x : 스페로이드 제작용 디바이스
7 : 스페로이드
8 : 배지
9 : 세포 배양 용기
11, 11x : 제 1 표면
12, 12x : 제 2 표면
13, 13x : 벽면
9 : 세포 배양 용기
91, 91x : 웰 용기
92 : 샬레
93 : 뚜껑

Claims

제 1 표면과,
상기 제 1 표면의 이면이 되는 제 2 표면과,
상기 제 1 표면과 상기 제 2 표면 사이를 관통하는 복수의 구멍을 형성하는 복수의 벽면을 구비하고,
상기 제 1 표면의 개구부의 내접원의 상당 직경이 상기 제 2 표면의 개구부의 내접원의 상당 직경보다 큰, 스페로이드 제작용 디바이스.
제 1 항에 있어서,
상기 제 2 표면의 내접원의 개구부의 상당 직경이 200 마이크로미터로부터 1 센티미터의 범위인, 스페로이드 제작용 디바이스.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
각 벽면의 적어도 일부분은, 상기 제 2 표면에 대해 1 도보다 크고, 90 도보다 작은 각도의 경사를 갖는, 스페로이드 제작용 디바이스.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 각 구멍에는 상기 제 1 표면으로부터 배지가 주입되고,
상기 각 벽면을 구성하는 재질의 표면과 상기 배지의 접촉각 θc 가, -1 ＜ cosθc ≤ 0 의 범위일 때, 상기 제 2 표면의 외접원의 개구부의 상당 직경의 절반인 외접원의 상당 반경 Rout (㎝) 가,
계산식 (2/3)αX² ＋ pX = 2γ_L,
단, p 는 상기 제 2 표면의 개구부에서의 수압 [g/㎠], α 는 상기 배지의 비중, γ_L 은 액체의 표면 장력 [g/㎝] 으로 정의되는 변수 X 의 값 이하인, 스페로이드 제작용 디바이스.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 각 구멍에는 상기 제 1 표면으로부터 배지가 주입되고,
상기 각 벽면을 구성하는 재질의 표면과 배지의 접촉각 θc 가 0 ＜ cosθc ＜ 1 의 범위일 때
계산식 γ_Lcosθc - γ_S ＞ 0
이고, 또한 p = γL × (2/r),
단, p 는 상기 제 2 표면의 개구부에서의 수압 [g/㎠], γ_L 은 액체의 표면 장력 [g/㎝], r 은 곡률 반경 [㎝], γ_L 은 액체의 표면 장력 [g/㎝] 을 만족하도록 내접원의 상당 직경을 설계하는 것을 특징으로 하는, 스페로이드 제작용 디바이스.
제 3 항에 있어서,
하나의 구멍을 형성하는 벽면과 인접하는 다른 구멍을 형성하는 벽면 사이의 폭으로서, 두 개의 벽면이 상기 제 2 표면에 대해 상기 각도 θi 의 경사를 갖는 상기 제 1 표면에 가까운 단부의 폭이 5 밀리미터 이하인, 스페로이드 제작용 디바이스.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 스페로이드 제작용 디바이스가 아크릴계 수지, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 스티렌계 수지, 아크릴·스티렌계 공중합 수지, 폴리카보네이트계 수지, 폴리에스테르계 수지, 폴리비닐알코올계 수지, 에틸렌·비닐알코올계 공중합 수지, 열가소성 엘라스토머 염화비닐계 수지, 실리콘 수지 및 실리콘 수지 중 하나, 또는 이들 조합으로 이루어지는 수지 성형품인, 스페로이드 제작용 디바이스.
제 7 항에 있어서,
상기 복수의 벽면에, 플라즈마 처리, 코로나 방전, UV 오존 처리 중 하나, 또는 이들 조합으로 이루어지는 표면 개질 처리 방법에 의해 관능기를 형성시킨, 스페로이드 제작용 디바이스.
제 7 항에 있어서,
상기 복수의 벽면에, 무기물, 금속, 합성 폴리머, 다이머, 트리머, 테트라머, 생체 유래 폴리머 중 하나, 또는 이들 조합으로 이루어지는 물질이 피복되어 있는, 스페로이드 제작용 디바이스.
제 8 항 또는 제 9 항에 있어서,
상기 복수의 벽면의 표면에, 나노미터 오더의 미세 구조를 갖는, 스페로이드 제작용 디바이스.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 스페로이드 제작용 디바이스가 금속, 유리 등의 무기물 중 하나, 또는 이들 조합으로 이루어지는 성형품인, 스페로이드 제작용 디바이스.
제 11 항에 있어서,
상기 복수의 벽면에, 플라스마 처리, 코로나 방전, UV 오존 처리 중 하나, 또는 이들 조합으로 이루어지는 표면 개질 처리 방법에 의해 표면을 개질한, 스페로이드 제작용 디바이스.
제 11 항 또는 제 12 항에 있어서,
상기 복수의 벽면에, 무기물, 금속, 폴리머, 다이머, 트리머, 테트라머 중 하나, 또는 이들 조합으로 이루어지는 물질이 피복되어 있는, 스페로이드 제작용 디바이스.
제 11 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 복수의 벽면의 표면에, 나노미터 오더의 미세 구조를 갖는, 스페로이드 제작용 디바이스.
제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 기재된 스페로이드 제작용 디바이스의 상기 제 2 표면을 물, 배지 및 완충액 중 하나에서 선택되는 용액과 접촉시켜 스페로이드를 회수하는, 스페로이드 회수 방법.
제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 기재된 스페로이드 제작용 디바이스의 상기 제 1 표면으로부터 압력을 가함으로써 스페로이드를 상기 제 2 표면의 개구부로부터 유출하는, 스페로이드 회수 방법.
제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 기재된 스페로이드 제작용 디바이스를 사용하는 스페로이드 제조 방법으로서,
상기 각 구멍에 세포를 포함하는 배지를 상기 제 1 표면으로부터 주입하고,
상기 각 구멍에서 액적을 형성시키고,
상기 액적의 부분에서 상기 세포를 배양하여, 스페로이드를 제작하는, 스페로이드 제조 방법.
제 17 항에 있어서,
상기 제 2 표면을 물, 배지 및 완충액 중 하나에서 선택되는 용액과 접촉시켜 스페로이드를 회수하는, 스페로이드 제조 방법.
제 17 항에 있어서,
상기 제 1 표면으로부터 압력을 가함으로써, 상기 액적을 파괴하고 스페로이드를 상기 제 2 표면의 개구부로부터 유출하는, 스페로이드 제조 방법.