JP5589159B2 - 細胞剥離抑制器具及びこれを用いた培養容器、細胞回収方法 - Google Patents
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Description
この発明は、培養している細胞の剥離を抑制する細胞剥離抑制器具及びこれを用いた培養容器、細胞剥離抑制方法に関するものである。
近年、薬剤の薬理活性評価や毒性試験のシミュレーターとして、生体内と同様の三次元組織であるスフェロイドが注目されている。このスフェロイドを培養する方法には種々あるが、その一つとして、樹脂フィルムや樹脂基板の培養面に形成された凹凸構造上に細胞を播種し、スフェロイドを形成するものがある（例えば、特許文献１参照）。
ところで、このような細胞をマルチウェルプレート上で培養すると、細胞をウェルごとに回収する必要があり面倒である。そこで、大面積のプレート状で培養することが考えられるが、大面積のプレート上で細胞を培養すると、なぜか培養面上の細胞が培養中に剥離するという問題があった。
そこで本発明は、大面積の培養面上で培養している細胞の剥離を抑制する細胞剥離抑制器具及びこれを用いた培養容器、細胞剥離抑制方法を提供することを目的とする。
上記目的を達成するために、本発明の細胞剥離抑制器具は、培養面上で細胞を培養するための培養容器本体に着脱可能であって、当該培養容器内の溶液の動きを抑制するように前記培養面を仕切るものであることを特徴とする。
この場合、前記細胞剥離抑制器具は、前記培養面を仕切る１以上の穴を有するものを用いることができる。また、前記穴の面積は3.8ｃｍ２以下である方が好ましい。
また、本発明の培養容器は、細胞を培養するための培養容器であって、細胞接着面として機能する培養面を有する培養容器本体と、前記培養容器本体に着脱可能であって、当該培養容器本体内の溶液の動きを抑制するように前記培養面を仕切る細胞剥離抑制器具と、を具備することを特徴とする。
この場合、前記細胞剥離抑制器具は、前記培養面を仕切る１以上の穴を有するものを用いることができる。また、前記穴の面積は3.8ｃｍ２以下である方が好ましい。また、前記培養面は、細胞接着面として機能する凹凸構造を有するものを用いることができる。
また、本発明の細胞剥離抑制方法は、細胞を培養する間、培養容器本体内の溶液の動きを抑制するように培養面を仕切ることを特徴とする。
この場合、上述した細胞培養抑制器具を用いて、前記培養容器本体内の溶液の動きを抑制することができる。
本発明によれば、培養容器の培養面を所定の大きさに仕切ることにより、培地の動きを抑制するので、培養面から細胞が剥離するのを防止することができる。
本発明の培養容器１は、細胞を培養するためのものであって、図１、図２に示すように、細胞接着面として機能する培養面20を有する培養容器本体２と、培養容器本体２内の溶液９の動きを抑制するための細胞剥離抑制器具３と、を具備するものである。
培養容器本体２としては、培養する細胞の接着面として機能する培養面20を有していればどのようなものでも良く、例えば、プレート、ディッシュ、シャーレ、トレイ等がある。また、８穴プレートのようなものも含まれる。
培養面20は、細胞接着面として機能するものであり、例えば、所定の凹凸構造を有するものや、所定の表面処理を施したものが該当する。
凹凸構造としては、培養する細胞の性質に応じて、線状（ラインアンドスペース）、ピラー状、ホール状等、種々の形状とすることができるが、好ましくは、所定の平面形状からなる単位格子201を規則的に複数配列した構造の方が良い。例えば、図３、図４に示すように、平面形状が多角形である単位格子201を複数連続したものとすることができる。この時、等方的に均一な構造上で細胞を成長させることができるという点で、正三角形、正方形、正六角形等の正多角形や、円形のものが好ましい。また、ピラー状やホール状の凹凸構造と平面形状からなる複数の単位格子201からなる凹凸構造とを組み合わせることも可能である。単位格子間202の幅は、細胞を単層状ではなく三次元的に成長させたり（スフェロイド培養）、分化させたりし、より生体内に近い状態で培養するという観点からは、３μｍ以下、２μｍ以下、１μｍ以下、７００ｎｍ以下、５００ｎｍ以下、２５０ｎｍ以下というように、小さくなるほど好ましい。この理由としては、単位格子間202の幅が小さくなるほど、凹凸構造面に接着した細胞は、多くの仮足を成長させながらスフェロイドを形成させることができると考えられるためである。
また、単位格子201の深さは、培養する細胞の性質に応じて、１ｎｍ以上、１０ｎｍ以上、１００ｎｍ以上、２００ｎｍ以上、５００ｎｍ以上、１μｍ以上、１０μｍ以上、１００μｍ以上等種々の大きさに形成される。また、この凹凸構造のアスペクト比としては、０．２以上、０．５以上、１以上、２以上等種々のものがある。
また、単位格子201の最小内径（好ましくは最大内径）は、３μｍ以下であることが好ましく、２μｍ以下、１μｍ以下、７００ｎｍ以下、５００ｎｍ以下、２５０ｎｍ以下というように、小さくなるほど好ましい。ここで、内径とは、単位格子201に外接する２本の平行線間の距離を意味する。したがって、最小内径とは、単位格子201に外接する二本の平行線間の距離のうち最も短いものを言い、最大内径とは、単位格子201に外接する二本の平行線間の距離のうち最も長いものを言う。例えば、単位格子201が正六角形の場合には、対向する平行な辺と辺との間の距離が最小内径となり、対向する頂点間の距離が最大内径となる。また、単位格子201が長方形の場合には、短辺の長さが最小内径となり、対角線の長さが最大内径となる。
凹凸構造の形成方法はどのような方法でも良いが、例えば、ナノインプリント技術、溶液キャスト法、エッチング、ブラスト、コロナ放電等を用いることができる。この時、より精密に形状等を制御できる点で、ナノインプリント技術による方法が好ましい。
また、培養容器本体２の材質は、細胞に対し無毒性のものであればどのようなものでも良く、例えば、「ポリスチレン」、「ポリエチレン」、「ポリプロピレン」、「ポリイミド」、「ポリ乳酸やポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体、ポリカプロラクトン等の生分解性ポリマー」、「環状オレフィン共重合体（ＣＯＣ）や環状オレフィン重合体（ＣＯＰ）等の環状オレフィン系熱可塑性樹脂」、「アクリル樹脂」、「光硬化性樹脂や熱硬化性樹脂等のその他の樹脂」、「酸化アルミニウム等の金属」、「ガラス」、「石英ガラス」、「シリコン」等を用いることができる。
表面処理としては、化学的な処理や、紫外線照射、ガンマ線照射、プラズマ照射等による処理がある。もちろん、細胞接着面として機能するような処理であれば、これ以外の処理を用いても構わない。
細胞剥離抑制器具３は、培養容器本体２内の培地等の溶液９が動くのを抑制するように、培養面20を仕切るものである。これにより、培養容器本体２内の溶液９が、インキュベータ等による振動や対流によって動くのを抑制するので、培養面20上に接着している細胞が溶液９の動きによって剥離するのを防止することができる。
なお、培養容器本体２内の培地等の溶液９が動くのを抑制できれば、仕切方はどのようなものでも良いが、例えば、培養面20を仕切る１以上の穴を有するものを用いることができる。穴の形状はどのようなものでも良く、図１に示すような格子状のものでも、マルチウェルプレートのような円状のものであっても良い。穴の面積は小さいほど溶液９の動きを抑制する効果は高いが、特に、2.25ｃｍ２以下において抑制効果が高い。また、溶液９が動くのを抑制できれば、コ字状やＣ字状のような一部が開口しているものであっても勿論構わない。仕切の高さは、溶液９が動くのを抑制できるのであればどのような高さでも良いが、好ましくは、容器内の溶液９の水面91より上まで仕切ることができるものが良い。
材質としては、培養容器本体２の材料と同様のものが使用でき、例えば、「ポリスチレン」、「ポリエチレン」、「ポリプロピレン」、「ポリイミド」、「ポリ乳酸やポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体、ポリカプロラクトン等の生分解性ポリマー」、「環状オレフィン共重合体（ＣＯＣ）や環状オレフィン重合体（ＣＯＰ）等の環状オレフィン系熱可塑性樹脂」、「アクリル樹脂」、「光硬化性樹脂や熱硬化性樹脂等のその他の樹脂」、「酸化アルミニウム等の金属」、「ガラス」、「石英ガラス」、「シリコン」等を用いることができる。
また、 細胞剥離抑制器具３は、培養容器本体２とは独立して形成され、培養容器本体２と着脱可能に形成される。例えば、 細胞剥離抑制器具３を培養容器本体２の内壁より小さく形成すれば良い。これにより、細胞の回収時に 細胞剥離抑制器具３を培養容器本体２から取り外すことができるので、大面積の培養面20上で培養した細胞を簡単に回収することができる。
次に、本発明の細胞剥離抑制方法について説明する。
本発明の細胞剥離抑制方法は、細胞を培養する間、培養容器本体内の溶液の動きを抑制するように培養面を仕切るものである。養容器本体内の溶液の動きを抑制するには、上述した本発明の細胞培養抑制器具を培養容器本体に装着して細胞を培養すれば良い。また、培養した細胞を回収する際には、培養容器本体から細胞培養抑制器具を取り外した後に回収すれば良い。
次に本発明の細胞剥離抑制器具の実施例について説明する。
実施例では、培養容器本体として、一つの穴の培養面の面積が12ｃｍ２である市販の８穴プレート（ＮＵＮＣ社製、nunc 1670 64）に、培養面としてのシートを部分的に熱融着して配置したものを用いた。当該シートには、一辺の長さが３μｍ（内径２μｍ）、深さ１μｍ、線幅500ｎｍの正方形からなる単位格子を規則的に複数配列した細胞接着面として機能する凹凸構造が形成されている。
また、細胞剥離抑制器具としては、ポリスチレン製の格子状の仕切板を用いた。格子状の穴の面積は、一つの穴の大きさが（Ａ）12ｃｍ２［格子なし］、（Ｂ）6ｃｍ２、（Ｃ）2.25ｃｍ２、（Ｄ）1.05ｃｍ２、（Ｅ）0.49ｃｍ２の５種類とした（図５参照）。
肝癌細胞（ＨｅｐＧ２）を１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ（日水製薬株式会社製）に懸濁し、３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで、上述した８穴プレートに播種した後、本発明の細胞剥離抑制器具を装着して３７℃，５％ ＣＯ２条件下で培養した。
培養７日目に、まず、細胞剥離抑制器具を外さずに、培養上清（浮遊しているスフェロイド）を回収した。次に、細胞剥離抑制器具を外し、ＰＢＳを添加してセルスクレーパーを用いて接着しているスフェロイドを回収した。回収した細胞液を遠心してＰＢＳに懸濁した後、格子の１マス分を分注し１／１０量のスフェロイド溶解液（SCIVAX社製NanoCulture Lysis）を添加し、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ａｓｓａｙ（インヴィトロゲン社製）により、細胞のＤＮＡ量を測定した。
浮遊しているスフェロイドと接着しているスフェロイドのＤＮＡ量の和を１として、浮遊しているスフェロイド及び接着しているスフェロイドのＤＮＡ量の割合を図６に示す。
図６のＤＮＡ量の割合から、穴の面積が2.25ｃｍ２以下になると接着しているスフェロイド数の割合が浮遊しているスフェロイド数の割合よりかなり多くなる。
したがって、本発明の培養容器およびこれに用いられる細胞剥離抑制器具は、培養面から細胞が剥離するのを防止する効果があることが認められた。
１ 培養容器
２ 培養容器本体
３ 細胞剥離抑制器具
９ 溶液
20 培養面
２ 培養容器本体
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Claims (4)
- 細胞接着面として機能する培養面を有する培養容器本体に着脱可能であって、当該培養容器内の溶液の動きを抑制するために、前記培養面を１つの穴の面積が2.25ｃｍ ２ 以下となるように仕切るものであることを特徴とする細胞剥離抑制器具。
- 細胞を培養するための培養容器であって、
細胞接着面として機能する培養面を有する培養容器本体と、
前記培養容器本体に着脱可能であって、当該培養容器本体内の溶液の動きを抑制するために、前記培養面を１つの穴の面積が2.25ｃｍ ２ 以下となるように仕切る細胞剥離抑制器具と、
を具備することを特徴とする培養容器。 - 前記培養面は、細胞接着面として機能する凹凸構造を有することを特徴とする請求項２記載の培養容器。
- 細胞接着面として機能する培養面を有する培養容器本体で細胞を培養し回収する細胞回収方法であって、
培養容器本体内の溶液の動きを抑制するために、前記培養面を１つの穴の面積が2.25ｃｍ ２ 以下となるように仕切る細胞剥離抑制器具を前記培養容器本体に装着して細胞を培養し、
前記培養容器本体から前記細胞培養抑制器具を取り外した後に、前記培養した細胞を回収することを特徴とする細胞回収方法。
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