CN101815782A - 细胞培养器具和使用该器具的细胞培养方法 - Google Patents

细胞培养器具和使用该器具的细胞培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供虽然具备多个能保持细胞的孔但操作性优异的细胞培养器具。本发明的细胞培养器具(1)具备基部(10)和框部(3)，所述基部(10)形成有包含多个能保持细胞的第1孔(21)的孔组(22)，所述框部（3）设置在所述基部(10)的所述孔组(20)的周围，形成能保持溶液的第2孔(50)。

Description

细胞培养器具和使用该器具的细胞培养方法
技术领域
本发明涉及细胞培养器具和使用该器具的细胞培养方法，特别是涉及形成有能保持细胞的多个孔的细胞培养器具和使用该器具的细胞培养方法。
背景技术
目前，作为形成有能保持细胞的多个孔的常用的细胞培养器具，例如有形成有96个直径3mm左右的孔的96孔板(例如非专利文献1、非专利文献2、非专利文献3)。另外，还有形成有384个较小的孔的384孔板以及形成有1536个更小的孔的1536孔板。
非专利文献1：Hiroshi Kurosawa，Journal of Bioscience andBioengineering，Vol.103，No.5，389-398，2007
非专利文献2：Celeste H.Campbell et al.，The FASEB Journal Vol.161917-1927，2002.
非专利文献3：Scott W.Allen et al.，DRUG METABOLISM ANDDISPOSITION Vol.29，No.8，1074-1079，2001.
但是，上述孔板均以对一个个孔进行操作为前提。即，对于96孔板，操作者通过使用移液管等器具的手工操作，对一个个孔进行细胞的接种或培养液的更换等操作。另外，对于384孔板和1536孔板，必须使用专用的机器人，对各孔进行溶液的注入或回收等操作。
另一方面，例如当在基板的表面形成多个能保持细胞的微孔，在该孔内培养细胞的情况下，考虑将该基板整体浸渍到培养液中，对该多个孔整体一次性进行细胞的接种或培养液的更换等细胞培养操作。但是，此时，例如为了在多种条件下培养，需要使用多个基板，此外为了将各基板整体浸渍，需要使用足量的培养液。因此，例如当使用稀少的细胞或试剂时，可能的培养条件的数目会受到限制。
发明内容
本发明是鉴于上述课题而完成的发明，其目的之一在于提供虽然具备多个能保持细胞的孔但操作性优异的细胞培养器具以及使用该器具的细胞培养方法。
用于解决上述课题的本发明的一个实施方式的细胞培养器具的特征在于：具备基部和框部，所述基部形成有包含多个能保持细胞的第1孔的孔组，所述框部设置在所述基部的所述孔组的周围，形成能保持溶液的第2孔。根据本发明，能够提供虽然具备多个能保持细胞的孔但操作性优异的细胞培养器具。
另外，上述第1孔的开口部的面积可以为100～1×106μm2的范围。这样即可提供虽然具备大量微孔但操作性优异的细胞培养器具。
另外，上述基部和上述框部可以分别由相互独立形成的基部部件和框部部件构成，上述框部部件形成有与上述孔组对应的贯穿孔，并被构成为能安装于上述基部部件上并能从上述基部部件上卸下，在上述框部部件安装在上述基部部件上的状态下，上述贯穿孔的内壁设置在上述孔组的周围，形成上述第2孔。这样即可进一步提高培养细胞时的操作性。
另外，此时，可以在上述基部部件上相互分离地形成有多个上述孔组，在上述框部部件上形成有至少一个分别与所述多个孔组中的一个对应的所述贯穿孔。此外，还可以在上述框部部件上形成有多个分别与上述多个孔组中的一个对应的上述贯穿孔，在上述框部部件安装在上述基部部件上的状态下，上述多个贯穿孔的各内壁设置在对应的一个上述孔组的周围，形成多个上述第2孔。这样即可对多个孔组的全部或一部分进行独立的操作。
另外，在上述基部部件和上述框部部件上可以分别形成有能在对应的位置上相互结合的第1结合部和第2结合部。这样即可简便并切实地将框部部件安装到基部部件上。另外，此时，在上述基部部件上还可以相互分离地形成有多个上述孔组，上述第1结合部可以形成在上述多个孔组的各自的周围。这样即可简便并切实地将框部部件安装到基部部件上。另外，还可以对多个孔组的全部或一部分进行独立的操作。另外，上述第1结合部和上述第2结合部可以一个形成为凸形，另一个形成为凹形，并能相互嵌合。这样即可简便并切实地进行基部部件与框部部件的定位。另外，还可以具备保持部件，该保持部件将上述基部部件和安装在上述基部部件上的上述框部部件一体保持，具有与上述基部部件和上述框部部件的各自的外周的至少一部分抵接并将上述基部部件和上述框部部件的相对位置固定的抵接部。这样即可简便并切实地进行基部部件与框部部件的定位。
用于解决上述课题的本发明的一个实施方式的细胞培养器具用框部部件的特征在于，其被构成为能安装于形成有包含多个能保持细胞的第1孔的孔组的基部部件上并能从该基部部件上卸下，并形成有与上述孔组对应的贯穿孔，通过安装在上述基部部件上，上述贯穿孔的内壁设置在上述孔组的周围，形成能保持溶液的第2孔。根据本发明，能够提供用于构成虽然具备能保持细胞的多个孔但操作性优异的细胞培养器具的框部部件。
用于解决上述课题的本发明的一个实施方式的细胞培养方法的特征在于，使用上述任一细胞培养器具。根据本发明，能够提供虽然具备能保持细胞的多个孔但操作性优异的细胞培养器具。
另外，上述细胞培养方法可以使用具备基部部件和能安装于该基部部件上并能从该基部部件上卸下的框部部件的上述细胞培养器具，并包含如下工序：在上述框部部件安装在上述基部部件上的状态下，通过向上述细胞培养器具中的上述第2孔中注入含有细胞的溶液，从而向与上述第2孔对应的一个上述孔组接种上述细胞的工序；以及从上述基部部件卸下上述框部部件，在上述孔组中培养上述细胞的工序。这样即可高效并切实地向孔组接种细胞。
另外，上述细胞培养方法还可以使用具备基部部件和能安装于该基部部件上并能从该基部部件上卸下的框部部件的上述细胞培养器具，并包含如下工序：在上述孔组中培养细胞的工序；以及在上述框部部件安装在上述基部部件上的状态下，通过向上述细胞培养器具中的上述第2孔中注入规定的溶液，从而使与上述第2孔对应的一个上述孔组的细胞与上述规定的溶液接触的工序。这样即可高效并切实地对孔组内的细胞进行处理。
另外，上述细胞培养方法还可以使用在上述基部部件上相互分离地形成有多个上述孔组、且在上述框部部件上形成有多个分别与上述多个孔组中的一个对应的上述贯穿孔的上述细胞培养器具，并包含如下工序：在上述多个孔组中培养细胞的工序；以及在上述框部部件安装在上述基部部件上的状态下，通过向上述细胞培养器具中的上述多个第2孔中注入互不相同的溶液，从而使与上述多个第2孔对应的上述多个孔组的细胞与互不相同的上述溶液接触的工序。这样即可高效并切实地用互不相同的溶液对在多个孔组中分别培养的细胞进行处理。
附图说明
图1是表示本发明的一个实施方式的细胞培养器具的一个例子的分离状态的立体图。
图2是用通过图1所示的II-II线的面切断后的分离状态的器具1的截面图。
图3是表示本发明的一个实施方式的细胞培养器具的一个例子的安装状态的立体图。
图4是用图3所示的IV-IV线切断后的安装状态的器具1的截面图。
图5是用于说明本发明的一个实施方式的细胞培养器具的一个例子的另一侧面的截面图。
图6是表示本发明的一个实施方式的细胞培养器具的另一例子的分离状态的立体图。
图7是用通过图6所示的VII-VII线的面切断后的分离状态的器具1的截面图。
图8是表示本发明的一个实施方式的细胞培养器具的另一例子的安装状态的立体图。
图9是用图8所示的IX-IX线切断后的安装状态的器具1的截面图。
图10是表示本发明的一个实施方式的具有结合部的细胞培养器具的一个例子的分离状态的立体图。
图11是表示本发明的一个实施方式的具有结合部的细胞培养器具的另一例子的分离状态的立体图。
图12是表示本发明的一个实施方式的具有结合部的细胞培养器具的另一例子的安装状态的立体图。
图13是表示本发明的一个实施方式的具有结合部的细胞培养器具的又一例子的分离状态的立体图。
图14是表示本发明的一个实施方式的具有结合部的细胞培养器具的再一例子的分离状态的立体图。
图15是表示本发明的一个实施方式的具有保持部件的细胞培养器具的一个例子的分离状态的立体图。
图16是表示本发明的一个实施方式的具有保持部件的细胞培养器具的一个例子的安装状态的立体图。
图17是用图16所示的XVII-XVII线切断后的安装状态的细胞培养器具的截面图。
图18是表示本发明的一个实施方式的细胞培养方法中包含的主要工序的流程图。
图19是表示本发明的一个实施方式的细胞培养器具的培养状态的一个例子的立体图。
图20是表示本发明的一个实施方式的细胞培养器具的培养状态的另一例子的立体图。
图21是表示本发明的一个实施方式的细胞培养器具的另一例子的立体图。
图22是表示用图21所示的XXII-XXII线切断后的器具1的截面图。
图23是表示在本发明的一个实施方式的细胞培养器具中形成的细胞组织体的一个例子的显微镜照片。
图24是表示在本发明的一个实施方式的细胞培养器具中形成的细胞组织体的另一例子的显微镜照片。
图25是表示在本发明的一个实施方式的细胞培养器具中形成的胚状体的一个例子的显微镜照片。
图26是表示在本发明的一个实施方式的细胞培养器具中形成的神经球的一个例子的显微镜照片。
图27是表示在本发明的一个实施方式的细胞培养器具中形成的胚状体的粒径分布的一个例子的说明图。
图28是表示在本发明的一个实施方式的细胞培养器具中形成的神经球的粒径分布的一个例子的说明图。
图29是表示在本发明的一个实施方式的细胞培养器具中形成的肝细胞球形聚集体的一个例子的显微镜照片。
图30是表示在本发明的一个实施方式的细胞培养器具中形成的胚状体的另一例子的显微镜照片。
图31是表示在本发明的一个实施方式的细胞培养器具中形成的肝细胞球形聚集体的粒径分布的一个例子的说明图。
图32是表示在本发明的一个实施方式的细胞培养器具中形成的胚状体的粒径分布的另一例子的说明图。
图33是表示本发明的一个实施方式的细胞培养器具的分离状态的外观的一个例子的照片。
图34是表示本发明的一个实施方式的细胞培养器具的安装状态的外观的一个例子的照片。
图35是表示本发明的一个实施方式的细胞培养器具的安装状态的外观的另一例子的照片。
图36是表示在本发明的一个实施方式的细胞培养器具中形成的细胞组织体的又一例子的显微镜照片。
图37是表示对在本发明的一个实施方式的细胞培养器具中形成的细胞组织体的直径进行了评价后得到的结果的一个例子的说明图。
具体实施方式
以下，参照附图对本发明的一个实施方式的细胞培养器具以及使用该器具的细胞培养方法进行说明。首先，对本实施方式的细胞培养器具(以下，称为“器具1”)进行说明。
图1～图4是器具1的一个例子的说明图。如图1～图4所示，器具1具备基部部件2和与该基部部件2独立形成并能安装于该基部部件2上并能从该基部部件2上卸下的框部部件3。图1是从基部部件2卸下框部部件3的状态(以下称为“分离状态”)的器具1的立体图。图2是用通过图1所示的II-II线的面切断后的分离状态的器具1的截面图。图3是框部部件3安装于基部部件2的状态(以下称为“安装状态”)的器具1的立体图。图4是用通过图3所示的IV-IV线的面切断后的安装状态的器具1的截面图。
如图1～图4所示，在基部部件2上形成有一个孔组(以下称为“微孔组20”)。即，在本实施方式中，基部部件2具有厚度一定的平板状地形成的第1基板部10。并且，在第1基板部10的上方侧的平坦表面(以下称为“上表面11”)的一部分上形成有微孔组20。
微孔组20包含能保持细胞的多个第1孔(以下称为“微孔21”)地构成。各微孔21作为在基部部件2的上表面11开口的有底的孔而形成。即，各微孔21具有圆形的平坦底面22和以设置在该底面22的周围的规定高度的圆筒内壁形式形成的内壁23。多个微孔21在第1基板部10的上表面11的规定范围内以规定的间隔规则地配置。
基部部件2可以使用根据目的选择的任意材料来形成。即，作为构成基部部件2的材料，例如可以从聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、聚酰胺、聚缩醛、聚酯(聚对苯二甲酸乙二醇酯等)、聚氨酯、聚砜、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯(聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)等)、聚乙烯等合成树脂、PDMS(聚二甲基硅氧烷)等硅类树脂、EPDM(三元乙丙橡胶)等合成橡胶、天然橡胶、玻璃、陶瓷、不锈钢等金属材料中选择1种材料单独使用、或将2种以上的材料组合使用。
另外，作为构成基部部件2的材料、尤其是构成形成有微孔组20的部分的材料，例如从利用显微镜等光学装置观察在该微孔组20内培养的细胞时的便利性的角度出发，可以优选使用上述材料中的透光性材料。即，在本实施方式中，第1基板部10可以使用例如透光性的合成树脂或玻璃来形成。
具体而言，例如可以由透光性的合成树脂形成第1基板部10，在该第1基板部10的上表面11的一部分形成比该第1基板部10的厚度小的规定深度的多个有底孔作为多个微孔21。另外，还可以例如在由透光性的合成树脂形成的第1平板的一部分上形成多个贯穿孔，通过使由玻璃形成的第2平板与该第1平板的该贯穿孔开口的表面之一粘接，形成由该第1平板和该第2平板构成的第1基板部10。此时，第1平板的各贯穿孔的内壁成为各微孔21的内壁23，堵塞各贯穿孔的第2平板的表面的一部分成为各微孔21的底面22。另外，此时，作为第1平板和第2平板，可以使用由同一材料成形的平板。
在形成微孔21时，可以采用根据目的选择的任意加工方法。即，可以通过例如使用了加工中心(machining center)等的穿孔加工、使用了激光等的光微细加工、蚀刻加工、压花加工等，在预先成形的第1基板部10的一部分上形成微孔21。另外，可以通过例如射出成形、加压成形、立体光刻等，在成形第1基板部10的同时在该第1基板部10的一部分上形成微孔21。
微孔21可以以与目的相应的任意尺寸来形成。通过以较小的规定范围的尺寸形成微孔21，可以例如在数厘米见方的基部部件2上形成多个微小的微孔21。此时，可以在多个微孔21中培养数量有限的稀少的细胞。另外，还可以在各微孔21中形成适当尺寸的细胞组织体(细胞三维集合并相互结合而形成的细胞块)。
即，各微孔21中，在基部部件2的表面(在本实施方式中为第1基板部10的上表面11)开口的部分(以下称为“开口部24”)的面积例如可以为100～1×106μm2的范围，优选为7×103～5×105μm2的范围。具体而言，例如如图1～图4所示，当微孔21的开口部24为圆形时，其直径可以为10～1000μm的范围，优选为100～800μm的范围。
另外，各微孔21的底面22的面积例如可以为100～1×106μm2的范围，优选为7×103～5×105μm2的范围。具体而言，例如如图1～图4所示，当微孔21的底面22为圆形时，其直径可以为10～1000μm的范围，优选为100～800μm的范围。
当开口部24或底面22的面积在上述范围内时，可以在一个基部部件2上形成多个微孔21。因此，即使是稀少的细胞，也可以在相互分离的多个微孔21的各微孔中培养。另外，此时，可以在多个微孔21的各微孔中一个个地形成规定范围的均一尺寸的细胞组织体(例如球形的球形聚集体)。即，若细胞组织体比规定的尺寸大，则不能从周围的培养液向该细胞组织体的内部所含的细胞充分地提供氧或营养。这点，当各微孔的开口部24和底面22的面积为上述范围的上限值或小于上限值时，能够大量并切实地形成能使内部的细胞维持良好状态的适当尺寸的细胞组织体。与此相对，当开口部24或底面22的面积大于上述范围的上限值时，在各微孔21中形成的细胞组织体的尺寸有时变得过大。此时，还会在一个微孔21内形成多个细胞组织体。另一方面，当开口部24或底面22的面积小于上述范围的下限值时，则难以切实地将细胞保持在各微孔21内。此时，增殖的细胞还会堵塞微孔21。另外，细胞还会以将相邻的微孔21间连接的方式增殖。
各微孔21的深度(在本实施方式中为图2和图4所示的内壁23的高度)例如优选为2.5～2000μm的范围。当微孔21的深度大于上述范围的上限值时，有时无法从该微孔21外的培养液向保持于该微孔21的底面22的细胞或细胞组织体充分地提供氧或营养素。另一方面，当微孔21的深度小于上述范围的下限值时，保持于该微孔21内的细胞或细胞组织体有时会在培养的操作中脱离到该微孔21外。
另外，各微孔21的深度与该微孔21的开口部24或底面22的代表长度(当开口部24和底面22呈圆形或多边形地形成时，分别为该圆的直径或该多边形的对角线长度)的比率(以下称为“高径比”)优选为0.5～2.0的范围。具体而言，例如当开口部24和底面22为直径5μm的圆形时，优选使微孔21的深度为2.5μm～10μm。另外，例如当开口部24和底面22为直径1000μm的圆形时，优选使微孔21的深度为500μm～2000μm。当高径比大于上述范围的上限值时，有时无法从各微孔21外的培养液向保持于该微孔21的底面22的细胞或形成的细胞组织体充分地提供氧或营养素。另一方面，当高径比小于上述范围的下限值时，保持于微孔21内的细胞或细胞组织体有时会在培养的操作中脱离到该微孔21外。
另外，当各微孔21的开口部24的面积、底面22的面积、深度分别为上述范围的上限值或小于上限值时，各微孔21中能保持的溶液为微量。因此，例如当在将基部部件2整体暴露于气相中的状态下向各微孔21进行溶液的注入或回收等操作时，则在操作中该微孔21内的溶液蒸发，会对该溶液的组成或该溶液中的细胞产生不良影响。因此，此时，优选在使基部部件2中至少形成有微孔组20的表面部分(在本实施方式中为第1基板部10的上表面11中形成有孔组20的部分)的整体浸渍于溶液中的状态下进行操作。
微孔21的底面22的整体或一部分可以通过选择构成基板部10的材料或对该底面22进行表面修饰处理来形成细胞粘附性或非细胞粘附性。当在微孔21的底面22培养细胞时，内壁23优选为非细胞粘附性。这里，细胞粘附性的表面是指，例如在培养所使用的溶液中，细胞沉降到该表面上时，该细胞能从球形变为较扁平的形状进行粘附的表面。另一方面，非细胞粘附性的表面是指，例如在培养所使用的溶液中，当细胞沉降到该表面上时，该细胞几乎不改变球形的形状，并极弱地进行粘附的表面。此时，非细胞粘附性表面上的细胞几乎完全不与该表面粘附，以球形的状态在溶液中维持浮游状态，或在培养液流等的作用下容易从该表面脱离。
微孔21的底面22和内壁23例如可以直接为构成第1基板部10的材料的表面，或为对构成该第1基板部10的材料表面通过物理方法或化学方法固定细胞粘附性物质或非细胞粘附性物质而形成的表面。
作为细胞粘附性物质，只要是能与所使用的细胞的细胞膜中存在的蛋白质等细胞表面分子(例如整合素或糖链受体等)中特定的物质结合的物质，则没有特殊限制，均可使用。即，可以根据细胞的种类适当选择使用例如从生物体获得的蛋白质(胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白等)、显示细胞粘附性的特定的氨基酸序列(精氨酸·甘氨酸·天冬酰胺(所谓的RGD)序列等)或具有特定的糖链序列(半乳糖侧链等)的合成的细胞粘附性物质。
作为非细胞粘附性物质，只要是不与所使用的细胞的细胞膜中存在的蛋白质或糖链等细胞表面分子结合的物质，则没有特殊限制，均可使用。即，可以根据细胞的种类适当选择使用例如从生物体获得的蛋白质(白蛋白等)、在溶液中显示极高亲水性的高分子(聚乙二醇及其衍生物等)、MPC(2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱)、聚HEMA(聚甲基丙烯酸羟乙酯)或SPC(嵌段聚氨酯)等化合物。
这些细胞粘附性物质或非细胞粘附性物质例如通过在微孔21的底面和内壁23上使含有它们的水溶液干燥，或在该水溶液中使该物质具有的官能团与键合于该底面22和内壁23的官能团之间发生化学反应(例如羧基或氨基等之间的缩合反应等)而形成共价键，或在该水溶液中使该物质具有的巯基与在该底面22和内壁23上预先形成的金属(铂、金等)薄膜结合，即可在该底面22和内壁23上固定。
当微孔21的底面22的整体为非细胞粘附性时，可以在该微孔21内形成不与该底面22粘附的细胞组织体。另外，例如通过在微孔21的底面22的中央部分形成细胞粘附性的第1区域，将包围该第1区域的周边部分作为非细胞粘附性的第2区域，可以在该微孔21内形成与该底面22中的第1区域粘附的细胞组织体。这种微孔21内的细胞组织体的形成在微孔21的开口部24或底面22的面积为上述范围内的情况下，可以特别简便并切实地实现。另外，如此在各微孔21内形成细胞组织体时，优选使内壁23为非细胞粘附性。当然，通过使微孔21的底面22的整体为细胞粘附性，也能够使细胞与该底面22的整体二维地粘附来进行培养。
如图1～图4所示，在框部部件3上以与基部部件2上形成的一个微孔组20对应的贯穿孔的形式形成一个窗部40。即，在本实施方式中，框部部件3具有厚度一定的平板状地形成的第2基板部30，贯穿该第2基板部30的矩形孔形成为窗部40。该窗部40在第2基板部30中与基部部件2的微孔组20对应的位置上以能收纳该微孔组20整体的开口面积形成。
另外，框部部件3以能安装于基部部件2上并能从基部部件2上卸下的方式构成。即，该框部部件3能按照基部部件2的微孔组20配置在窗部40内的方式安装于该基部部件2和从该基部部件2上卸下，并且安装后能再次从该基部部件2上卸下。此外，该框部部件3按照可以多次反复地在基部部件2安装和从基部部件2上卸下的方式构成。
如图3和图4所示，在框部部件3安装于基部部件2的安装状态的器具1中，该框部部件3设置在该基部部件2的微孔组20的周围。更具体而言，在安装状态下，窗部40的内壁41设置在对应的一个微孔组20的周围。其结果是，在器具1中，形成与窗部40对应的能保持溶液的第2孔(以下称为“微孔50”)。
即，微孔50作为具有形成有一个微孔组20的底面51和窗部40的内壁41的有底的孔而形成。该微孔50的底面51是基部部件2中形成有一个微孔组20的表面部分(在本实施方式中为第1基板部10的上表面11中形成有微孔组20的部分)。而且，例如当在将安装状态的器具1置于气相中的状态下向微孔50内注入溶液时，该微孔50能将该溶液保持在由底面51和内壁41围成的内部而不会使该溶液漏到该微孔50外。
微孔50的底面51的面积例如可以为1～2500mm2的范围，优选可以为10～1000mm2的范围。另外，微孔50的深度(即包围底面51的窗部40的内壁41的高度)例如可以为50μm以上，优选可以为500μm以上，更优选可以为1000μm以上。当底面51的面积和微孔50的高度分别在上述范围内时，能够将溶液稳定地保持在微孔50内。
框部部件3可以使用根据目的选择的任意材料来形成。即，作为构成框部部件3的材料，例如可以从聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、聚酰胺、聚缩醛、聚酯(聚对苯二甲酸乙二醇酯等)、聚氨酯、聚砜、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯(PMMA等)、聚乙烯等合成树脂、PDMS等硅类树脂、EPDM等合成橡胶、天然橡胶、玻璃、陶瓷、不锈钢等金属材料中选择1种材料单独使用、或将2种以上的材料组合使用。
另外，当使用能与基部部件2中微孔组20的周围的表面部分密合的材料来形成框部部件3中至少窗部40的周围的表面部分时，无需在器具1上形成用于将该框部部件3安装于该基部部件2的特殊部分，即可构成能安装于该基部部件2的该框部部件3。此时，还可以简单并切实地在器具1的安装状态下形成能保持溶液的微孔50。这种密合性高的材料可以根据与构成基部部件2的材料的组合来适当选择。即，例如可以优选使用上述框部部件3的形成中所使用的材料中的PDMS等硅类树脂、合成橡胶、天然橡胶等具有伸缩性的树脂(弹性体树脂)。
具体而言，例如可以用透光性的合成树脂形成第1基板部10，而用硅类树脂形成第2基板部30的整体或第2基板部30的下方侧的平坦表面(以下称为“下表面31”)中包围窗部40的部分。此时，当基部部件2上安装框部部件3时，在将该框部部件3与基部部件2的位置相对以使微孔组20收纳于窗部40内的同时，通过将该框部部件3的下表面31与该基部部件2的上表面11压接，即可使该窗部40的内壁41与该微孔组20的周围的上表面11密合地设置。
窗部40可以采用根据目的选择的任意加工方法来形成。即，可以通过例如使用了加工中心等的穿孔加工、使用了激光等的光微细加工、蚀刻加工、压花加工等，在预先成形的第2基板部30的一部分上形成窗部40。另外，可以通过例如射出成形、加压成形、立体光刻等，在成形第2基板部30的同时在该第2基板部30的一部分上形成窗部40。
图5表示用于说明器具1的另一侧面的与图4所示相同的器具1的截面。如图5所示，微孔组20包含构成其边缘的、在最靠近框部部件3的位置处形成的微孔(以下称为“边缘孔21i”)和构成其中央部分的、在距离该框部部件3较远的位置处形成的微孔(以下称为“中央孔21ii”)。
如上所述，通过在微孔组20中培养能够相互结合的细胞，即可在这些边缘孔21i和中央孔21ii分别一个个地形成该细胞三维集合得到的细胞组织体。
此时，尽管边缘孔21i和中央孔21ii以相同的形状和尺寸形成，在该边缘孔21i中形成的细胞组织体(以下称为“边缘组织体”)的尺寸与在该中央孔21ii中形成的细胞组织体(以下称为“中央组织体”)的尺寸也会不同。即，例如边缘组织体的尺寸存在大于中央组织体的倾向。
关于这点，本发明的发明者通过潜心研究而独自发现：通过使边缘孔21i与框部3的距离D(在图5所示的例子中为边缘孔21i的框部部件3侧的端部与该框部部件3的内壁41之间的距离D)为规定的微小阈值以下，能够使边缘组织体的尺寸无限地接近中央组织体的尺寸。
即，该距离D优选为5.0mm以下，更优选为2.0mm以下，特别优选为1.0mm以下。通过使距离D为上述范围，能够使边缘组织体的尺寸与中央组织体的尺寸之比例如为1.25以下，还可以进一步为1.20以下。
当减少距离D时，边缘孔21i与框部部件3接近，因此在该边缘孔21i处进行细胞培养时的操作和观察的难度提高。但是，框部部件3能安装于基部部件2上并能从该基部部件2上卸下。因此，例如根据需要，可以将框部部件3从基部部件2上卸下，在该分离状态下进行操作和观察。
因此，使用具有能装卸的基部部件2和框部部件3的器具1，通过将该器具1中的上述距离D减少到微小的上述范围内，能够在边缘孔21i和中央孔21ii中分别一个个地形成、培养尺寸非常均一的细胞组织体。
另外，在基部部件2上还可以相互分离地形成多个微孔组20。此时，在框部部件3可以形成有至少一个分别与多个微孔组20中的一个对应的窗部40。图6～图9是此种情况下的器具1的一个例子的说明图。图6是分离状态的器具1的立体图。图7是用通过图6所示的VII-VII线的面切断后的分离状态的器具1的截面图。图8是安装状态的器具1的立体图。图9是用通过图8所示的IX-IX线的面切断后的安装状态的器具1的截面图。需要说明的是，关于下例中的器具1，对于与上述图1～图4所示的例子相同的部分使用相同的符号，对于重复的能够省略详细说明。
如图6～图9所示，在基部部件2上相互分离地形成4个微孔组20a～20d。各微孔组20a～20d包含能保持细胞的多个微孔21地构成。
另一方面，在框部部件3上形成分别与基部部件2的4个微孔组20a～20d中的一个对应的4个窗部40a～40d。即，4个窗部40a～40d分别在与4个微孔组20a～20d中互不相同的一个对应的位置上形成。其结果是，框部部件3具有将4个窗部40a～40d之间分隔的呈十字状地形成的分隔部32。
如图8和图9所示，在安装状态的器具1中，各窗部40a～40d(参照图6和图7)的内壁41a～41d分别设置在与4个微孔组20a～20d中对应的一个的周围。其结果是，在器具1上形成被框部部件3的分隔部32隔开的4个微孔50a～50d。在各个微孔50a～50d的底面51a～51d分别形成4个微孔组20a～20d中对应的一个微孔组。
框部部件3的下表面31中至少4个窗部40a～40d的各周边部分与基部部件2的上表面11中至少4个微孔组20的各周边部分相互密合。其结果是，4个微孔50a～50d以能够相互独立地保持溶液的方式形成。
在基部部件2和框部部件3种可以分别形成有能在对应的位置上相互结合的第1结合部和第2结合部。图10是表示在图6～图9所示例子的器具1种形成有第1结合部和第2结合部的情况的一个例子的分离状态的立体图。
在图10所示的器具1中，在第1基板部10的上表面11中包围4个微孔组20a～20d的整体的外周部分的一部分上，形成有以规定高度突出于该上表面11的凸形的4个第1结合部(以下称为“嵌合突起60”)。另一方面，在与第1基板部的4个嵌合突起60对应的位置上，形成规定深度的凹形的4个有底孔(以下称为“嵌合孔61”)，其为第2基板部30的下表面31中包围4个窗部40a～40d的整体的外周部分的一部分。
这些嵌合突起60和嵌合孔61以对应的形状形成并能够嵌合。通过使对应的基部部件2的嵌合突起60与框部部件3的嵌合孔61分别嵌合，能够将该框部部件3安装到该基部部件2上，从而构成如图8和图9所示那样的安装状态的器具1。此时，能够简便并切实地使基部部件2与框部部件3按预定的位置关系结合。
另外，当在基部部件2上相互分离地形成多个微孔组20时，还可以在该基部部件2的该多个微孔组20的各自的周围形成能与框部部件3的一部分结合的结合部。图11和图12是分别表示此种情况下的器具1的一个例子的分离状态和安装状态的立体图。
在图11和图12所示的器具1中，在第1基板部10的上表面11中、在4个微孔组20a～20d的各自的外周部分分别形成有4个嵌合突起60。另一方面，在框部部件3上形成有仅与基部部件2的4个微孔组20a～20d中的一个对应的一个窗部40。并且，在该框部部件3的下表面31中窗部40的周围部分，在与在基部部件2的各微孔组20a～20d的周围形成的4个嵌合突起60对应的位置上，以能与该4个嵌合突起60嵌合的形状形成有4个嵌合孔61。
如图12所示，在安装状态的器具1中，仅在4个微孔组20a～20d中的一个微孔组20b的周围设置一个窗部40的内壁41。其结果是，在基部部件2上形成一个微孔50。在该微孔50的底面51形成一个微孔组20b。
另外，在4个微孔组20a～20d的各自的外周，按同一配置分别形成有4个嵌合突起60，因此框部部件3与该4个微孔组20a～20d中的任一个均对应地构成。即，通过在4个微孔组20a～20d中任意一个的周围安装框部部件3，该4个微孔组20a～20d中的任一个即可形成形成于底面51的一个微孔50。
另外，例如在上述图10所示的形成有4个窗部40的框部部件3中，还可以在该4个窗部40的各自的周围分别形成4个与图11和图12所示的嵌合突起60对应的嵌合孔61。并且，通过使对应的基部部件2的嵌合突起60与框部部件3的嵌合孔61分别嵌合，能够将该框部部件3安装到该基部部件2上，从而构成如图8和图9所示那样的安装状态的器具1。此时，能够简便并切实地按预定的位置关系使基部部件2与框部部件3结合。
另外，图11和图12所示为在框部部件3形成有一个贯穿孔40的例子，但也可以在框部部件3上形成与多个微孔组20中的一部分对应的2个以上的贯穿孔40。即，例如可以在框部部件3上形成如图11和图12所示那样的4个微孔组20a～20d中2个微孔组20a、20b分别对应的2个贯穿孔40。此时，在安装状态的器具1中，可以仅在4个微孔组20a～20d的一部分即2个微孔组20a、20b的各自的周围设置窗部40的内壁41，形成2个微孔50。
图13是表示具有第1结合部和第2结合部的器具1的另一例子的分离状态的立体图。在图13所示的器具1中，在第1基板部10的上表面形成有包围4个微孔组20a～20d的整体的规定深度的槽状的第1结合部(以下称为“槽部62”)。另一方面，在第2基板部30的下表面31上与第1基板部10的槽部62对应地形成包围4个窗部40a～40d的整体的规定高度的堤状的第2结合部(以下称为“堤部63”)。上述槽部62和堤部63以对应的形状形成并能够嵌合。
通过使基部部件2的槽部62与框部部件3的堤部63嵌合，能够将该框部部件3安装到该基部部件2上，从而构成如图8和图9所示那样的安装状态的器具1。此时，能够简便并切实地按预定的位置关系使基部部件2与框部部件3结合。
当在基部部件2上相互分离地形成多个微孔组20时，还可以在该基部部件2的该多个微孔组20的各自的周围形成能与框部部件3的一部分结合的结合部。图14是表示此种情况下的器具1的一个例子的分离状态的立体图。
在图14所示的器具1中，第1基板部10的上表面11中形成有包围4个微孔组20a～20d的各自的外周的槽部62。另一方面，框部部件3形成有与基部部件2的4个微孔组20a～20d中的一个对应的一个窗部40。并且，该框部部件3以能与形成于基部部件2的4个微孔组20a～20d中的一个的周围的槽部62的一部分嵌合的形状形成。并且，在安装状态的器具1中，与图12所示的例子同样，仅在4个微孔组20a～20d中的一个的周围设置框部部件3的一个窗部40的内壁41，形成一个微孔50。
另外，在4个微孔组20a～20d的各自的外周，按同一配置分别形成槽部62，因此框部部件3与该4个微孔组20a～20d的任一个均对应地构成。即，通过在4个微孔组20a～20d中的任意一个的周围安装框部部件3，该4个微孔组20a～20d中任一个即可形成形成于底面51的一个微孔50。
例如，当在基部部件2形成图14所示的槽部62时，也可以使用上述如图13所示那样的形成了4个窗部40的框部部件3。此时，框部部件3的堤部63(参照图13)可以为与图14所示的基部部件2的槽部62对应地在该框部部件3的4个窗部40的各自的周围突出而形成的格子状。通过使这些基部部件2的槽部62与框部部件3的堤部63嵌合，能够将该框部部件3安装到该基部部件2上，从而构成如图8和图9所示那样的安装状态的器具1。此时，能够简便并切实地按预定的位置关系使基部部件2和框部部件3结合。
另外，器具1还可以具备将基部部件2和安装于该基部部件2的框部部件3一体保持的保持部件。此时，保持部件具有与基部部件2和框部部件3的各自的外周的至少一部分抵接并将该基部部件2和该框部部件3的相对位置固定的抵接部。图15～图17是此种情况下的一个例子的器具1的说明图。图15和图16是分别表示该例子的器具1的分离状态和安装状态的立体图。图17是用通过图16所示的XVII-XVII线的面切断后的安装状态的器具1的截面图。
如图15～图17所示，该器具1具备基部部件2、框部部件3和保持部件4。保持部件4具有厚度一定的平板状地形成的第3基板部70。在该第3基板部70的上方侧的平坦表面形成有用于收纳基部部件2和框部部件3的矩形的有底孔(以下称为“收纳部71”)。该收纳部71具有矩形的平坦底面72和设置在该底面72的周围的规定高度的内壁73。
在图16和图17所示的安装状态的器具1中，基部部件2置于收纳部71的底面72上。此外，框部部件3以安装于基部部件2的状态被收纳于收纳部71。即，基部部件2和框部部件3以层叠的状态嵌入保持部件4的收纳部71。因此，基部部件2的外周22和安装于该基部部件2的框部部件3的外周33与收纳部71的内壁73抵接。其结果是，在器具1种能够简便并切实地按预定的位置关系保持基部部件2和框部部件3。
另外，如图15～图17所示，在该例子的框部部件3的一部分上形成有向上方突出的凸形的捏手部30a。因此，操作者通过例如用镊子夹捏手部30a，能够简单地将框部部件3安装于基部部件2上和从基部部件2上卸下。该捏手部30a可以在框部部件3成形时一体形成，也可以在预先形成的框部部件3上另外形成。另外，这种凸形的捏手部30可以在包括上述或后述例子中的框部部件3在内的本发明的任意框部部件3上以任意的形状来形成。
接着，对本实施方式的细胞培养方法(以下称为“本方法”)进行说明。在本方法中，在器具1的微孔组20种培养细胞。这里，作为细胞，无论作为来源的动物种或脏器·组织的种类等，可以使用符合目的的任意细胞。具体而言，作为所述细胞，可以使用例如来自人或人以外的动物(猴、猪、狗、大鼠、小鼠等)的任意的脏器或组织(肝脏、胰脏、肾脏、神经、皮肤等)的原代细胞(包括干细胞或ES细胞(Embryonic Stem cell：胚胎干细胞))、建立的细胞系、或对它们实施了基因操作等后得到的细胞。另外，作为细胞，可以单独使用1种细胞，也可以将2种以上的细胞按任意比率混合后使用。另外，当形成细胞组织体时，可以优选使用能在细胞之间相互形成结合的细胞。
另外，作为细胞培养中使用的溶液，可以使用以适当浓度含有需要的盐类和营养成分等能够维持所使用的细胞的生存状态和功能等的任意水溶液。具体而言，作为该溶液，可以使用例如在DMEM(Dulbecco’s ModifiedEagle’s Medium)等基础培养基中添加了抗生素等后得到的培养液或所谓的生理盐水等。
图18是表示本方法中包含的主要工序的流程图。如图18所示，本方法包含向器具1的微孔组20种接种细胞的接种工序S100、在该微孔组20中培养细胞的培养工序S200和对在该孔组20中培养的细胞实施规定的处理的处理工序S300。
在接种工序S100中，例如在图3和图4所示的框部部件3安装于基部部件2的安装状态下，通过向器具1的微孔50中注入含有细胞的溶液，即可在与该微孔50对应的一个微孔组20中接种细胞。具体而言，此时，例如首先将安装状态的器具1在超净工作台等无菌培养操作空间内并置于气相(空气)中。然后，操作者使用移液管将分散有细胞的培养液注入到器具1的微孔50内。其结果是，可以在形成于微孔50的底面51上的多个微孔21分别接种细胞。在上述接种工序S100中，可以将接种所需的细胞和溶液的量减少到与微孔50的容积相应的量，并且能向各微孔21中切实地接种细胞。
另外，例如当如图8和图9所示那样在器具1形成多个微孔50a～50d时，可以向该多个微孔50a～50d分别在互不相同的条件下接种细胞。即，例如可以在各微孔50a～50d接种种类互不相同的细胞，可以按互不相同的密度接种细胞，或者可以使用互不相同的培养液来接种细胞。
在培养工序S200中，例如当在接种工序S100中向安装状态的器具1中接种了细胞时，可以从基部部件2上卸下框部部件3，在分离状态的器具1的微孔组20中培养所述细胞。即，例如仅将卸下了框部部件3的基部部件2(分离状态的器具1)置于规定的培养容器(例如细胞培养中常用的直径数cm的塑料培养皿)内，并在将其整体浸渍到培养液中的状态下培养细胞。
另外，在培养工序S200中，也可以不将框部部件3从基部部件2上卸下，而在安装状态的器具1中进行细胞的培养。此时，器具1也被置于规定的培养容器内。并且，在其整体浸渍到培养液中的器具1的微孔组20中培养细胞。
图19是表示将分离状态的器具1(卸下了框部部件3后的基部部件2)的整体浸渍到培养液M中进行培养的情况的一个例子的说明图。图20是表示将安装状态的器具1的整体浸渍到培养液M中进行培养的情况的一个例子的说明图。
如图19和图20所示，在使用了器具1的细胞的培养中，可以使用能收纳该器具1整体的培养容器5。该培养容器5具有能收纳器具1的培养部5a。并且，在将器具1置于该培养部5a内的底面5b上的同时，在该培养部5a中充满培养液M。其结果是，器具1以沉降于培养液M中的状态被保持在培养容器5的底面5b上。可以在收纳于该培养容器5的器具1的各微孔21内培养细胞。另外，作为该培养容器5，例如可以使用细胞培养中常用的塑料培养皿。
另外，在安装状态的器具1中，例如利用显微镜等光学装置观察各微孔21中保持的细胞时，有时光因框部部件3而散射，不利于观察。因此，在培养工序S200中，例如用显微镜观察微孔21内的细胞时，优选将框部部件3从基材部件2上卸下使器具1处于分离状态。并且，可以在观察后，再将框部部件3安装到基部部件2上，继续细胞的培养。如上所述，在器具1中，由于框部部件3为能安装于基部部件2并且能从该基部部件2上卸下的结构，因此可以根据需要在任意时机任意次数地切换安装状态和分离状态。
在处理工序S300中，例如可以通过向培养有细胞的安装状态的器具1中的微孔50中注入规定的溶液，从而使与该微孔50对应的一个微孔组20的细胞与该规定的溶液接触。具体而言，此时，例如首先将在微孔组20中培养有细胞的安装状态的器具1在超净工作台等无菌培养操作空间内置于气相(空气)中。然后，操作者利用移液管将微孔50内的培养液回收并除去后，在该微孔50内重新注入规定的溶液。其结果是，使该溶液与保持在形成于微孔50的底面51的多个微孔21的各微孔中的细胞接触。在这种处理工序S300中，可以将处理所需的溶液的量减少到与微孔50的容积对应的量，并且可以切实地使该溶液与各微孔21的细胞接触。
另外，例如如图8和图9所示，当在器具1形成多个微孔50a～50d时，可以向安装状态的器具1中的所述多个微孔50a～50d分别注入互不相同的溶液。此时，可以使与多个微孔50a～50d对应的多个微孔组20a～20d的细胞与互不相同的溶液接触。即，可以在各微孔50a～50d中使细胞与互不相同的溶液接触。具体而言，例如向4个微孔50a～50d的各微孔中分别注入含有4种试剂中的互不相同的1种试剂的溶液，即可在各所述微孔50a～50d中使种类互不相同的试剂与细胞接触。
如此，通过使用具备形成有多个微孔组20的基部部件2和形成有多个窗部40的框部部件3的器具1，例如即使在可培养的细胞的数量非常少的情况下、或者对细胞的处理中所使用的溶液的量或溶解于该溶液中的试剂的量非常少的情况下，也能在各种条件下简便并切实地进行所述细胞的培养操作。
另外，例如，在培养工序S200中，当在各微孔21内形成了细胞组织体时，可以在处理工序S300中对所述细胞组织体实施规定的处理。即，当使各微孔21的底面22整体为非细胞粘附性，并在该各微孔21内形成了细胞组织体时，在多个微孔21内，该细胞组织体以浮游状态被保持。因此，在处理工序S300中，可以一次性简便并切实地从多个微孔21中回收多个细胞组织体。
此时，当如图8和图9所示那样在器具1的多个微孔50a～50d中分别形成了细胞组织体时，在安装状态的器具1中，可以仅从该多个微孔50a～50d的一部分、例如一个微孔50a中选择性地回收细胞组织体。
另外，例如当在各微孔21的底面22的中央部分形成细胞粘附性的第1区域，并使包围该第1区域的周边部分形成为非细胞粘附性的第2区域时，可以在该微孔21内形成与所述底面22中的第1区域粘附的细胞组织体。此时，可以在处理工序S300中对粘附于各底面22的状态的各细胞组织体实施规定的处理例如使其与规定的溶液接触等。
此时，当如图8和图9所示那样在器具1的多个微孔50a～50d的每个中形成了细胞组织体时，在安装状态的器具1中，可以在所述多个微孔50a～50d的每个中，使粘附于底面22的细胞组织体与互不相同的溶液接触。
图21和图22是器具1的另一例子的说明图。图21是器具1的立体图，图22是用通过图21所示的XXII-XXII线的面切断后的器具1的截面图。
图21和图22所示例子中的器具1具备相当于上述例子中的基部部件2的基部80a～80d和相当于上述例子中的框部部件3的框部81a～81d。这些基部80a～80d和框部81a～81d形成一体，不能相互装卸。并且，利用对应的基部80a～80d和框部81a～81d，形成能保持溶液的微孔50a～50d。
更具体而言，基部80a～80d相当于图6～图9所示例子中的微孔50a～50d的底部51a～51d，框部81a～81d相当于所述图6～图9所示例子中的窗部40a～40d的内壁41a～41d。在各基部80a～80d分别形成微孔组20a～20d，各框部81a～81d设置在该微孔组20a～20d的周围。该器具1具有将4个微孔50a～50d之间隔开的呈十字状地形成的分隔部82。
在具有形成一体的基部80和框部81的器具1中，也可以通过形成微孔50，与上述例子同样地简便并切实地对各微孔组20进行所期望的细胞培养操作，而无需使微小的微孔21干透。另外，也可以对多个微孔组20a～20d进行互不相同的处理。
作为构成基部80a～80d和框部81a～81d为一体的器具1的材料，可以使用与上述基部部件2和框部部件3所使用的材料相同的材料。即，例如可以从聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、聚酰胺、聚缩醛、聚酯(聚对苯二甲酸乙二醇酯等)、聚氨酯、聚砜、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯(PMMA等)、聚乙烯等合成树脂、PDMS等硅类树脂、EPDM等合成橡胶、天然橡胶、玻璃、陶瓷、不锈钢等金属材料中选择1种材料单独使用、或将2种以上的材料组合使用。
另外，作为构成器具1的材料、特别是构成形成有微孔组20的部分的材料，例如从利用显微镜等光学装置观察在所述微孔组20内培养的细胞时的便利性的角度出发，可以优选使用上述材料中的透光性材料。即，在本实施方式中，器具1的例如整体或一部分可以使用透光性的合成树脂或玻璃来形成。
另外，在形成微孔21时，可以采用根据目的选择的任意加工方法。即，可以通过例如使用了加工中心等的穿孔加工、使用了激光等的光微细加工、蚀刻加工、压花加工等，在预先成形的器具1的基部80a～80d的一部分上形成微孔21。此时，例如也可以通过在由聚苯乙烯等透光性树脂成形得到的市售塑料培养皿的底面使用上述加工方法形成微孔21，从而制造器具1。另外，可以通过例如射出成形、加压成形、立体光刻等，在成形基部80a～80d和框部81a～81d为一体的器具1的同时，在该基部80a～80d的一部分上形成微孔21。
如上所述，本发明的器具1尤其可以进行使用了稀少细胞和稀少试剂的简便并切实的细胞培养操作。因此，器具1可期待作为极其有用的工具应用于利用了培养细胞的新药研发、再生医疗、基础研究等各种产业用途中。
下面，对使用了器具1的本方法的具体实施例进行说明。
[实施例1]
使用图1～图4所示的器具1，比较在接种工序S100中在安装状态的器具1中接种细胞时和在分离状态的器具1中接种细胞时在微孔组20中能保持细胞的效率。即，在PMMA制的平板(24mm×24mm、厚400μm)的表面中的10mm×10mm的矩形范围内，通过使用了加工中心(桌上型NC微细加工机、株式会社PMT制)的穿孔加工处理，形成1020个直径为300μm、深度为200μm的圆形微孔21。该多个微孔21相互按其开口部24和底面22的圆的中心间距离为330μm的方式规则地配置。接着，通过实施使用了溅射装置(E-1030、日立株式会社制)的溅射处理，在其表面形成铂(Pt)的薄膜(厚6nm)。
如此操作，制作图1～图4所示的基部部件2。即，在该基部部件2的上表面11中的10mm×10mm的矩形范围内，形成一个包含1020个开口部24和底面22为直径300μm的圆形且深度为200μm的微孔21的微孔组20。
然后，在各微孔21内注入含有5mM浓度的非细胞粘附性物质即具有分子量为30000的聚乙二醇(PEG)链的非细胞粘附性的合成高分子(化学式：CH3(CH2CH2)nSH、日油株式会社制)的乙醇溶液，在氮气氛下使该非细胞粘附性高分子所具有的巯基与该各微孔21的底面22的铂表面之间形成化学键，从而在该底面22上固定该非细胞粘附性高分子。然后，利用乙醇溶液充分洗涤第1基板部10的整体，除去剩余的非细胞粘附性高分子，并将该第1基板部10在乙醇中浸渍约10分钟，然后对该第1基板10照射约30分钟紫外线，从而进行灭菌处理。如此使形成的各微孔21的底面22的整体为非细胞粘附性。
另一方面，在PDMS制的平板(20mm×20mm、厚2.2mm)上形成窗部40作为能收纳第1基板部10的微孔组20的矩形贯穿孔(10mm×10mm)，制作如图1～图4所示那样的框部部件30。即，首先，在直径在90mm的塑料培养皿内流入13mL由PDMS的预聚物和固化剂按10∶1的体积比率混合得到的PDMS溶液(Sylgard184、Daw Corning公司制)，在室温下放置2天，使其固化。然后，将固化的PDMS圆板从培养皿中取下，使用手术刀切出上述形状的PDMS制框部部件3。该框部部件3由于整体由PDMS形成，因此在通过在基部部件2的上表面11上按压该框部部件3的下表面31而构成的安装状态的器具1中，能容易并切实地使该下表面31与该上表面11密合。其结果是，可以构成图3和图4所示的形成有一个能保持溶液的微孔50的器具1。
在第1条件中，如图20所示，将安装状态的器具1置于直径为35mm的塑料培养皿(培养容器5)内，向该器具1中的微孔50(10mm×10mm×2.2mm)内，注入0.25mL通过在培养液(添加有10％的胎牛血清的Williams medium E培养基)中以4×105个/mL的密度分散有HepG2细胞(理化学研究所·生物资源中心)得到的细胞分散液。即，在一个微孔50内接种1×105个HepG2细胞。接种后，经过2小时后，通过移液管操作，将在微孔50内的微孔组20中保持的细胞回收，对该回收得到的细胞中含有的脱氧核糖核酸(DNA)进行定量。该DNA的定量通过采用DAPI(4’，6-二脒基-2-苯基吲哚)的方法来进行。根据该DNA的定量结果，算出实际在保持于微孔21内的细胞的数量相对于接种所用的细胞的总数的比例，作为细胞固定化率(％)。
另一方面，在第2条件中，如图19所示，将分离状态的器具1(即仅有基部部件2)置于直径为35mm的塑料培养皿(培养容器5)内，向该塑料培养皿内，注入2mL通过在上述培养液中以4×105个/mL的密度分散有HepG2细胞得到的细胞分散液。即，在塑料培养皿内接种8×105个HepG2细胞。另外，此时，基部部件2的整体在培养容器5内浸渍于培养液中。与上述第1条件同样，在接种后经过2小时后，将在微孔组20中保持的细胞回收，进行DNA的定量，算出细胞固定化率(％)。
其结果是，在上述第2条件下得到的细胞固定化率为约15％，而在上述第1条件下得到的细胞固定化率为约100％。即证实：通过在将框部部件3安装于基部部件2的安装状态下进行细胞的接种，能够简便并切实地在微孔组20中保持细胞。
[实施例2]
使用与上述实施例1同样制作的器具1，比较在接种工序S100中在安装状态的器具1中接种细胞时和在分离状态的器具1中接种细胞时在多个微孔21中分别保持的细胞的数量的偏差。
即，在第1条件中，如图20所示，将安装状态的器具1置于直径为35mm的塑料培养皿内，向该器具1中的微孔50(10mm×10mm×2.2mm)内，注入0.25mL通过在培养液(添加有10％的胎牛血清的Williams mediumE培养基)中以4×105个/mL的密度分散有HepG2细胞得到的细胞分散液。接种后，经过2小时后，在相差显微镜下计算在器具1的中央附近形成的60个微孔21的各底面22上沉降的细胞的数量。
另一方面，在第2条件中，如图19所示，将分离状态的器具1(即仅有基部部件2)置于直径为35mm的塑料培养皿内，向该塑料培养皿内，注入2mL通过在上述培养液中以4×105个/mL的密度分散有HepG2细胞得到的细胞分散液。在接种后经过2小时后，在相差显微镜下计算在与上述第1条件相同的位置上形成的60个微孔21的各底面22上沉降的细胞的数量。
其结果是，关于在一个微孔21中保持的细胞的数量，在第1条件下为68.2±13.4(算术平均±标准偏差)个，第2条件下为66.9±16.9(算术平均±标准偏差)个。即证实：通过在将框部部件3安装于基部部件2的安装状态下进行细胞的接种，存在能减少在各微孔21中保持的细胞的数量的偏差的倾向。
[实施例3]
使用与上述实施例1同样制作的器具1，在各微孔21内形成细胞组织体。比较在培养工序S200中显微镜观察在安装状态的器具1中保持的所述细胞组织体时和显微镜观察在分离状态的器具1中保持的细胞组织体时的观察的清晰度。
即，在器具1的各微孔21内接种HepG2细胞，培养10天，在该各微孔21内形成一个个由该HepG2细胞三维集合得到的球状的细胞组织体(HepG2球形聚集体)。需要说明的是，作为培养液，使用添加有10％的胎牛血清的Williams medium E培养基，关于HepG2细胞，在各微孔50中接种2×105个HepG2细胞。然后，在相差显微镜下观察在安装状态或分离状态的器具1的各微孔21内培养第10天时的HepG2球形聚集体。
图23所示为在安装状态的器具1中在接近框部部件3的微孔组20的端部的微孔21内形成的HepG2球形聚集体T1的相差显微镜照片。而图24所示为在分离状态的器具1中与图23同样地在微孔组20的端部的微孔21内形成的HepG2球形聚集体T2的相差显微镜照片。如图23所示，在安装状态的器具1中，微孔组20中接近框部部件3的微孔21内的HepG2球形聚集体T1的一部分无法清楚地观察。与此相对，如图24所示，在分离状态的器具1中，微孔组20在整个区域的各微孔21内的HepG2球形聚集体T2均能清楚地观察。即，当在显微镜下观察器具1的各微孔21内的细胞或细胞组织体时，优选将框部部件3从基部部件2上卸下而形成的分离状态。
[实施例4]
采用与上述实施例1相同的方法，制作各微孔21的底面22为非细胞粘附性的2种器具1(以下称为“第1器具”、“第2器具”)。在第1器具1中，在上表面11中的10mm×10mm的矩形范围内，形成一个包含572个开口部24和底面22为直径300μm的圆形、深度为200μm、中心间距离为440μm的规则配置的微孔21的微孔组20。另外，在第2器具1中，在上表面11中的10mm×10mm的矩形范围内，形成一个包含572个开口部24和底面22为直径400μm的圆形、深度为260μm、中心间距离为440μm的规则配置的微孔21的微孔组20。然后，在第1器具1的各微孔21内和第2器具1的各微孔21内形成细胞组织体。
即，如图20所示，将安装状态的第1器具1置于直径为35mm的塑料培养皿(培养容器5)内。然后，通过在第1器具1中的微孔50内注入分散有小鼠ES细胞(大日本住友制药)的细胞分散液，在各微孔21内接种该小鼠ES细胞。然后，在该培养容器5内加入2.0mL培养液，在将安装状态的第1器具1整体浸渍所述该培养液中的状态下培养5天。其结果是，在各微孔21内形成一个个由小鼠ES细胞三维集合得到的球状的细胞组织体(胚状体)。作为培养液，使用含有15％胎牛血清、1％核苷、1％非必需氨基酸、1％2-巯基乙醇、1％谷氨酸的DMEM培养基，在第1器具1的一个微孔50内接种1×105个小鼠ES细胞。另一方面，同样地向置于培养容器5内的第2器具1的各微孔21内接种小鼠神经干细胞(由大阪医疗中心提供)。然后，通过培养5天，在各微孔21内形成一个个由小鼠神经干细胞三维集合得到的球状的细胞组织体(神经球)。作为培养液，使用含有1％N-2supplement、20ng/mL重组人表皮生长因子(EGF)、20ng/mL重组人成纤维细胞生长因子(bFGF)的DMEM/F12培养基，在第2器具1的一个微孔50内接种1×105个小鼠神经干细胞。
作为对照组，在直径35mm的塑料培养皿(组织培养皿、日本Becton·Dickinson株式会社制)的整个底面，固定与上述第1器具1和第2器具2的各微孔21的底面22上固定的非细胞粘附性高分子相同的物质，在该培养皿内将小鼠ES细胞或小鼠神经干细胞培养5天。另外，关于小鼠ES细胞，作为培养液，使用含有15％胎牛血清、1％核苷、1％非必需氨基酸、1％2-巯基乙醇、1％谷氨酸的DMEM培养基，在每个培养皿中接种4×105个细胞，关于小鼠神经干细胞，作为培养液，使用含有1％N-2supplement、20ng/mL重组人表皮生长因子、20ng/mL重组人成纤维细胞生长因子的DMEM/F12培养基，在每个培养皿内接种1×105个细胞。
在相差显微镜下观察在器具1的各微孔21内或对照的培养皿内培养第5天时形成的细胞组织体，并以100个胚状体或神经球为对象，测定其尺寸的分布。
其结果如图25所示，在接种了小鼠ES细胞的器具1的各微孔21内，形成一个个球状的胚状体T3。另外，如图26所示，在接种了小鼠神经干细胞的器具1的各微孔21内，形成一个个球状的神经球T4。这些胚状体和神经球在各微孔21内不会粘附于底面22，而是以浮游状态被保持。
图27所示为在器具1的各微孔21内或对照的培养皿内培养第5天时形成的胚状体的直径的分布。图28所示为在器具1的各微孔21内或对照的培养皿内培养第5天时形成的胚状体的直径的分布。在图27和图28中，横坐标表示细胞组织体的直径(μm)，纵坐标表示各直径的细胞组织体的数量(个)。另外，黑圆点表示在器具1的微孔组20中形成的细胞组织体的测定值，白方块表示在对照的培养皿中形成的细胞组织体的测定值。如图27和图28所示，在对照的培养皿中形成各种直径的细胞组织体，而在器具1的微孔组20中形成直径均一的细胞组织体。即，通过在第1器具1的微孔组20中培养小鼠ES细胞，能在各微孔21内一个个地形成不与底面22粘附的直径为140μm～240μm的范围内的胚状体。另外，通过在第2器具1的微孔组20中培养小鼠神经干细胞，能够在各微孔21内一个个地形成不与底面22粘附的直径为120μm～200μm的范围内的神经球。
[实施例5]
首先，在PMMA制的平板(24mm×24mm、厚200μm)的表面中的10mm×10mm的矩形范围内，通过使用了加工中心(桌上型NC微细加工机、株式会社PMT制)的穿孔加工处理，形成672个直径为300μm的圆形贯穿孔。该圆形贯穿孔相互按其中心间距离为400μm的方式规则地配置。接着，在设有该圆形贯穿孔的PMMA平板的一侧的表面，通过热压接处理(106℃、2小时)粘贴未设有贯穿孔的另行形成的PMMA制平板(24mm×24mm、厚200μm)。
如此操作，制作图1～图4所示的基部部件2。即，在该基部部件2的上表面11中的10mm×10mm的矩形范围内，形成一个包含672个开口部24和底面22为直径300μm的圆形、深度为200μm、中心间距离为400μm的规则配置的微孔21的微孔组20。然后，通过实施使用溅射装置(E-1030、日立株式会社制)的溅射处理，在各微孔21的底面22上形成铂(Pt)的薄膜(厚6nm)。
另一方面，通过模塑成形，进一步在直径为200μm、长度为200μm、中心间距离为400μm的多个圆筒状突起的各顶端上制作形成有直径为100μm、长度为70μm的圆筒状突起的PDMS制印模。通过使用该印模的微接触印刷，在各微孔21的底面22上形成细胞粘附性第1区域。即，在含有细胞粘附性的蛋白质即胶原蛋白(Cellmatrix Type I-C、新田明胶公司制)的水溶液中，浸渍印模的各圆筒状突起的顶端。通过一边在相差显微镜下观察，一边使各圆筒状突起的位置与上述蒸镀了铂的各微孔21的底面22的中央附近的位置对准，在该底面22的中央附近涂布在该各圆筒状突起的顶端涂布的胶原蛋白。如此操作，在直径为300μm的各微孔21的底面22的中央附近形成一个细胞粘附性的直径为约100μm的第1区域。
然后，使底面22中的除第1区域以外的部分为非细胞粘附性。即，在形成第1区域后的各微孔21内注入含有5mM浓度的非细胞粘附性物质即具有分子量为5000或分子量为10000的PEG链的非细胞粘附性的合成高分子(化学式：CH3(CH2CH2)nSH、日油株式会社制)的乙醇溶液。然后，通过在氮气氛下放置规定时间，在各微孔21的底面22中的第1区域的周边部分固定非细胞粘附性高分子。
在具有如此形成的由细胞粘附性的第1区域和非细胞粘附性的第2区域构成的底面22的各微孔21内，接种原代大鼠肝细胞或小鼠ES细胞(大日本住友制药)。通过培养5天，在各微孔21内一个个地形成由原代大鼠肝细胞三维集合得到的球状的细胞组织体(肝细胞球形聚集体)或球状的胚状体。另外，原代大鼠肝细胞使用在各微孔21的第2区域固定了具有分子量为5000的PEG链的非细胞粘附性高分子的器具1来培养。小鼠ES细胞使用在各微孔21的第2区域固定了具有分子量为10000的PEG链的非细胞粘附性高分子的器具1来培养。关于原代大鼠肝细胞，作为培养液，使用添加了60mg/L的脯氨酸、50μg/L的EGF、10mg/L的胰岛素、7.5mg/L的氢化可的松、0.1μM的硫酸铜五水合物、3μg/L的硒酸、50pM的硫酸锌七水合物、50μg/L的亚油酸、58.8mg/L的青霉素、100mg/L的链霉素、1.05g/L的碳酸氢钠、1.19g/L的HEPES的DMEM无血清培养基，按1.7×105个/cm2的密度在形成于器具1的一个微孔50内接种。另一方面，关于小鼠ES细胞，作为培养液，使用含有15％胎牛血清、1％核苷、1％非必需氨基酸、1％2-巯基乙醇、1％谷氨酸的DMEM培养基，按1×105个/cm2的密度在形成于器具1的一个微孔50内接种。
另外，作为原代大鼠肝细胞的对照组，在适合肝细胞的球形聚集体形成的直径为35mm的塑料培养皿(Primaria、日本Becton·Dickinson株式会社制)内将原代大鼠肝细胞培养5天。另外，作为小鼠ES细胞的对照组，在直径为35mm的塑料培养皿(组织培养皿、日本Becton·Dickinson株式会社制)的整个底面，固定与微孔21的底面22上固定的非细胞粘附性高分子相同的物质，在该培养皿内将小鼠ES细胞培养5天。
在相位差显微镜下观察在器具1的各微孔21内或对照的培养皿内培养第5天时形成的细胞组织体，并以100个肝细胞球形聚集体或胚状体为对象，测定其尺寸的分布。
其结果如图29所示，在接种了原代大鼠肝细胞的器具1的各微孔21内，形成一个个球状的肝细胞球形聚集体T5。另外，如图30所示，在接种了小鼠ES细胞的器具1的各微孔21内，形成一个个球状的胚状体T6。这些肝细胞球形聚集体和胚状体在各微孔21内以与底面22中的第1区域粘附的状态被保持。
图31所示为在器具1的各微孔21内或对照的培养皿内培养第5天时形成的肝细胞球形聚集体的直径的分布。图32所示为在器具1的各微孔21内或对照的培养皿内培养第5天时形成的胚状体的直径的分布。在图31和图32中，横坐标表示细胞组织体的直径(μm)，纵坐标表示各直径的细胞组织体的数量(个)。另外，黑圆点表示在器具1的微孔组20中形成的细胞组织体的测定值，白方块表示在对照的培养皿中形成的细胞组织体的测定值。如图31和图32所示，在对照的培养皿中形成了各种直径的细胞组织体，而在器具1的微孔组20中形成了直径均一的细胞组织体。即，通过在器具1的微孔组20中培养原代大鼠肝细胞，能够在各微孔21内一个个地形成与底面22的中央附近粘附的直径为120μm～200μm的范围内的肝细胞球形聚集体。另外，通过在器具1的微孔组20中培养小鼠ES细胞，能在各微孔21内一个个地形成与底面22的中央附近粘附的直径为120μm～200μm的范围内的胚状体。
[实施例6]
制作形成了图6～图9所示的4个微孔50a～50d的器具1，确认能在该4个微孔50a～50d中分别相互独立地保持溶液。即，采用与上述实施例1相同的方法，在PMMA制平板(24mm×24mm、厚700μm)的表面中的相互分离的4个矩形范围(6mm×6mm)分别形成378个中心间距离为330μm的直径为300μm、深度为200μm的圆形微孔21，制作形成了图6～图9所示的4个微孔组20a～20d的基部部件2。
另一方面，通过在PDMS制平板(24mm×24mm、厚3mm)上形成能收纳第1基板部10的4个微孔组20a～20d中的互不相同的一个微孔组的矩形的贯穿孔(7mm×7mm)，制作形成了如图6～图9所示那样的4个窗部40a～40d的框部部件30。
图33所示为如此制作的形成了4个微孔组20a～20d的基部部件2和形成了4个窗部40a～40d的框部部件3分离的状态的器具1的照片。图34所示为框部部件3安装于该基部部件2上而形成有4个微孔50a～50d的安装状态的器具1的照片。图35所示为在该安装状态的器具1的4个微孔50a～50d中分别保持互不相同的溶液时的照片。即，在图35所示的器具1中，在第1微孔50a中保持用于判断细胞存活还是死亡而使用的深蓝色的台盼蓝溶液S1，在第2微孔50b中保持无色透明的缓冲液S2，在第3微孔50c和第4微孔50d中保持为了判断pH而添加了红色色素酚红的红色培养基S3。如图35所示，确认能在器具1的4个微孔50a～50d中分别相互独立地保持溶液。
[实施例7]
使用与上述实施例1同样制作的器具1，讨论图5所示的边缘孔21i与框部部件3的距离D和在该边缘孔21i及中央孔21ii中形成的细胞组织体的尺寸之间的关系。
即，制造具备由PMMA制平板(24mm×24mm、厚400μm)成形得到的基部部件2和由PDMS平板(20mm×20mm、厚1.1mm)成形得到的框部部件3且上述距离D互不相同的5种器具1。
具体而言，制造在上表面11中的10mm×10mm的矩形范围内规则地配置了900个直径为300μm、深度为300μm的圆形微孔21。即，在该基部部件2上按一定的间隔并排配置30列由以一定间隔串联配置的30个微孔21所形成的列。使各微孔21的底面22为非细胞粘附性。
另一方面，制造形成有尺寸互不相同的矩形窗部40的5种框部部件3以使得在安装于基部部件2时距离D为0μm、300μm、600μm、1000μm或2000μm中的任一距离。通过将这5种框部部件3中的任一种与基部部件2组合，制造具有一个微孔50、且距离D互不相同的5种器具1。
接着，将各器具1置于直径为35mm的塑料培养皿(组织培养皿、日本Becton·Dickinson株式会社制)内。在各器具1的微孔50内分别接种2×105个分散于培养液中的HepG2细胞。将该培养液在微孔50内放置2小时来培养细胞，使该细胞沉降于该微孔50的底面51上。然后，在塑料培养皿中加入2mL培养液，将器具1的整体浸渍到培养液内。在浸渍于培养液中的器具1的微孔50内培养细胞14天。另外，还准备了仅由不安装框部部件3的基部部件2构成的分离状态的器具1。并按微孔组20的单位面积的细胞密度与上述安装状态的器具1相等的方式接种HepG2细胞，同样地进行培养。其结果是，能在各器具1的各微孔21内一个个地形成由HepG2细胞三维集合得到的球状的细胞组织体(HepG2球形聚集体)。
对于各器具1，通过采用相位差显微镜进行观察，分别测定微孔组20的边缘的列中所包含的边缘孔21i中的50个边缘孔中分别形成的边缘组织体Ti的直径、距离边缘为第11～第20列中所含的中央孔21ii中的50个中央孔中分别形成的中央组织体Tii的直径。然后，算出边缘组织体Ti的直径的算术平均值与中央组织体Tii的直径的算术平均值的比率，作为“直径比”。
图36是在6种器具1中形成的细胞组织体的相位差显微镜照片。图36(A)是距离D为0μm的器具1的照片，图36(B)是距离D为300μm的器具1的照片，图36(C)是距离D为600μm的器具1的照片，图36(D)是距离D为1000μm的器具1的照片，图36(E)是距离D为2000μm的器具1的照片，图36(F)是没有框部部件3的器具1的照片。图36(F)的下方所示的比例尺的长度为500μm。
如图36所示，在各器具1的微孔50的底面51中，在与框部部件3邻接的边缘孔21i内一个个地形成球状的边缘组织体Ti，在更靠近内侧的中央孔21ii内一个个地形成球状的中央组织体Tii。边缘组织体Ti和中央组织体Tii均在边缘孔21i和中央孔21ii内不与底面22和内壁23粘附而在培养液中浮游地被保持。另外，在该实施例7中，在使器具1的整体充分浸渍到培养液中的同时，在操作条件上下功夫例如适当调节显微镜观察时的光强度等，能得到如图36所示那样的鲜明的显微镜照片。
图37所示为各器具1算出的细胞组织体的直径比。在图37中，横轴表示各器具1的距离D，纵轴表示各器具1的直径比。另外，图37的横轴的右端所示的“无框部部件”所示为使用未安装框部部件3的基部部件2时的结果。
如图37所示，通过减少距离D，与未安装框部部件3的情况(“无框部部件”)相比，能减少直径比。即，通过将距离D减少到2000μm以下，能够将直径比减少到1.20以下。另外，通过将距离D减少到1000μm以下，能够将直径比减少到1.16以下。特别是，能够将距离D减少到600μm以下，能够将直径比减少到1.15以下。
如此，在使用了器具1的细胞组织体的形成中，通过使该器具1的距离D为特定的微小范围内，能有效地减少边缘组织体与中央组织体的尺寸偏差，能够简便并切实地形成尺寸极度均一的大量细胞组织体。
另外，本发明的器具1和使用该器具1的细胞培养方法不限于上述例子。例如，基部部件2的微孔21可以形成符合目的的任意形状。即，微孔21的开口部24和底面22不限于圆形，例如也可以形成多边形。另外，开口部24和底面22也可以形成不同的形状。另外，开口部24和底面22也可以形成不同的面积。即，例如可以使微孔21的内壁23倾斜地来形成，使底面22的面积小于开口部24地来形成。另外，微孔21也可以形成实质上没有底面22的仅具有倾斜的内壁23的锥形形状。另外，框部部件3的窗部40也可以形成圆形、多边形等符合目的的任意形状。
另外，当在基部部件2上形成多个微孔组20时，在框部部件3可以形成1个或多个任意个数的窗部40。另外，在使用器具1的培养过程中，也可以将1个基部部件2与多种框部部件3组合使用。即，例如可以根据需要将形成了规定数量的微孔组20的基部部件2和形成了个数互不相同的窗部40的多个框部部件3分别组合使用。具体而言，例如如图6～图9所示，当在基部部件2上形成了4个微孔组20a～20d时，在接种工序S100中，安装如图6～图9所示形成了4个窗部40a～40d的框部部件3，在该4个微孔组20a～20d中分别接种细胞。在培养工序S200中，如图19所示，在卸下框部部件3的分离状态的器具1中继续培养。然后，在处理工序S300中，在该基部部件2上安装如图11和图12所示那样的仅形成了一个窗部40的框部部件3，使该4个微孔组20a～20d中的与一个微孔50对应的一个微孔组20b内的细胞和其他3个微孔组20a、20c、20d内的细胞与组成互不相同的溶液接触。
另外，保持部件4不限于如图15～图17所示那样具有与基部部件2的外周22和框部部件3的外周33整体抵接的抵接部。即，保持部件4只要能将基部部件2和框部部件3按规定的位置关系一体保持即可，可以为具有与上述外周22和外周33的各自的一部分抵接的抵接部的保持部件。

Claims (14)

1.一种细胞培养器具，其特征在于，
具备基部和框部，
所述基部形成有包含多个能保持细胞的第1孔的孔组，
所述框部设置在所述基部的所述孔组的周围，形成能保持溶液的第2孔。
2.如权利要求1所述的细胞培养器具，其特征在于，
所述第1孔的开口部的面积为100～1×106μm2的范围。
3.如权利要求1或2所述的细胞培养器具，其特征在于，
所述基部和所述框部分别由相互独立形成的基部部件和框部部件构成，
所述框部部件形成有与所述孔组对应的贯穿孔，并被构成为能安装于所述基部部件上并能从所述基部部件上卸下，
在所述框部部件安装于所述基部部件的状态下，所述贯穿孔的内壁设置在所述孔组的周围，形成所述第2孔。
4.如权利要求3所述的细胞培养器具，其特征在于，
在所述基部部件上相互分离地形成有多个所述孔组，
在所述框部部件上形成有至少一个分别与所述多个孔组中的一个对应的所述贯穿孔。
5.如权利要求4所述的细胞培养器具，其特征在于，
在所述框部部件上形成有多个分别与所述多个孔组中的一个对应的所述贯穿孔，
在所述框部部件安装于所述基部部件的状态下，所述多个贯穿孔的各内壁设置在对应的一个所述孔组的周围，形成多个所述第2孔。
6.如权利要求3至5中任一项所述的细胞培养器具，其特征在于，
在所述基部部件和所述框部部件上分别形成有能在对应的位置上相互结合的第1结合部和第2结合部。
7.如权利要求6所述的细胞培养器，其特征在于，
在所述基部部件上相互分离地形成有多个所述孔组，
所述第1结合部形成在所述多个孔组的各自的周围。
8.如权利要求6或7所述的细胞培养器具，其特征在于，
所述第1结合部和所述第2结合部中的一个形成为凸形，另一个形成为凹形，并能相互嵌合。
9.如权利要求3至8中任一项所述的细胞培养器具，其特征在于，
还具备保持部件，所述保持部件将所述基部部件和安装于所述基部部件的所述框部部件一体保持，具有与所述基部部件和所述框部部件的各自的外周的至少一部分抵接并将所述基部部件和所述框部部件的相对位置固定的抵接部。
10.一种细胞培养器具用框部部件，其特征在于，
其被构成为能安装于形成有包含多个能保持细胞的第1孔的孔组的基部部件上并能从该基部部件上卸下，并形成有与所述孔组对应的贯穿孔，通过安装于所述基部部件，所述贯穿孔的内壁设置在所述孔组的周围，形成能保持溶液的第2孔。
11.一种细胞培养方法，其特征在于，
使用权利要求1至9中任一项所述的细胞培养器具。
12.如权利要求11所述的细胞培养方法，其特征在于，
使用权利要求3至9中任一项所述的细胞培养器具，并包含如下工序：
在所述框部部件安装于所述基部部件的状态下，通过向所述细胞培养器具中的所述第2孔中注入含有细胞的溶液，从而向与所述第2孔对应的一个所述孔组接种所述细胞的工序；
以及，从所述基部部件卸下所述框部部件，在所述孔组中培养所述细胞的工序。
13.如权利要求11或12所述的细胞培养方法，其特征在于，
使用权利要求3至9中任一项所述的细胞培养器具，并包含如下工序：
在所述孔组中培养细胞的工序；
以及，在所述框部部件安装于所述基部部件的状态下，通过向所述细胞培养器具中的所述第2孔中注入规定的溶液，从而使与所述第2孔对应的一个所述孔组的细胞与所述规定的溶液接触的工序。
14.如权利要求11至13中任一项所述的细胞培养方法，其特征在于，
使用权利要求5所述的细胞培养器具，并包含如下工序：
在所述多个孔组中培养细胞的工序；
以及，在所述框部部件安装于所述基部部件的状态下，通过向所述细胞培养器具中的所述多个第2孔中注入互不相同的溶液，从而使与所述多个第2孔对应的所述多个孔组的细胞与互不相同的所述溶液接触的工序。
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