CN101802196B - 用于癌症治疗的RNAi介导的NuMA敲减 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及小干扰核酸分子(siRNA)在抑制核有丝分裂器蛋白(NuMA)基因表达中的应用及其在治疗包括癌症在内的疾病中的应用。
Description
相关专利申请的交叉引用
本申请要求2007年6月15日提交的第1130/MUM/2007号印度临时专利申请的申请日优先权,该临时专利申请通过引用全文并入本文。
发明领域
本发明涉及能够下调NuMA基因表达的小干扰核糖核酸(siRNA)分子领域及其在癌症治疗中的应用。
发明背景
核有丝分裂器蛋白(NuMA)是具有球状头和尾的236kDa的大卷曲螺旋蛋白,其是存在于间期细胞核中的主要核蛋白,并集中在有丝分裂细胞的纺锤体极。NuMA还被称为亲中心体蛋白(centrophilin)、SPN、SP-H、1H1/1F1和W1(Tang et al.“Nuclear mitotic apparatus protein(NuMA):spindleassociation,nuclear targeting and differential subcellular localization of variousNuMA isoforms.”Journal of Cell Science 107:1389-1402(1994))。NuMA会聚在微管的负极,此处功能对于纺锤体的组装至关重要。在分裂细胞中,NuMA在磷酸化后分散到细胞质中,与细胞质动力蛋白/动力蛋白激活蛋白(dynactin)结合形成复合体,并沿微管转移至纺锤体极,在此组装微管并将其束缚至纺锤体极。在分裂后期起始(onset)后,NuMA发生脱磷酸化,失去与动力蛋白/动力蛋白激活蛋白的结合,并从纺锤体极释放,从而使纺锤体解装配并重新形成间期子细胞核。NuMA的细胞周期依赖性磷酸化受蛋白激酶和磷酸酶的平衡活性的调节。已经证明,细胞周期蛋白B/cdc2激酶对NuMA的磷酸化使NuMA从细胞核释放并与中心体和/或纺锤体极的微管结合,而分裂后期起始后由细胞周期蛋白B降解引起的NuMA脱磷酸化使NuMA与纺锤体极分离。NuMA的过表达干扰与纺锤体相关的动力蛋白定位,并促进多极纺锤体的形成和癌症的发生。另一方面,很多非增殖细胞和高度分化的细胞中缺失NuMA。NuMA还在雄性生殖细胞和雌性生殖细胞的减数分裂纺锤体的组装过程中发挥作用。NuMA的降解导致正常细胞核结构瓦解,并已经被用作细胞凋亡的标志。
NuMA功能的任何异常都将导致向纺锤体极集中的微管遭到破坏,从而引起微管末端的外张。NuMA在细胞间期停留在细胞核中,并在多步磷酸化后与有丝分裂的中心体暂时结合。NuMA对诸如诱导细胞分裂的激素或诱导凋亡的热休克等外部信号做出响应。在分裂前期,NuMA分散在细胞质中,并与微管结合。在分裂中期或分裂后期,NuMA与染色质结合并最终与重新组成的细胞核结合。NuMA是对正常有丝分裂至关重要的细胞周期相关蛋白,其在凋亡早期发生降解。NuMA与细胞质动力蛋白和动力蛋白激活蛋白形成复合体。所述复合体的损耗导致有丝分裂纺锤体正常组装的失败。在有丝分裂中,NuMA通过端锚聚合酶-1(tankyrase-1)被聚ADP核糖化(PARsylated)。
Comptom和Cleveland(1993)进行的研究表明,有丝分裂过程中染色体分离和/或细胞核组装的适当终止时期需要NuMA。Yang et al.“An unusuallylong coiled-coil related protein in the mammalian nucleus.”J Cell Biol.116(6):1303-1317(1992)发现,向有丝分裂早期或分裂中期细胞中显微注射抗-NuMA抗体可以抑制有丝分裂纺锤体的形成或引起有丝分裂纺锤体的瓦解,由此证明NuMA可能在有丝分裂期间发挥重要作用。
一些研究已经描述了NuMA和癌症之间的关系,但还没有证明抑制NuMA能够治疗癌症。凋亡中的细胞释放NuMA(Miller et al.,Biotechniques,15:1042,1993),并且已经在各种癌症患者的血清中检测到NuMA(Miller et al.,Cancer Res.,52:422,1992),特别是在膀胱癌患者的尿液中检测到NuMA(Stampfer et al.,J.Urol.,159:394,1998)。
在WO/2005/014846中,NuMA被认为是用于鉴定受试者患乳癌风险和/或具有患乳癌风险的受试者的方法中的相关靶标,用于实施所述方法的试剂和试剂盒中的相关靶标,用于鉴定用于乳癌治疗的候选治疗剂的方法中的相关靶标,和用于治疗受试者乳癌的治疗方法中的相关靶标。NuMA基因的变异与家族性乳癌风险有关。
美国专利第6,287,790号公开了通过利用NuMA特异性抗体的细胞免疫染色和NuMA在各细胞核内的分布的显微分析来区分恶性细胞和增殖性非恶性细胞的方法。
美国专利第6,864,238号公开了用于使微管失稳的多肽和编码此多肽的多核苷酸。由于微管在细胞分裂中发挥至关重要的作用,而细胞分裂在癌细胞中发生的更为频繁,所以,所述多肽和多核苷酸可用于制备用于抑制细胞增殖的癌症治疗用组合物。
US 20030125290公开了包含用于诱导在细胞中响应的三乙二醇胆甾醇基寡核苷酸的组合物以及利用所述组合物治疗疾病的方法,所述在细胞中响应包括但不限于在癌细胞或滑膜细胞中抑制细胞增殖、诱导细胞周期阻滞、诱导caspase活化、切割聚(ADP-核糖)聚合酶、诱导凋亡或调节细胞外基质-细胞相互作用,或其组合。NuMA的释放用作凋亡的量度。
WO9640917A公开了用于鉴别细胞中与NuMA非共价地相互作用的蛋白的方法和组合物,通过所述方法鉴定的新蛋白,以及在体内干扰该相互作用的方法和组合物。
El Bashir et al.“Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interferencein cultured mammalian cells”Nature 411:494-498(2001),公开了在体外下调NuMA蛋白表达的针对NuMA的21个核苷酸的siRNA。
Chang et al.,“NuMA is a major acceptor of poly(ADP-ribosyl)ation bytankyrase 1 in mitosis”Biochem.J.:391:117-184(2005),公开了针对NuMA的siRNA在研究NuMA在体外人细胞中功能中的应用。
截至目前,以往的研究多集中于将NuMA作为用于易患乳癌的个体的风险评价的诊断标记物,和用于了解癌症预后的生物标记物。本发明集中于通过小干扰核酸(siRNA)调节NuMA基因表达,目的在于提供治疗性干预。
发明目的
本发明的基本目的是通过小干扰核酸(siRNA)分子调节NuMA基因表达。
本发明的目的是提供用于调节NuMA基因表达的21mer、23mer和27mer小核酸分子。
本发明的目的是提供用于治疗不同类型的癌症(更具体地,是乳癌、肺癌、前列腺癌、结肠直肠癌(colorectal cancer)、宫颈癌、表皮样癌和口腔癌)的具有21mer、23mer或27mer小核酸分子的化合物。
本发明的目的是提供用于定点靶向所述靶标的21mer、23mer和27mer小核酸分子。
本发明的目的是提供SNP特异性siRNA分子,从而为具有NuMA疾患的患者提供个体化治疗。
本发明的目的是提供能够单独使用或者与其它疗法组合使用以有效控制癌症治疗的21mer、23mer和27mer小核酸分子。
本发明的目的是提供能够与不限于脂质、聚合物和单克隆抗体的结合物组合的21mer、23mer和27mer小干扰核酸分子。
本发明的目的是测定与模拟物处理的对照组相比,共定位至其作用位点的NuMA的量。
发明内容
本发明涉及通过小干扰核酸(siRNA)分子调节NuMA基因表达。特别地,本发明涉及靶向NuMA的21mer、23mer或27mer小干扰核酸(siRNA)分子的化合物、组合物及其在调节NuMA表达中的应用。本发明的化合物可单独或与其它治疗或疗法组合用于癌症治疗。
在一个实施方案中,本发明的小核酸分子的特征还在于其为小干扰核酸(SIRNA)、小干扰RNA(SiRNA)、双链RNA(dsRNA)、小RNA(mRNA)、脱氧核糖核酸干扰(DNAi)和小发夹RNA(shRNA)分子。所述小核酸分子可以为未经修饰的或者经过化学修饰。在优选的实施方案中,本发明涉及21mer、23mer或27mer小干扰RNA。在本发明中,通过降低靶蛋白的量(从而削弱与该蛋白相关的功能特性)的能力来测定SIRNA的功效。
在另一个实施方案中,可以化学合成或酶促合成21mer、23mer或27merSIRNA或通过载体表达21mer、23mer或27mer SIRNA。在优选的实施方案中,本发明涉及长度为21mer、23mer或27mer的化学合成的SIRNA,该SIRNA单独或者与其它SIRNA(所述其它SIRNA靶向负责调节多种癌症的基因)组合来降低NuMA的表达水平。
在优选的实施方案中,本发明提供用于治疗多种类型的癌症的小核酸分子,所述多种类型的癌症包括乳癌、肺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、宫颈癌、表皮样癌、口腔癌、胶质瘤(glioma)和白血病。
在一个实施方案中,本发明提供利用肿瘤生物标记物验证21mer、23mer或27mer siRNA的功效的技术。本发明提供利用特定的肿瘤生物标记物诸如PCNA、KI-67和BCL-2抗原表达来进行功效检测。
在一个实施方案中,本发明提供用于治疗多种类型的癌症的靶向NuMA的SIRNA的组合及其组合,所述多种类型的癌症包括乳癌、肺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、宫颈癌、表皮样癌、口腔癌、胶质瘤和白血病。
本发明涉及靶向NuMA mRNA的siRNA。在一个实施方案中,本发明包括靶向Genbank登录号NM_006185的NuMA的第20-40、578-598或905-928位核苷酸的siRNA。在相关实施方案中,所述siRNA包括靶向NuMA分子的SNP的那些siRNA。
在相关实施方案中,所述siRNA靶向选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3组成的组的序列。
在一个实施方案中,本发明siRNA的至少一条链的长度在19至30个核苷酸之间。在相关实施方案中,siRNA具有选自由以下组成的组的结构:
SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5;
SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7;
SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9;和
SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11。
本发明还涉及通过施用siRNA(包括本发明的siRNA)降低靶细胞中NuMA表达的方法。
本发明还包括通过施用针对NuMA的siRNA治疗癌症的方法。在一个实施方案中,siRNA靶向Genbank登录号NM_006185的第20-40、578-598或905-928位核苷酸。在另一个实施方案中,siRNA靶向其相当的SNP(equivalent SNP)。在相关实施方案中,所述siRNA靶向选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3组成的组的序列。
在另一个实施方案中,用于治疗癌症的方法使用其中至少一条核苷酸链在19-30个核苷酸之间的siRNA。在相关实施方案中,所述siRNA具有选自由以下组成的组的结构:
SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5;
SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7;
SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9;和
SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11。
所述治疗癌症的方法可以用于任何癌症。在一个实施方案中,所述癌症选自由以下组成的组:宫颈癌、表皮样癌、口腔癌、胶质瘤、白血病、脑癌、食管癌、胃癌、膀胱癌、胰腺癌、宫颈癌、头颈癌、卵巢癌、黑色素瘤、淋巴瘤和多药耐药癌。在另一个实施方案中,所述癌症选自由结肠直肠癌、乳癌、肺癌和前列腺癌组成的组。
本发明还包括适合用于治疗癌症的药物组合物,其包含本发明的siRNA和药学上可接受的赋形剂。
附图说明
以下附图构成本发明说明书的一部分,并用于进一步证明本发明公开内容的某些方面,通过参考这些附图中的一幅或多幅并结合本发明公开的具体实施方案的描述,可以更好地理解本发明的这些公开内容。
图1:用RINA 25和RINA 10转染结肠癌细胞CCL-247,并通过免疫荧光测定法检测NuMA在纺锤体极的定位。比例:200X。
图1A:显示在用RINA 10转染的CCL-247细胞中NuMA在纺锤体极的定位以及细胞质中的特异染色。箭头表示定位于纺锤体极的NuMA。
图1B:显示用RINA 25转染的CCL-247细胞中缺失定位在纺锤体极的NuMA以及细胞质中的特异染色。箭头表示定位于纺锤体极的NuMA的缺失以及细胞质中NuMA特异染色的缺失。
图2A:显示在siRNA转染72小时后NuMA蛋白敲减的Western印迹,其中236KDa表示NuMA蛋白。50KDa蛋白条带表示微管蛋白内源对照。泳道M表示分子量标准。泳道1-4分别表示用RINA 1、9、25和10转染的肺癌细胞系A549。与模拟物(mock)处理的细胞相比,在所有siRNA转染的细胞中都存在非常弱的NuMA条带。泳道5-8表示用RINA 1、9、25和10转染的正常成纤维细胞系MCF-7。与模拟物处理的细胞相比,在所有siRNA转染的细胞中都存在非常弱的NuMA条带。
图2B:显示在siRNA转染72小时后NuMA蛋白敲减的Western印迹,其中236KDa表示NuMA蛋白。50KDa蛋白条带表示微管蛋白内源对照。泳道M表示分子量标准。泳道1-4表示用RINA 1、9、25和10转染的表皮样癌细胞系A431。与模拟物处理的细胞相比,在所有siRNA转染的细胞中都存在非常弱的NuMA条带。泳道5和4表示用RINA 1、9、25和10转染的前列腺癌细胞系PC3。与模拟物处理的细胞相比,在所有siRNA转染的细胞中都存在非常弱的NuMA条带。
图2C:显示在siRNA转染72小时后NuMA蛋白敲减的Western印迹,其中236KDa表示NuMA蛋白。50KDa蛋白条带表示微管蛋白内源对照。泳道M表示分子量标准。泳道1-4表示用RINA 1、9、25和10转染的宫颈癌细胞系HeLa。与模拟物处理的细胞相比,在所有siRNA转染的细胞中都存在非常弱的NuMA条带。
图3:通过在6孔板的每个孔内接种300个细胞检测siRNA的集落形成效率,试验一式三份。在温育10天结束时,在结晶紫染色后计算集落的数量。计算集落数量相对于阴性siRNA处理对照的平均百分数。
图4:在用RINA 25、RINA 10转染72小时后的结肠癌细胞系CCL-247或未经处理的结肠癌细胞系CCL-247在培养72小时后的细胞周期分析。M1表示处于细胞周期的G0/G1期的细胞数,M2表示处于细胞周期的S期的细胞数,M3表示处于细胞周期的G2期的细胞数,M4表示凋亡中的细胞。
图4A:分析未经处理的结肠癌细胞系CCL-247在培养72小时后的细胞周期。
图4B:分析经RINA 10处理的结肠癌细胞系CCL-247在培养72小时后的细胞周期。
图4C:分析经RINA 25处理的结肠癌细胞系CCL-247在培养72小时后的细胞周期。
图5:通过微阵列分析RINA 25在HTB 26乳癌细胞中对NuMA的抑制作用。微阵列分析鉴定出与经RINA 10处理的细胞相比,共有350个基因被上调,300个基因被下调。
图6:肿瘤的Western印迹。泳道1表示分子量标准。泳道2、3和4分别表示安慰剂处理的动物A-1、A4和A-10。泳道5、6和7分别表示用RINA25处理的动物B-2、B-9和B-11。箭头表示236KDa NuMA和50KDa微管蛋白。与泳道2、3和4中的相应条带相比,泳道4、5和6的NuMA条带的确较弱。这表明与安慰剂处理的动物相比,用RINA25处理的动物的蛋白水平降低。
发明详述
定义:
本文使用的术语“小干扰核酸”、“siNA或SINA”分子、“小干扰RNA”、“siRNA”、“小干扰核酸分子”、“小干扰寡核苷酸分子”表示能够通过RNA干扰机制抑制或下调基因表达的任何核酸分子。
本文使用的术语“RNA”表示包含至少一个核糖核苷酸残基的分子,其包括双链RNA,单链RNA,分离的RNA,部分纯化的、纯的或合成的RNA、重组产生的RNA以及变化的RNA或天然产生的RNA的类似物。
本文使用的术语“调节”表示基因的表达、或编码一个或多个蛋白或蛋白亚基的RNA分子或等同RNA分子的水平、或一个或多个蛋白亚基的活性被上调或下调,从而使得所述表达、水平或活性大于或小于调节子不存在时的观察结果。术语“调节”涵盖“抑制”,但该术语的使用不限于此定义。
本文使用的术语“基因”表示编码RNA序列的核酸,其包括但不限于编码多肽的结构基因。
本文使用的术语“核相关有丝分裂蛋白”或“NuMA”表示具有NuMA活性或亲中心体蛋白活性的任何NuMA蛋白、肽或多肽,例如由Genbank登录号NM_006185编码的那些。此术语还表示编码NuMA蛋白、肽或多肽的核酸序列,包括具有亚型(isoform)、突变基因、剪接变体和多态性的序列。
本文使用的术语“靶核酸”表示其表达或活性将被调节的任何核酸序列。所述靶核酸可以为DNA或RNA。
本文使用的术语“正义区”表示siNA分子中具有与靶核酸序列相同的序列的核苷酸序列。此外,siRNA分子的正义区可以包含与siNA分子的反义区互补的核酸序列。
本文使用的术语“反义区”表示siRNA分子中与靶核酸序列具有互补性的核苷酸序列。所述术语还涵盖与siRNA分子的正义区具有互补性的核酸序列。
本文使用的术语“互补”表示可以所述核酸可以与另一个核酸分子形成氢键(例如A-T、A-U、G-C)。
本文使用的术语“癌(癌症)”或“增殖性疾病”表示本领域已知的特点为细胞生长或复制失控的任何疾病、病症、特征、基因型或表型。该术语可以包含可以对细胞或组织中疾病相关的NuMA基因表达的单独调节或与其它疗法的组合作出响应的任何类型的癌症、肿瘤、淋巴瘤、恶性瘤。
除非特别指出,否则“一”表示“一个(种)或多个(种)”。
本发明涉及通过小干扰核酸(siRNA)分子调节NuMA基因表达。特别地,本发明涉及靶向NuMA的21mer、23mer或27mer小干扰核酸(siRNA)分子的化合物、组合物及其在调节NuMA表达中的应用。本发明的化合物可单独或与其它治疗或疗法组合用于癌症治疗。
在一个实施方案中,本发明通过小干扰核酸(siRNA)分子调节NuMA基因表达,所述小干扰核酸(siRNA)分子包括靶向NuMA的19-30mer siRNA,尤其包括21mer、23mer和27mer siRNA。在另一个实施方案中,本发明提供SNP特异性siRNA分子,从而为患者提供个体化治疗。与癌症相关的SNP是已知的。参见,例如WO 2005/014846A2,特别是第145-150页。示例性SNP包括以下(其中与乳癌相关的SNP用下划线表示):A-2315bp(T/A)、G-2337bp(A/G)、C-2381bp(G/C)、G-2617bp(A/G)、G-2932bp(T/C)、G-3369bp(A/G)、G-4422bp(G/A)、G-5896bp(C/T)、C-5981(C/A)、G-5473bp(T/C)、G-5516bp(G/T)、C-6034bp(C/T)、C-6048bp(C/A)、G-6145(C/T)、C-6288bp(G/A)、T-5288bp(C/T)。
在相关实施方案中,此19-31mer(包括21mer、23mer或27mer)siRNA分子可用于治疗不同类型的癌症,包括乳癌、肺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、宫颈癌、表皮样癌和口腔癌。在另一个实施方案中,本发明的siRNA分子可单独使用或者与其它疗法组合使用以有效控制癌症的治疗。
本发明还包括19-31mer(包括21mer、23mer和27mer)siRNA的组合物,其可以与不限于脂质、聚合物和单克隆抗体的结合物组合。
尽管本发明的一些实施方案重点阐述siRNA,但本文公开的内容并不解释为限于siRNA,而是还涵盖了利用小核酸分子、双链RNA(dsRNA)、小RNA(mRNA)、脱氧核糖核酸干扰(DNAi)和小发夹RNA(shRNA)分子、酶核酸分子(enzymatic nucleic acid)或反义核酸分子实施的相关组合物和方法。
所述小核酸分子可以为未经修饰的或者经过化学修饰的。在某些实施方案中,本发明涉及19-31mer(包括21mer、23mer和27mer)siRNA。在本发明中,通过降低靶蛋白的量(从而削弱与该蛋白相关的功能特性)的能力来测定siRNA的功效。
在另一个实施方案中,可以化学合成或酶促合成或由载体表达19-31mer(包括21mer、23mer和27mer)siRNA分子。在某些实施方案中,本发明提供化学合成的siRNA,其能够单独或者与其它siRNA(所述其它SIRNA靶向负责调节多种癌症的基因)组合用于降低NuMA的表达水平。
在某些实施方案中,本发明提供用于治疗包括乳癌、肺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、宫颈癌、表皮样癌、口腔癌、胶质瘤和白血病在内的多种类型的癌症的siRNA分子。
在一个实施方案中,本发明提供利用癌症生物标记物验证19-31mer(包括21mer、23mer或27mer)siRNA分子的功效的技术。本发明提供利用特定的肿瘤生物标记物诸如PCNA、Ki-67和BCL-2抗原表达来进行功效检测。
在一个实施方案中,本发明提供用于治疗包括乳癌、肺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、宫颈癌、表皮样癌、口腔癌、胶质瘤和白血病在内的多种类型的癌症的靶向NuMA的siRNA的组合。
在另一个实施方案中,本发明提供可以单独使用或与其它siRNA或小分子组合使用的siRNA分子,其中所述其它siRNA或小分子能够抑制NuMA表达以及与对细胞或组织中NuMA水平做出响应的癌症或其它病症或疾病相关的蛋白。一个实施方案是本发明的siRNA在与Genbank登录号NM_006185对应的表1中所示NuMA序列的编码基因的任何治疗中应用。
虽然本发明涉及调节NuMA的表达,但实施方案包括NuMA以及参与NuMA调节通路的其它基因的所有同源物、单核苷酸多态性(SNP)和转录变体。
在一个实施方案中,本发明的核酸分子在至少一条链上包含19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个碱基对。
在另一个实施方案中,本发明的核酸分子包含与具有NuMA核酸序列的RNA互补的19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个碱基对。
在一个实施方案中,本发明的siRNA分子包括双链RNA,其中所述RNA的一条链与NuMA的RNA互补。在另一个实施方案中,本发明的siRNA分子包括双链RNA,其中所述RNA的一条链包含具有NuMA序列的RNA序列的一部分。
在另一个实施方案中,表达载体编码以表达本发明的核酸分子。在另一个实施方案中,本发明的表达载体还包含与NuMA亚基的RNA互补的反义核酸分子。在再一个实施方案中,本发明的表达载体包含编码两个或更多个酶核酸分子(其可以相同或不同)的核酸序列。
在一个实施方案中,本发明提供包含本发明的核酸分子的哺乳动物细胞,例如人细胞。
本发明提供下调细胞中NuMA活性的方法,其包括在适合下调NuMA活性的条件下使本发明的核酸分子与所述细胞接触。
本发明还提供治疗患有与NuMA水平提高相关的病症的受试者的方法,其包括在适合此治疗的条件下使本发明的核酸分子与所述受试者的细胞接触。
在一个实施方案中,本发明还提供治疗患有与NuMA水平相关的病症的受试者的方法,其包括在适合此治疗的条件下使本发明的核酸分子与所述受试者的细胞接触。
在一个实施方案中,本发明的治疗方法还包括在适合所述治疗的条件下使用一种或多种药物疗法。本发明涉及的药物疗法包括单克隆抗体、化疗或放疗或其组合。
本发明还提供癌症治疗方法,所述癌症包括但不限于乳癌、肺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、脑癌、食道癌、胃癌、膀胱癌、胰腺癌、宫颈癌、头颈癌、卵巢癌、黑色素瘤、淋巴瘤、胶质瘤或多药耐药癌,所述方法包括在适合所述治疗的条件下向受试者施用本发明的核酸分子。
本发明提供组合物,其包含于药学上可接受的载体中的本发明的核酸分子。
本发明还提供向细胞(例如哺乳动物细胞,如人细胞)施用本发明的核酸分子的方法,其中所述细胞可以在培养中,或者在哺乳动物(例如人)体中,该方法包括在适合所述施用的条件下使细胞与所述核酸分子接触。所述施用方法可以在递送试剂(例如脂质、阳离子脂质、磷脂或脂质体)存在下进行。
本发明提供siRNA化合物其在调节NuMA基因表达中的应用。按照以下设计并研究所述化合物:
1.siRNA的设计
2.siRNA的制备
3.检测所述化合物的功效
4.21mer、23mer和27mer siRNA分子的比较数据
5.在动物模型中的功效评价
siRNA的设计包括设计用于调节NuMA的21个核苷酸的分子、23个核苷酸的分子和27个核苷酸的分子。对于所有的siRNA,无论其长度如何,都需要考虑以下一般性要求:
i.不允许有4个和或更多个连续的A、T、G或U核苷酸片段;
ii.避免使用诱导干扰素响应的以下序列:(A)5’-UGUGU-3’和(B)5’-GUCCUUCAA-3’;
iii.在以下参数下利用计算机(in-silico)通过BLAST检索核查各个siRNA双链从而避免脱靶效应的沉默:
A.除去低复杂度过滤从而避免由无意义的BLAST而引起查询序列有限或无查询序列(limited or no query sequencer)。
B.词长(word size)设定为7个字母,这是该算法的最小值。
C.将期望值的阈值设定为1000,从而避免出现短序列的可能性。此外,筛选靶基因NuMA的可接近位点,并根据ORF序列合成siRNA。
通过商业化方法进行siRNA的合成。大多数情况下,可以通过Qiagen提供的标准化学技术合成这些序列。所述化学方法包括依次加入被称为亚磷酰胺(phospharmidite)的受化学保护的单体单元,从而产生预期的寡核苷酸序列。所述合成主要包括四个步骤,例如偶联、加帽、氧化和5′-脱保护。通过PAGE、脱盐或通过IE-HPLC完成siRNA分子的纯化。通过MALDI-TOF分析各siRNA的质量,并通过综合分光光度计测定其产量。
在不同的细胞系中进行siRNA分子的功效测定。从ATCC获得以下细胞系,并根据ATCC推荐的方式培养:MCF-7(乳癌),SKBR-3(乳癌),PC3(前列腺癌),A549(肺癌),A431(皮肤癌)和HeLa(宫颈癌)。用siRNA转染细胞系,并进行温育。
通过计算转染16小时后具有Cy3标记siRNA的细胞数,获得各细胞系的转染效率。
除了转染百分数外,还观察了与未处理细胞系相比所述细胞系的形态特征。
通过对癌细胞系增殖的抑制效率来检测不同长度siRNA的功效。转染siRNA 72小时后,根据Calbiochem的说明书,用5-溴-2脱氧尿嘧啶(BrdU)温育细胞。该实验测定了向活跃增殖细胞的DNA中掺入BrdU的能力。通过吸光度值估测BrdU的掺入量,并与模拟体处理的细胞进行比较。已知BrdU的掺入仅在DNA合成时发生。在有丝分裂S-期,发生DNA合成,从而引起染色体的加倍。在癌细胞中,处于DNA合成过程中的细胞数量表示引起肿瘤生长的细胞的生长潜能。因此,掺入到细胞中的BrdU的量与肿瘤细胞的生长潜能直接成正比。
另外,还利用实时定量PCR分析,对用siRNA转染的细胞中特定mRNA的敲减效果进行分析。测定用NuMA特异性siRNA转染的细胞或用错义siRNA转染的细胞中NuMA mRNA的相对量,并通过Kenneth JL and ThomasDS“Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCRand 2-ΔCt method”Methods 25:402-408(2001)中记载的方法测定mRNA水平的变化倍数。
通过测定PCNA(增殖细胞核抗原)或Ki-67抗原的水平,获得用siRNA分子处理的癌细胞系的增殖和转移潜能。
通过Western印迹分析NuMA的蛋白水平。虽然siRNA的转染引起靶mRNA水平的成功敲减,但细胞具有弥补所述mRNA损失的多种机制,例如通过增强基因表达以满足细胞对所需蛋白的需求。因此,本发明中siRNA的功效通过降低靶蛋白的量(从而削弱与该蛋白相关的功能特性)的能力来测定。
如上文所述,NuMA蛋白水平的抑制对细胞的代谢活性具有多种可导致细胞功能受到破坏的作用。这可以通过集落形成试验进行测定,该试验主要鉴定了单个癌细胞启动细胞周期过程从而引起肿瘤发展(如果细胞转移)的能力。
通过分析由于细胞膜完整性受损引起的LDH向培养基中的释放量,来研究用siRNA转染的细胞系的细胞毒性。如上文所述,NuMA的敲减引起纺锤体极不能正确组装,从而导致细胞分裂失败。这引起有丝分裂检查点的激活,从而引起细胞周期阻滞。这些细胞可能丧失了细胞膜完整性,从而导致细胞毒性LDH的释放。
发现NuMA位于纺锤体极,并负责微管负端在纺锤体极的汇集。为了在细胞分裂过程中具有功能,要求NuMA以恰当的位置和数量进行定位。NuMA和纺锤体极共定位的缺失导致缺陷性纺锤体组装。虽然可以使用诸如mRNA定量和蛋白定量的方法,但这些方法都不能显示细胞正常功能所需的NuMA的最小阈值水平。本发明的目的是测定与模拟物处理的对照相比,可以共定位至其作用位点的NuMA的量。
评价siRNA对干扰素产生的影响,从而确定是否存在对外源核酸的引入产生的任何不利响应。
通过测定siRNA抑制肿瘤生长的能力或引起肿瘤消退的能力,对siRNA进行临床前评价。向6-8周龄裸鼠皮下或静脉内注射密度为10,000,000个细胞/100μL体积的结肠癌细胞系CCL-247(得自于ATCC)。移植瘤的体积(mm3)达80-100mm尺寸时,用针对NuMA的siRNA处理肿瘤。
RINA 25处理的动物显示NuMA蛋白的敲减,并且在3只经处理动物中,有1只观察到了肿瘤消退。
以下实施例用于证明本发明的某些实施方案。本领域技术人员可以理解,以下实施例中公开的技术代表了本发明人发现在本发明的实践中功能良好的技术。然而,本领域技术人员理解,根据本发明公开的内容可以在所公开的具体实施方案中进行很多变化并获得相似或相近的结果,而不偏离本发明的精神和范围。
实施例1:设计用于调节NuMA的21mer、23mer和27mer siRNA
根据以下文献设计21mer、23mer或27mer siRNA:Henshel,A et al.,“DEQOR:A web based tool for the design and quality control of siRNAs,”Nucleic Acids Res.2004;32:W113-W120;Ui-Tei,K,et al.,“Guidelines for theselection of highly effective siRNA sequences for mammalian and chick RNAinterference,”Nucleic Acid Res.2004;32(3):936-48;Sui,G.,et al.,“A DNAvector based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells,”Proc.Natl.Acad.Sci USA 2002;26(2):199-213;Kim,D.H.,et al.,“SyntheticdsRNA dicer-substrates enhance RNAi in plasmacytoid dendritic cells throughTLR7,”Nature Medicine 2005;11:263-270;Judge,A.D.,et al.,“Sequencedependent stimulation of the mammalian innate immune response by syntheticsiRNA,”Nat.Biotechnol.2005;23(4):457-62。在设计siRNA时需要满足以下基本要求:
对于21mer siRNA的设计:
1.所有siRNA都具有30-50%的GC含量;
2.各siRNA的3’都具有dTdT悬端。
对于23mer siRNA的设计:
1.所有siRNA在5’端都以G/C起始;
2.各siRNA的3’都具有dTdT悬端;
3.双链的GC含量在40-50%之间。
对于27mer siRNA的设计:
1.双链的GC含量在40-55%之间;
2.正义链为25个核苷酸,而反义链为27个核苷酸,从而导致反义链的3’具有悬端;
3.正义链的3’最后2个核苷酸包含脱氧糖而非核糖骨架。
4.正义链的5’具有悬端,而3’为平端。
利用可从网络上获取的各种算法和其它手工分析法筛选NuMA序列中可以满足上述标准的可接近位点。根据这些标准,鉴定出以下位点。
表1:用于合成siRNA的NuMA的靶ORF序列
SIRNA | RINA | 基因号 | ORF内的靶序列 | 起始位点 | 终止位点 | SEQIDNO: |
1(21mer) | 1 | NM_006185 | 5’-GAGGTACGATTCCGGAGAA-3’ | 20 | 40 | 1 |
2(23mer) | 9 | NM_006185 | 5’-GACCATGAGGACGGGCTAAAC-3’ | 578 | 598 | 2 |
3(27mer) | 25 | NM_006185 | 5’-CGAGAAGGATGCACAGATAGCCATG-3’ | 905 | 929 | 3 |
实施例2:siRNA分子的制备
利用诸如Applied Biosystems、Beckman等多个公司的可商购仪器,通过化学方式合成RNAi分子。这些分子可以通过以下任何标准化学法合成或购自Qiagen。根据在核糖2′-碳位引入的保护基团的类型对化学法进行分类:
1.2’-叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)
2.2’-O-三异丙基甲硅氧基甲基(TOM)
3.2’-乙酰氧基乙氧基化学(ACE)
该循环开始于结合在固相支持物或珠子上的3’-起始核苷。第二核苷偶联在第一核苷的5-羟基上。加帽抑制错误核苷或短核苷的增长(propagation)。然后,将核苷间磷酸键氧化为最终的P(V)态。最后,除去新核苷酸上的5’-保护基团,将形成的寡核苷酸用于下一个核苷酸的加入。核酸分子达到预期长度后,还要对其进行脱保护、从固相支持物上切下并分析其纯度和产量。
纯化:
通过脱盐或PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)或通过离子交换-高效液相色谱(IE-HPLC)对siRNA进行纯化。通过MALDI-TOF分析各核苷酸链的质量,并通过在30nm的积分分光光度吸收值测定产量。在通过MALDI-TOF进行的质量控制过程中,与预定值的最大允许差异是4个原子质量单位的差异。获得各个链的可比较产量后,使正义链和反义链退火,并真空冻干。使用时,将冻干粉悬浮在RNA悬浮缓冲液(100mM KCl、30mM HEPES缓冲液(pH7.5)和1mM MgCl2)中,在90℃加热1分钟,并在37℃温育1小时,以溶解冻干粉。通过这些制备方法,合成以下siRNA(表2)。
表2:针对NuMA的siRNA的合成及其末端修饰
RINA | 具有悬端的双链序列 | 产量 | SEQ IDNO |
1正义链反义链 | 5’r(GAG GUA CGAUUC CGG AGA A)dTdT3’5’r(UUC UCC GGAAUC GUA CCU C)dTdT 3’ | 296μgmL-1 | 4和5 |
9正义链反义链 | 5’r(GAC CAU GAG GAC GGG CUA AAC)dTdT 3’5’r(GUU UAG CCC GUC CUC AUG GUC)dTdT 3’ | 325μgmL- | 6和7 |
25正义链反义链 | 5’r(CGA GAA GGA UGC ACA GAU AGCCA)dTdG 3’5’r(CAU GGC UAU CUG UGC AUC CUU CUCGGU)3’ | 297μgmL-1 | 8和9 |
10正义链反义链 | 5’r(GAG GAG GAA GCG CCC AAU AUC)dTdT 3’5’r(GAU AUU GGG CGC UUC CUC CUC)dTdT 3’ | 325μgmL-1 | 10和11 |
RINA 10是错义序列,表示其不能靶向任何目标基因。将该序列作为阴性对照,在试验中称为模拟物处理。
实施例3:NuMA在不同癌细胞系中的表达分析
A)通过实时定量PCR的基因表达分析:
比较不同癌细胞系相对于正常二倍体细胞(视网膜色素上皮细胞(RPE-19)和人成纤维细胞(HFF-2))的NuMA水平。通过实时定量PCR比较基因的表达水平。在本研究中使用的癌细胞系包括乳癌细胞系(HTB-26、MCF-7和SKBR-3)、结肠癌细胞(CCL-247和HTB-38)、非小细胞肺癌细胞系(A549)和宫颈癌细胞系(HeLa)。利用经过略有改动的Qiagen Fast lane cell cDNA试剂盒制备用于实时PCR分析的第一链cDNA。简而言之,沉淀20,000个细胞,并用FCW缓冲液(Qiagen,德国)洗涤一次。在室温下利用缓冲液FCP(Qiagen,德国)裂解细胞15分钟。通过加入gDNA wipeout缓冲液(Qiagen,德国)在42.5℃温育30分钟,除去基因组DNA污染。通过加入Quantiscript反转录酶在42.5℃温育45分钟然后在95℃温育3分钟,合成第一链cDNA。所制备的第一链cDNA或者立即用于实时定量PCR,或者在-20℃贮存备用。
细胞系的汇集度维持在60-70%。在收集细胞前24小时加入新鲜培养基。如上所述,根据Fast lane cell cDNA试剂盒(Qiagen)的方法,利用实验细胞制备第一链cDNA。
与正常的二倍体细胞相比,癌细胞中NuMA的表达相差数倍。如表3所示,在所检测的癌细胞中,乳癌细胞系SKBR-3显示最高表达(分别是HFF-2和ARPE-19细胞的365%和308%),而在宫颈癌细胞系Hela中,NuMA处表达下调(分别为正常细胞HFF-2和ARPE-19的61.61%和51.95%)。
表3:与非癌细胞系相比,NuMA在不同癌细胞系中表达水平的百分数变化
实施例4:功效的检测
A)在不同细胞系中
寡核苷酸转染/siRNA转染:
从ATCC获取HTB-26、MCF-7、HCC-38和SKBR-3(乳癌细胞),CCL-247和HTB-38(结肠癌),A549(肺癌),HeLa(宫颈癌),PC-3(前列腺癌),A431(表皮样癌),HFF-2(正常二倍体纤维细胞)和ARPE-19(正常二倍体视网膜色素上皮细胞)细胞系,使其在于T-25瓶中保持70-80%的汇集度并在转染前24小时更换培养基。用于siRNA转染的细胞系传代次数不超过10次。转染时,用胰蛋白酶消化并以适当的细胞密度重新接种在24孔平板或者任何其它用于标准组织培养的一次性塑料皿中。除非另有说明,否则所有转染都在24孔板中进行,并根据用于给定试验的细胞系而改变细胞密度。在转染前1小时,以适当的细胞密度对24孔板的各个孔进行接种(生长培养基不超过400μL),并在含5%CO2的37℃培养箱中温育。将siRNA稀释到10nM的终浓度(向97μL Opti-MEM I中加入0.3μL 20μM的siRNA储备液),向其中加入3μL Hiperfect转染试剂(Qiagen),涡旋,并在室温下温育10分钟。在所有试验中都使用RINA 10作为阴性对照。
将siRNA-脂质体复合体充分混合,并轻柔地逐滴加入到含细胞的各个孔中,然后在37℃、5%的CO2中温育。通过计算转染16小时后具有Cy3标记的siRNA的细胞数,获得各细胞系的转染效率。用胰蛋白酶消化细胞,在PBS中洗涤1次,并悬浮在PBS中。利用倒置荧光显微镜观察细胞,并计算15个不同视野中的荧光细胞数和细胞总数。Cy3标记的细胞百分数反映了转染的效率,其在肺癌细胞系A549的70%至乳癌细胞系MCF-7的99%之间变化。
表4:通过Cy3标记的siRNA测定的不同细胞系的转染效率的百分数。
转染的细胞系 | %转染 |
HTB-26 | 98.00±0.9 |
MCF-7 | 99.00±0.2 |
HCC-38 | 90.00±4.0 |
SKBR-3 | 96.00±0.5 |
CCL-247 | 96.00±1.6 |
A549 | 70.00±1.0 |
HeLa | 97.00±5.0 |
PC3 | 85±3.0 |
HFF-2 | 93±1.0 |
ARPE-19 | 85±5.0 |
B)结肠癌细胞系CCL-247中NuMA的敲减使其无法定位在纺锤体 极:
通过用RINA 25和RINA 10转染结肠癌细胞CCL-247,研究NuMA敲减对细胞形态以及其分布的影响。转染72小时结束时,将细胞在乙醇中固定5分钟,然后根据Goding JW.,“Monoclonal Antibodies:principles and practice,”3rd ed.London:Academic Press.p 141-191;352-399(1996)的方法进行免疫荧光染色。在荧光显微镜下观察细胞,并比较未处理的细胞和用RINA 25或RINA 10处理的细胞。NuMA敲减对细胞形态没有影响。由于细胞质或纺锤体极中NuMA蛋白的水平降低,用RINA 25处理的细胞不能染色。如图1所示,在用RINA 10处理或未经处理的细胞中,观察到NuMA在有丝分裂过程中位于纺锤体极,以及遍布于细胞质中。所获得的结果表明,RINA 25可以成功地敲减了NuMA的表达。
C)鉴定所设计的不同siRNA在抑制癌细胞系增殖中的潜能
用RINA 1、9、25或10转染SKBR-3和HCC-38(乳癌)细胞系。转染24小时后,以8000个细胞/孔的密度将细胞一式三份地铺在96孔板的各个孔中。72小时后,将细胞与BrdU一起温育3小时。通过加入固定试剂终止BrdU的掺入,对细胞进行渗透处理从而允许利用抗BrdU抗体进行标记。所述抗体与辣根过氧化物酶(HRP)结合,而辣根过氧化物酶可以将H2O2转化为能够使用540nm的标准滤光器通过450nm的吸收值测定的发色产物。所述吸收值可用于估测与用RINA 10(阴性对照siRNA)处理的细胞相比,用siRNA处理后处于S-期的细胞比例。所有试验都进行一式三份,并得到其平均值和标准偏差。通过配对双尾t检验(P≤0.05)计算RINA 10处理的细胞与RINA 25处理的细胞之间的统计学显著性。用RINA 25转染后,癌细胞系SKBR-3和HCC-38的BrdU掺入分别为69%和41%。与用RINA 10处理的细胞相比,用RINA 1或RINA 9对细胞进行处理也引起BrdU掺入的降低,但降低程度小于用RINA 25处理的细胞(表5)。发现在RINA 10处理的细胞和所有siRNA处理的细胞间,在RINA 1和RINA 25处理的细胞间,在RINA 9和RINA 25处理的细胞间,在RINA 1和RINA 9处理的细胞间以及在RINA 25和RINA10处理的细胞间具有统计学显著性。这些结果表明,RINA 25比RINA 1和RINA9更有效。
表5:在siRNA转染72小时后,通过BrdU掺入计算的处于细胞周期S-期的细胞百分数*
细胞系(癌) | RINA1 | RINA9 | RINA25 |
SKBR-3(乳癌) | 99±0.1 | 91±0.2 | 69±0.19 |
HCC-38(乳癌) | 51±0.09 | 69±0.01 | 41±0.17 |
*相对于RINA 10(阴性siRNA)处理的细胞的百分数。
D)实时定量PCR分析:
不受理论的束缚,认为用siRNA转染细胞可引起RNAi通路的激活,其中与siRNA互补的mRNA被降解,从而降低mRNA的水平。可以通过测定siRNA转染后mRNA的水平,计算siRNA的功效(不过应当通过蛋白质水平确认最终确定的功效)。利用实时定量PCR测定与未经处理的细胞相比,利用siRNA转染的不同细胞系mRNA的水平。
表5:与未经处理的对照组细胞,siRNA转染72小时后不同细胞系NuMA的mRNA水平降低的倍数
细胞系 | RINA1 | RINA9 | RINA25 |
非小细胞肺癌(A549) | 4.31 | 2.86 | 4.35 |
乳癌细胞系(MCF-7) | 2.36 | 1.02 | 13.17 |
乳癌细胞系(SKBR-3) | 18.18 | 1.66 | 5.04 |
表皮样癌细胞系(A431) | N.D | 3.83 | 3.23 |
正常二倍体成纤维细胞(HHF-2) | 1.24 | 1.21 | 1.06 |
总之,当用RINA 25转染时,乳癌细胞系MCF-7和HTB-26显示最大的敲减效率。
E)NuMA蛋白水平的分析
转染72小时后,提取用siRNA转染的A549、HFF-2、A431和PC3细胞的总蛋白。与阴性siRNA处理样品相比,siRNA处理使NuMA蛋白水平的表达降低达90%(如图2)。蛋白表达的下降反映了实时PCR中观察到的mRNA水平的下降。
如图2所示,在不同的RINA中,与可观察到痕量蛋白的RINA 1处理和RINA9处理相比,RINA25使蛋白水平完全敲减。
实施例5:抗癌特性的体外检测
A)集落形成试验:
使用集落形成试验评价经siRNA处理的细胞启动并发展成肿瘤的能力。对24-孔板中的细胞(Hela、A549和CCL-247)转染24小时后,用胰蛋白酶处理细胞,计数并以300个细胞/板的浓度重铺在6孔板中,一式三份。同样制备了经模拟物处理的细胞系和未经处理的细胞系作为对照。温育10天后,用PBS洗涤细胞一次,并用300μL 0.1%的结晶紫染色5分钟,然后用PBS洗涤3次。该染色可以在图3中观察到,其中显示了CCL-247癌细胞。
在光学显微镜下对具有至少60个细胞的集落进行计数。利用下式获得集落形成的抑制百分数:
集落形成的抑制率=(对照的集落形成率-试验的集落形成率)/对照的集落形成率×100。
由三份重复的平均数获得各处理的集落形成单位的平均百分数和标准偏差。获得相对于模拟物处理的细胞的集落形成效率/存活率的百分数。
表6:siRNA转染10天后,通过结晶紫染色计算相对于模拟物处理的对照的集落形成单位(CFU)百分数。
细胞系 | 处理 | 集落形成的百分数(%) |
Hela(宫颈癌) | RINA25RINA10未处理 | 56.00±2.15*99.50±6.95100.00±0.2 |
A549(非小细胞肺癌) | RINA25RINA10未处理 | 78.60±2.47*105.18±9.73100.01±0.11 |
CCL-247(结肠癌) | RINA25RINA10未处理 | 58.65±27.26*90.00±0.38100.00±6.0 |
*相对于未处理的细胞和模拟物处理的细胞具有统计学上的显著性,P≤0.05。
根据细胞系,对不同细胞系的处理相对于未处理组对集落形成能力的抑制为56%-78%(表6)。HeLa细胞显示最小的集落形成(56%),而A549显示最大的集落形成(78%)。
B)siRNA转染对癌细胞的细胞毒性和/或细胞膜完整性的影响
利用LDH释放测定水平降低的NuMA对转染细胞的细胞毒性。用siRNA转染癌细胞系,并以20,000细胞/孔的浓度铺在24孔板中,一式三份。72小时后,对细胞进行简单离心以清除死亡的漂浮细胞,并将100μL用过的培养基加入到单个96孔板中以根据Sigma LDH检测试剂盒(TOX-7)的说明书评价LDH。利用690nm的标准滤光器测量在490nm的吸收值。如表7所示,根据三个重复孔计算平均值和标准偏差,并与未处理的细胞进行比较。
表7.在各种癌细胞系中敲减NuMA对LDH释放的影响*
细胞系 | 处理 | LDH的释放百分数(%) |
HTB-26 | RINA25RINA10未处理 | 114.39±5.30103.58±3.68100.00±0.01 |
CCL-247 | RINA25RINA10未处理 | 173.82±22.23210.39±35.58100.00±0.005 |
MCF-7 | RINA25RINA10未处理 | 315.50±4.853233.12±9.238100.00±0.0022 |
SKBR-3 | RINA25RINA10未处理 | 131.24±36.86124.49±16.02100.00±0.003 |
HCC-38 | RINA25RINA10未处理 | 133.60±11.28119.52±3.73100.00±0.004 |
PC3 | RINA25RINA10未处理 | 105.62±1.1698.30±0.48100.00±0 |
Hela | RINA25RINA10未处理 | 267.58±64.45240.99±75.11100.00±0.005 |
A549 | RINA25RINA10未处理 | 141.17±26.66112.05±5.95100.00±0 |
*与阴性对照RINA 10处理相比没有统计学显著性。
所得结果表明,与RINA 10处理的细胞相比,所检测的任一细胞系都没有显著的LDH释放。这表明,对NuMA表达的抑制没有细胞毒性。
C)siRNA转染对癌细胞系细胞周期的影响:
由于癌细胞一直处于增殖状态,在给定时间处于细胞周期的S-期的细胞数量决定了肿瘤的生长潜能。以8000个细胞/孔的密度将经siRNA处理的细胞(乳癌细胞HTB-26、MCF-7、HCC-38,结肠癌细胞CCL-247,肺癌细胞A549,宫颈癌细胞HeLa和前列腺癌细胞PC3)铺在96孔板中,以测定RINA25对细胞周期的影响,并由此测定其控制癌细胞系的生长指数的能力。如上所述,转染72小时后向细胞掺入BrdU,以测定处于细胞周期的S-期的细胞数量。根据吸收值,获得处于细胞周期的S-期的细胞相对于模拟物处理的细胞的百分数。所有试验都进行一式三份,并获得其平均值和标准偏差。
表8:在siRNA转染72小时后,通过BrdU掺入计算处于细胞周期的S-期的细胞的百分数。
细胞系(癌) | RINA25 | RINA10 |
HTB-26(乳癌) | 68.90±6.12* | 99.56±5.68 |
MCF-7(乳癌) | 75.85±3.45* | 92.90±8.22 |
HCC-38(乳癌) | 41.00±0.17* | 99.44±25.03 |
SKBR-3(乳癌) | 69.19±0.19* | 99.78±1.95 |
CCL-247(结肠癌) | 53.53±53.04* | 84.11±38.72 |
A549(肺癌) | 82.47±16.53 | 90.09±7.71 |
HeLa(宫颈癌) | 85.33±0.93* | 96.64±17.55 |
PC3(前列腺癌) | 78.79±5.73* | 100.34±1.95 |
*通过学生t检验计算相对于未处理的细胞的统计学显著性,P≤0.05。
在所检测的细胞系中,相对于模拟物处理的细胞,乳癌细胞系HCC-38显示仅41%的细胞处于细胞周期的S-期,而宫颈癌细胞Hela显示有85%的细胞处于S-期。
D)NuMA敲减对细胞周期的影响
72小时后,收集用RINA 25和RINA 10转染的癌细胞系。用PBS洗涤细胞,并在4℃在70%的冰冷乙醇中固定60分钟。然后用PBS洗涤细胞,并于4℃用溴化乙锭处理30分钟。利用FACS caliber(Becton Dickinson)对经溴化乙锭染色的细胞进行流式分析。利用Cell quest软件获取10,000个设门事件(gated event)的数据,并利用ModfitLT2.0(Verity Software House,Topsham,Me)分析。NuMA的敲减诱导凋亡。
如表10和11以及图4所示,(利用RINA 25)敲减NuMA导致在非小细胞肺癌细胞A549、乳癌细胞MCF-7和结肠癌细胞系CCL-247中诱导凋亡。另外,NuMA敲减还抑制细胞周期的S-期,而细胞周期的S-期表现了癌性细胞的增殖潜能。
表9.NuMA对癌症抑制;用RINA 25转染72小时的癌细胞系的流式细胞术分析。
细胞系和凋亡 | 第72小时的细胞周期阶段 | RINA25敲减的细胞(%) | 用RINA10处理的细胞(%) | 未处理 |
A549 | Go/G1SG2/M凋亡 | 44.9505.3604.9843.53 | 67.1210.1007.8013.68 | 70.5909.1409.2109.90 |
MCF-7 | Go/G1SG2/M凋亡 | 18.7302.8807.9766.02 | 22.3414.9712.8842.39 | 44.1621.6603.8214.29 |
CCL-247 | Go/G1SG2/M凋亡 | 21.8308.9520.1627.08 | 33.1611.0723.7906.46 | 34.4123.0912.7502.53 |
E)各癌细胞系的siRNA转染对干扰素响应的诱导:
根据本文其他地方的阐述将RINA 25和10转染入不同的癌细胞系中,并在24孔板中温育72小时。72小时结束时,离心平板除去死亡的细胞,并将100μL上清于4℃在圆底ELISA板内温育。然后,用PBST(含0.1%Tween20的磷酸盐缓冲液)洗涤细胞以除去未结合的抗原,并在室温下与5%的脱脂奶粉一起温育30分钟。然后,如上所述将孔用PBST洗涤三次,并再与结合有HRP的山羊抗兔抗体在室温下温育1小时。温育结束时,加入HRP底物。由三份重复计算吸收值,结果示于表10和11中。
表10.siRNA转染对诱导干扰素α响应的影响
细胞系 | siRNA | 干扰素α响应(ng) |
HTB-26 | RINA25RINA10未处理BSA | 19.03±17.9222*18.27±17.744318.30±18.322517.11±18.0524 |
*表示通过学生t检验计算,与其他处理相比在统计学上没有显著性(P≤0.05)。
表11.siRNA转染对诱导干扰素β响应的影响
细胞系 | siRNA | 干扰素β响应(pg/ml) |
HTB-26 | RINA25RINA10未处理BSA | 2.82±0.5720*2.69±0.44802.66±0.26192.48±0 |
*表示通过学生t检验计算,与其他处理相比在统计学上没有显著性(P≤0.05)。
siRNA转染常伴随IFN-α和IFN-β的产生。然而,在RINA处理细胞和未处理细胞中均没有统计学显著的IFN-α或IFN-β释放,这表明RINA 25没有引发任何IFNα响应。
F)对转录的影响
为了检测siRNA的特异性,如上所述,使用siRNA转染乳癌细胞HTB-26。在转染72小时结束时,按照Qiagen总RNA提取试剂盒(RNeasy Minikit)的说明书制备总RNA。将2μg总RNA悬浮在10μL水中。利用AgilentTechnologies的纳米芯片(nano-chip)在Bioanalyzer上检测RNA的质量。将1μg总RNA转化为生物素化的扩增RNA,用于与Illumina Sentrix阵列杂交。在该方法中涉及的步骤包括利用带有T7启动子的寡聚(dT)引物,通过ArrayScript对总RNA进行反转录。利用DNA聚合酶和RNase实现第二链的合成。纯化双链cDNA,并进行体外转录以合成生物素化的cRNA。将cRNA杂交(人全基因组的8-样品芯片)过夜,并用链霉亲和素-Cy3探针检测。在检测结束时,干燥Illumina Bead芯片,并用Bead Studio分析仪软件扫描。对所得结果进行分析,以获得未处理样品、RINA 10处理样品和RINA25处理样品间的基因表达差异。
利用Bead studio分析仪差异表达软件,对平均信号进行标准化,并以+/-13.6的差异(“diff”)打分进行“t检验”。鉴定了RINA 25处理样品、RINA10处理样品和未处理样品间的所有差异表达基因。将差异表达的探针ID分类,以得到下调或未调节的基因数。转录组表达水平的变化示于图5,显示了与阴性siRNA处理对照相比上调或下调的基因数。
G.裸鼠中的功效研究
为了检测siRNA在体内的功效,通过以10,000,000个细胞/100μL体积PBS的密度向一侧肋皮下注射人结肠癌细胞系CCL247,从而向6-8周龄的雌性裸鼠中引入结肠癌肿瘤移植物。在2周结束时,小鼠形成大约80-100mm3的肿瘤。将小鼠分为两组。组B由用RINA 25处理的3只动物组成,组A由用安慰剂处理的3只动物组成。每隔一天以10mg RINA/kg体重对动物进行处理。5次剂量后,取出肿瘤并通过蛋白印迹分析NuMA敲减。在RINA 25处理的动物中,NuMA水平相对于安慰剂处理组降低(图6)。这表明,RINA 25能够在体内条件下敲减结肠癌中的NuMA。在3只动物中,与所有其他动物相比,动物B-11在第7天和第11天显示最少的百分生长率(表12)。
表12.RINA 25敲减NuMA对肿瘤消退的影响
*组A-表示安慰剂处理的动物,其中向动物施用非特异性核酸。组B-表示施用RINA 25的动物。
根据本发明公开的内容,而不需要过度试验即可制备和实施本发明所公开和请求保护的所有组合物和方法。虽然已经在某些实施方案中对本发明的组合物和方法进行了阐述,但是本领域的技术人员清楚,在不背离本发明的概念、精神和范围的前提下,各种改变可以应用于本发明阐述的组合物和/或方法以及方法的步骤或步骤的顺序中。更具体地,显然,可以使用某些化学或生理相关的试剂代替本发明所阐述的试剂而获得相同或类似的结果。对于本领域技术人员来说,显然,所有类似的替代和修改都被视为在本发明的精神、范围和概念内。
序列表
<110>阿迪帕利·穆拉里
查德拉·韦迪亚达·瑞迪·古帕瓦莱·艾斯瓦尔
比玛兰度·拉伊·克里提
<120>用于癌症治疗的RNAi介导的NuMA敲减
<130>RLS PCT 027
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<170>PatentIn Ver.3.3
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<213>人类
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guuuagcccg uccucauggu ctt 23
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gauauugggc gcuuccuccu ctt 23
Claims (17)
1.siRNA,其靶向Genbank登录号为NM_006185的NuMA mRNA的第20-40、578-598或905-929位核苷酸,其中至少一条链由长度为20-30个核苷酸的核苷酸链组成。
2.如权利要求1所述的siRNA,其靶向选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3组成的组的序列。
3.如权利要求2所述的siRNA,其中所述siRNA具有选自由以下组成的组的结构:
SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5;
SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7;和
SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9。
4.权利要求1-3中任一项所述的siRNA在制备用于降低靶细胞中NuMA表达的药物中的应用。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的siRNA在制备用于治疗癌症的药物中的应用。
6.如权利要求5所述的应用,其中所述癌症选自由以下组成的组:宫颈癌、表皮样癌、口腔癌、胶质瘤、白血病、脑癌、食道癌、胃癌、膀胱癌、胰腺癌、宫颈癌、头颈癌、卵巢癌、黑色素瘤、淋巴瘤和多药耐药癌。
7.如权利要求5所述的应用,其中所述癌症选自由结肠直肠癌、乳癌、肺癌和前列腺癌组成的组。
8.用于治疗癌症的组合物,其包含权利要求1-3中任一项所述的siRNA和药学上可接受的赋形剂。
9.如权利要求8所述的组合物,其中所述癌症选自由以下组成的组:宫颈癌、表皮样癌、口腔癌、胶质瘤、白血病、脑癌、食道癌、胃癌、膀胱癌、胰腺癌、宫颈癌、头颈癌、卵巢癌、黑色素瘤、淋巴瘤和多药耐药癌。
10.如权利要求8所述的组合物,其中所述癌症选自由结肠直肠癌、乳癌、肺癌和前列腺癌组成的组。
11.一种组合物,其包含调节NuMA表达的小核酸分子,其中所述小核酸分子的长度高达30个寡核苷酸,并且其中所述小核酸分子包含:
(a)与选自由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2组成的组的序列中至少19个连续核苷酸100%互补的核苷酸序列;或
(b)与SEQ ID NO:3中至少20个连续核苷酸100%互补的核苷酸序列。
12.如权利要求11所述的组合物,其中所述小核酸分子包含选自由以下组成的组的序列:
包含正义链SEQ ID NO:4和反义链SEQ ID NO:5的siRNA 1;
包含正义链SEQ ID NO:6和反义链SEQ ID NO:7的siRNA 9;和
包含正义链SEQ ID NO:8和反义链SEQ ID NO:9的siRNA 25。
13.一种组合物,其包含调节NuMA表达的长度高达30个寡核苷酸的小核酸分子,其中所述小核酸分子包含与选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3组成的组的整个序列互补的核苷酸序列。
14.调节NuMA表达的小核酸分子在制备用于调节细胞中NuMA表达的药物中的应用,其中所述小核酸分子的长度高达30个寡核苷酸,并且其中所述小核酸分子包含:
(a)与选自由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2组成的组的序列中至少19个连续核苷酸100%互补的核苷酸序列;或
(b)与SEQ ID NO:3中至少20个连续核苷酸100%互补的核苷酸序列。
15.如权利要求14所述的应用,其中所述小核酸分子选自由小干扰核酸(siNA)、小干扰RNA(SiRNA)、双链RNA(dsRNA)、小RNA(μRNA)、小发卡RNA(shRNA)和DNA干扰(DNAi)分子组成的组。
16.如权利要求14所述的应用,其中所述小核酸分子包含与Genbank登录号NM_006185的NuMA核苷酸序列中的序列100%互补的21-27个核苷酸。
17.如权利要求16所述的应用,其中所述小核酸分子包含与Genbank登录号NM_006185的NuMA核苷酸序列中的序列100%互补的23-27个核苷酸。
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