CN1111455A - 有丝分裂发生和运动发生的肽抑制物 - Google Patents

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Abstract

本发明在细胞生物学领域中涉及能够与细胞内 信号转导物相互作用从而干扰导致细胞增殖和之信 号转导途径的新的肽。可从单个氨基酸和/或预生 成的有两个或多个氨基酸残基的肽化学成本发明的 肽。本发明的肽可用于治疗肿瘤性疾病。

Description

本发明属于细胞生物学领域，涉及能够与细胞内信号转导物相互作用，从而干扰将导致细胞增殖和运动之信号转导途径的新的肽。
多肽生长因子通过使细胞表面受体与酪氨酸激酶酶促活性结合而介导其生理学反应（参见Ullrich，A.and    Schlessinger，J.Cell    61：203-211（1990））。
在结合这些配基之后，生长因子受体经受二聚作用，然后特异性酪氨酸残基发生自动磷酸化作用。
在蛋白质的细胞内环境中，存在着具有限定的生物学功能的分子，其可作为配基激活之酪氨酸激酶受体的底物。
近年来积累的实验数据表明，在与受体结合后，这些底物分子转变成激活的形式，并变成生长因子用以控制细胞增殖之关键性信号发送途径的一部分。
已表明许多介质对生长因子之细胞反应的细胞质分子可通过其SRC同源区2（SH2）区域与活化的受体相互作用（Koch，C.A.，et    al.，Science    252：668-674〔1991〕）。
SH2区域是约含100个氨基酸的保守的蛋白质组件，其可见于细胞质信号发送蛋白质的显著不同的基团中。
具有SH2区域的蛋白质常常具有另一个约50个残基的不同序列，即SH3区域，该区域在信号转导期间也卷入蛋白质-蛋白质相互作用的调节（参见Clark，S.G.，et    al.，Nature    356：340-344（1992）和其中所列的参考文献）。
配基后的受体自动磷酸化结合起到分子开关作用，以产生胞质信号发送蛋白质之SH2区域的结合位点，（Anderson，D.，et  al.，Science    250：979-982（1980）），从而使之变成活化的靶。
SH2区域直接识别磷酸酪氨酸（Matsuda，M.，et    al.，Science    248：1537-1539（1990））。
然而，正如原来经检查SH2结合位点所提出的，SH2区域的高亲和性结合需要使磷酸酪氨酸嵌入特异性氨基酸序列中（Cantley，L.C.，et    al.，Cell    64，281-302（1991））。
例如，含SH2的蛋白质磷酯酰肌醇（PT）3-激酶、Ras    GTP-ase激活蛋白质（Ras    GAP）和磷脂酶C-r（PLC-r）可各自与血小板衍生生长因子β受体的不同的自动磷酸化位点相结合（Kashishian，A.，et    al.，EMBO    J.11：1373-1382（1992）;Fantl，W.J.，et    al.，Cell    69：413-423（1992））。
也已在表皮生长因子受体（EGF-R）、集落刺激因子1受体（FGF-R）和成纤维细胞生长因子受体（FGF-R）中鉴定了起到PI3-激酶、PLC-r和Ras    GAP之特异性对接位点作用的自动磷酸化位点（Cantley，L.C.，et    al.，Cell    64：281-302（1991）;Mohammadi，  M.，et    al.，Mol.Cell.Biol.    11：5068-5078（1991）;Reedijk，M.，et    al.，EMBO    J.41：1365-1372（1992）;Rotin，D.，et    al.，EMBO    J.11：559-567（1992））。
业已证明相当于PDGF受体磷酸化位点的相对短的肽序列可抑制活化的PDGF受体和PI3-激酶间的相互作用（Escobedo，J.A.，et    al.，Mol.Cell.Biol.，11：1125-1132）。
与磷酸酪氨酸之C末端直接相连的残基，特别是在+1、+2和+3位的残基似乎可提供对特异性SH2区域的选择性。
因此，已在PDGF受体中鉴定了FI3-激酶之p85亚单位的识别型主（motif）：序列为Tyr-Met/Val-Xxx-Met（YMXM或YVXM）-其中Xxx和X分别是以三字母或一字母代表任何氨基酸（Domchek，S.M.，et    al.，Biochemistry    31：9865-7870（1992））。
对含SH2分子家族和各自识别型主之新成员的鉴定正在迅速进行。
已证明这些分子中有一些直接参与引发对配基的生物学反应。在配基刺激后，蛋白质Grb2通过其SH2区域与两EGF受体相联系就是这种情况。
将微量Grb2和H-ras注射到哺乳动物细胞中，可刺激DNA合成并进而导致有丝分裂发生（LowensteinmE.J.，et    al.，Cell    70：431-442（1992））。
这些结果表明，Grb2在生长因子控制ras信号发生的机制中起着关键性作用。
虽然近年来的工作主要集中在研究胞质信号发生蛋白质与最特异化的EGF和PDGF受体间的相互作用，但本发明人则将其注意力放在肝细胞生长因子（HGF）受体上。
也称为Scatter因子（SF）的HGF是一种由中胚层器官的细胞分泌的杂二聚体蛋白质（Stoker，M.，et    al.，Nature    327：239-242（1987）;Weidner，K.M.，et    al.，J.Cell    Biol.111：2097-2180（1990））。
该因子在上皮细胞中诱导了一系列生物学活性，其中包括有丝分裂发生、刺激细胞游动性及促进基质侵入（Nakamura，T.，et    al.，Biochem.Biophys.Res.，Comm.122：1450-1459（1984）;Stock，M.et    al.，Nutwre    327：239-242（1987）;Weidner，K.M.et    al.，J.Cell.Biol.111：2097-2180（1990）;Rubin，J.S.et    al.，Proc.Natl.Acad，Sci    USA    88：415-419（1991）。
HGF/SF也是一种体外成形物质（Stern，C.D.et    al.，Development    110：1271-1284（1990）;Montesano    et    al.，Cell    66：691-711（1991））和体外与体内的强有力的血管形成因子（Bussolino，M.F.，et    al.，J.Cell.Biol.119：629-641（1992））。
虽然HGF/SF的生物学效应因靶细胞而有所不同，但HGF/SF信号都是由信号受体（即由MFT原致癌基因编码的酪氨酸激酶所介导的（参见Comoglio，P.M.，I.D.Goldkerg    and    E.M.Rosen（eds），Mepatocyte    Growth    Factor-Scatter    Factor（HGF/SF）and    C-Met    Receptor，Birkhauser    Verlag    Basel/Switzer/and）。
HGF受体也称为p190MET，是一种细胞外α和跨膜β亚单位构成的杂二聚受体（Giordano，S.，et al.，Nature 339：155-156（1989）），二者是蛋白水解裂解170KDa的普通单链前体而产生的（Giordano，S.，et al.，Oncogene 4：1383-1388（1989））。
由人MET    c    DNA转染的NIH3T3成纤维细胞表达功能性受体并对HGF/SF反应，同时伴有游动性增加并侵入细胞外基质（Giordano.S.et    al.，PNAS    90：649-653（1993））。
在染色体重排（Park    et    al.，Cell    45：895-904（1986））、基因过表达（Giordano    S.et    al.，Nature    339：155-186（1989））、缺陷性翻译后加工（Mondino    et    al.，Mol.Cell.Biol.11：6084-6092（1991）和自动成环后，已在被转化细胞系中观察到HGF/SF受体的不受控制的酪氨酸激酶活性。
已在许多上皮来源的人肿瘤中观察到受体的过表达（Di    Renzo    et    al.，Oncogene    6：1997-2003（1991）;Di    Renzo    et    al.，Oncogene    7：2549-2553（1992）;Prat    et    al.，Int.J.Cancer    49：323-328（1991））。
这一事实有力地表明了HGF/SF受体的致癌基因的潜在力。
关于由HGF/SF激发的信号转导途径所知甚少。
由该因子诱导的多效性生物学反应提高可能一个以上的机制被激活。
本发明人以前已证明过，HGF/SF受体在体外的自动磷酸化与PI3-激酶、ras-GAP、PLC-r及Src相关的酪氨酸激酶有联系（Bardelli，A.，et    al.，Oncogene    7：1973-1978（1992））。
已发现，在受HGF/SF刺激的细胞中，PI3-激酶与被激活的受体相联系（Graziani，A.，et    al.，J.Biol.Chem.266：22087-22090（1991））。
最近，作者还证明，HGF/SF通过刺激鸟嘌呤核苷酸交换因子而增加其GDP和GTP结合状态间的更新来激活Ras（Graziani，A.，et    al.，J.Biol.Chem.待出版（1993））。
我们现已发现，HGF/SF受体与蛋白质Shc和Gbr2相联系。哺乳动物基因Shc编码三个广泛表达的含有C末端SH2区域和N末端胶原蛋白同源区域的66、46和52KDa的重叠蛋白质（p66shc、p46shc和p52phc）（Pelicci et al.，Cell 70：93-104（1992））。p46she和p52phc是利用两个不同的ATG由同一转录本编码的。
p66phc则是由可替代的剪接转录本编码的（Migliaccio et al.，待发表）。实验证据表明，She蛋白质参予由酪氨酸激酶受体产生的信号转导。这些蛋白质中，She蛋白质在对激活EGF（Pelicci et al.，文献出处同上）和PDGF（未发表资料）受体、Erb-B-2（Segatto et al.，Oncogene    2105-2112（1993）、Src及Fps（McGlade    et    al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA    89：8869-8873（1992）的反应中迅速地被酪氨酸磷酸化。She蛋白质的过表达诱导PC12嗜铬细胞中的轴突过度生长，而且这种效应可被负显性Ras突变型的表达所阻断（Rozakis-Adcock    et    al.，Nature    360：689-692（1992））。在细胞受到某些生长因子的刺激后，She蛋白质与Grb2/Sem5接合体形成稳定的复合物（Lowenstein    et    al.，Cell    70：431-442（1992）;Rozakis-Adcock  et    al.，文献出处同上）。已知上述接合体通过将SOS-一种鸟嘌呤核苷酸交换因子（Li    et    al.，Nature    363：83-87（1993）;Galeet    al.，Nature    363：88-92（1993）;Rozakis-Adcock    et    al.，Nature    363：83-95（1993）;Egan    et    al.，Nature    363：45-51（1993）;Simon    et    al.，Cell    73：169-177（1993）;Oliver    et    al.，Cell    73：179-191（1993）-吸收到膜上而激活Ras功能。
从上述内容可以清楚地看出，活化的酪氨酸激酶受体和胞溶质转导物分子间的相互作用是导致细胞增殖和游动的信号传输途径中的一个关键性步骤。
因为这些生物学反应构成子肿瘤生长和扩散的最特殊的特征，所以本领域中需要弄清干预这种相互作用的因素。
本发明人已合成了一组能够与细胞内信号转导物相互作用，从而干扰导致细胞增殖和游动及细胞外基质侵入之途径的磷酸肽。
可以利用这些生物学特性抑制肿瘤细胞的生长并阻止转移扩散。
本发明人还有下列新的发现：（1）Shc蛋白质通过SH2区域结合酪氨酸磷酸化的SF/HGF受体;（2）Shc蛋白质与SF/HGF受体尾部的磷酸酪氨酸Y1349和Y1356相结合;（3）Shc蛋白质的过表达增加对SF/HGF的促有丝分裂反应;（4）Shc蛋白质结合到SF/HGF受体上之后，在Y137上磷酸化;（5）在Y137上磷酸化的Shc蛋白质与Grb2蛋白质形成特异性复合物;以及（6）Shc上的Grb2接合位点（Y137VNV）具有如HGF/SF受体（YVNV）上的信号转导物结合位点相同的序列。因此，我们已从Shc上的Grb2接合位点及肝细胞生长因子受体上含有识别型主Y1349VHV和Y1356VNV的Shc接合位点合成了肽。这些肽能够干扰导致细胞增殖和游动及细胞外基质侵入的途径。
因此，本发明进一步提供了具有Shc蛋白质之一部分序列的肽，该肽能够与胞溶质信号转导物结合。该肽一般能够抑制Shc蛋白质和Grb2蛋白质之间或Grb2和被激活的肝细胞生长因子受体之间的结合。
此外，本发明还提供了具有人肝细胞生长因子受体的细胞内区域之一部分序列的肽，该肽可与胞溶质信号转导物相结合。
该肽一般能够抑制Shc蛋白质或磷酯酰肌醇3-激酶之p85亚单位和被激活的肝细胞生长因子受体之间或Shc和其它胞溶质信号转导物之间的结合。
本发明的肽一般是代表酪氨酸磷酸化位点的含酪氨酸分子。该肽分子长度为4至20个氨基酸，例如8至12个氨基酸。
该肽一般再生出分子内信号转导物之SH2区域的潜在识别型主。
该肽可具有4至20个氨基酸且具有序列XN-YVN（或H）V-XC，其中XN和XC各自是有0至16个氨基酸的序列。
XN和XC较好是其侧接HGF/SF受体和Shc蛋白质中YVN（或H）V序列之一的序列。转导物与激活的酪氨酸激酶受体之间的相互作用允许吸收并活化转化物本身。
HGF/SF受体的活化可以是生理性的（即作为配基结合及受体二聚化的结果），或构成性的（即在既使没有配基时受体也被持久地激活）。构成上的激活可以以没有细胞外配基结合区的受体形式发生，例如在致癌基因受体中或染色体转位后（如在本文所述的TPR-MET融合体中）。大多数细胞内信号转导物都是与细胞生长或与致癌基因转化相关的（Fantl，W.J.，et    al.，Cell    69：413-423（1992）;Reedijk，M.，et    al.，Mol.Cell.Biol.10：5601-5608（1990）;Lowenstein，E.J.et    al.，Cell    70：431-442（1992））。
因此，抑制与活化的酪氨酸激酶受体或Shc蛋白质和其他转导物之间的结合构成了抑制细胞有丝分裂发生和运动发生的手段，因此本发明的肽可阻碍心肿瘤的发展。
本发明的优选实例是选自下表所列者的肽：
Figure 941904407_IMG1
其中Tyr＊代表磷酸化的或未磷酸化的酪氨酸残基。
在已知的细胞内信号转导物中，已证明PI3-激酶在配基刺激后可于体内或体外结合HGF受体。其HGF/SF受体上的识别型主尚未被确定。
以前用PDGF受体完成的实验已显示，分别以三字母代码或一字母代码表示的四佧氨基酸序列Tyr-Xxx-Xxx-Met（YXXM）（其中Xxx或X代表任何氨基酸残基）构成PI3-激酶的典型相符序列。
在MGF受体中，有一个潜在的识别型主Tyr-Glu-Val-Met（Y1313EVM），其可能代表PI3-激酶的结合位点。
令人惊奇的是，下文报告的实验结果显示，虽然含有相符Y1313EVM的合成的磷酸肽能够与PI3-激酶结合，但可以删除酪氨酸而没有影响PI3-激酶结合。
相反，正如使用磷酸肽H-Tyr＊-Val-His-Val-Asn-Ala-Thr-Tyr-OH、H-Tyr＊-Val-Asn-Val-Lys-Cys-Val-Ala-OH和H-Tyr＊-Val-His-Val-Asn-Ala-Thr-Tyr＊-Val-Asn-Val-Lys-OH得到的抑制数据所证明的，本发明人已使用本发明的合成性磷酸肽和受体Tyr-Phe突变型鉴定了1349和1356位两个磷酸酪氨酸中的PI3-激酶结合位点。
这些残基这样地Tyr-Val（Asn或His）-Val〔YVN或H）V〕确定为PI3-激酶的新的识别型主，而且通常可将相应的磷酸肽用作HGF受体与PI3-激酶结合的抑制物。
因此本发明的特别优选的实例是具有结构式H-Tyr＊-Val-His-Val-Asn-Ala-Thr-Tyr-OH或H-Tyr＊-Val-Asn-Val-Lys-Cys-Val-Ala-OH或H-Tyr＊-Val-His-Val-Asn-Ala-Thr-Tyr＊-Val-Asn-Val-Lys-OH的磷酸肽（其中Tyr＊代表磷酸化酪氨基的残基）。
本发明的进一步的优选实例是肽H-Asp-Asp-Pro-Ser-Tyr＊-Val-Asn-Val-Gln-OH（DDPSY＊VNVQ）-其中Tyr＊（Y＊）代表磷酸化的或未磷酸化的酪氨酸。
可以医药上可按受的盐的形式提供本发明的肽。适当的盐包括碱性盐和碱金属盐（如钠或钾盐）和铵盐;以及酸加成盐如盐酸盐和乙酸盐。
可按常规方法如Escobedo，J.A.等人（Mol.Cell.Biol  11：1125-1132（1991））或Turck，C.W.（Peptide    Res.5：156-160（1992））所描述的方法，例如使用保护性的预磷酸化酪氨酸残基合成本发明的肽。
特别是可使用本领域已知的液相或固相方法学制备该肽（Schroeder    et    al.，“The    Peptides”，Vol.I，Academic    Press    1965，或Bodanszky    et    al.，“Peptide    Synthesis”，Interscience    Publishers，1966，或Mcomie（ed.）“Protective    Group    in    Organic    Chemistry”，Plenum    Press，1973，或Barany    et    al.，“The    Peptides：Analysis，Synthesis，Biology”2，Chapter1，Academic    Press，1980）。
因此，本发明包括制备本发明肽的方法，该方法包括由单个氨基酸和/或预制的两个或多个氨基酸残基的肽化学合成该肽。当希望制备其中酪氨酸残基被磷酸化的肽时，可在固相合成期间引入预磷酸化保护性的酪氨酸残基或者在将肽连接到固相载体上时使保护性预制肽的酪氨酸残基磷酸化。
在固相合成情况下，可使用任何一种手工或自动肽合成仪，并且可使用Boc或Fmoc战略以分步方式将肽接合到树脂载体上。
使用的所有试剂（用作原料的）均可在市场上购得，或者可按本领域已知的方法生产和纯化。
当制备磷酸肽时，为了避免保护性肽在专保护期间裂解磷酸基团，可使用含有适当清除剂混合物的三氟甲烷硫酸-三氟乙酸的溶液。
在0.1%三氟乙酸中，在C18-Vydac柱（Hesperia    Calif）上使用乙腈线性梯度，以反相高效液相层析法纯化去保护的肽，并用冻干法分离之。所有磷酸肽都是作为多水合的聚三氟乙酸盐得到的。所有产品的肽含量为65-90%，且经在λ＝225nm处测定PHLC峰相关积分值证实层析纯度在95%以止。用酸水解物进行氨基酸分析（在6NHCl+0.1%苯酚中于110℃进行22小时）。或者，可首先合成含有非磷酸化酪氨酸的肽，然后用酶促方法或化学方法（在这种情况下，必须适当地保护易于与磷酸化剂反应的其他功能基团）将磷酸基团引入到酪氨酸残基上。
在本说明书中，用来表示氨基酸和保护基团的缩写词是根据生物化学命名IUPAC-IVB委员会的推荐而定的（参见Eur.J.Biochem-.，Vol.138，9-37，1984）。具体地说，整个文章使用下列综写词：Boc，叔丁氧基羰基;tBu，叔丁基;Bzl，苄基;CIZ，4-氯苄氧基羰基;DPCDI，二异丙基碳二亚胺;DCM，二氯甲烷;DMF，二甲基甲酰胺;Dnp，二硝基苯基;Fmoc，9-芴基甲氧基羰基;RP-HPLC，反相高效液相层析;Trt，三苯甲基。
可通过如实验部分所示的化较实验（与酪氨酸激酶受体的结合）来估测本发明的磷酸肽抑制细胞内转导物与酪氨酸激酶受体或与Shc蛋白质结合的能力。通过实验部分中所述的焦点形成试验（focus    formation    assay）进一步证明酪氨酸激酶受体上自动磷酸化位点的生物学重要性。
具体地说，该试验证明如何能通过在思考受体本身条件下的特异性自动磷酸化位点发生突变（Tyr-Phe突变），而有效地抑制天然被活化之HGF受体的转化活性。
然后重新产生HGF/SF受体的磷酸化位点之一的肽即干扰转导物的结合，从而抑制促有丝分裂和促游动信号的下游传递。
因此本发明的肽可用于治疗人或动物，例如治疗肿瘤增殖性疾病。
本发明的肽是磷酸化的或未磷酸化的。该肽的活性形式一般是磷酸化的，但以未磷酸化的形式使用肽并使该肽在病人体内变为磷酸化的则可能是有利的。这是因为当肽处于未磷酸化形式时可更容易地被摄入细胞内。
可以通过任何方便的胃肠道外途径（此种形式或适当结合的形式）让病人服用本发明的肽，以增加酶促稳定性和细胞通透性。
可适当选择皮下、静脉内或肌肉内用药途径;给药剂量、次数可据多种因素而定。这些因素包括用药目的、被治疗病人的年龄和体重及病人的身体状态。得出肽的治疗有效量但一般每次给药量为每剂10至1000μg，最好是50至500μg。
该肽可配制成药物组合物。药物组合物也包含医学上可接受的载体和稀释剂。可根据给药途径使用任何适当的载体或稀释剂。
以下实例可用来图解本发明。
在附图中：
图1：酪氨酸磷酸化的肽抑制p85与HGF/SF受体的结合。使用兔多克隆抗血清以免疫沉淀法从杆状病毒感染性sf9细胞中纯化重组体HGF/SF受体并用冷ATP磷酸化。用各种磷酸肽（10μM）温育表达p85的sf9细胞的溶胞产物。然后使溶胞产物与固相化的重组体HGF/SF受体结合。结合后冲洗复合物并用实施例4的材料和方法中所述的体外激酶检测法检测与受体结合的p85。根据氨基末端酪氨酸的数目来鉴定磷酸肽。
图2：用不同浓度的酪氨酸磷酸化的肽抑制p85与HGF/SF受体的结合。使用逐步增加浓度的（从左到右10nM、100nM、1μM）有效地超竟争与HGF/SF受体结合之p85的磷酸肽（图1），以限定它们对p85的相对亲合性。实验条件如图1中所示。使用磷酸肽1365作为p85相互作用的阴性对照。
图3：酪氨酸磷酸化肽抑制PI3-激酶全酶与HGF/SF受体的结合。分析有效地超竟争p85之磷酸肽（图1）干扰PI-3-激酶全酶与HGF/SF受体结合的能力。将饥饿三天的A549细胞的胞溶质提取物与各种磷酸肽（10μm）一起预温育，然后与固相化重组体HGF/SF受体一起温育。按实施例4的材料的方法中所述的PI3-激酶活性检测法检测免疫复合物中受体结合的PI3-激酶的存在。指出PI3-激酶反应之磷酯酰肌醇-3-磷酸（PIP）的位置。
图4：Tyr-Phe突变对HGF/SF受体与p85间相互作用的影响。用编码野生型HGF/SF受体（wt）或其中在所指出的位置上酪氨酸密码子被转变（单个地或结合地）为苯丙氨酸密码子之受体的质粒转染COS7细胞。COS7细胞表达内源性HGF/SF受体。然而，猴蛋白质不被抗羧基末端人特异性肽的单克隆抗体识别。用这些抗体选择性地免疫沉淀来自被转染之COS7细胞的人HGF/SF受体。将固相化的预磷酸化受体与表达p85的sf9细胞的溶胞产物一起温育。在A框中，受体和p85均用实施例4的材料和方法中所述的体外激酶检测法进行标记。B框中，使用抗p85单克隆抗体经免疫印迹法检测受体免疫复合物中的p85的存在。
图5：Tyr-Phe突变在体内对HGF/SF受体与PI3-激酶合酶间相互作用的影响。用HGF/SF刺激表达野生型或突变型受体的COS7细胞并溶解之。用人特异性单克隆抗体免疫沉淀受体。在A和B框中，用实施例4的材料和方法中所的PI3-激酶活性检测法检测受体相关PI3-激酶的存在。指出PI3-激酶反应之磷酯酰肌醇-3-磷酸（PIP）的位置。C和D框中的免疫印迹（使用人特异性单克隆抗体）显示，试验PI3-激酶活性的样品含有等量的重组体受体。已得到了1204位上天冬氨酸转变为天冬酰胺残基的TK受体突变型。这就产生了激酶无活性HGF/SF受体。
图6：根据胰酶解磷酸肽作图鉴定HGF/SF受体中作为体外磷酸化位点的Y1349和Y1356。线圈A显示对合成的非磷酸化肽（I24K）在214nm处所作HPLC分析的结果，其相当于含有HGF/SF受体中酪氨酸Y1349和Y1356的胰蛋白酶解肽。65分钟后从HPLC柱上洗脱124K。B和C显示由体外〔r-32P〕ATP-磷酸化野生型受体（B）和phe1349-1356受体突变型（C）衍生之胰酶解磷酸肽的放射-HPLC洗脱曲线。
图7：估计磷酸酪氨酸1313、1349和1356对p85之N-和C-SH2区域的相对亲和性。用BIAcore装置进行生物特异性相互作用分析以检测亲和性（Jonsson，U.，Fagerstam，L.，Roos，H.，Ronnberg，J.，Sjolander，Stenber，E.，Stahlberg，R.，Urbaniczky，C.，Ostlin，H.，and Malmquist.1991.Surface plasmon reasonance and miorofluidicsfor    real    time    biospecific    interaction    analysis.Biotechniques    11：520-527;Jonsson，V.and    M.Malmquist.1992，Real    time    biospcific    analysis.The    integration    of    surface    plasmon    reagonance    detection，general    biospecific    interface    chemistry    and    microfluidics    into    one    analytical    system    p.291-236摘自F.Turner（ed），Advances    in    Biosensors，Vol.2，JAI    Press，London;Kinetic    analysis    of    monoclonal    antibody-antigen    interactions    with    a    new    biosensor    based    analytical    system.J.Immunol.Meth.145：229-246）。
检测磷酸肽抑制SH2区域与包含人PDGF受体中之Y751的固相比磷酸肽（DMSKDESVDY＊VPMLDMK）间相互作用的能力，以确定相对亲和性。A和B框显示这些检测的结果，其中结果以与磷酸肽Y751结合的后分抑制率表示。C框显示达到半数最大结合抑制率所需的磷酸肽浓度。
图8：用不同的TPR-MET构建体进行的焦点形成试验。在TPR-MET1349中，相当于HGF/SF受体之Tyr1349和或Tyr1356的酪氨酸残基TPR-MET Phe1356和TPR-MET Phe1349-1356被诱变成苯丙氨酸。
图9：SF/HGF诱导Shc的磷酸化并与SF/HGF受体和Grb2结合。使对照组和表达Y317→F突变型Shc cDNA（A549/Y317F）的A549细胞生长至细胞会合，血清饥饿24小时并溶解之。标示（+）处，用200V/ml纯SF/HGF将细胞刺激5分钟。如所指出的，在9%SD5-PAGE上分辨用第一抗体（IPP）沉淀的免疫复合物，并用第二抗体（WB）进行免疫印迹分析。箭头指出内源性Shc异型（p46、p52、p56）、SF/HGF受体β链（p145）、被转染的加标记突变Shc异型（p53和p58）及Grb2蛋白质（p23）。
图10：Shc的结合和酪氨酸磷酸化依赖于SF/HGF受体激酶活性。如所指出的，用抗Met单克隆抗体（A和B）和抗She多克隆血清（C.和D.）免疫沉淀瞬时表达野生型SF/HGF受体（WT）或激酶缺陷受体突变型（LYS）的COS-1细胞的溶胞产物，用抗Met或抗P-Tyr抗体进行Western印迹分析和探查。箭头指示在COS-1细胞中为超优势的、全功能的、形成SF/HGF受体的前体蛋白质（Ponzetto    et    al.，Mol.Cell.Biol    13：4600-4608（1993））;p46、p52和p56是Shc异型。
图11：Shc和Grb2    SH2区域与从SF/HGF处理的细胞中溶出的蛋白质的结合。从未受刺激的（-）或SF/HGF刺激的（+）A549细胞的会合单层中制备溶胞产物。将总细胞蛋白质与重组体GST-SH2温育进行结合实验。将Shc（A）或GST-SH2、Grb2（B）固定在谷胱甘肽琼脂糖上。洗脱结合的蛋白质并使用所指出的抗体进行Western印迹分析。
图12：SF/HGF受体上Shc结合位点的作图。用抗Shc抗体免疫沉降表达SF/HGF受体的细胞，其中受体是野生型的（WT）或在各线顶上指出的残基上为突变为Y→F;然后用抗Met抗体进行印迹分析并显现之。箭头指出受体前体（p170）。
图13：Shc SH2区域与SF/HGF受体的接合位点（Y1356）结合但不与其自身（Y317）结合。通过两个其上面已固定了磷酸肽的生物传感器表面注射同样浓度的Shc-SH2。Y1356p衍生于受体尾部的序列VNATY1356VNVK;Y317p衍生物序列DDPSY317VNVQ。应说明的是两肽均含有同样的核心（YVNV），但有不同的上游序列。反应的初速度迅速增加是由于被注射溶液的“容积效应”。
图14：Shc的过表达提高了对SF/HGF的促有丝分裂反应。用明胶包被配有聚碳酸滤膜（8μm孔径）的盲孔Boyden小室。用5-〔125l〕碘-2′-脱氧尿苷标记细胞（见方法部分）并放在上部小室中。下部小室充以添加了所指浓度的纯化SF/HGF的无血清培养基。37℃温育6小时后，机械除去附于滤膜上侧的细胞;固定游动到滤膜下侧的细胞并在r计数器中定量（Y轴：CPM结合的）。下方框显示在40U/mlSF/HGF存在下迁移到滤膜下侧之细胞的低倍放大显微图象（4x）。细胞是用携带SHC cDNA的反录病毒（SHC-PIXSH）或空病毒（MOCK）感染的。
图15：Grb2 SH2区域与Shc的Y317接合位点结合。A框：通过固相化的衍生于Shc序列DDPSY317VNVQ的磷酸肽注射一系列浓度的Gst-SH2.Grb2所得到的传感器图谱。B框：竞争肽对解离速率的影响。在Grb2注射终止时，注射缓冲液或20M未生物素化的磷酸肽。C框：对A框中所示数据的分析。左面的图是6个不同的传感图谱的结合速率对相对反应的作图。右面的图中，各线的斜率对浓度作图：新的斜率给出结合速度常数的值。
图16：SF/HGF受体与含有连接物分子Shc和Grb2间相互作用的方式。Grb2的高亲和性与受体尾部上的接合位点Y1356VNV结合。连接物分子Shc可与磷酸酪氨酸Y1349或Y1356相互作用结合后，Shc被受体转磷酸到Y317上，重新产生一个Grb2的高亲和性接合位点。从而受体可通过Shc途径激活促游动反应，而不干扰由Grb2-SOS驱动的Ras介导的促游动反应。
实施例1
制备H-Tyr＊-Val-His-Val-Asn-Ala-Thr-Tyr-OH（或I）
对0.89g（0.5mmol）Fmoc-Tyr（tBu）-4-（氧甲基）-苯氧基甲基-共聚（苯乙烯-1%二乙烯苯）树脂（0.56mmol/g）进行下述步骤（1）至（5）的循环处理：
（1）DMF
（2）哌啶（20%）在DMF中
（3）DMF
（4）Fmoc-氨基酸在DMF中预生成的1-羟基苯并三唑酯（2.0mmol）
洗液和试剂的体积为10至20ml。
为了完成树脂反应（步骤2，4）或完全从树脂上取代先前的试剂（步骤1，3，5），必要时可将各步骤重复多次。每次循环后取树脂样品，并经茚三酮试验检查反应完成情况。恰在使用前使Fmoc-氨基酸（2.0mmol）、1-羟基苯并三唑（2.0mmol）和DPCDI（2.0mmol）在DMF中反应生成Fmoc-氨基酸的1-羟基苯并三唑酯。
对于提供式Ⅰ之序列的每种氨基酸残基都要重复进行（1）至（5）的反应循环。
依次加入下列被保护的氨基酸：Fmoc-Thr-（tBu）-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Asn-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-His（Trt）-OH、Fmoc-Val-OH和Boc-Tyr-（PO3Bz12）-OH。最后一次循环后，用DCM将肽酰树脂洗几次并干燥之。
就起始树脂来说重量增加0.54g。
在0℃下将1.0g肽酰树脂与20ml三氟甲基磺酸/三氟乙酸/二甲基-硫醚/乙二硫醇（20∶50∶3∶3∶1）的混合物搅拌3小时。用1升二乙醚沉淀去保护的肽并过滤收集之。
在C18-Vydac（Mesperia，CA）柱（2.2×25cm）（在0.1%三氟乙酸中）上经RP-HPLC纯化粗肽，其中使用0-65%的乙腈线性梯度经90分钟洗脱肽产物。
合并含有纯产物的各部分，真空中蒸发除去乙腈并将留下的溶液冻干。得到132mg层析纯度（HPLC）为95.7%的式Ⅰ化合物。
氨基酸比例为：Ala    1（1）;Asp    1.07（1）;His0.96（1）;Thr    0.91（1）;Tyr    1.88（2）;Val    2.03（2）。
肽含量：73.7%。
FAB质谱：m/z 1044.4〔M-H〕-。
实施例2
制备H-Tyr＊-Val-Asn-Val-Lys-Cys-Val-Ala-OH（式Ⅱ）
从0.5mmol    Fmoc-Ala-4-（氧甲基）-苯氧基甲基-共聚（苯乙烯-1%二乙烯基苯）树脂开始并依次加入下列被保护的氨基酸：Fmoc-Val-OH、Fmoc-Cys（Trt）-OH、Fmoc-Cys（Boc）-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asn-OH、Fmoc-Val-OH、Boc-Tyr-OH，按实施例1中所述的同样方式将去磷酸肽组装在树脂上。
末次循环后，于25℃用30当量1H-四唑和10当量二-叔丁基-N，N-二异丙基氨基膦酸在DMF中的溶液处理1小时，然后用20当量叔丁基氢过氧化物在甲苯中的溶液于25℃处理1小时，以直接使仍连接在树脂上的肽的Tyr残基磷酸化。按实施例1中所述方法裂解、除去保护基团并在1.0g肽酰树脂上纯化粗产物。
氨基酸比例：Ala    1（1）;Asp    1.02（1）;Cys未测（1）;Lys    0.99（1）;Tyr    0.95（1）;Val    2.98（3）。
肽含量：68.9%。
FAB质谱：m/z973.4〔M-H〕-。
实施例3
制备H-Tyr＊-Val-His-Val-Asn-Ala-Thr-Tyr＊-Val-Asn-Val-Lys-OH（式Ⅲ）
对0.74g（0.5mmol）Boc-Lys（CIZ）-4-（氧甲基）苯基乙酰氨基-甲基-共聚（苯乙烯-1%二乙烯苯）树脂（0.68mmol/g）进行下列步骤（1）至（7）的循环处理。
（1）DCM
（2）三氟乙酸（50%）在DCM中
（3）DCM
（4）二异丙基乙胺（5%）在DMF中
（5）DMF
（6）Boc-氨基酸在DMF中预生成的1-羟基苯并三唑酯（2.0g）
（7）DMF
为完成树脂反应（步骤2，4，6）或完全置换树脂上的先前存在的试剂（步骤1，3，5，7），必要时可使各步骤重复多次。
每次循环后取树脂样品并用茚三酮试验检查反应完成情况。
临使用前通过Boc-氨基酸（2.0mmol）、1-羟基苯并三唑（2.0mmol）和DPCD1（2.0mmol）在DMF中的反应生成Boc-氨基酸的1-羟基苯并三唑酯。
为提供式Ⅲ的序列，对于每种氨基酸残基均须重复进行步骤（1）至（7）的反应循环。
依次加入下列被保护的氨基酸：Boc-Val-OH、Boc-Asn-OH、Boc-Val-OH、Boc-Tyr（PO3Bz12）-OH、Boc-Thr（Bzl）-OH、Boc-Ala-OH、Boc-Asn-OH、Boc-Val-OH、Boc-His-（Dnp）-OH、Boc-Val-OH和Boc-Tyr-（PO3Bz12）-OH。
在完成合成时，用15ml的1M苯硫酚（在DMF中）直接在仍连在树脂上的肽上除去His（Dnp）保护基团，然后在DCM将肽酰树脂洗几次并干燥之。
得到1.51g肽酰树脂。
按实施例1中所述方法进行裂解，除去保护基团并对1.0g起始肽酰树脂进行粗产物纯化。得到196mg层析纯度（HPLC）为95.9%的化合物Ⅲ。
氨基酸比例：Ala    1（1）;Asp    1.99（2）;His    1.05（1）;Lys    0.97（1）;Thr    0.93（1）;Tyr    1.85（2）;Val    4.01（4）。
肽含量：71.1%。
FAB质谱：m/z 1564.62〔M-H〕-。
实施例4
材料的方法
试剂、细胞、抗体。除特别指出者外，所有试剂均购自Sigma    Chemical    Co.。共价偶联到琼脂糖上的蛋白A购自Pharmacia    LKB    Biotechnology    Inc.所有放射活性同位素均购自American    Corp.。A549肺癌细胞和COS-7细胞购自ATCC（CCL    185）（American    Type    Culture    Collection），这些细胞均在添加了10%胎牛血清（Flow    Laborato-ries，Inc.）的DMEM培养基中和5%CO2-饱合水的大气环境下生长。购自ATCC（CRL 1711）的Spodoptera frugiperda（sf9）细胞是使用SF-900培养基（GIBCO BRL）以单蛋培养物形式生长。抗血清和单克隆抗Met抗体是抗相当于人MET序列（Prat，M.，et al.，Mol.Cell.Biol.11（12）：5954-5962（1991））之C末端19个氨基酸的合成肽的。抗p85抗体则是由Otsu等人（Otsu，M.，et al.，Cell 65：91-104（1991））描述的。
实施例1至3中所述的方法合成磷酸肽。
使用杆状病毒载体在昆虫细胞中表达HGF/SF受体和p85    cD-NA。按已述方法（Bardelli，A.，et    al.，Oncogene    7：1973-1978（1992）;Otsu，M.，et    al.，Cell    65：91-104（1991））构建重组体HGF/SF受体和p85杆状病毒并用以转染sf9细胞（Piwnica-Worms，H.et    al.，J.Virol.64：61-6（1990））。
GST-SM2区域融合蛋白质。经聚合酶链反应制得牛PI-3激酶p85亚单位的N-和C-SH2区域（氨基酸314-431和612-722），并克隆到PGEX-2细菌表达载体（Smith，D.B.，and    Johnson，K.S.，Gene    67：31-40（1988））中。用谷胱甘肽亲和层析法（Panayotou，G.，et    al.，EMBO    J.，11：4261-4272（1992））从细菌溶胞物中纯化谷胱甘肽S转移酶（GST）-SH2融合蛋白质。在Applied    Biosystems    420A分析仪上进行氨基酸分析以确定重组蛋白质的浓度。
位点针对性诱变并在COS-7细胞中表达MET cDNA。以前曾报导过MET cDNA的克隆方法（Ponzetto，C.，et al.，Oncogene 6：553-559（1991），EMBL数据库，参考号n0x54559）。将从核苷酸2355至末端的3′末端片段再克隆到pSELECTTM-1中。使用体外寡核苷酸位点针对性诱变系统（Altered SitesTMin vitro Mutagenesis System，Promega）进行位点针对性诱变。使用Applied Biosystem 391装置合成寡核苷酸。进行序列测定以鉴定突变克隆（T7序列测定药盒，Pharmacia）。在含有大晚期腺病毒启动子的PMET2载体中重新构建携带适当的Tyr-Phe突变的全长MET cDNA。COS7细胞中所有质粒均由脂染素（Lipofectin GIBCO BRL）转染。
体外结合实验。在添加0.2mM苯基甲基磺酰氯、1μg/ml亮肽酶素（Leupeptin）、0.1TIU/ml抑肽酶和1μg/ml抑胃肽（pepstatin）的缓冲液A（10mM Tris-MCl缓冲液pH7.5，10%甘油、1%Triton X-100，150nM NaCl，5mM EDTA）中感染后，将表达重组体HGF/SF受体（约4×106个细胞/点）的sf9细胞溶解36小时。4℃下以15000g离心15分钟以澄清溶胞物，上清液与偶联到蛋白A-琼脂糖上的抗Met抗体温育2小时后免疫沉淀之。免疫复合物用缓冲液A洗三次、用缓冲液B（10mM Tris-HCl pH7.4，10mM NaCl、1mM EDTA）洗一次并用缓冲液C（25mM 4-（2-羟乙基）-1-哌嗪-乙烷磺酸（HEPES）缓冲液pH7.2，100mM NaCl、5mM MgCl2）洗一次。在加有10μm未标记的ATP的缓冲液C中于25℃温育15分钟使样品预磷酸化，然后用添加1mM原钒酸钠的冷缓冲液A洗三次。按以前所述方法（Bardelli，A.，et al.，Oncogene 7：1973-1978（1992））进行固相化受体与杆状病毒表达的p85间的结合。为了用PI3-激酶全酶进行结合实验，使用血清饥饿3天的A549细胞（大约2×106个细胞/点）作为PI3-激酶的来源。在添加0.2mM苯基甲基磺酰氯、12μg/ml亮肽酶素、0.1TIV/ml抑肽酶和1μg/ml抑胃肽的MOPS缓冲液（20mM3-（N-吗啉代）丙基磺酸）（pH7.5）、1mM MgCl2、0.1mM EDTA、200mM蔗糖、1mM原钒酸钠）中对A549细胞进行Dounce匀浆处理。4℃下以100，000×g将匀浆离心20分钟。当检查磷酸肽阻断与受体的结合能力时，将细胞溶胞产物与磷酸肽于4℃预保温1小时，然后与固相化的重组体HGF/SF受体保温。结合后，将免疫复合物用缓冲液A洗三次、用缓冲液D（0.5M LiCl、100mM Tris-HCl pH7.6）洗两次，并用缓冲液B洗两次。
按下述方法检测受体免疫沉淀物中PI3-激酶之p85亚单位的存在：i）以体外激酶检测法检测用〔r-32p〕ATP标记的受体和结合的蛋白质;ⅱ）Western免疫印迹法;ⅲ）PI3-激酶活性检测法。
体内结合实验。于37℃用HGF/SF（12ng/ml）将表达HGF/SF受体突变型的被转染的COS7细胞刺激10分钟，并在1mM原钒酸钠存在下在缓冲液A中溶解之。于4℃下以15，000×g将溶胞产物离心澄清15分钟，并在对偶联到蛋白A-琼脂糖上的人蛋白质特异的抗Met抗体保温2小时后免疫沉淀上清液。复合物用缓冲液A洗两次、用缓冲液D洗两次、并用缓冲液B洗两次。用Whitman等人（Whitman，M.，et    al.，Nature    315：239-242（1985））所述的PI3-激酶检测法检测复合物中受体结合的PI3-激酶的存在。
体外激酶检测法。在10μCi〔r-32p〕ATP（比活性7，000Ci/mM;Amersham）存在下，于25℃在20μl缓冲液C中将受体结合的蛋白质标记15分钟。加入1ml没有蛋白质抑制剂的冰冷的缓冲液A终止反应。样品用冷缓冲液A洗三次。在煮沸的Laemmli缓冲液中从蛋白A-琼脂糖上洗脱免疫复合物。然后对上清液进行8%十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。
Wertern免疫印迹法。结合后在煮沸的Laemmli缓冲液中溶解免疫沉淀物，在8%SDS-PAGE上分离并电转移到硝酸纤维素滤膜（Hi-bond，Amersham）上。然后将滤膜与指出的抗体一起保温并用增强的化学发光系统（ELCTM，Amersham）检测特异性结合。
胰蛋白酶解磷酸肽作图。从聚丙烯酰胺凝胶上切下相当于体外磷酸化野生型和突变型HGF/SF受体的32p标记的带，并按前述方法（Ferracini，R.，et al.，J.Biol.Chem.266：19558-19564（1991））处理之。在100%二甲基甲酰胺中溶解胰蛋白酶肽酯化产物，用HPLC上柱缓冲液（0.1%三氟乙酸，溶在水中）稀释到50%并在反相C2/C18Superpack Pep-s柱（Pharmacia）上经高效液相层析（HPLC）分离之，其中洗脱液为存在0.1%三氟乙酸的乙腈梯度（0-32%，70分钟内），流速为1ml/分钟。用Radiomatic A-100放射活性流式检测仪（Packard    Instrument    Co.）监视洗脱的放射活性。在上述HPLC上分离作为对照的合成肽（I24K，neosystem    Laboratorise）并在214nm处分析这。I24K包含Met蛋白质序列中从异亮氨酸1337到赖氨酸1360的24个氨基酸，因此相当于预期的酪氨酸磷酸肽，但不同的是它未被磷酸化。
使用BLAcore分析Y1349和Y1356与p85N-和C-SH2区域的相互作用。对BIAcore生物转感器的详细构成和操作原则已有描述（Jonsson，V.，et al.，Biotechniques 11：520-527（1991）;Jonsson，V.，et al.，Malmquist。1992，F.Turner（ed.），Advances in Biosensor，Vol.2.JAI Press，London（1992）;Karlsson，R.，et al.，J.Immunol.Meth.145：229-246（1991））。在SMART层析系统上通过一个Pharmacia柱对使用于这些实验的SH2区域脱盐，其中所用层析柱是为了完成与由20mM Hepes，pH7.4，150mM NaCl，3.4mM EDTA、0.005%Tween 20和4mM DTT组成的BIAcore过柱缓冲液的缓冲液交换。在用N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和N-乙基-N′-（3-二甲氨基丙基）-碳二亚胺盐酸化物（EDC）（Pharmacia）的1∶1混合物活化后，将在20mM乙酸钠缓冲液（pH4.0）中的50μg/ml抗生物素蛋白（Boehringer）固定在传感器小片表面上。用乙醇胺（1.0M）封闭过量的反应基团。以5μg/秒的流速经50秒时间通过抗生物素蛋白上方注射生物素化的磷酸肽Y751（DMSKDESVDYVPMLDMK）。用0.1%SDS的短脉冲除去非特异性结合的材料。
将GTS-SH2区域融合蛋白质与一系列不同浓度的HGF/SF受体磷酸肽混合，并于25℃恒温以5μl/分的流速经40秒钟在表面上注射。用0.1%SDS的4秒脉冲除去结合到表面上的材料，以使信号达到本底水平。
结果
用合成的磷酸肽进行的比较实验。在我们的最初研究中，我们在体外用重组体HGF/SF受体进行的结合实验中使用合成的磷酸肽超竞争p85或PI3-激酶。设计磷酸肽以覆盖可能存在于HGF/SF受体的胞质部分中的所有的酪氨酸。上文中已列出了这些磷酸肽的序列，见本发明详细阐述。16个磷酸肽的长度均为8个氨基酸并以N末端上的磷酸酪氨酸作为序列起始氨基酸。1个磷酸肽长度为12个氨基酸并包括2个磷酸酪氨酸。以前用PDGF受体进行的研究显示，位于磷酸酪氨酸直接下游的4个氨基酸对于限定SH2识别位点是很重要的（Fantl，W.J.，et    al.，Cell;69：413-423（1992））。
在图1所示的实验中，我们使用了用重组体杆状病毒感染的昆虫细胞（sf9）的溶胞产物作为p85蛋白质的来源（Otsu，M.，et    al.，Cell    65：91-104（1991））。适当稀释这些溶胞产物（参见材料和方法部分）并与各种磷酸肽（10μM）预保温，然后与HGF/SF重组体受体保温。从用携带全长人MET    cDNA（Bardell，A.，et    al.，Oncogern    7：1973-1978（1992））的重组体杆状病毒感染之sf9细胞的溶胞产物中免疫沉淀出受体。在这些细胞中，受体主要是以未裂解的前体形式（图中的METBac）合成的，但该前体是全功能性的（Bardelli，A.，et al.，Oncogene 7：1973-1978（1992））。将受体固定在蛋白A-琼脂糖小珠上并用冷ATP预磷酸化。结合后，洗小珠并用〔r-32p〕-ATP处理使复合物磷酸化。在磷酸化反应期间，受体和p86变成被标记的，因此可在SDS-PAGE中检测到。图1显示只有三种磷酸肽可有效地超竞争为p85：H-Tyr＊-Glu-Val-Met-Leu-Lys-Cys-Trp-OH，H-Tyr＊-Val-His-Val-Asn-Ala-Thr-Tyr-OH，H-Tyr＊-Val-Asn-Val-Lys-Cys-Val-Ala-OH。
磷酸肽H-Tyr＊-Val-His-Val-Asn-Ala-Thr-Tyr＊-Val-Asn-Val-Cys-OH也完全阻止p85结合，而磷酸肽H-Tyr＊-Cys-Pro-Asp-Pro-Leu-Tyr-Glu-OH只部分地有效。在图2所示的实验中，我们粗略地限定了这些磷酸肽对p85的相对亲和性。按前述方法进行实验，但使用10nM至1μM的不同浓度的磷酸肽。H-Tyr＊-Glu-Val-Met-Leu-Lys-Cys-Trp-OH超竞争p85的效率最高，其次是H-Tyr＊-Val-Asn-Val-Lys-Cys-Val-Ala-OH、H-Tyr＊-Val-His-Val-Asn-Ala-Thr-Tyr-OH和H-Tyr＊-Cys-Pro-Asp-Pro-Leu-Tyr-Glu-OH。
磷酸肽H-Tyr＊-Val-His-Val-Asn-Ala-Thr-Tyr＊-Val-Asn-Val-Lys-OH对p85的亲和性似乎与H-Tyr＊-Val-Asn-Val-Lys-Cys-Val-Ala-OH差不多。
因为与p110催化亚单位的相互作用可能影响p85的构象，所以这些结果可能不反映复合物中p85之SH2区域的真实性质。为了排除这种可能性，我们使用A549细胞的溶胞产物作为PI3-激酶全酶的来源。检测受体复合物中的PI3-激酶活性可看出全酶和重组受体间的联系。图3显示已证明能够超竞争p85的磷酸肽也干扰PI3-激酶全酶与HGF/SF受体的结合。特别是应注意到包括磷酸酪氨酸1349和1356的磷酸肽在从HGF/SF受体中置换PI3-激酶全酶上似乎比包括其中一个残基的磷酸肽更为有效。
该第一组实验的结果揭示可能存在由磷酸酪氨酸对1307-1313和1349-1356组成的HGF/SF受体中PI3-激酶的双结合位点。已显示这样一对磷酸酪氨酸残基可能对PDGF受体不可少的，已知其中Tyr740和Tyr751形成PI3-激酶结合位点（Fantl，W.J.，et    al.，Cell    69：413-423（1992）;Kazlauskas，A.，et    al.，Mol，Cell，Biol.12：2534-2544（1992）。
p85或PI3-激酶全酶与HGF/SF受体Tyr-Phe突变型的结合。按照本领域技术人员已知的方法对野生型受体cDNA进行位点针对性诱变制成一系列构建体。这些构建体在COS7细胞中瞬时表达，得到相应的Tyr-Phe受体突变型Phe1003、Phe1307、Phe1313、Phe1349、Phe1356和Phe1365。
除单个氨基酸取代外，还可制成某些多氨基酸取代。具体地说，我们制得了进一步阐明比较实验结果需要的两个双位点突变型：突变型Phe1307-1313和突变型Phe1349-1356。
图4显示与图1中所示者相似的结合实验的结果，该实验是使用同一p85来源（表达性sf9细胞），并使用被转染的COS7细胞作为野生型和突变型HGF/SF受体的来源。被转染的COS7细胞以1∶1比例表达单链受体前体及蛋白水解加工的成熟形式。结合反应后将样品分割为二并进行不同的加工以得到A和B框所示的结果。A框中借助激酶检测法可显现出受体和p85。该框中显示突变型受体是有活性的，并以可比较的量存在。虽然所有其它突变型（以及pHe1307-1313）仍结合p85并使之磷酸化，但仅双突变型Phe1349-1356不是这种情况。B框中显示在结合后删去激酶试验，而以SDS-PAGE法分离样品并转移到硝酸纤维素膜上。然后用对p85特异的单克隆抗体着染Western印迹。该实验进一步证实只有突变型Phe1349-1356丢失了结合p85的能力。应注意的是，将A和B框所示结果比较后可见，虽然突变型Phe1356仍能结合p85，但似乎它在使之磷酸化上是有缺陷的。它提示在具有该受体突变型的复合物中，p85可能没有定位在适于有效磷酸化的正确位置上。
图5显示体内也可得到相似的结果。在该实验中，于HGF/SF刺激后从被转染的COS7细胞的溶胞产物中免疫沉淀出受体。溶胞和免疫沉淀均于原钒酸钠存在下进行，以阻止受体去磷酸化。然后对受体免疫沉淀物进行PI3激酶分析，调整Met蛋白质含量，以定量测定出复合物中内源性PI3-激酶与受体共沉淀的量。只有PI3-激酶活性的量低于结合到野生型受体上之激酶活性量的Phe1349-1356双突变型共沉淀。结合到Phe1349-1356双突变型上的残留活性可能是由于与来自COS7细胞的内源性Met蛋白质形成受体二聚物。同样量的残留结合也存在于得自用激酶无活性突变型转化之COS7细胞（TK-，图5）的免疫沉淀物上，该事实支持了上述解释。
该第二组实验的结果表明，残基Y1349和Y1356介导PI3-激与HGF/SF受体的结合，而残基Y1307和Y1313则不能。
野生型和突变型受体的磷酸肽作图。使用突变型受体得到的结果暗示，酪氨酸1349和1356是在体内磷酸化的。构建一个合成肽（124K）使之相当于包含这两个残基的胰蛋白酶解肽。该肽需要含有含水和有机溶剂以得到最好回收率，并且在很晚时间从用于分离的HPLC柱上洗脱（参见图6中A框）。当以同样方法处理得自己经在体外磷酸化之野生型受体的胰酶消化产物时，回收到在很接近非磷酸化124K肽的时间洗脱的峰（图6，B框）。该新的峰未出现在双位点突变型中（图6，C框），而且在单位点突变型中峰值较低（未显示）。所有受体物在COS7细胞中表达并且于胰蛋白酶消化之前在体外被磷酸化。
这些结果表明酪氨酸1349-1356确实是体外磷酸化位点，且结图5中所示的结合实验强有力地提示同样的酪氨酸残基也是体内磷酸化位点。
估计磷酸酪氨酸1349和1356对p85之N-和C-SH2区域的相对亲和性。p85分子存在两个SH2区域并需除去HGF/SF受体中的两个磷酸酪氨酸以排除PI3-激酶结合，这样就提出一个其中各SH2区域与两个酪氨酸之一相互作用的模型（Kashishian，A.，et    al.，EMBO    J.11：1373-1382;Kavanaugh，W.M.，et    al.，Mol.Cell.Biol.12：3415-3424（1992））。
因此检测两上磷酸肽对p85的N-和C-末端SH2区域的相对亲和性是有意思的。我们最初试图使用BIAcore装置以双特异性相互作用分析法进行这一检测（Johsson，U.，et al.，Biotechniques 11：520-527（1991））;Jonsson，U.，and M.，Malmquist.，F.Turner（ed），Advances in Biosensoxs，Vol.2，JAI Press，London（1992）;Karlsson，R.，et al.，J.Immunol.Meth.145：299-246（1991））。然而，磷酸肽直接或在生物素化后通过结合基质固相化的抗生物素蛋白而偶联到基质上，没有产生明显的反应。推测这是由于这些肽中的磷酸酪氨酸是在N末端并且固相化干扰了它的结合能力。因此，我们以间接方式进行了亲和性检测，其中包括检测磷酸肽抑制SH2区域与包括人PDGF受体中磷酸酪氨酸751（Y751）并已显示对两个SH2区域均有高亲和性之固相化磷酸肽间相互作用的能力。将p85的N-和C-SH2区域与一系列不同浓度的Met磷酸肽混合并越过固相化Y751磷酸肽注射之。图下显示这些以对磷酸肽Y751结合的百分抑制率表示的检测结果。虽然它不可能产生出对这些相互作用的绝对亲和性，但观察到最大抑制率数值的比较结果提供了关于相对亲和性的有用信息。C框中显示了总结的数据。最高表现亲和性是由Y1313磷酸肽呈现的，其含有典型的YXXM型主。包含不常见结合位点YVXV的磷酸肽Y1349和Y1356也抑制p85N-和C-SH2区域与磷酸肽Y751的结合，但须有较高的浓度。包括更为明显的Y1313在内的所有磷酸肽均显示对C-SH2比对N-SH2有更高亲和性。这些数据与得自图2所示实验的数据是一致的，并表明至少在体外和在我们的实验条件下，新的结合型主Tyr-Val-Xxx-Val（YVXV）对p85的亲和性比典型的相符结合型主低两个数量级。
实施例5
TPR-MET-Tyr-Phe突变型的转化活性。通过实施例4中所述的实验，已将HGF/SF受体的1349和1356位中的酪氨酸残基（由原致癌基因编码）鉴定为参予吸收和激活PPI3-激酶及可能的附加胞质转导物的接合位点。如果永久地激活，转导物即起到促游动信号之连续效应物的作用，从而产生细胞的致癌基因转化。
为了证明HGF/SF受体的1349和1356位上酪氨酸残基在导致致癌基因转化的过程中的重要性，我们利用了TPR-MET分子-MET原致癌基因的永久激活形式一的优点（Gonzatti-Maces，et    al.，Proc.Natl.Acael.Sci.VSA    85：21-25（1988））。TPR-MET是由染色体1的TPR序列和染色体7的MET序列间的DNA重排而得到的。TPR-MET产物具有对NIH    3T3成纤维细胞的转化负责的结构性酪氨酸激酶活性。
我们已通过位点针对性诱变将TPR-MET分子的1349和1356位上的酪氨酸残基突变为苯丙氨酸。
已使用TPR-MET野生型原致癌基因及突变形式TPR-MET-Phe1349、TPR-MET-Phe1356和TPR-MET-Phe1349-1356进行了焦点形成试验。在该试验中，用克隆在pXMT2质粒中的不同的TPR-MET构建体以磷酸钙法转染Fisher大鼠成纤维细胞（Sambrook，et    al.，Molecular    Cloning，A    Laboratory    Manual（第二级）pp.16.22，Cold    Spring    Harbor    Laboratory    Press（1989）。细胞生长在含有5%胎牛血清的DMEM培养基中并于10天后计焦点数。结果总结于下表中并在图9中作了图示说明。
Figure 941904407_IMG2
如从上表和图8可以了解到的，Tyr1349，特别是Tyr1356的突变使转化焦点数目显著增加。
此外，当两Tyr残基突变成苯丙氨酸时，TPR-MET的转化活性完全被消除。
这些数据进一步证明了这些位点在该细胞内促运动信号转导中的生物学重要性。
因此，能够阻止细胞内转导物与HGF/SF受体之Tyr1349和Tyr1356结合的本发明的磷酸肽是致癌基团转化的潜在抑制物。
实施例6
材料和方法
细胞系。将肺癌A549细胞和COS-1细胞常规培养在添加10%FCS的RPMI培养基中。PA317两向性病毒包装细胞系（Miller    and    Buttimore（1986）Mol.Cell.Biol.6：2895-2902）和生态向性病毒包装细胞系Psi-2（Mann    et    al.，（1983）Cell33：153-159）维持在添加了10%FCS的Dulbecco′s改良的Eagle′s培养基中。单克隆抗体和多克隆抗血清。用在细菌中表达的Shc    SH2区域免疫免以制备抗Shc多克隆抗血清。生产针对PML肽（Pandolfi    et    al，Oncogene    6：1285-1292（1991）的抗TAG血清。抗磷酸酪氨酸的单克隆抗体购自Vpstate    Biotechnology。抗Met抗体是抗相当于人Met蛋白质（Pata-Bank    reference    no.X54559）之C末端19个氨基酸的合成肽的。
免疫沉淀和Western印迹方法。从血清饥饿和SF//HGF处理的A549细胞中制备溶胞产物。在冰上于含有新添加的蛋白酶抑制剂（1mM苯基甲基磺酰氯、10mg/ml亮肽酶素和5mg/ml抑肽酶）的PY缓冲液（20mM Tris-HCl pH7.8，50mM NaCl、50mM NaF、30mM Na4P2O7、5mM EGTA、1mM原钒酸钠、1%（v/v）Triton x-100中溶解细胞。4℃下离心澄清溶胞产物并用BCA试剂（Pierce）测定蛋白质浓度。为进行免疫沉淀实验，将适当的抗体吸附到蛋白A-琼脂糖柱（Pharmacia）上并在4℃下与细胞溶解产物保温1.5小时。用冰冷的NET缓冲液（50mM Tris-Hcl pH7.5、150mM NaCl、0.1%NP-4.0、1mM EDTA pH8.0，0.25%明胶）将免疫复合物洗3次、洗脱并经在95℃在还原Laemmli缓冲液中加热3分钟使之变性;然后在十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离蛋白质。为了进行免疫印迹分析，SDS-PAGE后，将特异性免疫沉淀物或20-50mg总细胞溶胞产物转移到硝酸纤维素滤膜上。用溶解在TBST（20mM Tris-HCl pH7.8、150mM NaCl、0.02%Tween 20）中的2%脱脂乳粉（在22℃保温1小时）封闭非特异性反应活性后，用在TBST中稀释的特异性抗体于22℃探测滤膜2小时。广泛清洗后，使用辣根过氧化物酶结合的种特异性第二抗体（Bio Rad）通过提高的化学发光反应（ECLTM，.Amersham）检测免疫复合物。
CDNA位点针对性诱变和表达。以前报导过MET  cDNA的克隆（Ponzetto    et    al，Oncogene    6：553-559（1991））;MEBL    Data-D    Dankreference no.x54559）。将从核苷酸2355到末端的3′末端片段再克隆化pSELECTTM-1中。使用体外寡核苷酸位点针对性诱变系统（Altered sitesTMin vitro Mutageneis System，Promega）进行位点针对性诱变。使用Applied Biosystem 391装置合成寡核苷酸。经序列测定（T7测定序药盒Pharmacia）鉴定突变克隆。在含有大晚期腺病毒启动子PMT2载体中重新构建携带适当Tyr→Phe突变的全长MET cDNA。COS-1细胞中所有质粒均被脂染素（Lipofectin）（GIBCO BRL）转染。将携带突变Y317→F的Shc cDNA克隆到哺乳动物表达载体LXSN中。突变的cDNA经与PMLcDNA的162bp片段（Pandolfi et al.，引文同上）码内融合而由外来抗原决定基标示。作为可替代的初始阶段使用的结果，标记的cDNA编码53和58KDa的PML标示的Shc蛋白质。有关该构建体的详细描述将在其他文献中报导（Salcini et al.，待发表）。以磷酸钙法将此表达载体与新霉素抗性基团共转染到A549细胞中。用G418选择表达加标记之She蛋白质的稳定的细胞系。
使用GST融合蛋白质进行体外结合研究。使用聚合酶链反应（PCR）分离相当于其SH2区域的Grb2    cDNA区域（从核苷酸256到核苷酸551），并克隆到细菌表达质粒pGEX-2T（GST-Grb2）的BamHI-EcoRI位点中。使表达GST-GST-Grb2或GST-Shc（Segatto    et    al.，Oncogene    2105-2122（1993））的细菌培养物于37℃在含有1m    M    IPTG的LB培养基中生长3-4小时。离心分离细菌，重新悬浮在1/100体积没有TritonTM的冰冷的PY缓冲液中并经超声波处理使之溶解。加入Triton X-100到1%浓度后，离心澄清溶胞产物。在谷胱肽-琼脂糖TM（Pharmacia）上纯化重组体蛋白质并如此用于结合试验。每次反应中，将结合到谷胱甘肽-Sepharose上的约5μgGST、GST-Grb2或GST-Shc与300mg在PY缓冲液中制成的适当细胞溶解物于4℃保温2小时。将蛋白质复合物在冰冷的PY缓冲液中洗5次、洗脱并经在95%于Laemmli缓冲液中加热3分钟变性、在SDS-PAGE上分离并以免疫印迹法分析这。
Shc蛋白质的过表达。将Shc克隆序列（Pelicci    et    al.，Cell    70：93-104（1992））克隆在LXSN反录病毒质粒（Miller    et    al.，（1989）;由D.Miller赠送）的EcoRI限制性位点中，以构建LSHCSN质粒。以磷酸钙沉淀法（Sambrook    et    al.，Molecular    Cloning：A    Laboratory    Manual，Lnd    Ed.，Cold    Spring    Marbor    Laboratory，Cold    Spring    Harboucr，NY（1989）将LXSN或LSHCSN质粒转染到PA317反录病毒包装细胞系的Y2中。48小时后，用Y-2上清液感染PA317。然后在有限稀释条件下用含G418的培养基选择细胞。基于外源性Shc表达的水平和病毒滴度选择一个病毒产生克隆并用于感染靶细胞。
BlAcore分析。以前曾详细描述过使用BIAcore装置获得SH2区域相互作用之动力学检测的基本操作原则及方法学（Panayotou    et    al.，Mol.Cell.Biol.13：3567-3576（1993）;Ponzetto    et    al.，Mol.Cell.Biol.13：4600-4608（1993））。
使纯化的GST-SH2区域或完整蛋白质在BIAcore过柱缓冲液（20mM    Hepes，pH7.4、150mM    NaCl、3.4mMEDTA、0.005%Tween20和4mM    DTT）中脱盐并注射到抗生物素蛋白固定的、生物素化的磷酸肽上。经检测抗磷酸酪氨酸抗体的结合使被固定的磷酸肽的量标准化。对一系列不同浓度的蛋白质检测结合情况并允许已结合的材料在缓冲液流中或在注射20μM非生物素化的竟争磷酸肽后发生解离。经在Applied    Biosystem氨基酸分析仪上进行氨基酸分析以计算肽和蛋白质浓度。
对细胞生长和游动性的检测。将在含10%FCS（Flow）的DMEM培养基中的2.5×103个细胞铺敷在96小井平板（Costar）上。24小时后除去培养基并换成含有5%FCS连同宽浓度范围之SF/HGF（1-10ng/ml）的DMEM。用结晶紫染色后以色比法估测细胞数（Kueng et al.，Anal.Biochem. 182：16-19（1989）;在Microplate阅读器（3350型，Bio-Rad）中读出各小井在595nm处的吸光率。用于趋药性研究的盲井Boyden小室和无聚乙烯吡咯烷酮聚碳酸盐滤膜（13mm，8μm孔径）购自Nucleopore。按已述方法进行趋药性试验（Albini et al.，Cavncer Research 47：3239-3245（1987））。用5-〔125I〕碘代-2′-脱氧尿苷（3μCi/ml，在加有10%FCS的RPMI1640培养基中）标记细胞。保温16-20小时后，用胰蛋白酶消化细胞并用无FCS培养基洗3次。将重新悬浮在无FCS培养基中的3×105个细胞铺敷在Boyden小室的上部分;下小室下部分加入无FCS培养基并加或不加SF/HGF（5-40U/ml）。将Boyden小室在5%CO2水饱和的大气中于37℃保温6小时。保温后机械除去附着在滤膜上侧的细胞，同时固定带有迁移到下侧之细胞的滤膜并在γ计数器中计算。
结果
Shc蛋白质通过SH2区域结合酪氨酸磷酸化的SF/HGF受体。
肺癌A549细胞表达功能性SF/HGF受体及分子量为46、52和66KDa的三个Shc异型。为了试验是否酪氨酸磷酸化的SF/HGF受体和Shc在体内形成稳定的复合物，用抗Met免疫沉淀得自SF/HGF处理之细胞的溶胞产物并用抗Shc抗体进行免疫印迹分析。Shc蛋白质与SF/HGF受体共沉淀（图1A）。在对映实验中得到了相同的结果，其中用抗受体（抗Met）抗体探查得自SF/HGF处理之A549细胞的溶胞产物。Shc蛋白质与SF/HGF受体共沉淀（图1B）。这些结果证明SF/HGF受体和Shc被结合在SF/HGF刺激的细胞中。
为了进一步证实SF/HGF受体和Shc间的结合严格依赖于受体酪氨酸磷酸化，使用瞬时表达野生型SF/HGF受体或激酶缺陷性受体突变型（Lys1110→A）之cDNA的COS-1细胞溶胞产物进行相似的实验。如以前描述过的（Longati et al.，待发表），在COS-1细胞中过表达的野生型受体是在体内从结构上磷酸化的，而激酶无活性的Lys1110→A突变型则是未被磷酸化的（图2A和B）。被转染受体和内源性Shc间形成的稳定复合物只出现在表达野生型酪氨酸磷酸化受体的COS-1细胞中（图2c）。在体外使用Shc-Sh2区域（作为GST融合蛋白质在细菌中表达的）重新构成复合物也利用Shc-SF/HGF受体相互作用。固相化的Shc-SH2区域与从SF/HGF处理之A549细胞中溶解出的酷氨酸磷酸化的受体形一种稳定的结合，但与从对照组细胞中溶解出来的未磷酸化的受体则不能形成这种稳定结合（图3A）。用对照GST蛋白质进行的结合检测为阴性。这些结果表明Shc的SH2区域足以与在体外自动磷酸化的SF/HGF受体结合。
Shc蛋白质与SF/HGF受体尾部的磷酸酪氨酸Y1349和Y1356结合。
借助野生型和突变型SF/HGF受体的磷酸肽作图，已显示定位于受体之C末端尾部的两个残基（Y1349和Y1356）在对配基结合的反应中被磷酸化（Ponzetto et al.，（1993），引文出处同上）。通过用其中一个或两个酪氨酸被突变成苯丙氨酸（Y1349→F、Y1356→F或Y1349，1356→F）的受体突变型进行的结合实验研究这些位点在介导与Shc之相互作用中的可能的关系。如前所示，在这些位点上携带个别或组合突变的受体分子具有天然酪氨酸激酶活性（Ponzetto et al.，（1993），文献出处同上）。用表达受体突变型的构建体转染COS-1细胞并用抗Shc抗体免疫沉淀之;用抗Met受体抗体对免疫沉淀物进行印迹分析。单一突变型受体Y1349→F或Y1356→F与内源性Shc结合的能力只稍低于野生型受体或携带无关（Y1003→F）突变的对照受体。棹反，Y1349，1356→F双突变型则完全失去了其结合Shc蛋白质的能力（图4）。
经真实时间生物传感器分析（Panayotou et al.，文献同上;Felder et al.，Mol.Cell.Biol.13：1449-1455（1993）进一步证实Shc之SH2区域和磷酸酪氨酸Y1349或Y1356间的直接相互作用。衍生于受体尾部序列的合成磷酸肽VNATY1356＊VNVK被亲和纯化的Shc的GST-SH2区域特异结合（图5）。用肽IGEHY1349＊VHVN可得到相似的结果。在两种情况下，根据解离速度（K diss）和结合速率数算出的亲和常数太高，以致难于准确确定。
这些数据显示，Shc的低亲和性与SF/HGF受体尾部的酪氨酸1349或酪氨酸1356结合。
Shc蛋白质的过表达增强对SF/HGF的促游动反应
在刺激之后，上皮细胞通过盲井Boyden室滤膜迁移，而SF/HGF则是对上皮细胞起到促游动作用（Giordano    et    al.，Proc.Notl.Acod.Sci.USA    90：649-653（19993））。可通过在A549细胞中过表达蛋白质来研究Shc对促游动反应的作用。用带有Shc    cDNA两向性逆病毒来感染细胞，并依据使用抗Shc抗体的Western印迹分法，按其Shc表达的高水平来选择出大量不同的感染性大块细胞群落。
过度表达Shc蛋白质的A549细胞之促游动反应要比对照性未感染细胞或仅受载体感染之细胞中的反应要强得多（图6，下框）。在所有试验过的配基浓度中都观察到了过度表达Shc之细胞引起的对SF/HGF的较强反应（图6，上框）。
可通过细胞计数或胸苷掺合来检测促游动反应。A549细胞中的Shc过表现对反应于SF/HGF或血清的细胞生成根本不起作用。同样，如先前描述的检测（Grazianieral.，J.Biol.Chem.268：9165-9168（1993）。在Ras的SF/HGF诱导性鸟嘌呤核苷酸交换子活性并未受到外源性Shc过表达的显著作用
结合在SF/HGF受体之后，Shc蛋白质在Y317上磷酸反。
为了确定是否Shc在对SF/HGF受体激酶的游活起反应中被磷酸化，用重组SF/HGF刺激A549细胞、溶解、用抗Shc抗体免疫沉淀并用抗磷酸酪氨酸抗体进行免疫印迹分析。刺激5分钟后A549细胞中可检测到p46Shc、p52Shc和p66Shc的酪氨酸磷酸化作用显著增强（图1c），表明Shc是SF/HGF受体的底物。也在用SF/HGF受体转染的COS-1细胞中进行相似的实验。在过表达野生型（基本结构上有活性的）受体激酶的细胞中，内源性Shc蛋白质是被酪氨酸磷酸化的。然而，在用Lys1110→A激酶阴性受本转染的COS-1细胞中Shc则未被磷酸化。
借助磷酸肽作图和突变分析，已显示在EGF处理的细胞中Shc的主磷酸化位点是Y317（Salcini et al.，待发表）。为了确定在SF/HGF处理后同一残基也被磷酸化，将带有Y317→F突变标示的SHC cDNA转染到A549细胞中并表达之。在这些细胞中，经SF/HGF处理后，被抗“标记”抗体选择性免疫沉淀的Y317→F突变型没有在酪氨酸上发生磷酸化（图1D）。
在Y317上磷酸化的Shc蛋白质与Grb2“连接物”形成特异性复合物。
用Grb2抗体探查抗Shc免疫沉淀物的Western印迹，以试验在SF/HGF刺激后的A549细胞中SF/HGF激发Shc-Grb2复合物生成的可能性。如图1E中所示，在对SF/HGF反应中磷酸化的Shc蛋白质与Grb2结合。如使用Grb2的固定化SH2区域（作为GST融合蛋白质在细菌中表达的）和从对照或SF/HGF刺激的A549细胞制备的溶胞产物进行的体外实验所显示的，这种结合是通过Grb2的SH2区域介导的。在SF/HGF刺激后被Grb2融合蛋白质结合的Shc的量显著增加（图3B）。
使用生物传感器以真实时间检测法检测Grb2 GST-SH2融合蛋白质与固相化酪氨酸磷酸化的Shc肽DDPSY317＊VNVG的结合，得到这种相互作用的动力学参数及平衡解离常数（图7）。用所得数据计算出如图7C中所示的Kass（2.6×105M-1S-1）。在缓冲液中并在竞争性磷酸肽的存在下检测Kdiss，以防止重新结合。如图7B所示，加入竞争磷酸肽对于解离速率具有显著影响，且以前也已就其他SH2区域-磷酸肽相互作用观察到这种现象（Panayotou et al.，1993文献出处同上;Felder et al.，1993，文献同上）。所得Kdiss的值为0.04S-1，求出总亲和性为153nM。
这些数据显示在对SF/HGF的反应中，Shc蛋白质在酪氨酸Y317上磷酸化决定了对Grb2“连接物”之高亲和性接合位点的形成。因此，磷酸化的Shc蛋白质可能具有被激活的SF/HGF受体和Grb2之间的桥接分子的功能。令人感兴趣的是，Grb2之Shc接合位点的氨基酸序列，即Y317VNV，与位于SF/HGF受体尾部的序列完全相同（图8）;而Y1356VNV，与位于SF/HGF受体尾部的序列完全相同（图8）;已显示Y1356VNV在配基刺激后直接结合Grb2（Ponzetto et al.，已提交）。
Shc蛋白质并不形成连环
Shc序列Y317VNV与存在于SF/HGF受体中的两个Shc结合位点之一完全相同（图8）。这一观察提示，Shc可通过结合另一个Shc分子的磷酸酪氨酸Y317而形成连环。使用生物传感器比较Shc-Shc2区域与存在于Shc分子上的磷酸肽DDPSY317VNVQ，及与存在于SF/HGF受体上的磷酸肽VNATY1356VNVK的结合。Shc-SH2与Shc衍生的磷酸肽的结合远比与SF/HGF受体衍生的磷酸肽结合弱（图5）。这些数据表明Y317（在Shc中）N末端上的氨基酸和Y1356（在SF/HGF受体中）N末端上的氨基酸可被Shc的SH2区域识别。因此Shc-Shc结合在体内是不受支持的，而且Shc磷酸肽残基Y317可适于结合其他分了，而不是介导连环的形成。
结论
总地说来，包含Shc之接合位点（Y317VNV）的例如长度为4至20个氨基酸的肽，特别是肽H-Asp-Asp-Pro-Ser-Tyr＊-Val-Asn-Val-Gln-OH（DDPSY＊VNVQ）y以及包含肝细胞生长因子受体之Tyr＊识别型主（Y1356VNV）的例如长度为4至20个氨基酸的肽，特别是肽H-Val-Asn-Ala-Thr-Tyr＊-Val-Asn-Val-Lys-OH（VNATY＊VNVK）-其中Tyr＊（y＊）代表磷酸化或未磷酸化的酪氨酸残基，能够结合Grb2-SH2区域。因此，它们可用以竞争和防止Grb2蛋白质与酪氨酸磷酸化的受体如被激活的肝细胞生长因子受体（HGF/SF受体）、PDGF受体、EGF受体或与其他胞溶质酪氨酸磷酸化转导物如Shc或IRS-1蛋白质的SH2结合，以阻止游动发生并进而阻止肿瘤增殖。
另一方面，包含肝细胞生长因子受体之Tyr1356或Tyr1349识别型主（分别是Y1356VNV或Y1349VHV）的肽，特别是上文提到的肽H-Val-Asn-Thr-Tyr＊-Val-Asn-Val-Lys-OH（VNATY＊VNVK）和肽H-Ile-Gly-Glu-His-Tyr＊-Val-His-Val-Asn-OH（IGEHY＊VHVH），或包含上述酪氨酸残基的肽，如H-Ile-Gly-Glu-His-Tyr＊-Val-His-Val-Asn-Ala-Thr-Tyr＊-Val-Asn-Val-Lys-OH（IGEHY＊VHVNATY＊VNVK）-其中Tyr＊（y＊）代表磷酸化或未磷酸化的酪氨酸残基，能够结合Shc-SH2区域。因此，它们可用以竞争和防止Shc蛋白质与酪氨酸磷酸化的受体如被活化的肝细胞生长因子受体、EGT受体或与其他胞溶质酪氨酸磷酸化的转导物如IRS-1或胞溶质酪氨酸激酶如Src的SH2结合，以阻止有丝分裂发生及游动发生，并因而阻止肿瘤细胞扩散。因此，这些肽可发挥抗肿瘤和抗转移作用。
如上所述，本发明的肽可作为未磷酸化形式的优秀药物;在这种情况下，该肽可在细胞内经生物化学途径转化成其磷酸化的形式，在其中发挥药理学作用。

Claims (24)

1、具有人肝细胞生长因子受体细胞内区域之一部分序列的肽，该肽可与细胞溶质信号转导物结合。
2、根据权利要求1的肽，其可抑制磷酯酰肌醇3-激酶的p85亚单位和被激活的肝细胞生长因子受体间的结合。
3、根据权利要求1的肽，其可抑制Shc蛋白质和被激活的肝细胞生长因子受体间的结合。
4、根据权利要求1的肽，其可抑制Shc蛋白质和细胞溶质信号转导物间的结合。
5、具有Sc蛋白质之一部分序列的肽，该肽可与细胞溶质信号转导物结合。
6、根据权利要求5的肽，其可抑制Shc蛋白质和Grb2蛋白质间的结合。
7、根据权利要求5的肽，其可抑制Grb2蛋白质和被激活的肝细胞生长因子受体间的结合。
8、根据前述权利要求中任一项的肽具有序列
XN-YVN（或H）V-XC，
其中XN和XC各自具有0到16个氨基酸的序列。
9、根据权利要求8的肽，其中XN和XC是侧接HGF/SF受体和Shc蛋白质中YVN（或H）V序列之一的序列。
10、根据权利要求9的肽，其为H-Asp-Asp-Pro-Ser-Tyr＊-Val-Asn-Val-Glh-OH，且其中Tyr＊是磷酸化的或未磷酸化的酪氨酸残基。
11、根据权利要求9的肽，其为H-Val-Asn-Ala-Thr-Tyr＊-Val-Asn-Val-Lys-OH，且其中Tyr＊是磷酸化的或未磷酸化的酪氨酸残基。
12、根据权利要求9的肽，其为H-Ile-Gly-Gln-His-Tyr＊-Val-His-Val-Asn-OH，且其中Tyr＊是磷酸化的或未磷酸化的酪氨酸残基。
13、根据权利要求9的肽，其为H-Ile-Gly-Gln-His-Tyr＊-Val-His-Val-Asn-Ala-Thr-Tyr＊-Val-Asn-Val-Lys-OH，且其中Tyr＊是磷酸化的或未磷酸化的酪氨酸残基。
14、根据权利要求9的肽，其为H-Tyr＊-Val-His-Val-Asn-Ala-Thr-Tyr-OH，且其中Tyr＊是磷酸化的或未磷酸化的酪氨酸残基。
15、根据权利要求9的肽，其为H-Tyr＊-Val-His-Val-Asn-Ala-Thr-Tyr＊-Val-Asn-Val-Lys-OH，且其中Tyr＊是磷酸化的或未磷酸化的酪氨酸残基。
16、根据权利要求9的肽，其为H-Tyr＊-Val-Asn-Val-Lys-Cys-Val-Ala-OH，且其中Tyr＊是磷酸化的或未磷酸化的酪氨酸残基。
17、根据权利要求1的肽，其为
H－Tyr*-Asp-Ala-Arg-Val-His-Thr-Pro-OH
H-Tyr*-Arg-Ala-Thr-Phe-Pro-Glu-Asp-OH
H-Tyr*-Pro-Leu-Thr-Asp-Met-Ser-Pro-OH
H-Tyr*-His-Gly-Thr-Leu-Leu-Asp-Asn-OH
H-Tyr*-Met-Lys-His-Gly-Asp-Leu-Arg-OH
H-Tyr*-Leu-Ala-Ser-Lys-Lys-Phe-Val-OH
H-Tyr*-Asp-Lys-Glu-Tyr-Tyr-Ser-Val-OH
H-Tyr*-Tyr-Ser-Val-His-Asn-Lys-Thr-OH
H-Tyr*-Ser-Val-His-Asn-Lys-Thr-Gly-OH
H-Tyr*-Pro-Asp-Val-Asn-Thr-Phe-Asp-OH
H-Tyr*-Leu-Leu-Gln-Gly-Arg-Arg-Leu-OH
H-Tyr*-Cys-Pro-Asp-Pro-Leu-Tyr-Glu-OH
H-Tyr*-Glu-Val-Met-Leu-Lys-Cys-Trp-OH
H-Tyr*-Pro-Ser-Leu-Leu-Ser-Ser-Glu-OH
其中Tyr＊是磷酸化的或未磷酸化的酪氨酸残基。
18、制备根据上述权利要求这一的肽的方法，该方法包括从单个氨基酸或预生成的有两个或多个氨基酸残基的肽化学合成所说的肽。
19、根据权利要求18的方法，其中在固相合成期间直接引入预磷酸化的被保护的酪氨酸残基。
20、根据权利要求18的方法，其中在肽连接在固相载体上时使被保护的预生成的肽的酪氨酸残基磷酸化。
21、含有药学上可接受的载体或稀释剂，以及作为活性成分的前述权利要求1至17中任一项限定之肽的药物组合物。
22、根据权利要求1到17之任一项的肽用于人或动物体的治疗。
23、根据权利要求22的肽用于治疗肿瘤性疾病。
24、根据权利要求1至17中任一项限定的肽用于生产治疗肿瘤性疾病的药物。
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