CN101200719A - 肝癌相关基因dlk1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了DLK1基因在制备治疗原发性肝癌的RNA干扰药物中的应用，提供了以所述DLK1基因为靶点的siRNA序列，包含以所述DLK1基因为靶点的siRNA序列的载体、宿主细胞，还提供了治疗及诊断肝癌的生物芯片及试剂盒。以DLK1基因为制备治疗原发性肝癌基因药物的靶点，使得攻克肝癌成为可能。

Description

肝癌相关基因DLK1及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学和基因工程领域，具体地，本发明涉及肝癌相关基因DLK1、以其mRNA序列为靶点的一组siRNA、及其在制备诊断肝癌试剂、制备基因治疗肝癌的药物中的应用。

背景技术

目前我国有慢性肝炎患者约1200万例，每年死于肝病约30万，其50％为原发性肝癌，约占全世界肝癌死亡人数的45％左右。绝大多数与HBV、HCV感染有关。肝癌发病率在我国居2-3位，主要在青壮年男性发病，在华东地区的发病率明显高于其他地区，近年来，有持续上升趋势。在上海，肝癌的发病率居第三位，仅次于肺癌和胃癌。最新资料显示这个比例还有继续上升的趋势。现在，肝癌，特别是肝炎病毒引起的肝癌已经严重危害了我国人民生命安全。因此，非常有必要对肝癌发生的分子机制作深入的研究。

随着人类基因组测序的完成，基因组学的研究重点已经转移到以解析基因功能为主的功能基因组学研究。功能基因组学的重点是以疾病为中心，全力解决人类疾病相关基因研究中的重大科学问题。肝癌在我国素有“国病”之称，经过半个世纪的探索，对于肝癌的早期诊断和治疗虽然有了一定的认识，但肝癌预后仍然很差，特别是对其发病机制的了解及治疗药物的新靶点方面，更是知之甚少。因此，寻找与肿瘤相关的基因，特别是寻找新的抑癌基因是近年来肿瘤研究的热点。DLK1基因定位于染色体14q32上。DLK1是在胞外区域包含6个EGF样重复序列的糖基化Delta样跨膜蛋白。DLK1首先是在脂肪前体细胞中发现，与脂肪细胞的分化紧密相关。DLK1基因具有抑制脂肪前体细胞向脂肪细胞分化的功能。近年来，有研究发现DLK1在神经母细胞瘤细胞和小细胞肺癌细胞株等肿瘤细胞中存在表达，表明DLK1基因可能与肿瘤发生相关；同时在老鼠的胎肝细胞和胆汁淤积引起的肝纤维化细胞中均发现DLK1的表达。在我们的前期肝癌及癌旁表达谱分析的研究中，发现DLK1基因在肝癌中的表达较癌旁组织中明显增加，提示DLK1基因可能对肝癌的发生相关。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种肝癌相关基因DLK1的mRNA序列，盖基因定位在人染色体14q32上，可用于制备治疗原发性肝癌的RNA干扰药物。

为解决上述技术问题，本发明提供肝癌相关基因DLK1的mRNA序列。

本发明还提供一种表达载体，含有所述以DLK1上mRNA为靶点的siRNA序列。

本发明还提供一种含有所述表达载体的宿主细胞。

在本发明的再一方面，还提供了一种用于治疗肝癌的试剂盒，其含有所述的以DLK1上mRNA为靶点的siRNA。

在本发明的又一方面，还提供了一种用于治疗肝癌的生物芯片，其含有以DLK1上mRNA为靶点的siRNA。

在本发明的又一方面，还提供了肝癌相关基因DLK1在制备诊断肝癌及肿瘤的试剂，和制备基因治疗肝癌及肿瘤的药物中的应用。

本发明由于对DLK1基因进行了体外动物细胞试验，证实DLK1缺失能够导致肝肿瘤细胞显著缩小，认为DLK1基因在进行制备治疗肝癌的基因药物中有巨大作用，可以成为基因治疗的靶点。

附图说明

图1是实施例1中pSUPER DLK874和pSUPER DLK1011的RNA干扰效率示意图，其中，pSUPER为空载对照，pSUPER Luc+为阴性对照；

图2是实施例2中三次克隆实验中的一次的实验照片；

图3是实施例2中从上到下为Hep3B、HepG2和Huh-7细胞在三次独立实验中的克隆数目统计图，其中，*表示与对照组比较时p值＜0.05；

图4是实施例3中DLK1表达稳定下调的Huh-7细胞株的鉴定示意图，其中，β-actin作为各样品蛋白上样量对照；

图5是实施例3中DLK1表达稳定下调Huh-7细胞株的生长曲线比较示意图，其中，细胞活力在450nm波长处测量，每点上下所标的黑色刻度线标志为其标准差；

图6是实施例4中DLK1表达下调的Huh-7细胞在裸鼠体内的成瘤性降低示意图；上图为4周后携带肿瘤的裸鼠照片，皮下的肿瘤呈圆块状；下图为4周后取下的皮下肿瘤照片，其中Huh-7 p1011 A4细胞在六周后仍无肿瘤形成；

图7是实施例5中SMMC-7721瞬间转染pcDNA3.0和pcDNA3.0-DLK1后的生长曲线示意图；

图8是实施例5中SMMC-7721瞬间转染pcDNA3.0和pcDNA3.0-DLK1后的Western Blotting分析鉴定图，其中DLK1为转染pcDNA3.0-DLK1质粒，3.0为转染pcDNA3.0质粒，blank为没有转染的SMMC-7721细胞，β-actin作为各样品蛋白上样量对照。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步详细的说明。

本发明的实施例如下所示

实施例1  构建并鉴定DLK1的RNAi质粒

在本实施例中，引入pSUPER质粒，以构建能够对细胞进行比较稳定转染的RNAi的质粒。该质粒含有H1-RNA多聚酶III基因启动子，将能转录出含有短链发夹结构RNA(shRNA)的cDNA序列寡核苷酸插入pSUPER质粒的该启动子之后，使此载体在转染入细胞后能在细胞内稳定合成发卡样结构的shRNA，即达到比较稳定的沉默目的基因的作用。

在本实施例中所用的寡核苷酸序列如下：

1、pSUPER Luc+：

正向引物：gatccccctt acgctgagta cttcgattca agagatcgaa gtactcagcgtaagtttttg gaaa

反向引物：agcttttcca aaaacttacg ctgagtactt cgatctcttg aatcgaagtactcagcgtaa gggg

2、pSUPER DLK874：

正向引物：gatccccggt ctcacctgtg tcaagattca agagatcttg acacaggtgagacctttttg gaaa

反向引物：agcttttcca aaaaggtctc acctgtgtca agatctcttg aatcttgacacaggtgagac cggg

3、pSUPER DLK1011：

正向引物：gatccccggt gtccatgaaa gagctcttca agagagagct ctttcataggcacctttttg gaaa

反向引物：agcttttcca aaaaggtgtc catgaaagag ctctctcttg aagagctctttcataggcac cggg

其中pSUPER Luc+质粒，其RNAi所针对的片段为改良过的北美萤火虫(Photinuspyralis)萤光素酶基因的19个碱基片段。该基因Luc+是具有种属特异性的报告基因，在哺乳动物细胞中不存在该基因也不表达。因此，本实施例中pSUPER Luc+质粒为RNAi干扰体系的参照，以排除pSUPER Luc+质粒在RNAi过程中可能出现的非特异的实验结果。而pSUPER DLK874和pSUPER DLK1011质粒干扰的靶序列分别针对DLK1基因序列第874和第1011个碱基开始的连续19个碱基片段。

将靶序列对应的cDNA序列分别插入到正向引物(Forward primer)和反向引物(Reverse primer)的前段空缺内，同时将该cDNA的互补cDNA序列插入后段空缺，形成完整的正向引物，共64个碱基。在得到人工合成DNA序列后，对正向引物和反向引物进行退火和磷酸化，随后连接入pSUPER载体，再经过转化进行阳性克隆的筛选。

利用pSUPER质粒内部固定的限制性内切酶位点Ecor I和Hind III，对pSUPER Luc+质粒进行酶切鉴定。

阳性克隆酶切后的条带大小约为360bp，而阴性克隆酶切后为300bp。所挑选的8个pSUPER Luc+克隆中左起第2和3号克隆酶切后的条带略高于其它条带，大小符合阳性克隆的特征。选择该两个克隆经测序鉴定发现3号克隆的序列完全符合目的序列片段。而4个pSUPER DLK1011克隆中，左起1、3、4号均为阳性，测序鉴定发现1号克隆的序列完全符合目的序列片段。另外，pSUPER DLK874质粒的鉴定筛选过程同上。最终得到该三个以pSUPER为载体的RNAi质粒。

将构建好的pSUPER DLK874和pSUPER DLK1011瞬间转染入内源性表达DLK1的HCC细胞Huh-7、Hep3B和HepG2中，并以pSUPER Luc+为对照质粒，用Real-timeQuantitative PCR鉴定其沉默DLK1基因表达的效果(见图1)。

图1中的数据是以各样品的管家基因β肌动蛋白(β-actin)表达量为参考经标准化后的相对平均值。本实施例中，DLK1的Real-time Quantitative PCR引物如下：

正向引物：5’-gtactcggga aaggactgcc-3’

反向引物：5’-ctcgcagaaa ttgcctgaga-3’

所用探针为：5’-FAM-aggcacccgt ggatgatgag-TAMRA-3’

以上Real-time Quantitative PCR的实验每个都至少重复进行3次。由图1可见，由pSUPER载体介导的RNA干扰能使目的基因DLK1的表达在上述三种细胞内下调50-60％。

实施例2瞬间克隆形成试验(证明HCC细胞的DLK1表达抑制后其克隆形成能力降低)

在鉴定pSUPER载体介导的RNAi有效的基础上，对实施例1中的三种内源性表达DLK1的细胞进行瞬间克隆形成试验(见图2、图3)，并以无内源性DLK1表达的HCC细胞株Bel-7402细胞作为对照细胞。

将pSUPER空载质粒和pSUPER DLK874、pSUPER DLK1011质粒与pcDNA3.0质粒以10比1的比例分别共转染入Hep3B、HepG2、Huh-7和Bel-7402细胞，此处pcDNA3.0质粒为转染后的细胞提供G418抗性。在转染后，各对照组的分别取等量细胞分入100mm细胞培养皿中培养，并用含适当浓度的G418的MEM或者DMEM完全培养液进行筛选并等待耐药克隆的形成。其中HepG2和G418筛选浓度为1000μg/ml，Hep3B、Huh-7和Bel-7402均为600μg/ml。待3-4周，克隆形成较为完全后染色并拍照保存。

可以看到，在内源性DLK1被下调后，Hep3B、HepG2和Huh-7细胞形克隆形成的数目都有明显下降，即其克隆形成能力被显著削弱。而没有内源性表达的Bel-7402细胞在同样的实验中其形克隆形成的数目却没有明显改变。

实施例3 Western Blotting分析(证明Huh-7细胞的DLK1表达被抑制后其生长增殖能力降低)

以Huh-7细胞为对象，将pSUPER空载质粒和pSUPER DLK874、pSUPER DLK1011质粒与pcDNA3.0质粒以10比1的比例分别共转染入Huh-7细胞，构建DLK1表达抑制的Huh-7稳定细胞株，并用Western Blotting Analysis对于其中的4株稳定细胞株在蛋白水平上对DLK1的表达进行鉴定(见图4)。

图4中，pSUPER C5为pSUPER空载质粒稳定细胞株；p1011 B3和p1011 A4为稳定转染pSUPER DLK1011后形成的亚克隆；p874 C2为稳定转染pSUPER DLK874后形成的亚克隆。得到两株DLK1稳定下调的细胞株Huh-7 p874 C2和Huh-7p1011A4，而稳定株Huh-7 p1011 B3中DLK1的表达并没有下调。

在建立了DLK1稳定下调细胞株的基础上，研究了这两株稳定株的生长属性是否受DLK1下调的影响而改变，为此，比较这些细胞及对照的生长曲线。如图5所示，当DLK1的表达被下调后，其稳定株的生长增殖能力明显减弱。与之比较的空载稳定细胞株pSUPER C5和内源性DLK1表达没有被下调的对照稳定细胞株p1011 B3，它们两者的生长状态良好。虽然它们之间也略有差异，即pSUPERC5要比p1011 B3生长增殖能力稍微更强一些，但是这两者总的要比p874 C2和p1011 A4的生长增殖能力都要显著得多。该实验经重复三次后，得到相似的结果。

实施例4无胸腺的BLAB/cA裸鼠体内实验(证明Huh-7细胞的DLK1表达被抑制后其在动物体内成瘤能力降低)

本实施例共取32只裸鼠，分成四组，每组八只，分别于皮下注射相同量(2×10⁶)的Huh-7 pSUPER C5、p1011 B3、p874 C2和p1011 A4细胞。注射后四周观察裸鼠的生存状态及所成肿瘤的形态指标(见图6)。

经观察发现，DLK1被稳定下调的Huh-7 p874 C2细胞在裸鼠皮下所成的肿瘤要比对照组Huh-7 pSUPER C5和p1011 B3细胞在裸鼠下所成的肿瘤在体积上显著减小，而且Huh-7 p1011 A4在观察注射肿瘤细胞后六周仍然未见肉眼可见肿瘤形成，解剖证实该注射Huh-7 p1011 A4细胞的8只裸鼠确实没有肿瘤形成。注射Huh-7 pSUPER C5、p1011 B3、p874 C2细胞后的所有裸鼠在四周后都形成了肿瘤，而且注射了Huh-7 pSUPER C5和p1011 B3细胞所形成的肿瘤经解剖分离后显示其所成肿瘤实体的体积比Huh-7 p874 C2的更大(见图6)，并且该两组肿瘤实体本身没有显著性差异。但注射了Huh-7 pSUPER C5和p1011 B3细胞的裸鼠与注射了Huh-7 p874 C2和p1011 A4细胞的裸数的体重净重、进食能力和精神状态在4周后没有显著差异，所有裸鼠在实验中止即解剖前全部存活。

本实施例结果显示对于内源性表达DLK1的肝癌细胞株在模型动物皮下进行的成瘤实验中，DLK1对于肿瘤细胞的成瘤能力起了重要的增强作用。由于DLK1被稳定下调的细胞成瘤作用大幅度降低，甚至其中一例了Huh-7 p1011 A4细胞的8只裸鼠都没有长出肉眼可见的肿瘤，因此本实施例证明了Huh-7细胞的DLK1表达被抑制后其在动物体内成瘤能力降低。

实施例5DLK1促进SMMC-7721细胞的生长

以上实施例均采用了RNAi的手段使DLK1的表达受到抑制，观察到DLK1的表达抑制后，肝癌细胞生长增殖能力、克隆形成和成瘤能力都有显著的降低，这提示DLK1对于肝癌细胞的生长增殖及成瘤性起着某种维持或限制的作用。本实施例用以验证DLK1是否可以直接起到癌基因的作用来促进肿瘤细胞的增殖。

在无内源性DLK1表达的SMMC-7721细胞中，瞬间转入之前所构建的过表达DLK1全长蛋白的pcDNA3.0-DLK1质粒，并以pcDNA3.0空载质粒为对照，观察细胞的生长增殖曲线(见图7)。Western Blotting Analysis中的样品为生长曲线所用同一批转染了pcDNA3.0和pcDNA3.0-DLK1质粒的SMMC-7721细胞，各样品上样量均为20μg，以鉴定转染质粒后DLK1在SMMC-7721细胞中表达的效率(见图8)。

在本实施例中，在SMMC-7721细胞中进行了该两个质粒的瞬间转染，转染试剂为Lipofectamine 2000(Invitrogen)，在转染4-5小时后将含有转染试剂的培养液撤去，更换成新鲜的DMEM完全培养液，以尽量减少转染试剂的毒性对于细胞的损伤。继续培养至次日，计数后分入96孔板内生长，每孔均匀分入1000个细胞。经过8天的观察，发现转染了DLK1的SMMC-7721细胞比转染了空载质粒的细胞生长显著增快。

本实施例结果表明DLK1能显著增强无内源性DLK1表达的HCC细胞株SMMC-7721的生长增殖能力。

序列表

<110>上海人类基因组研究中心

<120>肝癌相关基因DLK1及其应用

<130>NP-11134

<160>23

<210>1

<211>1532

<212>RNA

<213>Homo sapiens

<400>1

gagagcgcag cgcgcagccc ggtgcagccc tggctttccc ctcgctgcgc gcccgcgccc      60

cctttcgcgt ccgcaaccag aagcccagtg cggcgccagg agccggaccc gcgcccgcac     120

cgctcccggg accgcgaccc cggccgccca gagatgaccg cgaccgaagc cctcctgcgc     180

gtcctcttgc tcctgctggc tttcggccac agcacctatg gggctgaatg cttcccggcc     240

tgcaaccccc aaaatggatt ctgcgaggat gacaatgttt gcaggtgcca gcctggctgg     300

cagggtcccc tttgtgacca gtgcgtgacc tctcccggct gccttcacgg actctgtgga     360

gaacccgggc agtgcatttg caccgacggc tgggacgggg agctctgtga tagagatgtt     420

cgggcctgct cctcggcccc ctgtgccaac aacgggacct gcgtgagcct ggacgatggc     480

ctctatgaat gctcctgtgc ccccgggtac tcgggaaagg actgccagaa aaaggacggg     540

ccctgtgtga tcaacggctc cccctgccag cacggaggca cctgcgtgga tgatgagggc     600

cgggcctccc atgcctcctg cctgtgcccc cctggcttct caggcaattt ctgcgagatc     660

gtggccaaca gctgcacccc caacccatgc gagaacgacg gcgtctgcac tgacattggg     720

ggcgacttcc gctgccggtg cccagccggc ttcatcgaca agacctgcag ccgcccggtg     780

accaactgcg ccagcagccc gtgccagaac gggggcacct gcctgcagca cacccaggtg     840

agctacgagt gtctgtgcaa gcccgagttc acaggtctca cctgtgtcaa gaagcgcgcg     900

ctgagccccc agcaggtcac ccgtctgccc agcggctatg ggctggccta ccgcctgacc     960

cctggggtgc acgagctgcc ggtgcagcag ccggagcacc gcatcctgaa ggtgtccatg    1020

aaagagctca acaagaaaac ccctctcctc accgagggcc aggccatctg cttcaccatc    1080

ctgggcgtgc tcaccagcct ggtggtgctg ggcactgtgg gtatcgtctt cctcaacaag    1140

tgcgagacct gggtgtccaa cctgcgctac aaccacatgc tgcggaagaa gaagaacctg    1200

ctgcttcagt acaacagcgg ggaggacctg gccgtcaaca tcatcttccc cgagaagatc    1260

gacatgacca ccttcagcaa ggaggccggc gacgaggaga tctaagcagc gttcccacag    1320

ccccctctag attcttggag ttccgcagag cttactatac gcggtctgtc ctaatctttg    1380

tggtgttcgc tatctcttgt gtcaaatctg gtgaacgcta cgcttacata tattgtcttt    1440

gtgctgctgt gtgacaaacg caatgcaaaa acaatcctct ttctctctct taatgcatga    1500

tacagaataa taataagaat ttcatcttta aa    1532

<210>2

<211>27

<212>RNA

<213>Homo sapiens

<400>2

GAUUCUGCGAGGAUGACAAUGUUdTdT

<210>3

<211>27

<212>RNA

<213>Homo sapiens

<400>3

AACAUUGUCAUCCUCGCAGAAUCdTdT

<210>4

<211>29

<212>RNA

<213>Homo sapiens

<400>4

GAUGGCCUCUAUGAAUGCUCCUGUGdTdT

<210>5

<211>29

<212>RNA

<213>Homo sapiens

<400>5

CACAGGAGCAUUCAUAGAGGCCAUCdTdT

<210>6

<211>27

<212>RNA

<213>Homo sapiens

<400>6

CAGGCAAUUUCUGCGAGAUCGUGdTdT

<210>7

<211>27

<212>RNA

<213>Homo sapiens

<400>7

CACGAUCUCGCAGAAAUUGCCUGdTdT

<210>8

<211>25

<212>RNA

<213>Homo sapiens

<400>8

CAGCCGGCUUCAUCGACAAGAdTdT

<210>9

<211>25

<212>RNA

<213>Homo sapiens

<400>9

UCUUGUCGAUGAAGCCGGCUGdTdT

<210>10

<211>27

<212>RNA

<213>Homo sapiens

<400>10

GAGCUACGAGUGUCUGUGCAAGCdTdT

<210>11

<211>27

<212>RNA

<213>Homo sapiens

<400>11

GCUUGCACAGACACUCGUAGCUCdTdT

<210>12

<211>27

<212>RNA

<213>Homo sapiens

<400>12

CAGGUCUCACCUGUGUCAAGAAGdTdT

<210>13

<211>27

<212>RNA

<213>Homo sapiens

<400>13

CUUCUUGACACAGGUGAGACCUGdTdT

<210>14

<211>29

<212>RNA

<213>Homo sapiens

<400>14

CCGCAUCCUGAAGGUGUCCAUGAAAdTdT

<210>15

<211>29

<212>RNA

<213>Homo sapiens

<400>15

UUUCAUGGACACCUUCAGGAUGCGGdTdT

<210>16

<211>27

<212>RNA

<213>Homo sapiens

<400>16

UAUCGUCUUCCUCAACAAGUGCGdTdT

<210>17

<211>27

<212>RNA

<213>Homo sapiens

<400>17

CGCACUUGUUGAGGAAGACGAUAdTdT

<210>18

<211>25

<212>RNA

<213>Homo sapiens

<400>18

ACAACCACAUGCUGCGGAAGAdTdT

<210>19

<211>25

<212>RNA

<213>Homo sapiens

<400>19

UCUUCCGCAGCAUGUGGUUGUdTdT

<210>20

<211>25

<212>RNA

<213>Homo sapiens

<400>20

GAACCUGCUGCUUCAGUACAAdTdT

<210>21

<211>25

<212>RNA

<213>Homo sapiens

<400>21

UUGUACUGAAGCAGCAGGUUCdTdT

<210>22

<211>27

<212>RNA

<213>Homo sapiens

<400>22

GAUCGACAUGACCACCUUCAGCAdTdT

<210>23

<211>27

<212>RNA

<213>Homo sapiens

<400>23

UGCUGAAGGUGGUCAUGUCGAUCdTdT

Claims (7)

1.肝癌相关基因DLK1，其特征在于：它定位于人染色体14q32上，它具有如SEQ ID NO：1所示的mRNA序列。

2.一种表达载体，其特征在于：含有以权利要求1所述的mRNA核糖核酸序列为靶点的寡核苷酸siRNA序列。

3.一种含有如权利要求2所述表达载体的宿主细胞。

4.一种用于治疗肝癌的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有如权利要求1所述的mRNA核糖核酸序列为靶点的寡核苷酸siRNA序列。

5.一种用于诊断肝癌的生物芯片，其特征在于：所述生物芯片的载体含有如权利要求1所述的mRNA核糖核酸序列为靶点的寡核苷酸siRNA序列。

6.一组以肝癌相关基因DLK1为靶点的核糖核酸序列，用于制备治疗原发性肝癌的RNA干扰药物，其特征在于：它的寡核苷酸序列如下：

siRNA1：

S：GAUUCUGCGAGGAUGACAAUGUUdTdT(SEQ ID NO：2)

AS：AACAUUGUCAUCCUCGCAGAAUCdTdT(SEQ ID NO：3)

siRNA2：

S：GAUGGCCUCUAUGAAUGCUCCUGUGdTdT(SEQ ID NO：4)

AS：CACAGGAGCAUUCAUAGAGGCCAUCdTdT(SEQ ID NO：5)

siRNA3：

S：CAGGCAAUUUCUGCGAGAUCGUGdTdT(SEQ ID NO：6)

AS：CACGAUCUCGCAGAAAUUGCCUGdTdT(SEQ ID NO：7)

siRNA4：

S：CAGCCGGCUUCAUCGACAAGAdTdT(SEQ ID NO：8)

AS：UCUUGUCGAUGAAGCCGGCUGdTdT(SEQ ID NO：9)

siRNA5：

S：GAGCUACGAGUGUCUGUGCAAGCdTdT(SEQ ID NO：10)

AS：GCUUGCACAGACACUCGUAGCUCdTdT(SEQ ID NO：11)

siRNA6：

S：CAGGUCUCACCUGUGUCAAGAAGdTdT(SEQ ID NO：12)

AS：CUUCUUGACACAGGUGAGACCUGdTdT(SEQ ID NO：13)

siRNA7：

S：CCGCAUCCUGAAGGUGUCCAUGAAAdTdT(SEQ ID NO：14)

AS：UUUCAUGGACACCUUCAGGAUGCGGdTdT(SEQ ID NO：15)

siRNA8：

S：UAUCGUCUUCCUCAACAAGUGCGdTdT(SEQ ID NO：16)

AS：CGCACUUGUUGAGGAAGACGAUAdTdT(SEQ ID NO：17)

siRNA9：

S：ACAACCACAUGCUGCGGAAGAdTdT(SEQ ID NO：18)

AS：UCUUCCGCAGCAUGUGGUUGUdTdT(SEQ ID NO：19)

siRNA10：

S：GAACCUGCUGCUUCAGUACAAdTdT(SEQ ID NO：20)

AS：UUGUACUGAAGCAGCAGGUUCdTdT(SEQ ID NO：21)

siRNA11：

S：GAUCGACAUGACCACCUUCAGCAdTdT(SEQ ID NO：22)

AS：UGCUGAAGGUGGUCAUGUCGAUCdTdT(SEQ ID NO：23)。

7.如权利要求1所述的肝癌相关基因DLK1在制备诊断肝癌及肿瘤的试剂，和制备基因治疗肝癌及肿瘤的药物中的应用。

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